Summary
Apresentamos um protocolo para estabelecer um modelo maciço de hemorragia pontina em um rato através de dupla injeção de sangue autólogo.
Abstract
Nós fornecemos um protocolo para estabelecer um modelo maciço de hemorragia pontina em um rato. Foram utilizados neste estudo ratos com cerca de 250 gramas. Cem microliters de sangue autólogo foram retirados da veia da cauda e estereotipados injetados nos pons. O processo de injeção foi dividido em 2 etapas: Primeiro, 10 μL de sangue foi injetado em um local específico, posição anteroposterior (AP) -9,0 mm; lateral (Lat) 0 mm; vertical (Vert) -9,2 mm, seguida de uma segunda injeção do sangue residual localizado em AP -9,0 mm; Lat 0 mm; Vert -9,0 mm com um intervalo de 20 minutos. O teste do feixe de equilíbrio, o teste de colocação dos membros e o neuroscore Voestch modificado foram utilizados para avaliar a função neurológica. A Ressonância Magnética (RM) foi utilizada para avaliar o volume de hemorragia in vivo. Os sintomas deste modelo estavam em consonância com pacientes com hemorragia pontina maciça.
Introduction
Hemorragia intracerebral é responsável por um quinto dos pacientes com AVC. O prognóstico da hemorragia intracerebral depende da velocidade, volume e localização do sangramento1,2. Em comparação com a hemorragia do cérebro, a hemorragia cerebral tem maior mortalidade e morbidade3. Cerca de 40% da hemorragia cerebral ocorre nos pons4. A etiologia e a fisiopatologia da hemorragia pontina são bem diferentes e menos estudadas do que a hemorragia do antebraína5.
Há dois tipos de modelos animais de hemorragia pontina. Um deles é o modelo de hemorragia espontânea induzido pela infusão de colagem bacteriana nos pons6,7,8. A maior vantagem deste modelo é que o sangramento é espontâneo. No entanto, a colagemnase só pode induzir um pequeno volume de hemorragia pontina. Além disso, a colagem pode causar outras lesões no cérebro. O outro modelo é induzido pela injeção estereotática de sangue autólogo no pons9. A vantagem deste modelo é que é fácil dominar com uma alta taxa de sucesso. Teoricamente, os pesquisadores poderiam injetar qualquer volume de sangue em qualquer local de pons. No entanto, devido ao vazamento de volta através da rota da agulha, o volume injetado é limitado. Recentemente, o método de dupla injeção foi promovido para reduzir o vazamento de volta9. Este método injeta sangue autólogo duas vezes com um intervalo de 20 minutos entre as injeções. O método de dupla injeção é aplicado para induzir hemorragia pontina leve (30 μL) e moderada (60 μL), mas não hemorragia pontina maciça. Na clínica, a maioria dos pacientes com hemorragia pontina com prognóstico ruim tem hemorragia maciça (mais de 10 mL).
No estudo anterior, fornecemos um protocolo para estabelecer um modelo de derrame isquêmico pontino no rato10. Neste estudo, modificamos o método de dupla injeção existente, e fornecemos um protocolo detalhado para induzir hemorragia pontina maciça em um rato por injeção dupla de 100 μL de sangue autólogo em dois locais diferentes nos pons.
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Protocol
O protocolo foi revisado e aprovado pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais do Segundo Hospital Afiliado da Universidade Médica de Guangzhou. Os ratos foram fornecidos pelo Centro Animal da Universidade Médica do Sul. O design experimental é mostrado na Figura 1.
1. Animais e instrumentos
- Use ratos sprague-dawley machos de 8 semanas pesando 250 ± 10 g.
- Abrigar os ratos por pelo menos 7 dias antes da cirurgia sob condições ambientais controladas com temperatura ambiente de 25 °C, umidade relativa de 65%, e um ciclo claro-escuro de 12/12 h.
- Forneça comida e água sem limite.
- Prepare os instrumentos (Figura 2A-E).
2. Injete o sangue nos pons
- Pesar os ratos novamente 3 dias antes da cirurgia para selecionar ratos com peso corporal adequado para os experimentos.
- Durante os 3 dias antes da modelagem, treine os ratos para andar em feixe de equilíbrio 3 vezes por dia para garantir que ratos normais possam passar a viga de equilíbrio sem pausa.
- Pré-aqueça a almofada de aquecimento a 37 °C antes da anestesia.
- Fixar um microdrill ao suporte no quadro estereotaxic.
- Injete os ratos com 50 mg/kg de cetamina e 5 mg/kg de xilazina intraperitonealmente. Espere até que não haja resposta do dedo do dedo do dedo do dedo.
- Transporte o rato para o quadro estereotaxic em uma posição propensa. Coloque as barras de ouvido acima do canal auditivo para fixar a cabeça. Fixar o crânio em uma posição horizontal para evitar a distorção da injeção(Figura 2F).
- Mantenha a anestesia por isoflurane (97,5% de oxigênio e 2,5% de isoflurane) através de um cone de nariz estereotaxic com uma porta de entrada e saída.
- Use pomada para manter a córnea úmida.
- Raspe o cabelo acima do crânio com uma micro máquina de barbear.
