Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

מנגנון ביטול השינה: שיטה יעילה ביותר למניעת שינה של דרוסופילה

Published: December 14, 2020 doi: 10.3791/62105
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Department of Neuroscience, Washington University School of Medicine

Summary

מניעת שינה היא כלי רב עוצמה לחקור את תפקוד השינה ואת הרגולציה. אנו מתארים פרוטוקול למחסור בשינה Drosophila באמצעות מנגנון ביטול שינה, ולקבוע את היקף השינה ריבאונד הנגרמת על ידי מחסור.

Abstract

הומאוסטזיס שינה, העלייה בשינה שנצפתה לאחר אובדן שינה, הוא אחד הקריטריונים המגדירים המשמשים לזיהוי שינה ברחבי ממלכת החיות. כתוצאה מכך, מניעת שינה והגבלת שינה הם כלים רבי עוצמה המשמשים בדרך כלל כדי לספק תובנה על תפקוד השינה. עם זאת, ניסויים מניעת שינה הם בעייתיים מטבעם בכך גירוי המחסור עצמו עשוי להיות הגורם לשינויים שנצפו בפיזיולוגיה ובהתנהגות. בהתאם לכך, טכניקות מוצלחות של מניעת שינה צריכות לשמור על בעלי חיים ערים, ובאופן אידיאלי, לגרום לריבויישן שינה חזק מבלי לגרום גם למספר רב של השלכות לא מכוונות. כאן, אנו מתארים טכניקה של מניעת שינה עבור Drosophila melanogaster. מנגנון ביטול השינה (SNAP) מנהל גירוי כל 10s כדי לגרום לגיאוטקסיס שלילי. למרות הגירוי צפוי, SNAP מונע ביעילות >95% של שינה בלילה אפילו זבובים עם כונן שינה גבוהה. חשוב לציין, התגובה ההומיאוסטטית הבאה דומה מאוד לזו שהושגה באמצעות מניעת ידיים. התזמון והמרווח של הגירויים ניתן לשנות כדי למזער את אובדן השינה ובכך לבחון השפעות לא ספציפיות של הגירוי על פיזיולוגיה והתנהגות. ה- SNAP יכול לשמש גם להגבלת שינה ולהעריך את סף העוררות. ה- SNAP היא טכניקה רבת עוצמה להפרעות שינה שניתן להשתמש בה כדי להבין טוב יותר את תפקוד השינה.

Introduction

השינה קרובה לאוניברסלית בבעלי חיים, אך תפקידה עדיין לא ברור. שינה הומאוסטזיס, עלייה מפצה בשינה בעקבות מניעת שינה, הוא מאפיין מגדיר של שינה, ששימש לאפיון מצבי שינה במספר בעלי חיים1,2,3,4,5.

לישון בזבוב יש קווי דמיון רבים עם שינה אנושית, כולל תגובה הומיאוסטטית חזקה לאובדן שינה4,5. מחקרים רבים של שינה בזבוב השתמשו במחסור בשינה הן כדי להסיק את תפקוד השינה על ידי בחינת ההשלכות השליליות המצטברות מהתעוררות ממושכת, והן כדי להבין את ויסות השינה על ידי קביעת המנגנונים הנוירוביולוגיים השולטים בוויסות ההומיאוסטטי של השינה. לכן זבובים מחוסרי שינה הוצגו להפגין ליקויים בלמידה ובזיכרון6,7,8,9,10,11,12, פלסטיות מבנית13,14,15, תשומת לב חזותית16, התאוששות מפגיעה עצבית17,18, הזדווגות והתנהגויות אגרסיביות19, 20, התפשטות תאים21, ותגובות ללחץ חמצוני22,23 אם להזכיר כמה. יתר על כן, חקירות של המנגנונים הנוירוביולוגיים השולטים על שינה ריבאונד הניבו תובנות קריטיות על המכונות העצביות המהוות את הומיאוסטטייק השינה8,9,23,24,25,26,27,28,29 . לבסוף, בנוסף לחשיפת תובנות בסיסיות על תפקוד השינה בבעלי חיים בריאים, מחקרים על מניעת שינה גם הודיעו תובנות על תפקוד השינה במצביםחולים 30,31.

