Summary
الحرمان من النوم هو أداة قوية للتحقيق في وظيفة النوم والتنظيم. نحن نصف بروتوكول النوم يحرم دروسوفيلا باستخدام جهاز إبطال النوم ، وتحديد مدى انتعاش النوم الناجم عن الحرمان.
Abstract
التوازن النوم، والزيادة في النوم لوحظ بعد فقدان النوم، هي واحدة من المعايير المحددة المستخدمة لتحديد النوم في جميع أنحاء المملكة الحيوانية. ونتيجة لذلك، فإن الحرمان من النوم وتقييد النوم هما أداتان قويتان تستخدمان عادة لتوفير نظرة ثاقبة على وظيفة النوم. ومع ذلك، فإن تجارب الحرمان من النوم إشكالية بطبيعتها من حيث أن حافز الحرمان نفسه قد يكون السبب في التغيرات الملحوظة في علم وظائف الأعضاء والسلوك. وبناء على ذلك، ينبغي أن تبقي تقنيات الحرمان من النوم الناجحة الحيوانات مستيقظة، ومن الناحية المثالية، تؤدي إلى انتعاش قوي في النوم دون أن تؤدي أيضا إلى عدد كبير من العواقب غير المقصودة. هنا، ونحن نصف تقنية الحرمان من النوم لDrosophila الميلانوغاستر. جهاز إبطال النوم (SNAP) يدير حافزا كل 10s للحث على geotaxis السلبية. على الرغم من أن التحفيز يمكن التنبؤ به ، إلا أن SNAP يمنع بشكل فعال >95٪ من النوم الليلي حتى في الذباب مع محرك الأقراص عالي النوم. والأهم من ذلك أن الاستجابة اللاحقة للنواس الساكنة تشبه إلى حد كبير الاستجابة التي تحققت باستخدام الحرمان اليدوي. يمكن تعديل توقيت المحفزات والمباعدة بينها لتقليل فقدان النوم وبالتالي فحص الآثار غير المحددة للتحفيز على علم وظائف الأعضاء والسلوك. يمكن أيضا استخدام SNAP للحد من النوم وتقييم عتبات الإثارة. وSNAP هو تقنية قوية اضطراب النوم التي يمكن استخدامها لفهم أفضل وظيفة النوم.
Introduction
النوم هو شبه عالمي في الحيوانات، ومع ذلك وظيفتها لا تزال غير واضحة. التوازن النومي، الزيادة التعويضية في النوم بعد الحرمان من النوم، هو خاصية مميزة للنوم، التي تم استخدامها لتوصيف حالات النوم في عدد منالحيوانات 1،2،3،4،5.
النوم في ذبابة لديه العديد من أوجه التشابه مع النوم البشري، بما في ذلك استجابة قوية homeostatic لفقدان النوم4،5. وقد استخدمت العديد من الدراسات للنوم في ذبابة الحرمان من النوم على حد سواء لاستنتاج وظيفة النوم من خلال دراسة العواقب السلبية التي تتراكم من الاستيقاظ الموسعة، وفهم تنظيم النوم من خلال تحديد الآليات العصبية البيولوجية التي تتحكم في تنظيم الهوستاتيكي للنوم. وهكذا تبين الذباب المحروم من النوم لإظهار العاهات في التعلم والذاكرة6، 7،8،9،10،11،12، اللدونة الهيكلية13،14،15، الاهتمام البصري16، الشفاء من إصابة الخلايا العصبية17،18، التزاوج والسلوكيات العدوانية19، 20, انتشار الخلايا21, والاستجابات للإجهاد التأكسدي22,23 على سبيل المثال لا الحصر. وعلاوة على ذلك، أسفرت التحقيقات في آليات البيولوجيا العصبية السيطرة على النوم انتعاش رؤى حرجة في الآلات العصبية التي تشكل homeostat النوم8،9،23،24،25،26،27،28،29 . وأخيرا، بالإضافة إلى الكشف عن رؤى أساسية في وظيفة النوم في الحيوانات السليمة، وقد أبلغت دراسات الحرمان من النوم أيضا رؤى في وظيفة النوم في الدول المريضة30،31.
في حين أن الحرمان من النوم هو بلا شك أداة قوية ، مع أي تجربة الحرمان من النوم ، من المهم التمييز بين الأنماط الظاهرية التي تنتج عن الاستيقاظ الممتد ، من تلك الناجمة عن التحفيز المستخدم للحفاظ على الحيوان مستيقظا. الحرمان من النوم عن طريق الحرمان من اليد أو التعامل اللطيف ، ويعتبر عموما وضع معيار للحرمان من النوم التخريبية الحد الأدنى. هنا نصف بروتوكولا ل الذباب المحروم من النوم باستخدام جهاز إبطال النوم (SNAP). وSNAP هو الجهاز الذي يسلم التحفيز الميكانيكية للذباب كل 10s، والحفاظ على الذباب مستيقظا عن طريق تحفيز geotaxis السلبية (الشكل 1). وSNAP يحرم بكفاءة الذباب من >98٪ من النوم ليلا، حتى في الذباب مع ارتفاع محرك النوم8،32. وقد تم معايرة SNAP على الذباب الحساس الانفجار، والتحريض من الذباب في SNAP لا يضر الذباب. الحرمان من النوم مع SNAP يحفز انتعاش مماثلة لتلك التي تم الحصول عليها عن طريق الحرمان من اليد7. وبالتالي فإن SNAP هو طريقة قوية للنوم يحرم الذباب أثناء التحكم في آثار التحفيز المثير.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. إعداد تجريبي
- جمع الذباب لأنها eclose في قوارير، وفصل الذباب الذكور والإناث.