- Desenhe uma linha média de 3 cm com uma caneta marcadora no crânio da linha do canthus lateral bilateral a 0,5 cm atrás da fontanelle posterior, como mostrado na Figura 2F.
- Aplique entoiodina esfoliante cirúrgico de forma circular, começando no meio da linha média marcada e girando para fora.
- Coloque a cortina cirúrgica.
- Faça uma incisão com um bisturi ao longo da linha média marcada.
- Use um cotonete para remover qualquer sangue em potencial.
- Coloque um pedaço de fórceps em cada lado da aba do couro cabeludo para expor o crânio(Figura 2G).
- Mergulhe um cotonete em 0,9% salino e remova suavemente os tecidos conjuntivos do osso do crânio para evitar que os tecidos conjuntivos fique preso no microdrill.
- Marque o ponto central do bregma como o ponto de origem através de uma caneta marcadora.
- Realize uma craniotomia (1 mm de diâmetro) utilizando um microdrill em AP-9,0 mm, Lat 0 mm(Figura 1B e Tabela 1). Prossiga com cuidado porque este ponto é muito próximo do seio venoso (Figura 2G).
- Remova o microdrill do quadro estereotaxic.
- Coloque uma seringa Hamilton de 100 μL no suporte estereotaxista(Figura 2K). Ligue o interruptor da bomba de injeção, clique no botão de inalação rápida, aspira a solução de heparina (12500 U diluída em 100 mL de soro fisiológico) a 100 μL e depois drene-a completamente para evitar a coagulação sanguínea muito rápido.
- Aplique clorexidina e 75% de álcool na cauda inteira da raiz para ponta pelo menos 3 vezes para desinfetar a pele, suavizar o chifre e dilatar a veia da cauda para aumentar a taxa de sucesso da injeção.
- Conecte uma acupuntura do couro cabeludo a uma seringa de 1 mL.
- Insira a acupuntura do couro cabeludo em uma veia lateral da cauda a 3 cm da ponta da cauda e tome 150 μL de sangue(Figura 2H).
- Remova a acupuntura do couro cabeludo da seringa de 1 mL.
- Transfira o sangue para um tubo(Figura 2I).
NOTA: Transfira rapidamente para evitar a coagulação sanguínea. - Troque as luvas cirúrgicas.
- Escolha o modo Retirar, defina o volume para 100 μL, defina a velocidade em 200 μL/min, clique no botão RUN, aspire 100 μL de sangue na seringa Hamilton(Figura 2J).
- Escolha o modo Infuse, defina a velocidade em 1 μL/min.
- Avance a seringa até que a ponta atinja 9,2 mm abaixo da superfície do cérebro (Figura 1C e Figura 2L).
- Clique no botão Executar, injete os primeiros 10 μL de sangue a uma velocidade de 1 μL/min(Tabela 1).
- Pare a injeção e deixe a seringa em posição por 20 minutos para evitar que o sangue flua para o espaço subaracnóide.
- Retraia a seringa até que a ponta chegue a 9,0 mm abaixo da superfície do cérebro.
- Reinicie a injeção na mesma velocidade de 1 μL/min até que o sangue residual tenha sido injetado completamente.
- Deixe a seringa em posição por 10 minutos para evitar o fluxo sanguíneo.
- Remova a seringa do cérebro lentamente.
- Use cimento ósseo para cobrir o orifício de craniotomia.
- Quando o cimento secar, sutura a ferida com filamento de sutura de poliamida 4-0. Depois de costurar 3 ou 4 stiches, empate 2-1-1 nós cirúrgicos padrão.
- Para prevenir a infecção, injete penicilina (0,25 mL, 80 UI diluída em soro fisiológico de 4 mL) intraperitoneally.
- Injete os ratos subcutâneamente com tartarato butorphanol (2,5 mg/kg) e repita a injeção a cada 2 horas para aliviar a dor pós-operatória até 24 horas após a cirurgia.
- Observe o rato a cada 15 minutos até que ele se recupere totalmente da anestesia. Devolva-o à gaiola original, com uma almofada de aquecimento debaixo da gaiola. Forneça ao rato acesso livre a comida e água até o sacrifício.
3. Testes comportamentais
NOTA: Realizar testes comportamentais no dia 1, dia 3, dia 7 e dia 14 após a modelagem, incluindo o teste do feixe de equilíbrio, teste de colocação de membros e o neuroscore Voetsch modificado.
- Teste de feixe de equilíbrio11.
NOTA: Este é um teste especificamente para examinar a função sensorial da plataforma traseira.- Preparado o aparelho para garantir que o feixe (3 cm de largura × 70 cm de comprimento) esteja 20 cm acima do chão.
- Coloque uma caixa escura na parte de trás da viga com uma entrada estreita.
- Coloque um gerador de ruído branco e uma fonte de luz brilhante, que são usadas para motivar o rato a atravessar a viga e entrar na caixa de gol, na extremidade da cabeça da trave.
- Pare o barulho e a luz quando o animal entrar na caixa de gol. Regissuor a latência da cabeça para a caixa de gol (em segundos) e o desempenho do hindlimb durante a travessia da trave.
