Summary
通过引入标准化检查表和使用点击器进行正强化训练，可以改进猪的研究。这项工作支持收集样本和进行与动物有关的日常家务。
Abstract
实施 3R 计划非常重要。为了改善实验猪的生命，我们专注于将动物纳入实验之前的时间段。我们在开发过程中改进了检查表。通过使用清单记录了每头猪的进度。这有助于看护者，使他们仍然专注于必要的行动，使动物社会化，并限制动物的压力和焦虑程度。在这一阶段，猪变得平静，并准备开始额外的点击训练，以进一步限制在实验期间的压力。猪将很容易允许收集基本的结果措施，而无需沉浸或固定。
协议分为两个。首先，当猪到达研究设施时，过渡阶段开始。引入治疗和逐渐接近看门人接触是第一步。然后，看门人引入能够触摸头部和后部的动作，以模仿例如操纵耳朵采集血液样本或后部以获得直肠温度。在动物饲养员关系上建立了牢固的基础，这迅速将猪抵达后所表达的压力降到最低。其次，开始进行积极的强化训练，教动物如何在不感到压力的情况下执行更复杂的任务。单击器作为辅助增援器引入。
时间、结构、教育和彻底沟通似乎是成功实施本议定书的最重要标准。除了有冷静和顺从的猪，看门人报告说，他们享受的焦点，他们被允许给每头猪，增加了他们的整体工作满意度。有护理人员有坚定的承诺，并专注于每头猪的过渡进展和福利，进一步加强了该部门的护理文化。
Introduction
罗素和伯奇在1959年讨论的3R（替换、减少和改进）原则，构成了今天关于将动物用于实验目的的高道德标准的基础。在从事临床前实验室动物研究的生物医学研究设施中，必须坚持精细化原则。"改进是指对仍需使用的动物适用的不人道程序的发生率或严重程度的任何降低"1。
当代定义还规定，改进是"通过利用最新的活体技术和提高对福利对科学成果影响的理解来促进动物福利的研究"。这意味着，今天的改进举措不仅对动物本身的福利很重要，而且对研究质量也很重要，因为科学成果将受益于这些倡议3。
需要考虑的一个改进举措是使实验动物社会化和训练。他们可能接受过执行某种任务的训练，例如，在抽取血液样本时踩到秤或表现冷静。有些物种可能比其他物种更自然地接受训练，这影响了训练实验室动物物种的传统。传统上，狗的训练已经进行了几个世纪，例如，为了在狩猎中使用狗。这些历史传统无疑使生物医学研究环境中的狗训练更加简单明了。与非人类灵长类动物一起，对实验犬的训练已经讨论和进行了相当长一段时间。
这两种物种的共同之处在于，它们在"社会动物学尺度"中名列前茅。这个尺度根据动物在人类社会中的位置和用途对动物进行排名。排名靠前也带来了巨大的公众需求，即尽可能人道地对待动物，并限制它们的压力和焦虑程度。与狗和非人类灵长类动物相比，啮齿动物被置于社会动物学尺度的低端。他们没有受到同等的公众关注和照顾。从历史上看，他们受到的治疗不太好——大概也是因为他们传播危及生命的疾病的能力。然而，在过去几年中，在临床前研究环境中对啮齿动物进行了培训，其相关的科学益处并没有被忽视。老鼠和老鼠都很容易训练，训练也限制了他们的应激反应，从而加强了科学成果7，8。
报告如何在实验室动物环境中对猪进行社交和训练，据我们所知，这是很少见的。在社会动物学尺度上，猪被放置在狗和啮齿动物之间。我们承认该物种主要是一种食物资源，但尽管如此，生物医学研究中也使用了相当数量的猪。仅在欧盟，2015-2017年每年约有75，000头猪用于科学目的。这个数字包括农场猪和微型猪。人们越来越注重通过培训来改善这些动物的生活，作为遵守3R的一项措施。养猪和微型猪确实可以训练11，12，但他们的起点在社会化方面有所不同。 微型猪在幼年时期被饲养用于研究和社交。他们长大后脾气平静。养殖猪是供消费的，而且往往根本不是社会化的。在丹麦，用于肉类生产的终结猪通常被安置在15-25头高密度的猪群中，在那里它们必须竞争才能在猪群的等级中占据一席之地。他们的脾气反映了这种能力。