ملاحظة: تجرى تجارب النوم عادة مع الذباب الأنثوي. من المهم جمع الإناث العذراء. ستضع الإناث المتزاوجات البيض الذي يفقس في يرقات مما يعقد تحليل البيانات. - ذباب البيت من جنس واحد في مجموعات من 20 <.
ملاحظة: الإسكان الذباب في بيئة المخصب اجتماعيا (مجموعات من >50) يعدل محرك النوم6،13 القياسات التي يحتمل أن تكون محيرة من النوم انتعاش. وعلاوة على ذلك، بعد الإثراء الاجتماعي، سوف ينخفض النوم على مدى بضعة أيام6. وبالتالي ، فإن النوم الأساسي ليس مستقرا مما يعقد تحليل النوم المرتد. حفظ الذباب في مجموعات من <20 يتجنب هذا الخلط المحتمل. - حافظ على الذباب في قوارير لمدة 3-5 أيام في بيئة خفيفة ورطوبة يتم التحكم فيها.
ملاحظة: العمر والنضج الذباب تؤثر بقوة النوم. النوم مرتفع في الذباب القديم في يوم واحد ويستقر من قبل 3-5 أيام من سن4. وعادة ما يتم الحفاظ على الذباب على ضوء 12 ساعة: 12 ساعة جدول زمني مظلم في الرطوبة 50٪.
2. إعداد أنابيب لتسجيل النوم
ملاحظة: يتم مراقبة السكون باستخدام أجهزة مراقبة النشاط الحركي. يمكن أن تحمل الشاشة 32 ذبابة موجودة بشكل فردي في أنابيب قطرها 5 مم. عادة، يتم تحليل الأنماط الجينية في مجموعات من 16 أو 32 ذبابة.
- إعداد عدد مناسب من الأنابيب مع ذبابة الغذاء في نهاية واحدة.
ملاحظة: النظام الغذائي والتمثيل الغذائي معروفة للتأثير على النوم33،34، وبالتالي فمن المهم بشكل خاص لوضع الذباب على نفس الطعام الذي تربى عليه. - ختم نهاية الأنابيب بالشمع.
ملاحظة: الحرمان من النوم وانتعاش هو تجربة لمدة خمسة أيام، والغذاء يمكن أن تجف إذا لم تكن مختومة بشكل صحيح. في الأنابيب المغلقة بشكل صحيح ، يمكن الحفاظ على الطعام لمدة 10 أيام أو أكثر. وبالتالي، فمن الأهمية بمكان لضمان أن يتم إغلاق نهايات الأنابيب بشكل جيد. الذباب يمكن أيضا أن تتعثر إلى الطعام الرطب، ومع ذلك. وهكذا، فإنه يساعد على جعل أنابيب 1-2 أيام قبل بدء التجربة. - وضع الاستيقاظ بشكل فردي ، والذباب يتصرف في أنابيب زجاجية طويلة 65 ملم لتسجيل النوم باستخدام الطامح وسد نهاية الأنابيب مع سدادة رغوة.
ملاحظة: الذباب لا يتعرض أبدالتخدير ثاني أكسيد الكربون عند وضع الذباب في أنابيب لتسجيل النوم. يرصد الطامح من أنابيب المطاط مع نهاية واحدة مغطاة بفرش الجبن وإدراجها في تلميح ماصة 1 مل.
3. تسجيل النوم
- تحميل الذباب في أنابيب في أجهزة مراقبة النشاط لمراقبة النوم.
ملاحظة: تراقب صخور SNAP ذهابا وإيابا من -60 درجة إلى +60 درجة كل ~10 ق. وتقام الشاشات في -60 درجة ل~ 5.9s ; يستغرق ~ 2.9 ق لعلبة عقد الشاشات للانتقال من -60 درجة إلى +60 درجة و ~ 1 ق للانتقال مرة أخرى من +60° إلى -60 درجة. يمكن تغيير طول الدورة حسب الحاجة عن طريق ضبط الجهد الذي تم توفيره للمحرك.- احرص على وضع الأنابيب في شاشات النشاط في الاتجاه الصحيح. في الاتجاه الصحيح ، تكون نهاية الأنبوب مع الطعام في الجزء العلوي من SNAP لضمان عدم دفع الذباب إلى الطعام. بالإضافة إلى ذلك ، فإن النهاية مع الطعام على جانب الشاشة مع مقبس تسجيل النوم. وهذا يسمح لشاشات النشاط أن تكون موجهة بشكل صحيح في SNAP للحرمان من النوم كفاءة مع رصد النشاط في وقت واحد.