- Registrar a pontuação de desempenho a seguir: 0, equilibra-se com postura estável; 1, apertos lado do feixe; 2, aconchega o feixe com 1 subida traseira caindo; 3, aconchega o feixe com 2 membros caindo, ou girando ao redor da viga por mais de 60 s; 4, tenta equilibrar na trave >40 s, mas cai; 5, tenta equilibrar na trave >20 s, mas cai; e 6, cai, sem tentativa de equilibrar ou equilibrar na trave <20 s.
- Teste de colocação de membros
NOTA: O teste de colocação do membro examina 3 estímulos independentes de visão, toque e propriocepção com 6 parâmetros, para avaliar a função sensorial do rato. O escore total da função neurológica variou de 0 a 12. Antes do teste, o rato deve ser habituado ao manuseio.- Segure o rato por trás e coloque-o sobre a mesa lentamente a partir de uma altura de 10 cm. Normalmente, o rato esticaria os membros dianteiros e os colocaria sobre a mesa.
- Pegue o rato pelas costas e segure-o de frente para a borda da mesa. Observa-se a reação dos membros dianteiros. Um rato normal colocaria os membros dianteiros na mesa.
- Deixe o rato agarrar a borda da mesa. Um rato normal usaria o queixo para evitar que o nariz e o nariz tocassem na borda da mesa.
- Coloque o rato sobre a mesa, empurre o rato com uma suave pressão lateral atrás do ombro do rato em direção à borda da mesa, e observe a colocação dos membros dianteiros e traseiros. Um rato normal agarraria a borda com seus membros dianteiros e traseiros.
- Coloque o rato sobre a mesa com o rosto em direção à borda, e empurre-o suavemente de trás para a borda. Um rato normal agarraria a borda com seus membros dianteiros.
- Coloque o rato sobre a mesa de costas para a borda e empurre-o por trás para a borda da mesa. Observe a reação dos blocos traseiros. Um rato normal agarraria a borda com seus traseiros.
- Avalie a colocação dos membros dianteiros ou de bordas traseiras na borda da tabela. Registos: 0, sem colocação; 1, colocação inacabada e/ou atrasada; 2, colocação imediata e completa.
- A neuroscore Voetsch modificada8
NOTA: O neuroscore Voetsch modificado é um escore vertebrobasilar de capacidade sensorial, contendo 14 parâmetros: movimento da cabeça, atividade, audição, reflexo da dor, reflexo da córnea, propriocepção, sensação do pescoço, exploração, circling, sensação de torso axial, movimento de 4 membros, movimento de membros dianteiros, escalada e caminhada de feixe. A pontuação para cada parâmetro varia de 0 (déficit neurológico completo) a 3 (sem déficit neurológico). O escore total da função neurológica varia de 0 a 42.- Coloque o rato sobre a mesa (50 cm de comprimento × 35 cm de largura) e deixe que ele se mova por cinco minutos. Observe o movimento espontâneo de sua cabeça: move-se em todas as dimensões, 3; prefere um lado, 2; apenas movimento para 1 lado, 1; flexionado para lado unilateral, 0.
- Coloque o rato sobre a mesa (50 cm de comprimento × 35 cm de largura) e deixe que ele se mova por cinco minutos. A atividade é definida como: totalmente responsiva, 3; moderadamente responsivo, 2; minimamente responsivo, 1; coma, 0.
- Observe o círculo craniocaudal: vira bilateralmente, 3; prefere 1 lado, 2; apenas para 1 lado, 1; caiu para um lado, 0.
- Avaliar o movimento dos membros dianteiros: movimento igual e bilateral, 3; assimetria leve, 2; grande assimetria, 1; paresis, 0.
- Avaliar o movimento de 4 membros: movimento igual e bilateral, 3; assimetria leve, 2; grande assimetria, 1; paresis, 0.
- Quando o rato estiver parado, realize uma pitada de ouvido para estimular as aurículas e teste o reflexo da dor: afasta-se rapidamente e simetricamente do estímulo, 3; afasta-se lentamente ou assimetricamente do estímulo, 2; mostra algum movimento em resposta à dor, 1; sem reação, 0.
- Quando o rato estiver parado, faça um barulho em ambos os lados do corpo do rato para testar a audição: dedos esfregando, 3; estalo de dedos, 2; palmas altas, 1 e nenhum surpreendente, 0.
- Para verificar a propriocepção, toque na vibrissae do rato em ambos os lados, respectivamente, com uma vara contundente e observe sua resposta ao estímulo: reaja ao toque, 3; reação diminuída de um lado, 2; diminuído em ambos os lados, 1; ausente, 0.
- Para avaliar a sensação axial do torso, coloque uma vara contundente em ambos os lados do corpo do rato e observe sua resposta ao estímulo: reação rápida e simétrica aos estímulos, 3; reação ligeiramente diminuída ou assimétrica, 2; reação muito diminuída e assimétrica, 1 e nenhuma reação, 0.
- Para testar o reflexo da córnea, segure o rato e toque rapidamente a córnea de ambos os lados com um cotonete: ambos os olhos se fecham rapidamente, 3; reflexo diminuído de um lado, 2; diminuído em ambos os lados, 1; ausente, 0.