通常，他们被安置在稳定的设施中，部分预定的地板，以限制泥泞的工作量。为了优化体重增加，他们通过自动食物和送水系统喂养脂肪。因此，他们与农场工人的接触是有限的，他们处理后会感到压力很大。当动物被转移到研究设施时，这会带来一些挑战。在这里，动物福利、畜牧业和3R发挥着关键作用。从研究的角度来看，每种动物都很重要，以获得最好的研究成果。动物的福利对于确保动物间在压力、焦虑和恐惧方面的低变化也很重要。出于这些原因，必须注意从"畜群动物"到"个体"的过渡。抵达后，猪进入一个新的环境，有新的气味，新的食物，日常接触动物看护者，往往也新的笔伴侣。对猪来说，这种转变可能非常紧张，几天的适应期的重要性在实验室动物科学15中得到承认。
通过构建适应期，我们使用结构化的分步检查表创建了我们称之为"过渡阶段"的阶段。检查表确保每头猪都得到足够的看门人联系，并学会在不加压力的情况下进行检查和采集样品的基本处理。然后，可以继续工作，通过针对每个具体研究项目16、17的积极强化训练来训练猪。当执行所需的操作时，点击器用于表示食物奖励。将过渡阶段的步骤与猪的额外点击训练相结合，使动物在研究设施中顺利安顿下来。他们变得平静和容易处理，可以，用很少的努力，可以教站着不动，例如血液样本收集。通过使用这种类型的处理协议，取代了老式技术，如动物的沉着或圈套。为了确保所有猪都得到足够的处理，一个清单被填写出来。
人们普遍认为，动物确实会感到积极的情绪，因此在与动物合作时，重点不应仅仅放在消除消极情绪上。与看门人的培训课程是积极情感体验的一个例子。这是相当愉快的猪，因为它收到治疗和关注。除了减少处理压力和恐惧相关行为在设施的好处，培训动物提供了一个机会，给动物积极的情感体验。增加积极的经验，可以抵消一些负面的经验，实验室动物遇到的实验进行，从而将进一步增加动物福利19，20。
虽然猪显然喜欢训练课程，但训练课同时为看门人提供了一个机会，以加强与每头猪的纽带。作为一名动物看护者，进行痛苦的动作，如注射动物，是工作的一部分。然而，能够训练动物，并将这些行动转化为积极的经验本身就是有益的。它增加了护理人员的承诺，并在加强该署的护理文化方面扮演重要角色。
这些猪是根据该研究所的动物福利政策饲养的，该政策指的是关于动物实验、住房和畜牧业的国家立法。该协议适用于任何年龄的断奶猪。在发展过渡清单（图1）时，共使用了40头雌性杂交农场猪（丹麦兰德拉斯-约克郡-杜洛克），重达35-80公斤（表1）。猪被分配到一组取决于他们到达的时间。2020年1月至9月期间，这些猪被安置在研究稳定设施中。所有养殖场的猪都是在传统的母猪养殖场饲养的，体重约15公斤时转移到合作养殖场。在纳入生存研究前至少两周，这些猪被运送到大学的研究稳定设施。在头两周，从农场猪到研究动物的过渡发生了。该协议由无害和积极的行动组成，因此可以立即启动，作为适应期的一部分。
这些猪被一个接一个地安置在3.4-6.8米2的实心混凝土地板上，通过自动供水获得水。每头猪都有一个喂食槽，与相邻笔分离的至少一部分允许鼻子接触。当猪被安排接受手术干预或植入设备时，它们被单独安置，以避免笔友舔和咬伤口，并拔出植入物。床上用品是稻草，动物进一步丰富干草和不同的活动玩具，例如绳子，球，桶，咀嚼棒塑料制成（图2）。
这些动物来自国家农场猪健康监测计划中的一群动物，这意味着它们被筛选出7种病原体24种，这些病原体在生产环境中会影响猪。根据FELASA的建议，对研究群进行半年一次的随机检查，以及猪的样本，由于意外的研究结果而需要诊断。这个项目使用的一些猪对猪的生殖和呼吸系统综合症有血清反应：然而，没有一头猪表现出任何与感染相对应的临床症状。所有使用聚合酶链反应进行评估的样本均为阴性，证明猪处于健康状态。
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Protocol