- ضع شاشات النشاط في غرفة التسجيل لمراقبة النوم.
- مراقبة النوم لمدة يومين كاملين على الأقل لتقدير النوم الأساسي.
ملاحظة: عادة ما يتم استبعاد الذباب النهاري في شاشات النشاط كيوم للتكيف للسماح للذباب بالتكيف مع كونه موجودا في أنابيب. يتم تسجيل النوم الأساسي لمدة يومين كاملين على الأقل (48 ساعة) بدءا من الصباح التالي ليوم تحميل الذباب. - حفظ عدد النشاط الحركي للذباب في صناديق دقيقة واحدة من وقت الأضواء في يوم معين إلى الأضواء في اليوم السابق باستخدام برنامج تسجيل النشاط (على سبيل المثال ، من 8 صباحا إلى 8 صباحا).
- تقدير النوم من بيانات النشاط الحركي مع وحدات الماكرو المخصصة باستخدام 5 دقائق من الخمول كعتتبة لنوبة من النوم35.
ملاحظة: يتم حساب عدد من مقاييس السكون من عدد الأنشطة الحركية. وتشمل هذه النوم في دقيقة / ساعة أكثر من 24 ساعة، مجموع وقت النوم في 24 ساعة، متوسط والحد الأقصى نهارا وليلة النوم أطوالنوبة 36.
4. الحرمان من النوم والتعافي
- وبما أن الذباب يمكن أن يحرم من النوم لفترات زمنية متغيرة (على سبيل المثال، 12 ساعة و24 ساعة و36 ساعة) ويمكن أيضا تقييم نوم التعافي على فترات مختلفة (على سبيل المثال، 6 ح و12 ساعة و24 ساعة و48 ساعة)، حدد مدة التعافي حسب الحاجة التجريبية. يمكن تصور تعافي النوم باستخدام مؤامرة كسب/فقدان النوم أو عن طريق فحص نسبة النوم المستردة على مدى فترة زمنية محددة مسبقا (على سبيل المثال، 6 ح).
- إذا كان النوم مستقرا خلال اليومين الأساسيين، في اليوم الثالث، ضع مراقبي النشاط في SNAP للحرمان من النوم بين عشية وضحاها.
ملاحظة: الذباب سوف تظهر انتعاش النوم قوية على مدى مجموعة من النوم مرات8،32،37،38، ولكن النوم يجب أن تكون مستقرة لتقييم موثوق النوم انتعاش. النوم مستقر عندما يكون الفرق في النوم بين أيام خط الأساس ± 100 دقيقة. - تأكد من تأمين شاشات النشاط في مكانها مع دبابيس حامل الشاشة، وأسلاك الشاشة موصولة، والشاشات الموجهة بشكل صحيح مع نهاية مع الغذاء في الجزء الخلفي، والحواجز البلاستيكية في الجبهة(الشكل 1).
ملاحظة: تم تصميم SNAP بحيث تدور الكاميرا مرة واحدة كل 10 s (الشكل 1). إدراج البلاستيك يعيد الأنابيب عن طريق دفع الأنابيب مرة أخرى عندما يكون الجهاز في موقف "حتى". إعادة ضبط الأنابيب مهم لضمان أن جميع الأنابيب لديها مجموعة كاملة من الحركة في بداية كل دورة. - افصل شاشات النشاط، واخرج الشاشات من SNAP فور تشغيل الأضواء بعد الحرمان من النوم بين عشية وضحاها.
ملاحظة: من الأهمية بمكان إنهاء الحرمان من النوم، ووضع الذباب في الانتعاش مباشرة عند الأضواء بعد 12 ساعة من الحرمان من النوم بين عشية وضحاها. حتى تأخير 20-30 دقيقة في وضع الذباب في الانتعاش يمكن أن تتداخل مع مدى انتعاش النوم. - ضع الذباب في غرفة تسجيل حيث سيتم دون إزعاج لمدة يومين (48 ساعة) لمراقبة النوم الانتعاش.
ملاحظة: إذا كانت غرفة التسجيل تستخدم لإجراء تجارب أخرى، يجب توخي المزيد من الحذر لتجنب تحفيز الذباب المتعافي. - حساب مقدار النوم المفقود. لكل ذبابة على حدة، حساب الفرق بالساعة بين النوم التي تم الحصول عليها أثناء الحرمان من النوم والساعة المقابلة خلال خط الأساس. مجموع الاختلافات في الساعة لحساب مجموع النوم المفقودة.
- حساب مقدار النوم المسترد. لكل ذبابة فردية، احسب الفرق بالساعة بين النوم الذي يتم الحصول عليه أثناء التعافي والساعة المقابلة أثناء خط الأساس؛ مجموع الاختلافات في الساعة لحساب مجموع النوم المكتسبة.