- Para verificar a sensação do pescoço, segure o rato e use uma vara contundente para tocar o pescoço: reage ao toque ativamente, 3; reação lenta ao toque, 2; reação muito diminuída, 1; sem reação, 0.
- Para observar a exploração, use uma caixa escura clara.
NOTA: Dois terços da caixa devem estar abertas e acesas, enquanto o resto está coberto e escuro. Uma porta de 7 cm conecta os dois compartimentos. - Coloque o rato no compartimento de luz por 5 minutos e, em seguida, o compartimento escuro por mais 5 minutos, permita que ele se mova e regise as atividades do rato. Quando 4 membros forem colocados em uma sala, grave-o como uma entrada. Pontuações recordes da seguinte forma: atinge os compartimentos claro e escuro ativamente, 3; atinge 1 compartimento, 2; move-se lentamente apenas após estímulo, 1; e nenhum movimento, 0.
- Para verificar a capacidade de escalada, coloque o rato na parte inferior de um plano de 20 cm de largura e 70 cm de comprimento com um ângulo de 30 graus para o solo horizontal. Recorde de pontuações da seguinte forma: capaz de subir para o topo, 3; escalada prejudicada, 2; aderência estacionária, 1; e cai imediatamente, 0.
- Para examinar a caminhada do feixe, coloque o rato em uma extremidade de um feixe de 3 cm de largura, 70 cm de comprimento que está 20 cm acima do solo, registrando pontuações como a seguir: explora todo o feixe, 3; explora parte da viga, 2; algum movimento e quedas, 1; sem movimento, 0.
- Calcule os pontos.
4. Confirmação de hemorragia por ressonância magnética
- Faça a ressonância magnética às 24h após a cirurgia.
- Anestesiar o rato com isoflurane (5% para indução, 1% a 1,5% para manutenção).
- Fixar a cabeça do rato na bobina do cérebro de rato combinada com uma bobina de volume somente de transmissão.
- Coloque a bobina junto com o rato no scanner de ressonância magnética. Fixar o rato dentro do berço através das barras de dente e ouvido.
- Use uma jaqueta térmica de circuito fechado para manter a temperatura corporal do rato a 37 ± 0,5 °C durante a ressonância magnética.
- Execute uma sequência piloto para garantir a geometria correta.
- Aplique uma sequência de eco de giro rápido para coletar varreduras ponderadas por T2. Definir os parâmetros da seguinte forma: tempo de eco (TE), 132 ms; tempo de repetição (TR), 2.500 ms; matriz de aquisição, 148 × 148; campo de visão, 100 mm × 100 mm; 12 fatias; 1,5 mm de espessura.
- Devolva o rato para a jaula.
5. Confirmação da hemorragia por anatomia grosseira
NOTA: Sacrifique os ratos no ponto de tempo designado, 24h e 14 d após a cirurgia(Figura 1D).
- Anestesiar o rato com 5% de isoflurane até a perda de consciência. Em seguida, eutanize-o com dióxido de carbono (CO2) (20-30% do volume da gaiola por minuto).
- Confirme a morte usando os seguintes sinais: sem aumento e queda do peito, sem batimentos cardíacos palpáveis, sem resposta ao dedo do dedo do dedo, cor da mucosa pobre, mudança de cor ou opacidade nos olhos.
- Faça deslocamento cervical.
- Segure o rato gravando as patas em uma plataforma estéril. Crie uma incisão midline do colo uterino para expor o hipogástrium ao tórax e fígado. Faça uma incisão lateral da margem popal superior ao longo da clavícula para a extrema esquerda e outro corte lateral do xiphoide ao longo do diafragma para a extrema esquerda, para expor o coração. Levante a aba da caixa torácica e fixe-a na plataforma com um alfinete.
- Conecte a extremidade de uma agulha (27 G) a uma bomba de perfusão contendo soro fisiológico de 4 °C. Avance a ponta da agulha para o coração ao longo da borda esquerda do ventrículo esquerdo para evitar entrar no átrio. Ligue a bomba de perfusão para garantir que a ponta esteja no ventrículo esquerdo e faça um corte no átrio direito.
- Desligue a bomba de perfusão quando o líquido drenado do átrio direito ficar incolor e o fígado ficar branco. Este procedimento precisa de aproximadamente 100 mL 4 °C salino.
- Decapite o rato e colhe todo o cérebro usando tesouras e fórceps. Remova qualquer umidade da superfície cerebral com papel manchado.
- Mantenha o cérebro inteiro a -80 °C por 1 min.
NOTA: Este passo pode ser pulado se o cérebro puder ser cortado sem congelamento. - Coloque o cérebro na matriz cerebral de ratos coronais com o lado dorsal para cima.
- Insira uma lâmina de aço inoxidável de 0,21 mm de espessura no centro de hemorragia de acordo com o orifício na superfície do cérebro.
- Insira outras lâminas no cérebro em um intervalo de 2 mm.
- Mergulhe as seções cerebrais em 10 mL de solução de paraformaldeído (PFA) de 4% por 24 h a 4 °C. Enxágüe-os com salina tamponada de 0,01 mmol/L (PBS).
- Organize as seções de rostral a caudal e imagem-los.