用于验证协议的猪是动物实验委员会批准的研究的一部分，该理事会是评估和批准丹麦所有动物实验的国家政府机构。理事会进行类似于国际民航联的道德审查。
1. 抵达研究设施
- 首先，在指定区域清洗猪，以便进行彻底的目视检查。使用排除名单排除有伤口、耳咬、脓肿、跛脚等的猪，因此只有临床上健康的动物才被允许进入设施。
- 洗完后，根据颜色标记将猪分成两组。颜色标记指示哪些猪是供应商的笔友。这一点很重要，因为猪在被介绍给新的笔友时，会努力建立等级制度。让他们和已经熟悉的猪一起分类， 大大限制了这场战斗。
- 让猪在抵达当天的其余时间不受干扰（下午喂食除外），因为运输后它们可能会感到很大的压力。
2. 第一部分：过渡阶段（估计时间4-6天）
注：在过渡阶段的活动期间，猪留在家中。我们每次治疗时都用半个苹果。每头猪的进展在过渡阶段进展清单（图1和补充文件1）中得分。
- 在抵达后连续两天，介绍治疗。
- 一次把几个（半个苹果总数）扔进笔里，每天两次，让猪自己寻找食物，静静地站在笔外。除了熟悉食物外，目标是让动物将治疗与看门人的存在积极联系起来。
- 第三天和连续几天，介绍熟悉猪与"由看门人处理"。喂食时输入笔。
- 在猪吃饭时，坐在它手臂的长度（图3）。冷静地向猪伸出一只手来触摸它的背部。触摸应超过两秒钟才能算成功。如果猪背离食物，慢慢地把手取走。
- 等到动物开始进食，再执行动作。如果动物再次背离食物，停止尝试触摸它，但留在笔下的低谷旁边（2-3分钟的会议）。
- 当猪在进食时接受背部接触时，继续办理手续。现在，将手向头部和尾部的两个方向移动。
- 如果猪接受，摸摸头部和耳朵。如果在任何时候，猪背离一个动作停止行动，但留在笔的剩余时间（2-3分钟共为会话）。耳朵很重要，因为它能够从耳内静脉导管中取血。
- 慢慢上升，能够触摸到尾部区域，这是第二重要的区域。站立和移动对猪更可怕， 这就是为什么这一步是独立得分的原因。当猪接受触摸区域和操纵尾巴时，可以采取直肠温度来支持大多数研究协议。
- 进一步加强看门人和动物之间的纽带，在两会期间进入笔除了喂养时间。在两节课（每次2-3分钟）期间提供猪食（一次一片），同时坐在笔内的角落里。起初，从伸出的手臂给治疗，但逐渐减少距离，所以猪需要走近，以获得它的奖励。
- 过渡阶段的最后阶段是能够触摸猪在身体的特定区域，并只使用少量的治疗这样做。进入笔，而第二个看门人站在笔外，并提供一两个治疗猪。奖励猪是冷静和允许触摸描述，同时能够保持所有四只蹄在地上（不跳上笔的围栏）。
3. 第二部分：开始点击培训
注：在过渡阶段之后，动物们准备开始点击器训练。建议在指定区域进行培训，因为它有助于猪识别训练课程即将开始。一天中的几个短会话比一个较长的会话好。
- 一次带一头猪走出家门，进入指定的训练区。如果所用区域对猪来说是新颖的，则第一期应不进行训练，并在每头猪约 5-7 分钟的探索中严格探索几种食物。
- 引入点击器坐着或站在猪无法企及的治疗。当猪表现出兴趣时，点击，并立即给予款待。在猪保持兴趣的同时，快速连续这样做。如果猪失去兴趣，暂停点击和治疗，直到猪再次接触。此会话应不超过 10 分钟。
- 猪会很快理解点击，但重要的是要使点击和治疗之间的关联非常强烈。连续重复步骤几个会话，使点击和治疗之间的关联强烈。测试猪是否通过单击一次来将点击与治疗关联起来，而不是通过治疗和密切监控猪的行为来跟踪此。如果猪环顾四周急切地期待治疗，训练就完成了，如果不进行一些额外的训练。
- 一旦猪知道点击，请介绍目标棒。目标棒是一端有标记区域的棍子。将目标端保持在鼻子的高度。在某个时候，猪会出于好奇而碰它。单击猪触摸目标并给予款待的第二秒。
- 立即再次呈现目标，如果再次触摸，请单击并给予治疗。继续目标训练，直到猪明白，它将因触摸目标而得到奖励。将目标逐渐移离，以便猪必须进一步移动才能到达目标。