בעוד מניעת שינה היא ללא ספק כלי רב עוצמה, עם כל ניסוי מניעת שינה, חשוב להבחין פנוטיפים הנובעים התעוררות ממושכת, מאלה המושרה על ידי הגירוי המשמש כדי לשמור על החיה ערה. מניעת שינה על ידי מניעת ידיים או טיפול עדין, נחשב בדרך כלל כקביעת התקן למחסור מינימלי בשינה. כאן אנו מתארים פרוטוקול למחסור בשינה זבובים באמצעות מנגנון ביטול השינה (SNAP). ה-SNAP הוא מכשיר המספק גירוי מכני לטסים כל 10s, ושומר על זבובים ערים על ידי גרימת גיאוטקסיס שלילי(איור 1). ה-SNAP מונעת ביעילות זבובים >98% משנת הלילה, אפילו בזבובים עם הנעה בשינה גבוהה8,32. ה-SNAP מכויל על זבובים רגישים למפץ, תסיסה של זבובים ב-SNAP לא פוגעת בזבובים; מניעת שינה עם SNAP מעורר ריבאונד דומה לזה המתקבל על ידי מניעת יד7. ה- SNAP הוא אפוא שיטה חזקה למניעת זבובים בשינה תוך שליטה על ההשפעות של הגירוי המעורר.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. הכנה ניסיונית

  1. לאסוף זבובים כשהם מתחלקים לתוך בקבוקונים, הפרדת זבובים זכר ונקבה.
    הערה: ניסויי שינה נערכים בדרך כלל עם זבובים נשיים. חשוב לאסוף נקבות בתולות. נקבות מויזות יטילו ביצים שבוקעות לתוך זחלים מה שמסבך את ניתוח הנתונים.
  2. זבובי בית של מין אחד בקבוצות של <20.
    הערה: דיור טס בסביבה מועשרת חברתית (קבוצות של >50) מווסתכונןשינה 6,13 מדידות מבלבלות פוטנציאליות של שינה ריבאונד. יתר על כן, לאחר העשרה חברתית, השינה תרד על פני כמה ימים6. לכן, שינה בסיסית אינה יציבה לסבך ניתוח של שינה ריבאונד. שמירה על זבובים בקבוצות של <20 מונעת את הבלבול הפוטנציאלי הזה.
  3. יש לשמור על זבובים בבקבוקונים למשך 3-5 ימים בסביבה מבוקרת אור ולחות.
    הערה: גיל ובגרות של זבובים משפיעים מאוד על השינה. השינה גבוהה בזבובים בני יום אחד ומתייצבת על ידי 3-5 ימים של גיל4. זבובים נשמרים בדרך כלל על אור של 12 שעות: לוח זמנים חשוך של 12 שעות ב-50% לחות.

2. הכנת צינורות להקלטת שינה

הערה: השינה מנוטרת באמצעות צגי פעילות לוקומוטור. צג יכול להחזיק 32 זבובים שוכנים בנפרד בצינורות בקוטר 5 מ"מ. בדרך כלל, גנוטיפים מנותחים בקבוצות של 16 או 32 זבובים.

  1. הכן מספר מתאים של צינורות עם מזון זבוב בקצה אחד.
    הערה: דיאטה ומטבוליזם ידועים להשפיע על שינה33,34, ולכן חשוב במיוחד למקם זבובים על אותו מזון שבו הם גדלו.
  2. לאטום את קצה הצינורות עם שעווה.
    הערה: מניעת שינה וריבאונד הם ניסוי של חמישה ימים, ומזון יכול להתייבש אם לא אטום כראוי. בצינורות אטומים כראוי, מזון יכול להישמר במשך 10 ימים או יותר. לכן, זה קריטי כדי להבטיח כי הקצוות של הצינורות אטומים היטב. זבובים יכולים גם להיתקע למזון רטוב, עם זאת. לכן, זה עוזר לעשות צינורות 1-2 ימים לפני תחילת הניסוי.
  3. במקום בנפרד להתעורר, מתנהג זבובים לתוך צינורות זכוכית באורך 65 מ"מ להקלטת שינה באמצעות שאיפה ולחבר את הקצה של הצינורות עם פקק קצף.
    הערה: זבובים לעולם אינם נחשפים מחדש להרדמה CO2 בעת הצבת זבובים לתוך צינורות להקלטת שינה. השאפתן עשוי צינורות גומי עם קצה אחד מכוסה גבינה מוכנס לתוך קצה פיפטה 1 מ"ל.