ملاحظة: ما إذا كان ذبابة هو في الواقع النوم المحرومين هو تجريبي. وبالتالي، يجب على المجرب فحص نسبة النوم المفقودة. إذا لم تفقد الذبابة كمية كافية من النوم ، فيمكن استبعادها من التحليل. على الرغم من أن هذا قد يكون مطلوبا لنهج الحرمان من النوم الأخرى، إلا أنه نادرا ما يكون مطلوبا من أي وقت مضى ل SNAP. أكثر شيوعا، قد لا يكون النوم مستقرا في ذبابة معينة قبل بدء الحرمان من النوم. إذا كان النوم غير مستقر، لا يمكن حساب التوازن. نحن نقبل فرقا أقصاه ± 100 دقيقة من النوم محسوبة قبل بدء الحرمان من النوم كمرشحين للإدماج. في بعض الأحيان ، يتم توزيع نوم الذبابة الفردية بشكل غير متساو عبر يوم 24 ساعة (على سبيل المثال ، قد يحصل بعض الأفراد على 60-70٪ من حصة نومهم خلال النهار وبالتالي يفقدون نسبة صغيرة فقط من حصتهم من النوم البالغة 24 ساعة عند حرمانهم لمدة 12 ساعة في الليل). يمكن تقييم هذه الذبابات بشكل منفصل. - حساب متوسط نسبة النوم المسترد (بالنسبة لخط الأساس) على مدى 12 ساعة و 24 ساعة و 48 ساعة من فترة التعافي لكل نمط جيني.
- من بيانات النوم، احسب متوسط وأقصى طول نوبة نوم نهارية على خط الأساس، وأيام التعافي لكل نمط جيني.
ملاحظة: يتميز النوم المرتد في الذباب بزيادة كمية النوم وزيادة عمق النوم في أيام التعافي. يستخدم دمج النوم كمقياس لعمق النوم. ويمكن أيضا أن تستخدم عتبات الإثارة كمقياس لعمق النوم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
كانتون S (CS) كان يستخدم سلسلالات من النوع البري. تم الحفاظ على الذباب على ضوء 12 ساعة: 12 ساعة جدول زمني مظلم، والنوم المحرومين لمدة 12 ساعة بين عشية وضحاها. التفتيش على ملامح النوم من الذباب CS في يوم خط الأساس (بس), يوم الحرمان من النوم (SD), ويومين الانتعاش (rec1 و rec2) (الشكل 2A) يشير إلى أن الذباب كان فعليا النوم المحرومين في SNAP, واستعاد النوم خلال النهار بما يتفق مع التقارير التي لوحظت في الأدب4,5. كما ينظر إلى فعالية SNAP في الحفاظ على الذباب مستيقظا في النشاط العالي (300-350 التهم / ساعة) التي تظهرها الذباب أثناء الحرمان من النوم (الشكل 2B). والواقع أن رصد عدد أنشطة الذباب أثناء الحرمان من النوم يمكن أن يكون مقياسا مفيدا لفعالية بروتوكول الحرمان و/أو مقياسا غير مباشر لمحرك النوم. عندما يكون الحرمان من النوم غير فعال ، لا يكون الذباب نشطا أثناء فترة الحرمان. الذباب التي هي تحت ارتفاع محرك النوم تغفو بسرعة بعد كل حافز ولا تعبر الأنبوب بقدر35. كل من زاوية إمالة الجهاز ، وسرعة الإسقاط حاسمة لضمان الحفاظ على الذباب مستيقظا بشكل فعال دون إلحاق الضرر بهم. يمكن لكل مختبر تحسين زاوية وسرعة عن طريق ضبط الربيع(الشكل 1B)و / أو حجم وشكل كام (الشكل 1C والشكل 1D، والحق).
لتقدير مدى فعالية الحرمان من النوم والشفاء، تم حساب النوم المفقود أثناء الحرمان ثم استعادته في أيام التعافي لكل ذبابة فردية(الشكل 2C). والأهم من ذلك، لم يحدث أي تغيير كبير في النوم الأساسي بين يوم الحرمان ويوم خط الأساس (انظر 0-12 ساعة في الشكل 2C)مما يشير إلى أن النوم مستقر في هذه الذباب. وهناك فرق كبير في النوم في هذه الفترة 12 ساعة (على سبيل المثال، ± 100 دقيقة) تشير إلى أن النوم لم يكن مستقرا. حرمت SNAP الذباب بشكل فعال من >98٪ من نومها الليلي. استعاد الذباب ~ 20٪ من نومه في أول 12 ساعة ولم يتعافى من نوم إضافي خلال الليل ، كما ذكر سابقا. ومع ذلك ، بدأ الذباب في استعادة النوم في اليوم التالي بحيث تعافى ~ 36 ٪ من نومهم أكثر من 48 ساعة من الانتعاش (الشكل 2D). 30 - 40٪ تعافى النوم أكثر من 48 ساعة هو نموذجي إلى حد ما للذباب البرية من نوع النوم المحرومين باستخدام SNAP.