6. Seção de parafina e hematoxilina e eosina (HE) coloração
- Conserte o cérebro com 4% de solução PFA por pelo menos 24 h em temperatura ambiente. O volume de PFA deve ser de 5 a 10 vezes de volume cerebral.
- Corte o cérebro do centro de hemorragia em dois pedaços através de lâmina e matriz cerebral de rato coronal.
- Faça blocos de tecido embutidos em parafina.
- Se se section o bloco de tecido embutido em parafina coronally em 40 μm de espessura desliza em um microtome, corte 4 seções em sucessão, começando do centro de hemorragia, e flutue-os em um banho de água de 40 °C.
- Monte as seções de 40 μm (8 slides no total para um cérebro) em lâminas de vidro limpas e ar seco durante a noite à temperatura ambiente.
- Asse os slides a 56 °C por 1h.
- Lave por 3 minutos em xileno, 3 vezes.
- A queda é 30 vezes maior em 100% etanol, 30 vezes mais em 100% etanol, 30 vezes em 95% etanol e 30 vezes mais em 95% etanol.
- Enxágüe na água da torneira até ficar limpa.
- Mergulhe as seções em Hematoxilina por cerca de 10 minutos.
- Enxágüe na água da torneira até ficar limpa.
- Mergulhe seções na mancha de eosina por 30 s.
- A desidratação desliza com 3-4 quedas de 95% de etanol, 3-4 quedas em 100% etanol, 100% etanol por 1 minuto e 10 quedas em 100% etanol + xileno (1:1).
- Limpe seções com xileno por 1 min, 2 vezes.
- Monte usando meio de montagem não aquoso e uma mancha de cobertura.
- Seque as seções no ar durante a noite à temperatura ambiente, depois san-los.
7. Estatísticas
- Use o GraphPad Prism 6.0 para calcular o teste t do Student ou o teste U de Mann Whitney.
NOTA: Todos os dados devem ser expressos como ± SE. As diferenças entre dois grupos são determinadas com um teste t-test de duas caudas ou teste U de Mann Whitney. P<0,05 é definido como significância estatística.
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Representative Results
Foram utilizados 25 animais, 3 para controle, 6 para 30 μL, 6 para 60 μL e 10 para injeções de sangue de 100 μL. Um rato que recebeu uma injeção de 100 μL de sangue autólogo (1/10) morreu dentro de 24 horas após a cirurgia.
Os exames comportamentais foram realizados no dia 1º, dia 3, dia 7 e dia 14 após a cirurgia. As pontuações para o grupo controle e grupos de injeção de sangue em diferentes pontos de tempo após a cirurgia são apresentadas na Tabela 2. A hemorragia pontina causou déficits neurológicos como reflexo córnea diminuído e circulação(Figura 3B,C). A injeção de 100 μL de sangue também induziu a miotonia (Figura 3A). Os resultados do teste do feixe de equilíbrio, teste de colocação de membros e neuroscore Voetsch modificado revelaram que a função neurológica foi diminuída à medida que o volume de hemorragia pontina aumentava.
A ressonância magnética foi realizada 24 horas após a cirurgia(Figura 4). Nos grupos de injeção de sangue, na sequência T2, a hemorragia foi detectada como uma borda hipointense com um núcleo iso-a ligeiramente hiperintense na parte basilar dos pons. Não houve hemorragia detectada pela ressonância magnética em outras áreas cerebrais(Figura 4). O volume de hemorragia foi aumentado à medida que o volume de injeção de sangue autólogo aumentava.
Em seguida, os ratos foram sacrificados às 24 horas e dia 14 após a cirurgia, separadamente, e foram feitas seções de 2 mm de espessura(Figura 4). Hemorragia foi detectada ao redor do local da injeção e distribuída na base dos pons. Houve um pequeno edema em torno da hemorragia no grupo de injeção de sangue de 100 μL.
Alguns dos ratos foram sacrificados 3 dias após a cirurgia e parafina-seccionadas para fazer a coloração do HE. Os resultados mostraram que, nos grupos de injeção sanguínea, as células inflamatórias enriqueceram na zona peri-hemorragia(Figura 5C e F). A hemoglobina permanece contida em glóbulos vermelhos intactos(Figura 5D e G).