3. הקלטת שינה

  1. טען זבובים בצינורות לתוך צגי פעילות כדי לפקח על השינה.
    הערה: סלעי SNAP מנטרים הלוך ושוב מ - 60° ל + 60 ° כל ~ 10s. המסכים מוחזקים ב-60° עבור ~ 5.9s ; נדרשים ~2.9 s כדי שהמגש יחזיק את הצגים יעבור מ- -60° ל- +60° ו- ~ 1 s כדי לחזור מ- +60° ל- -60°. ניתן לשנות את אורך המחזור לפי הצורך על ידי התאמת המתח המסופק למנוע.
    1. הקפד להבטיח כי צינורות ממוקמים צגי פעילות בכיוון הנכון. בכיוון הנכון, קצה הצינור עם מזון נמצא בחלק העליון של SNAP כדי להבטיח כי זבובים לא לקבל דחף לתוך המזון. בנוסף, הסוף עם מזון הוא בצד של הצג עם שקע הקלטת השינה. הדבר מאפשר למוניטורים של הפעילות להיות מכוונים כראוי ב- SNAP למחסור יעיל בשינה ובו זמנית ניטור הפעילות.
  2. מקם צגי פעילות בתא ההקלטה כדי לפקח על השינה.
  3. נטר שינה במשך יומיים מלאים לפחות כדי להעריך שינה בסיסית.
    הערה: היום זבובים נטענים לתוך צגי פעילות בדרך כלל אינו נכלל כיום הסתגלות כדי לאפשר לזבובים להסתגל להיות מאוכסן בצינורות. שינה בסיסית נרשמת לפחות יומיים מלאים (48 שעות) החל מהבוקר שאחרי היום זבובים נטענים.
  4. שמור ספירת פעילות locomotor של זבובים בפחים של דקה אחת מרגע האורות ביום נתון לאורות ביום הקודם באמצעות תוכנת הקלטת פעילות (למשל, מ 8 בבוקר עד 8 בבוקר).
  5. הערכת שינה מנתוני הפעילות של locomotor באמצעות פקודות מאקרו מותאמות אישית באמצעות 5 דקות של חוסר פעילות כסף עבור התקף שינה35.
    הערה: מספר מדדי שינה מחושבים מספירת הפעילות של locomotor. אלה כוללים שינה של דקה/שעה מעל 24 שעות, זמן שינה כולל ב 24 שעות, ממוצע ומקסימום בשעות היום ולילה אורכים36.