- 当猪在移动时跟随目标时，通过将物体放入训练区域来增加额外的挑战，因此猪必须更加努力地专注于目标棒任务，以获得奖励。
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Representative Results
应用协议第一部分所述的过渡阶段，可以顺利地将农场猪引入研究设施。让平静的猪轻松地工作，可以轻松地做日常琐事，并且能够在没有麻醉或固定的情况下进行小手术和取样。
为了跟踪猪在过渡阶段的进展，开发了一个清单（清单1），以标记当个别猪在过渡过程中达到定义的步骤。猪计划在抵达后两周内进入研究项目，总天数是选择的指标，以显示过渡的成功。
根据清单1，对20头猪的过渡阶段进行了跟踪，以验证是否有可能在两周内将猪从养殖猪转为研究猪（图4）。所有猪在12天内完成清单，表明设定的时间框架已经足够了。
根据第一次体验修改了清单 1。一个新的严格的清单（清单2）被开发出来。为了进一步改进和规范过渡，主要修订是增加每日会议次数，并限制每届会议所花的时间。比较两个清单显示，使用清单2进行过渡的猪在过渡的最初几天有类似的进展，而后一步的步骤更快。图5中可以看到清单1和清单2的使用之间的比较。
过渡阶段结束后，动物将允许采取基本的结果措施，如测量温度和检查手术伤口。当猪（雌性）被过渡，允许触摸尾部区域时，尿液样本可以使用放在外部生殖器周围但肛门下的造血袋收集（图6）。
可以收集的数据结果的另一个例子是血液样本。在我们的设施，我们经常在手术过程中在耳静脉中放置静脉导管。康复后，导管可用于药物管理，以减少肌肉注射次数，采集多个血液样本支持项目，并评估猪恢复正常生理（图7）。
从过渡阶段开始，点击器培训将在过渡阶段的基础上进行，以便在处理过程中获得更多好处并获取结果数据。训练猪跟随目标棒将允许看门人将猪，例如移动到秤上，以监测体重（图8）或运输箱（图9），如果猪需要运送到手术或成像设施。在一个项目中，猪被训练在用药时静止不动（图10）。
当开始点击训练时，很明显，每头猪都是独一无二的，它们对训练的反应也不同。在培训期间，这一点得到承认，培训课程也相应地得到安排。有些猪需要两到三倍的培训课程来学习相同的任务，如果某些任务需要在特定时间点学习以支持研究项目，这可能会有问题。
| 动物数据 | 清单 1 （n=20） | 更新的清单 （n=20） |
| 物种 | 国产猪（苏斯·斯克鲁法家猪） | 国产猪（苏斯·斯克鲁法家猪） |
| 品种 | （丹麦兰德拉斯 x 约克郡） x 杜洛克 | （丹麦兰德拉斯 x 约克郡） x 杜洛克 |
| 性 | 女性 | 女性 |
| 重量 | 35-80公斤（平均47，5公斤） | 40-80公斤（平均62，5公斤） |
| 年龄 | 10-22 周 | 10-22 周 |
表1：用于评估清单的猪的基本特征。
图1：过渡阶段清单。如前所述，其中一些活动发生在同一天，但时间间隔不同。步骤 3-5 发生在喂食期间，而步骤 1-2 和 6-7 发生在白天的固定时间点。请注意，每次会话必须在清单顶部指示的时间内执行，但每头猪只需大约 2 分钟。阴影框表示任务不执行。完整的清单可在补充文件 1 中找到。请单击此处查看此图的较大版本。
图2：该部门使用的一些丰富内容请点击这里查看此图的较大版本。
图3：在协议第2.2和第2.3步中说明看门人的位置。请单击此处查看此图的较大版本。
图4：使用清单1的过渡阶段的时间线。请单击此处查看此图的较大版本。
图5： 过渡阶段的进展。使用清单 1 
（） 与清单 2 （+） 相比显示过渡阶段进展的散射图。每个地块对应于一头猪的观察。误差栏表示平均值和 SD。y 轴是天数。在 x 轴上，步骤如下： 1：苹果从手。2;喂食时触摸猪。3;喂食时触摸后部和尾部。4;一边给治疗，一边摸后背和后尾。 请单击此处查看此图的较大版本。