يتميز التوازن أثناء النوم بزيادة مدة النوم وزيادة عمق النوم خلال فترة النقاهة بعد الحرمان. يستخدم دمج النوم أثناء النهار عادة كمقروء لعمق النوم. يمكن تقييم توطيد النوم كمتوسط مدة نوبة النوم على مدار اليوم بأكمله(الشكل 2E). ومع ذلك، كما تبدد ضغط النوم أثناء الانتعاش، سيتم تقليل متوسط مدة نوبة النوم مع تقدم اليوم. وبالتالي، فإنه من المفيد في كثير من الأحيان أيضا لدراسة التغييرات في الحد الأقصى لمدة نوبة النوم التي يمكن أن توفر متري أكثرحساسية (الشكل 2F).
| طريقة الحرمان من النوم | مجموع عدد الأوراق | ٪ أوراق / تقنية | تقييم استرداد متوسط |
| الاداه الاضافيه | 52 | 37.14% | 33 ± 3 |
| دوامة / اهتزاز عشوائي | 49 | 35.00% | 18 ± 3 |
| الحرمان من اليد | 9 | 6.43% | 36 ± 11 |
| SD الحرارية | 15 | 10.71% | 36 ± 12 |
| محدد | 15 | 10.71% | 29 ± 10 |
الجدول 1: دراسة استقصائية لمختلف أساليب الحرمان من النوم المستخدمة في الأدبيات. فقط 116/254 ورقة استخدمت الحرمان من النوم. عدد الأوراق التي تستخدم كل طريقة = "مجموع عدد الأوراق". جزء من الأوراق باستخدام كل طريقة = "٪ أوراق / تقنية". متوسط طول الاسترداد المقيم لكل طريقة = "تقييم استرداد متوسط". SD - الحرمان من النوم. SNAP - جهاز إبطال النوم
| طول SD | مجموع الدراسات |
| < 6 ساعة | 12 |
| 6 ساعة | 23 |
| >6 ساعة و 12 ساعة < | 17 |
| 12 ساعة | 69 |
| >12 ساعة و 24 ساعة < | 7 |
| 24 ساعة | 19 |
| > 24 ساعة | 9 |
| SD المزمن | 4 |
| أي SD | 160 |
الجدول 2 - الأرباح مدة الحرمان من النوم التي أجريت في دراسات مختلفة. SD - الحرمان من النوم
الشكل 1. النوم إبطال APparatus (SNAP). أ)وجهة نظر الجبهة للجهاز. يمكن أن تستوعب SNAP 8 أجهزة عرض نشاط في صفين; دبابيس حامل تقييد الشاشات في مكان. يمكن ضبط الساقين للمساعدة في وضع الجهاز في الاتجاه الصحيح. ب)عرض عن قرب من المحرك والربيع التي تهز الجهاز ذهابا وإيابا. المحرك يتحول كام أن يميل الجهاز مرة أخرى إلى موقف "حتى" وكمادات الربيع. الافراج عن الربيع من ضغط يستقر الجهاز مرة أخرى إلى موقف "أسفل". ج)اليسار - عرض الجانب للجهاز في موقف "أسفل". حامل دبابيس كبح الشاشات; تضمن فتحة سلك الشاشة أن يتم الاحتفاظ بأسلاك المراقبة في مكانها. منصات تساعد على تخفيف تأثير العض الجهاز إلى موقف 'أسفل'. الحق -- عرض عن قرب من الكاميرا. D)الجانب الأيسر عرض الجهاز في موقف "حتى". الحق - دوران عكس اتجاه عقارب الساعة من كام يميل الجهاز في موقف 'حتى'. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2. النتائج التجريبية. أ)مؤامرات النوم من CS الذباب لمدة أربعة أيام من التجربة: يوم خط الأساس (bs)، يوم الحرمان من النوم (SD)، ويومين من الانتعاش (rec1 و rec2). ب)متوسط النشاط الحركي عدد الذباب في يوم الحرمان من النوم. الذباب حرم من النوم من الساعة 12-24. ج)الدورة الزمنية للحرمان من النوم والتعافي. وحرم ذباب Cs من النوم من الساعات 12 إلى 24، وسمح له بالتعافي من الساعة 24-72. حرمت SNAP الذباب بشكل فعال من النوم >98٪، والتي تم استردادها جزئيا أكثر من 48 ساعة (ن = 12 ذبابة، التدابير المتكررة ANOVA للوقت، F [70,1470]= 12.97، ص < 10-15). د)النسبة المئوية للنوم تعافى أكثر من 48 ساعة. تعافى الذباب ~ 20٪ من نومهم أكثر من 12 ساعة، و ~ 36٪ من نومهم أكثر من 48 ساعة E) توطيد النوم لكل يوم من أيام التجربة كما تقاس متوسط مدة نوبة النوم خلال النهار. النوم هو أكثر الموحدة في يوم الانتعاش الأول مقارنة مع خط الأساس (ص <0.05، تي اختبار). F)توحيد النوم لكل يوم من أيام التجربة كما يقاس الحد الأقصى لمدة نوبة النوم خلال النهار. النوم هو أكثر الموحدة في يوم الانتعاش الأول مقارنة مع خط الأساس (ص <0.05، تي اختبار). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
النوم في Drosophila يتميز بشكل مستقل في عام 2000 ، من قبل مجموعتين4،5. في هذه الدراسات الرائدة، حرم الذباب من النوم عن طريق التعامل اللطيف (أي الحرمان من اليد) وأظهر أنه يظهر استجابة قوية للحرمان من النوم بين عشية وضحاها. الأهم من ذلك ، مع أي تجربة الحرمان من النوم من المهم السيطرة على الآثار المحيرة المحتملة للطريقة المستخدمة للحفاظ على الحيوان مستيقظا. وضعت دراسات الحرمان من اليد معيارا لدراسات التوازن الذبابي كوسيلة أقل تعطيلا للذباب المحروم من النوم. وSNAP يحرم بكفاءة الذباب من النوم من >98٪ من النوم ليلا، والأهم من ذلك يحفز انتعاش النوم مماثلة لتلك التي تم الحصول عليها مع الحرمان من اليد4،7.