4. מניעת שינה והתאוששות

  1. כמו זבובים ניתן להעריך שינה במשך פרקי זמן משתנים (למשל, 12 שעות, 24 שעות ו 36 שעות) ואת השינה התאוששות ניתן גם להעריך במרווחי זמן שונים (למשל, 6 שעות, 12 שעות, 24 שעות ו 48 שעות), לקבוע את משך ההחלמה על ידי צורך ניסיוני. ניתן לדמיין שחזור שינה באמצעות עלילת רווח/אובדן שינה או על ידי בחינת אחוז שינה התאושש על מרווח קבוע מראש (למשל, 6 שעות).
  2. אם השינה יציבה ביומיים הבסיסיים, ביום השלישי, מקם צגי פעילות לתוך SNAP למחסור בשינה למשך הלילה.
    הערה: זבובים יציגו ריבאונד שינה חזק על פני מגוון של שינה פעמים8,32,37,38, אבל השינה צריכה להיות יציבה כדי להעריך באופן אמין ריבאונד שינה. השינה יציבה כאשר ההבדל בשינה בין ימי הבסיס הוא ± 100 דקות.
  3. ודאו שמסכי הפעילות מאובטחים במקום עם סיכות מחזיקי צג, כבלי צג המחוברים לחשמל וצגים מכוונים נכון עם הסוף עם מזון מאחור, ומחסומי פלסטיק מלפנים(איור 1).
    הערה: ה-SNAP מתוכנן כך שהמצלמה מסתובבת אחת ל-10 s(איור 1). הכנסת הפלסטיק מאפסת את הצינורות על ידי דחיפת הצינורות בחזרה כאשר המנגנון נמצא במצב "למעלה". איפוס הצינורות חשוב כדי להבטיח כי כל הצינורות יש את טווח התנועה המלא בתחילת כל מחזור.
  4. נתק את צגי הפעילות והוציא את המסכים מה-SNAP מיד עם הדלקת האורות בעקבות מניעת שינה במהלך הלילה.
    הערה: זה קריטי כי מניעת שינה מסתיימת, וזבובים ממוקמים בהתאוששות מיד על אורות על בעקבות 12 שעות של מניעת שינה לילה. אפילו עיכוב של 20-30 דקות בהצבת זבובים בהתאוששות יכול להפריע להיקף השינה החוזרת.
  5. הנח זבובים בתא הקלטות שבו הם יהיו ללא הפרעה במשך יומיים (48 שעות) כדי לפקח על שנת ההתאוששות.
    הערה: אם תא ההקלטה משמש לניסויים אחרים, יש לנקוט משנה זהירות כדי למנוע גירוי זבובים מחלימים.
  6. חשב את כמות השינה שאבדה. עבור כל זבוב בודד, לחשב את ההבדל השעתי בין שינה המתקבלת במהלך מניעת שינה לבין השעה המקבילה במהלך קו הבסיס; לסכם את ההבדלים לשעה כדי לחשב את השינה הכוללת שאבדה.
  7. חשב את כמות השינה ששוחזרה. עבור כל זבוב בודד, לחשב את ההבדל השעתי בין שינה המתקבלת במהלך ההתאוששות לבין השעה המתאימה במהלך קו הבסיס; לסכם את ההבדלים לשעה כדי לחשב את השינה הכוללת שנצבר.
    הערה: אם זבוב הוא למעשה חסר שינה הוא אמפירי. לכן, הנסיין צריך לבחון אחוז שינה אבודה. אם הזבוב לא איבד כמות מספקת של שינה זה יכול להיות נשלל מהניתוח. למרות שזה עשוי להידרש עבור גישות אחרות מניעת שינה, זה רק לעתים רחוקות אם אי פעם נדרש עבור SNAP. בדרך כלל יותר, שינה לא יכול להיות יציב זבוב נתון לפני החניכה של מניעת שינה. אם השינה אינה יציבה, לא ניתן לחשב הומאוסטזיס. אנו מקבלים הבדל מרבי של ± 100 דקות שינה המחושב לפני תחילת מניעת השינה כמועמדים להכללה. לעיתים, שנתו של זבוב בודד מחולקת באופן לא אחיד על פני 24 שעות ביממה (למשל, אנשים מסוימים עשויים לקבל 60-70% ממכסת השינה שלהם במהלך היום ובכך לאבד רק חלק קטן ממכסת השינה שלהם 24 שעות כאשר נמנע מהם 12 שעות בלילה). זבובים אלה ניתן להעריך בנפרד.
  8. חשב את האחוז הממוצע של שינה התאוששה (יחסית לקו הבסיס) מעל 12 שעות, 24 שעות ו 48 שעות של תקופת ההתאוששות עבור כל גנוטיפ.
  9. מנתוני שינה, חשב את אורך השינה הממוצע והמקסימלי בשעות היום בקו הבסיס, ואת ימי ההתאוששות עבור כל גנוטיפ.
    הערה: שינה ריבאונד בזבובים מאופיינת בכמות שינה מוגברת, ועומק שינה מוגבר בימי ההתאוששות. איחוד שינה משמש כמדד של עומק שינה. סף עוררות יכול לשמש גם כמדד של עומק שינה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

קנטון S (Cs) שימש כזן פראי. הזבובים נשמרו באור של 12 שעות: לוח זמנים חשוך של 12 שעות, ושינה נמנעה במשך 12 שעות בלילה. בדיקת פרופילי השינה של זבובי Cs ביום הבסיס (bs), יום מניעת שינה (sd) ושני ימי התאוששות (rec1 ו rec2) (איור 2A) עולה כי זבובים היו למעשה מניעת שינה SNAP, ושינה התאוששה במהלך היום עולה בקנה אחד עם דיווחים שנצפו בספרות4,5. האפקטיביות של ה-SNAP בשמירה על זבובים ערים ניכרת גם בפעילות הגבוהה (300-350 ספירות/שעה) המוצגת על ידי זבובים במהלך מניעת שינה(איור 2B). ואכן, ניטור ספירת הפעילות של זבובים במהלך מניעת שינה יכול להיות ברומטר שימושי של האפקטיביות של פרוטוקול הקיפוח ו / או מידה עקיפה של כונן שינה. כאשר מניעת השינה אינה יעילה, הזבובים אינם פעילים באותה מידה במהלך תקופת המחסור. זבובים שנמצאים תחת כונן שינה גבוהה נרדמים במהירות לאחר כל גירוי ואינם חוצים את הצינור ככל35. הן זווית ההטיה של המנגנון, והן מהירות הירידה הם קריטיים כדי להבטיח כי זבובים נשמרים ערים ביעילות מבלי לפגוע בהם. כל מעבדה יכולה לייעל את הזווית והמהירות על ידי התאמת הקפיץ (איור 1B) ו/או הגודל והצורה של המצלמה(איור 1C ואיור 1D,ימינה).