图6：在喂食过程中，通过放在外生殖器周围的造血袋采集尿液样本。猪在手术过程中保持镇定，没有注意到造骨袋。请单击此处查看此图的较大版本。
图7：过渡期后进食期间静脉注射。看门人能够坐在动物附近，专注于正确注入药物。请单击此处查看此图的较大版本。
图8：使用目标棒踩踏秤。由于积极的强化训练，猪渴望跟随目标棒。请单击此处查看此图的较大版本。
图9：跟随目标粘入运输箱。如果猪需要被运送到成像设施，此程序是有用的。请单击此处查看此图的较大版本。
图10：猪训练把头放在支架上，站着不动，这样药物就可以在眼睛里不服用安息剂。服药后，猪把头靠在支架上，进行目视检查。请单击此处查看此图的较大版本。
补充文件1。请点击这里下载此文件。完整的过渡阶段进度清单即时打印。请注意，到达日期字段的更改会影响表中的日期。
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Discussion
实施包含第一部分、过渡阶段检查表和第二部分的协议，连续单击器培训计划已确认成功。详细清单的介绍和使用为研究设施中猪的引进提供了一种改进方法。结构化过渡阶段还为在纳入研究项目之前培训猪打下了更好的基础。注意到看护人对工作的承诺增加，猪的积极情绪反映在它们的日常行为中，这实在令人吃惊。
新猪的到来和研究猪的平稳过渡长期以来一直是一个重点领域，但变化一直难以引入。为了概述工作和收益，决定使用清单来监测优先步骤的有效性。在清单1中，步骤基于预期对过渡影响最大的行动。使用清单1对20头猪的过渡情况进行了评分和评估。然后调整列表以消除遇到的问题。这些大多与误解和不一致的报告有关。关键的一步是解释每一步骤以及所涉及的步骤的哪些行动。因此，对每一步的描述进行了详细阐述，并将清单修改为更直观。在触摸猪时，删除了一个步骤，以简化成功与失败的区别。要明确步骤是否执行，以指示是否执行了步骤 
（） 除了一个框，说明猪是否执行了操作 （+） 或拒绝执行操作（÷）。为了支持修改，分配了额外的时间来训练使用清单2。这次讨论分组进行，目的是讨论每一步，并商定成功标准。在实际执行方面，提出了一些重要问题。例如，当猪习惯于看护人和治疗时，它们可能非常具有侵入性，可能令人生畏，甚至对看护人造成危险。作为最后一次修改，每次猪的会话次数增加了，而每次会话所花费的时间则减少了。
为了评估清单2，包括了20头猪。由于兽医和看门人之间的沟通不畅，三头猪缺少第4步的数据，并强调了沟通的必要性。据估计，每天使用的时间是相同的，但猪在更少的几天内完成过渡阶段。定义了白天需要执行步骤的某些时间段，这需要更改某些日常程序。结合准备和执行步骤所需的总时间，这是实施中最大的限制。清单中每个步骤包含 7 个步骤，但由于列表的修改，图 3 中的比较减少到 4 个可比较步骤。在过渡阶段实施彻底的结构可提高认识，并将改进举措作为繁忙的研究设施的优先事项。
实施结构化检查表使评估单个猪之间的变化。有趣的是，对于一些猪来说，与看门人完成与触摸相关的步骤相比，他们理解治疗的天数通常更高。另一个有趣的观察是，被触摸的意愿发生了相当突然的变化。一次，猪会立刻后退，在下一个会话中，仅仅几个小时后，猪将允许长时间接触（一次超过一分钟）。
为了进一步为研究项目准备猪，在过渡阶段之后开始进行积极的强化训练。建议使用单击器培训计划。它允许几个值班的看护者参加动物的训练。使用点击器可以缓解看门人之间的转换，因为奖励信号保持不变。当点击器培训开始时，很明显，每头猪都是独一无二的，对训练的反应也不同。然而，在几节课中，所有的动物都渴望参加训练课程，并充分享受与看门人共度时光。单击器培训猪使有关研究项目的具体任务能够不使用武力执行。它还减少了某些项目（例如步态分析）中看到的动物间变化。在日常琐事中，例如猪在研究设施内移动或称重时，它也会有很大的帮助。点击器培训的一个关键步骤是引入点击器时，猪和看门人之间的信任程度。猪需要信任看门人，因为它需要接近，但仍然专注于任务，而不是看门人。另一个关键步骤是选择治疗。动物必须把它看作是一种奖励。偶尔我们会遇到一头不觉得苹果好吃的猪，然后我们把苹果换成一块枣子或修剪一下。考虑与大猪一起工作的风险很重要，尤其是当他们在训练环境中兴奋时。他们有一个强大的咬，他们可以跳起来，试图在意想不到的时间点达到治疗。为了应对这些危险，请考虑使用目标棒将注意力从培训师身上移开，让治疗明显遥不可及，在短时间内工作，并且不要用完治疗。