منذ الدراسات التأسيسية التي تحدد النوم في الذباب ، تم تطوير عدد من الطرق لتقييم التوازن النومي في الذباب بطريقة عالية الإنتاجية7و9و39و40و41. قمنا بمسح ~ 250 ورقة عن النوم في الذباب ووجدنا ~ 46٪ من هذه المقالات المنشورة ذكرت باستخدام الحرمان من النوم لتقييم تنظيم النوم أو وظيفته(الجدول 1). تسبب عدد من الطرق المختلفة بشكل فعال في انتعاش النوم في الذباب. ومن المثير للاهتمام، من بين الدراسات التي قيمت انتعاش النوم، اختلفت البروتوكولات المستخدمة للحرمان من النوم وانتعاش النوم. وعلى وجه التحديد، تباينت مدة الحرمان من النوم(الجدول 2)والمدة التي تم فيها تقييم الانتعاش(الجدول 1)تباينا كبيرا، مما قد يعقد مقارنات النتائج التي تم الحصول عليها مع بروتوكولات مختلفة. ومن المعروف أن انتعاش النوم في الذباب لا يزال قائما لمدة تصل إلى 48 ساعة بعد الحرمان من النوم5. وبناء على ذلك، نعتقد أن أفضل الحصول على وصف شامل لآثار التلاعب النوم معين على التوازن عندما يتم تقييم انتعاش الهواستاتيكي على مدى فترة نقاهة 48 ساعة.
من المهم ملاحظة أن حرمان الذباب من النوم خلال النهار لا يزيد باستمرار من محرك النوم4. وبالتالي، فإن بدء بروتوكول الحرمان من النوم لمدة 24 ساعة عند تشغيل الأضواء والاستمرار حتى اليوم التالي لن يعزز بالإضافة إلى ذلك النوم الانتعاش مقارنة مع بروتوكول الحرمان من النوم 12 ساعة بدءا من إطفاء الأنوار. في الواقع ، قد يكون انتعاش النوم المحسوب أقل لأنه سيشمل النوم النهاري غير المنظم بشكل منزلي بالإضافة إلى النوم الليلي. ملاحظة أن الحرمان من النوم أثناء النهار لا يؤدي إلى انتعاش الهوديستاتيكي ومع ذلك يمكن استخدامها للسيطرة على الآثار المحيرة المحتملة لطريقة الحرمان من النوم. وهكذا ، الذباب النوم المحرومين بين عشية وضحاها في SNAP مقارنة الذباب التي تتلقى حافزا مماثلا في النهار7.
بالإضافة إلى استخدامه للحرمان التام من النوم ، من خلال تغيير وتيرة التحفيز ، يمكن أيضا استخدام SNAP لتقييد النوم بشكل مزمن وتجزئة7،42، وبالتالي محاكاة حالات فقدان النوم المزمن في البشر. علاوة على ذلك ، من خلال تقديم المحفزات في خطوات زيادة التردد ، يمكن أيضا استخدام SNAP لقياس عتبات الإثارة8. وبالتالي فإن SNAP هو وسيلة سهلة لحرمان وتقييد النوم من الذباب بشكل فعال ، وتقييم الاستجابة المنزلية ، وقياس خصائص النوم الأخرى.
يمكن أن تناسب SNAP في حاضنة ذبابة مختبر قياسية ، ولكنها بالتأكيد ستزعج الذباب في الحاضنة التي ليست جزءا من التجربة. لحسن الحظ ، يمكن وضع SNAP في مكان معزول للنوم يحرم الذباب دون إزعاج التجارب الجارية الأخرى. نظرا لأن النوم في حالة الشفاء هش، يجب توخي الحذر لضمان أن النوم في حالة الشفاء يتم في مكان هادئ.
استكمال الدراسات من الحرمان من النوم، وقد وضعت الأدوات الوراثية والصيدلانية لتعزيز النوم في الذباب8،43،44. وبالتالي ، فإن القدرة على تعديل النوم بسهولة بشكل ثنائي الاتجاه ستسمح لأبحاث النوم الذبابي بالاستمرار في تقديم رؤى عميقة في تنظيم النوم ووظيفته.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
وليس لدى صاحبي البلاغ ما يكشفان عنه.