כדי להעריך כמותית את האפקטיביות של מניעת שינה והתאוששות, שינה שאבדה במהלך המחסור ולאחר מכן הוחזרה בימי ההחלמה חושבה עבור כל זבוב בודד (איור 2C). חשוב לציין, לא חל שינוי משמעותי בשינה הבסיסית בין יום המחסור ליום הבסיס (ראו 0-12 שעות באיור 2C)המציין כי השינה יציבה בזבובים אלה. הבדל גדול בשינה בתקופה זו של 12 שעות (למשל, ± 100 דקות) יציע כי השינה לא יציבה. ה-SNAP למעשה מנע מזבובים >98% משנת הלילה שלהם. זבובים התאוששו ~ 20% משנתם ב 12 השעות הראשונות ולא לשחזר שינה נוספת במהלך הלילה, כפי שדווח בעבר. עם זאת, זבובים החלו להתאושש שינה למחרת, כך שהם התאוששו ~ 36% משנתם מעל 48 שעות של התאוששות (איור 2D). 30 - 40% שינה התאוששה מעל 48 שעות אופייני למדי עבור זבובים מסוג בר שינה מקופח באמצעות SNAP.

הומאוסטזיס שינה מאופיין הן על ידי משך שינה מוגברת ועל ידי עומק שינה מוגבר במהלך תקופת ההחלמה לאחר מחסור. איחוד שינה בשעות היום משמש בדרך כלל כהקראה של עומק השינה. ניתן להעריך את איחוד השינה כמשך השינה הממוצע לאורך כל היום(איור 2E). עם זאת, כמו לחץ השינה מתפוגג במהלך ההתאוששות, משך התקף השינה הממוצע יופחת ככל שהיום מתקדם. לכן, לעתים קרובות כדאי לבחון שינויים במשך השינה המרבי שיכול לספק מדד רגיש יותר (איור 2F).

שיטת מניעת שינה סה"כ # של ניירות % ניירות / טכניקה התאוששות ממוצעת מוערכת
הצמד 52 37.14% 33 ± 3
מערבולת/רעד אקראי 49 35.00% 18 ± 3
מניעת ידיים 9 6.43% 36 ± 11
SD תרמוגנטי 15 10.71% 36 ± 12
לא צוין 15 10.71% 29 ± 10

טבלה 1: סקירת שיטות שונות של מניעת שינה המשמשות בספרות. רק 116/254 ניירות השתמשו במחסור בשינה. מספר הניירות המשתמשים בכל שיטה = "סה"כ # של ניירות". שבריר הניירות בכל שיטה = "% ניירות / טכניקה". אורך ההתאוששות הממוצע המוערך עבור כל שיטה = "התאוששות ממוצעת מוערכת". SD - מניעת שינה. SNAP - מנגנון ביטול שינה

אורך SD סה"כ לימודים
< 6 שעות 12
6 שעות 23
>6 שעות ו-< 12 שעות 17
12 שעות 69
>12 שעות ו-<24 שעות 7
24 שעות 19
> 24 שעות 9
SD כרוני 4
כל SD 160