与猪的集中过渡和培训工作带来了更多的热情，从看门人的工作人员。积极强化培训领域的教育一直是优先事项，并导致看护者对研究项目有更强烈的承诺。看护人与研究人员和兽医工作人员对话，参与新项目的动手规划，使看护者能够就培训如何支持研究成果 和 动物福利提出合格的建议。从每头猪收集更多的数据而不造成伤害是3R的基石之一。每周一次的会议侧重于过渡和培训，增加了对每头猪的关注，并加强了该部门的护理文化。看到猪，当他们即将开始训练课本身就是有益的，行为比表明猪喜欢的课程。在为特定项目规划生猪培训时，请记住，当猪熟悉训练程序时，它们会进入兴奋状态。抵消这种情况的想法包括：如果可能，不要在收集样品的地方进行培训。所以，如果你打算在家里做血液样本笔，尝试做其他地方的训练。猪会知道他们的日常生活，所以计划采取样品的时间点，训练通常不执行，如果可能的话。当培训必须是收集样本的地方时，让猪在开始培训或数据收集协议之前，每次探索区域一定分钟数。
将结构置于我们的过渡阶段是一项总体积极的举措。抵达后不久，猪的压力就减轻了，并且迅速过渡到拥有享受看护人陪伴而不是对笔的伤害的猪。我们经历了员工的转机，从他们只看到额外工作的角度，到他们看到使用清单转换猪的好处。该协议具有巨大的应用潜力，可以作为一个重要的工具应用于几乎每一个涉及研究猪的设置。我们现在用它来过渡农场猪和小猪，并致力于在心血管科学、神经科学和眼科等项目中进一步实施点击器培训。该部门的总体态度和护理文化已经提出，有一个愿望和渴望推动这些新经验进一步合并研究和动物福利不断和应用3R。
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Disclosures
作者没有披露。
Acknowledgments
比阿特丽斯·切宁·奥勒森、卡罗琳·雅各布森、蒂恩·比约恩霍尔特·古斯塔夫森、海伦娜·塞琳·克耶尔·拜里尔和基拉·索尼森·格拉赫德在设计清单和在日常工作中使用清单方面所作出的巨大努力、反馈和协助，都得到了认可。医学插画家肯·克拉格斯费尔特因其专业帮助说明图3而得到认可。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Wrap, e-power, blå, 7,5cm | E-vet A/S, Ole Rømers Vej 26 A, DK-6100 Haderslev | 203165B | Adhesive wrap used to wrap around the end of a stick to make a target stick. It is an advantage that it can be changed as it will get dirty quite quickly. |
| Apples | Varius | Uknown | Used as treats |
| Klikker (Clicker) | E-vet A/S, Ole Rømers Vej 26 A, DK-6100 Haderslev | TX2289 | Clicker used in training |
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