Acknowledgments
تم دعم هذا العمل من قبل المعاهد القومية للصحة منح 5R01NS051305-14 و 5R01NS076980-08 إلى PJS.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Locomotor activity tubes | |||
| Fisher Tissue Prep Wax | Thermo Fisher | 13404-122 | Wax used for sealing tubes |
| Glass tubes | Wale Apparatus | 244050 | We cut 5mm diameter Pyrex glass tubes into 65mm long tubes to record sleep. Pre-cut tubes can also be purchased. |
| Nutri Fly Bloomington Formulation fly food | Genesee Scientific | 66-113 | Labs might use their own fly food recipe. It is important that sleep be recorded on the same food that flies were reared in. |
| Rotary glass cutting tool | Dremel Multi Pro | 395 | Used to cut 65mm long glass tubes |
| Monitoring Sleep | |||
| DAM System and DAMFileScan software | Trikinetics | Software used to acquire data from DAM monitors and save the acquired data in an appropriate format | |
| Data acquisition computer | Lenovo | Idea Centre AIO3 | A equivalent computer from any manufacturer can substitute |
| Drosophila Activity Monitors | Trikinetics | DAM2 | These monitors are used to record flies' locomotor activity |
| Environment Monitor | Trikinetics | DEnM | Not essential, but an easy way to monitor environmental conditions in the chamber where sleep is recorded |
| Light Controller | Trikinetics | LC4 | A convenient way to control the timing of when the SNAP is turned on and off |
| Power Supply Interface Unit for DAM | Trikinetics | PSIU-9 | Required for data acquisition computers to record Trikinetics locomotor acitvity data |
| RJ11 connector | 7001-64PC | Multicomp | DAM monitors accept RJ11 jacks |
| Splitters | Trikinetics | SPLT5 | Used to connect upto 5 DAM monitors |
| Telephone cable wire | Radioshack | 278-367 | Phone cables to acquire data from DAM monitors |
| Sleep Deprivation | |||
| Power supply | Gw INSTEK | GPS-30300 | Power supply for the SNAP |
| Sleep Nullifying Apparatus | Washington University School of Medicine machine shop |
References
- Nath, R. D., et al. The Jellyfish Cassiopea Exhibits a Sleep-like State. Current Biology. 27 (19), 2984-2990 (2017).
- Vorster, A. P., Krishnan, H. C., Cirelli, C., Lyons, L. C.
- Zhdanova, I. V., Wang, S. Y., Leclair, O. U., Danilova, N. P.
- Shaw, P. J., Cirelli, C., Greenspan, R. J., Tononi, G. Correlates of sleep and waking in Drosophila melanogaster. Science. 287 (5459), 1834-1837 (2000).
- Hendricks, J. C., et al. Rest in Drosophila is a sleep-like state. Neuron. 25 (1), 129-138 (2000).
- Ganguly-Fitzgerald, I., Donlea, J., Shaw, P. J. Waking experience affects sleep need in Drosophila. Science. 313 (5794), 1775-1781 (2006).
- Seugnet, L., Suzuki, Y., Vine, L., Gottschalk, L., Shaw, P. J. D1 receptor activation in the mushroom bodies rescues sleep-loss-induced learning impairments in Drosophila. Current Biology. 18 (15), 1110-1117 (2008).
- Donlea, J. M., Thimgan, M. S., Suzuki, Y., Gottschalk, L., Shaw, P. J. Inducing sleep by remote control facilitates memory consolidation in Drosophila. Science. 332 (6037), 1571-1576 (2011).
- Seidner, G., et al. Identification of Neurons with a Privileged Role in Sleep Homeostasis in Drosophila melanogaster. Current Biology. 25 (22), 2928-2938 (2015).
- Li, X., Yu, F., Guo, A. Sleep deprivation specifically impairs short-term olfactory memory in Drosophila. Sleep. 32 (11), 1417-1424 (2009).
- Melnattur, K., et al. A conserved role for sleep in supporting Spatial Learning in Drosophila. Sleep. , 197 (2020).
- Seugnet, L., Suzuki, Y., Donlea, J. M., Gottschalk, L., Shaw, P. J. Sleep deprivation during early-adult development results in long-lasting learning deficits in adult Drosophila. Sleep. 34 (2), 137-146 (2011).
- Donlea, J. M., Ramanan, N., Shaw, P. J. Use-dependent plasticity in clock neurons regulates sleep need in Drosophila. Science. 324 (5923), 105-108 (2009).
- Bushey, D., Tononi, G., Cirelli, C. Sleep and synaptic homeostasis: structural evidence in Drosophila. Science. 332 (6037), 1576-1581 (2011).
- Huang, S., Piao, C., Beuschel, C. B., Götz, T., Sigrist, S. J. Presynaptic Active Zone Plasticity Encodes Sleep Need in Drosophila. Current Biology. 30 (6), 1077-1091 (2020).
- Kirszenblat, L., et al. Sleep regulates visual selective attention in Drosophila. Journal of Experimental Biology. 221, Pt 24 (2018).
- Singh, P., Donlea, J. M. Bidirectional Regulation of Sleep and Synapse Pruning after Neural Injury. Current Biology. 30 (6), 1063-1076 (2020).