Figura 1: Diagramas esquemáticos do modelo de hemorragia pontina. (A) Coleta de sangue autólogo da veia da cauda. (B) O diagrama esquemático da localização da broca. (C) Os diagramas esquemáticos do local da injeção. (D) Design experimental. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Instrumentos e procedimento de cirurgia. (A) Máquina de anestesia. (B) Instrumentos cirúrgicos. (C) Microdrill. (D) Bomba de micro injeção. (E) Aparelho estereotaxico. (F) Uma linha marcada no meio do crânio. (G) A seta amarela aponta para a localização da broca. (H) Drenagem de sangue da veia da cauda. (I) Transfira o sangue para o tubo Eppendorf. (J) Aspire o sangue na seringa hamilton. (K) Avance a seringa Hamilton através do orifício do crânio. (L) Processo de injeção de sangue autólogo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Resultados representativos de testes comportamentais. (A) Miotonia em um rato injetado 100 μL de sangue autólogo. (B) Reflexo córnea diminuído no lado direito em um rato injetado 60 μL de sangue autólogo. (C) Reflexo córnea diminuído nos lados bilaterais em um rato injetado 100 μL de sangue autólogo. (D) Um rato recebeu 60 μL de sangue autólogo circulado para o lado contralateral da lesão. (E) Resultados do teste do feixe de equilíbrio. (F) Resultados da neuroscore Voetsch modificada. (G) Resultados do teste de colocação dos membros. Linha significa diferença significativa entre os dois grupos (p < 0,05). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Resultados representativos da ressonância magnética e da anatomia bruta. A ressonância magnética (Superior) foi realizada 24 h após a cirurgia de hemorragia pontina, em seguida, os ratos foram sacrificados e cortados em seções cerebrais de 2 mm (Inferior). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Resultados representativos da coloração do HE. Cérebros foram colhidos dos ratos injetados 100 μL de sangue 3 d após a cirurgia. (A) Toda a seção cerebral. Campos baixos a partir (B) da área de pontina normal, (C) zona de peri-lesão e (D) núcleo de hemorragia. Campos elevados da área de pontina normal (E), (F) zona de peri-lesão e (G) núcleo de hemorragia. A barra de escala foi de 100 μm. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura S1: Resultados representativos da anatomia bruta no dia 14 após a cirurgia. Clique aqui para baixar este arquivo.
| Moderada | moderado | maciço | |
| Volume total | 30 μL | 60 μL | 100 μL |
| Primeira injeção | |||
| Coordenadas estereotáticas | AP -9,0 mm; Lat 0; Vert -9,2 mm | ||
| volume | 10 μL | 10 μL | 10 μL |
| velocidade | 1 μL/min | 1 μL/min | 1 μL/min |
| Tempo de intervalo | 20 min. | 20 min. | 20 min. |
| Segunda injeção | |||
| Coordenadas estereotáticas | AP -9,0 mm; Lat 0; Vert -9,2 mm | AP -9,0 mm; Lat 0; Vert -9.0 mm | |
| volume | 20 μL | 50 μL | 90 μL |
| velocidade | 1 μL/min | 1 μL/min | 1 μL/min |
| Antes da retirada da agulha | 10 min. | 10 min. | 10 min. |
| AP: posição anteroposterior | |||
| Lat: lateral | |||
| Vert: vertical | |||
Tabela 1: Injeção de sangue autólogo.
| Número de rato | Dia 1º | Dia 3. | Dia 7. | Dia 14. |
| A neuroscore Voetsch modificada | ||||
| 30 μL-1 | 33 | 34 | 38 | 41 |
| 30 μL-2 | 30 | 35 | 37 | 41 |
| 30 μL-3 | 34 | 37 | 40 | 42 |
| 60 μL-4 | 27 | 30 | 36 | 38 |
| 60 μL-5 | 23 | 28 | 34 | 39 |
| 60 μL-6 | 26 | 29 | 35 | 39 |
| 100 μL-7 | 16 | 25 | 31 | 36 |
| 100 μL-8 | 13 | 22 | 29 | 37 |
| 100 μL-9 | 14 | 21 | 26 | 36 |
| Sham-10 | 41 | 42 | 42 | 42 |
| Sham-11 | 42 | 42 | 42 | 42 |
| Sham-12 | 42 | 42 | 42 | 42 |
| Teste de feixe de equilíbrio | ||||
| 30 μL-1 | 1 | 0 | 0 | 0 |
| 30 μL-2 | 1 | 1 | 0 | 0 |
| 30 μL-3 | 2 | 1 | 0 | 0 |
| 60 μL-4 | 3 | 2 | 0 | 0 |
| 60 μL-5 | 4 | 2 | 0 | 0 |
| 60 μL-6 | 3 | 2 | 1 | 0 |
| 100 μL-7 | 5 | 4 | 3 | 1 |
| 100 μL-8 | 5 | 4 | 2 | 1 |
| 100 μL-9 | 4 | 4 | 2 | 1 |
| Sham-10 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| Sham-11 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| Sham-12 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| Teste de colocação de membros | ||||
| 30 μL-1 | 11 | 12 | 12 | 12 |
| 30 μL-2 | 10 | 11 | 12 | 12 |
| 30 μL-3 | 10 | 11 | 12 | 12 |
| 60 μL-4 | 9 | 11 | 12 | 12 |
| 60 μL-5 | 8 | 9 | 9 | 11 |
| 60 μL-6 | 8 | 9 | 10 | 11 |
| 100 μL-7 | 4 | 5 | 9 | 11 |
| 100 μL-8 | 3 | 4 | 8 | 10 |
| 100 μL-9 | 2 | 4 | 7 | 8 |
| Sham-10 | 11 | 12 | 12 | 12 |
| Sham-11 | 12 | 12 | 12 | 12 |
| Sham-12 | 12 | 12 | 12 | 12 |
Tabela 2: Resultados de testes comportamentais.
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Discussion
No presente estudo, fornecemos um protocolo para gerar um modelo maciço de rato de hemorragia pontina. Este modelo pode ser usado para a pesquisa sobre o mecanismo fisioterásio e prognóstico de hemorragia pontina maciça.
Ao longo do experimento, foram usados 25 ratos, dos quais apenas um morreu. A verificação da ressonância magnética, da anatomia bruta e da coloração do HE indicaram que este método tinha uma taxa de mortalidade muito baixa e uma alta taxa de sucesso. Para estabelecer um modelo maciço de hemorragia pontina, dois problemas devem ser resolvidos, o sangue autólogo injetado tende a vazar para o espaço subaracnóide e fluir de volta para o quarto ventrículo ao longo do trato da agulha. O modelo de hemorragia pontina de dupla injeção existente (60 μL no total) resolveu o primeiro problema, quase nenhum sangue fluiu para o espaço subaracnóide. No entanto, ainda havia uma pequena quantidade de fluxo sanguíneo. No presente estudo, várias estratégias foram aplicadas para otimizar o método de dupla injeção existente para permitir a injeção de uma quantidade maior de 100 μL de sangue autólogo sem fluxo de retorno. Primeiro, dois pontos de injeção diferentes em vez de um foram empregados. Em segundo lugar, a heparina foi usada para lavar a seringa com resíduo mínimo para reduzir a dosagem, a fim de proteger apenas o sangue da coagulação durante o processo de injeção, mas não o suficiente para promover vazamento e backflow após a injeção. Terceiro, o tempo de injeção foi longo e a velocidade de injeção foi lenta, 1 μL/min. Além disso, apenas uma pequena quantidade de sangue autólogo foi injetada na primeira vez, enquanto a segunda injeção foi realizada 20 minutos depois. Posteriormente, a agulha foi retirada somente após 10 minutos, e este procedimento foi realizado extremamente lentamente. Usando este método, quase não havia sangue fluindo para o espaço subaracnóide ou quarto ventrículo nos ratos injetados com 30 μL ou 60 μL de sangue autólogo, mas ainda havia uma pequena quantidade de backflow nos ratos injetados com 100 μL. Estendendo o tempo antes de remover a agulha poderia resolver este problema.
Os testes comportamentais foram realizados no dia 1, dia 3, dia 7 e dia 14 após a modelagem, incluindo teste de feixe de equilíbrio, teste de colocação de membros e neuroscore Voetsch modificado. No primeiro dia após a cirurgia, quase todos os ratos dos grupos de injeção de sangue apresentaram comportamento circulante (ou seja, virando à esquerda ou à direita), acompanhados pelo desaparecimento do reflexo córnea unilateral ou bilateral. Embora sangue autólogo tenha sido injetado na linha média do pontino, foi distribuído de forma desigual nos dois lados do cérebro. Esta parecia ser a razão para o desempenho diferente em testes comportamentais. As atividades e reações dos ratos injetados 30 μL ou 60 μL de sangue autólogo desaceleraram mais perto do normal. Nos ratos injetados 100 μL de sangue, as funções sensoriais foram significativamente enfraquecidas e a resposta foi fraca. A rigidez muscular apareceu em alguns ratos no estado de repouso. No dia 1, dia 3 e dia 7, houve diferenças óbvias entre ratos injetados 30 μL, 60 μL ou 100 μL de sangue autólogo e os ratos no grupo controle na neuroscore Voetsch modificada. No teste do feixe de equilíbrio e no teste do local dos membros, não houve diferenças significativas entre os ratos injetados 30 μL ou 60 μL de sangue e os ratos no grupo controle em qualquer ponto de tempo. No entanto, os resultados do teste do feixe de equilíbrio e do teste de colocação de membros em ratos injetados 100 μL de sangue autólogo foram significativamente diferentes quando comparados com o grupo controle no dia 1 e no dia 3. A possível razão pode ser que há menos itens de avaliação no teste do feixe de equilíbrio e no teste de colocação dos membros em comparação com o neuroscore Voetsch modificado, que não são sensíveis o suficiente para descobrir déficits neurológicos sutis. É inapropriado usar esses dois métodos para avaliar o comportamento em modelos de hemorragia com sintomas leves, mas eles são aplicáveis no modelo de hemorragia pontina maciça. No geral, o neuroscore Voetsch modificado mostrou-se mais adequado para avaliar de forma abrangente e precisa as funções neurológicas em diferentes modelos de hemorragia pontina.
Existem várias vantagens deste método. Com base no método anterior de dupla injeção, o segundo local de injeção foi alterado e a dosagem da heparina foi ajustada para evitar o vazamento e o fluxo de retorno no modelo leve (30 μL) e moderado (60 μL) de hemorragia pontina. Mesmo no maciço (100 μL) modelo de hemorragia pontina, o backflow era muito limitado, e ocorreu apenas em um pequeno número de ratos. Este método pode ser facilmente realizado com uma alta taxa de sucesso e uma baixa taxa de mortalidade. Além disso, a hemorragia pontina experimental pode ser observada durante um longo período, pelo menos 14 dias após a modelagem, o que é propício para investigar todo o desenvolvimento da doença e os efeitos dos tratamentos. O maior avanço deste modelo foi que ele imitava os sintomas de pacientes com hemorragia pontina. Clinicamente, a hemorragia pontina maciça resulta em déficits neurológicos graves, enquanto os modelos anteriores de hemorragia pontina só desenvolveram volume hemorrágico relativamente pequeno com sintomas leves. A hemorragia pontina maciça neste modelo distribuído nos pons bilaterais, que é semelhante com a distribuição de hemorragia em pacientes com hemorragia pontina. Em modelos experimentais anteriores de hemorragia pontina, a hemorragia só está localizada nos pons unilaterais9.