- Stanhope, B. A., Jaggard, J. B., Gratton, M., Brown, E. B., Keene, A. C. Sleep Regulates Glial Plasticity and Expression of the Engulfment Receptor Draper Following Neural Injury. Current Biology. 30 (6), 1092-1101 (2020).
- Kayser, M. S., Yue, Z., Sehgal, A. A critical period of sleep for development of courtship circuitry and behavior in Drosophila. Science. 344 (6181), 269-274 (2014).
- Kayser, M. S., Mainwaring, B., Yue, Z., Sehgal, A. Sleep deprivation suppresses aggression in Drosophila. Elife. 4, 07643 (2015).
- Szuperak, M., et al. A sleep state in Drosophila larvae required for neural stem cell proliferation. Elife. 7, (2018).
- Vaccaro, A., et al. Sleep Loss Can Cause Death through Accumulation of Reactive Oxygen Species in the Gut. Cell. 181 (6), 1307-1328 (2020).
- Kempf, A., Song, S. M., Talbot, C. B., Miesenböck, G. A potassium channel β-subunit couples mitochondrial electron transport to sleep. Nature. 568 (7751), 230-234 (2019).
- Donlea, J. M., Pimentel, D., Miesenböck, G. Neuronal machinery of sleep homeostasis in Drosophila. Neuron. 81 (4), 860-872 (2014).
- Liu, S., Liu, Q., Tabuchi, M., Wu, M. N. Sleep Drive Is Encoded by Neural Plastic Changes in a Dedicated Circuit. Cell. 165 (6), 1347-1360 (2016).
- Pimentel, D., et al. Operation of a homeostatic sleep switch. Nature. 536 (7616), 333-337 (2016).
- Sitaraman, D., et al. Propagation of Homeostatic Sleep Signals by Segregated Synaptic Microcircuits of the Drosophila Mushroom Body. Current Biology. 25 (22), 2915-2927 (2015).
- Foltenyi, K., Greenspan, R. J., Newport, J. W. Activation of EGFR and ERK by rhomboid signaling regulates the consolidation and maintenance of sleep in Drosophila. Nature Neuroscience. 10 (9), 1160-1167 (2007).
- Seugnet, L., et al. Notch signaling modulates sleep homeostasis and learning after sleep deprivation in Drosophila. Current Biology. 21 (10), 835-840 (2011).
- Seugnet, L., Galvin, J. E., Suzuki, Y., Gottschalk, L., Shaw, P. J. Persistent short-term memory defects following sleep deprivation in a Drosophila model of Parkinson disease. Sleep. 32 (8), 984-992 (2009).
- Tabuchi, M., et al. Sleep interacts with aβ to modulate intrinsic neuronal excitability. Current Biology. 25 (6), 702-712 (2015).
- Melnattur, K., Zhang, B., Shaw, P. J. Disrupting flight increases sleep and identifies a novel sleep-promoting pathway in Drosophila. Science Advances. 6 (19), 2166 (2020).
- Thimgan, M. S., Suzuki, Y., Seugnet, L., Gottschalk, L., Shaw, P. J. The perilipin homologue, lipid storage droplet 2, regulates sleep homeostasis and prevents learning impairments following sleep loss. PLOS Biology. 8 (8), (2010).
- Keene, A. C., et al. Clock and cycle limit starvation-induced sleep loss in Drosophila. Current Biology. 20 (13), 1209-1215 (2010).
- Shaw, P. J., Tononi, G., Greenspan, R. J., Robinson, D. F. Stress response genes protect against lethal effects of sleep deprivation in Drosophila. Nature. 417 (6886), 287-291 (2002).
- Andretic, R., Shaw, P. J. Essentials of sleep recordings in Drosophila: moving beyond sleep time. Methods Enzymol. 393, 759-772 (2005).
- Seugnet, L., et al. Identifying sleep regulatory genes using a Drosophila model of insomnia. Journal of Neuroscience. 29 (22), 7148-7157 (2009).
- Bushey, D., Huber, R., Tononi, G., Cirelli, C. Drosophila Hyperkinetic mutants have reduced sleep and impaired memory. Journal of Neuroscience. 27 (20), 5384-5393 (2007).
- Geissmann, Q., et al. Ethoscopes: An open platform for high-throughput ethomics. PLOS Biology. 15 (10), 2003026 (2017).
- Faville, R., Kottler, B., Goodhill, G. J., Shaw, P. J., van Swinderen, B. How deeply does your mutant sleep? Probing arousal to better understand sleep defects in Drosophila. Scientific Reports. 5, 8454 (2015).
- Huber, R., et al.
- Klose, M., Shaw, P. Sleep-drive reprograms clock neuronal identity through CREB-binding protein induced PDFR expression. bioRxiv. , (2019).
- Dissel, S., et al. Sleep restores behavioral plasticity to Drosophila mutants. Current Biology. 25 (10), 1270-1281 (2015).
- Gerstner, J. R., Vanderheyden, W. M., Shaw, P. J., Landry, C. F., Yin, J. C. Fatty-acid binding proteins modulate sleep and enhance long-term memory consolidation in Drosophila. PLoS One. 6 (1), 15890 (2011).