No entanto, há também algumas limitações desse método. Em primeiro lugar, a hemorragia pontina neste estudo foi causada pela injeção de sangue, parcialmente heparinizada durante a transição, o que pode influenciar a coagulação sanguínea ou até mesmo a homeostase nos pons circundantes. Em segundo lugar, este modelo requer equipamentos especiais, como aparelhos estereotaxicos e bomba de injeção. Terceiro, este modelo não pode imitar hemorragia espontânea.
Em conclusão, este estudo forneceu um método para criar um modelo experimental de hemorragia aguda aguda de pontina no rato, o que poderia promover novas pesquisas mecânicas e terapêuticas neste campo.
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Disclosures
Sem conflitos de interesse.
Acknowledgments
Este estudo foi apoiado financeiramente pela Fundação Nacional de Ciência da China (81471181 e 81870933) e pelo Programa de Laboratório de Abertura da Universidade Médica de Guangzhou (0506308) para Y Jiang, e pela Fundação Nacional de Ciência da China (81701471) e pelo Programa Científico da Comissão Municipal de Saúde de Guangzhou (20191A01083) para Z Qiu, e pela Fundação Nacional de Ciência da China (81501009) para L Wu.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100ml Saline solution | Guangdong yixiang | 191222201 C1 | Preparing heparin diluent |
| 100μl Microinjector | Shanghai Gaoge | Injection of autologous blood | |
| 1ml Syringe | Jiangsu Zhiyu | 20191014 | Withdraw autologous blood from the tail vein |
| 75% Alcohol | Shandong Lierkang | Disinfection of rat tail | |
| Adhesive tape | Shanghai Jinzhong | Surgicl instruments | |
| Animal anesthesia system | RWD | R510-31S-6 | Inducing and maintaining anesthesia |
| Balance beam | Jiangsu Saiangsi | For neurological deficit scores | |
| Blades | Shanghai Feiying | 74-C | For gross anatomy |
| Bone cement | Shanghai Xinshiji | 20180306 | Surgicl instruments |
| Brain tank | Shenzhen LEIYEA | For gross anatomy | |
| Butorphanol tartrate | Jiangsu Hengrui | For pain management | |
| Electric cranial drill | Nanjing Darwin biotechnology | 20180090018 | Making a burr hole on the skull |
| EP tube | Nantong Surui | Transfer autologous blood | |
| Erythromycin eye cream | Yunnan pharmacy | Eyes protection | |
| HE dye liquor | Solarbio | G1120 | For HE staining |
| Heating pad | Dangerous Jungle | JR01 | Keeping warm |
| Heparin sodium injection | Chengdu Haitong Pharmacal Company | 190701 | Preparing heparin diluent |
| IndoPhors | Guoyao of China | Sterilization | |
| Isoflurane | RWD | 20080701 | Inducing and maintaining anesthesia |
| Light dark box | Jiangsu Saiangsi | For neurological deficit scores | |
| Micro-injection pump | Baoding Leifu | TFD03-01-C | Injection of autologous blood |
| MRI system | Philips | Confirmation of infarction in vivo | |
| Needle holder | Shanghai Jinzhong | J32020 | Surgicl instruments |
| Penicilin | Guoyao of China | Infection Prevention | |
| Q-tips | Jiangxi Songhe | Surgicl instruments | |
| Scalp heedle | Jiangxi Hongda | 20200313 | Withdraw autologous blood from the tail vein |
| Scalpel | Shanghai Kaiyuan | 170902 | Surgicl instruments |
| Shearing scissors | Shanghai Jinzhong | Y00040 | Surgicl instruments |
| Stereotaxic apparatus | RWD | 900-00001-00 | for surgical positioning |
| Surgical towel | Xinxiang Huakangweicai | 20070601 | Surgicl instruments |
| Suture needle | Shanghai Jinzhong | Surgicl instruments | |
| Suture scissors | Shanghai Jinzhong | J25041 | Surgicl instruments |
| Tissue holding forcepts | Shanghai Jinzhong | J31080 | Surgicl instruments |
References
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- Tao, C., et al. A novel brainstem hemorrhage model by autologous blood infusion in Rat: White Matter Injury, Magnetic Resonance Imaging, and Neurobehavioral features. Journal of Stroke and Cerebrovascular Diseases. 25 (5), 1102-1109 (2016).
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- Behrouz, R. Prognostic factors in pontine haemorrhage: A systematic review. European Stroke Journal. 3 (2), 101-109 (2018).
- Guo, X., et al. Brainstem iron overload and injury in a rat model of brainstem hemorrhage. Journal of Stroke and Cerebrovascular Diseases. 29 (8), 104956 (2020).
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- Wu, L., et al. Keep warm and get success: The role of postischemic temperature in the mouse middle cerebral artery occlusion model. Brain Research Bulletin. 101, 12-17 (2014).