טבלה 2. משך מניעת השינה המבוצע במחקרים שונים. SD - מניעת שינה

Figure 1
איור 1. השינה מבטלת את האפארטוס (SNAP). A) מבט קדמי על המנגנון. ה- SNAP יכול להכיל 8 צגי פעילות בשתי שורות; סיכות מחזיק לרסן את המסכים במקום. ניתן להתאים את הרגליים כדי לסייע במיקום המנגנון בכיוון הנכון. ב)מבט מקרוב על המנוע והאביב שמטלטלים את המנגנון הלוך ושוב. המנוע הופך מצלמה שמטה את המנגנון בחזרה לעמדה "למעלה" ודוחס את הקפיץ. שחרור הקפיץ מדחיסה מצמיד את המנגנון בחזרה לעמדה "למטה". ג)מבט צדדי שמאלי על המנגנון במצב "למטה". סיכות מחזיק צגי ריסון; חריץ כבל צג מבטיח שכבבי הצג מוחזקים במקומם. רפידות עוזרות לרפד את ההשפעה של המנגנון המתפרץ לעמדה 'למטה'. מימין - מבט מקרוב על המצלמה. ד) מבט בצד שמאל של המנגנון במצב "למעלה". מימין - סיבוב הנגד בכיוון השעון של המצלמה מטה את המנגנון לעמדה 'למעלה'. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2. תוצאות ניסוי. A) חלקות שינה של Cs טסות במשך ארבעת ימי הניסוי: יום הבסיס (bs), יום מניעת שינה (sd) ויומיים של התאוששות (rec1 ו rec2). ב) פעילות לוקומוטור ממוצעת סופרת זבובים ביום של מחסור בשינה. הזבובים היו מחוסרי שינה משעות 12-24. ג)זמן כמובן של מניעת שינה והתאוששות. זבובי CS היו מחוסרי שינה משעות 12 - 24, והותר להם להתאושש משעה 24 - 72. ה- SNAP מנע למעשה זבובים של >98% שינה, אשר התאושש חלקית מעל 48 שעות (n = 12 זבובים, צעדים חוזרים ונשנים ANOVA לזמן, F [70,1470]= 12.97, p < 10-15). D) אחוז השינה התאושש מעל 48 שעות. זבובים התאוששו ~ 20% משנתם מעל 12 שעות, ו ~ 36% משנתם מעל 48 שעות E) איחוד שינה עבור כל יום של הניסוי כפי שנמדד על ידי משך השינה הממוצע במהלך היום. השינה מאוחדת יותר ביום ההתאוששות הראשון בהשוואה לקו הבסיס (p <0.05, t-test). ו) איחוד שינה עבור כל יום של הניסוי כפי שנמדד על ידי משך שינה מקסימלי במהלך היום. השינה מאוחדת יותר ביום ההתאוששות הראשון בהשוואה לקו הבסיס (p <0.05, t-test). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

שינה בדרוסופילים אופיינה באופן עצמאי בשנת 2000, על ידי שתי קבוצות4,5. במחקרים חלוציים אלה, זבובים נשללו שינה על ידי טיפול עדין (כלומר, מניעת ידיים) והוכחו להפגין תגובה הומיאוסטטית חזקה למחסור בשינה בלילה. חשוב לציין, עם כל ניסוי מניעת שינה זה חיוני כדי לשלוט על השפעות מבלבלות פוטנציאליות של השיטה המשמשת כדי לשמור על החיה ערה. מחקרים על מניעת ידיים קובעים את אמת המידה למחקרים על הומאוסטזיס זבובים כאמצעי מינימלי לשיבוש שינה של זבובים. SNAP מונע ביעילות זבובים של שינה של >98% של שינה בלילה, וחשוב מכך גורמת ריבאונד שינה דומה לזה המתקבל עם מניעת יד4,7.

מאז מחקרי היסוד המגדירים שינה בזבובים, פותחו מספר שיטות להערכת הומאוסטזיס שינה בזבובים באופן תפוקה גבוהה7,9,39,40,41. סקרנו ~ 250 מאמרים על שינה בזבובים ומצאנו ~ 46% מהמאמרים שפורסמו אלה דיווחו באמצעות מניעת שינה כדי להעריך ויסות שינה או פונקציה (טבלה 1). מספר שיטות שונות גרמו ביעילות לריבוינד שינה בזבובים. מעניין, של המחקרים כי העריכו ריבאונד שינה, הפרוטוקולים המשמשים למחסור בשינה ריבאונד שינה שונה. באופן ספציפי, הן משך מניעת השינה (טבלה 2) והן משך הזמן שעבורו הוערך ריבאונד (טבלה 1) השתנו באופן משמעותי, מה שעלול לסבך השוואות של תוצאות שהושגו בפרוטוקולים שונים. שינה ריבאונד זבובים ידוע להתמיד עד 48 שעות בעקבות מניעת שינה5. בהתאם לכך, אנו חושבים תיאור יסודי של ההשפעות של מניפולציה שינה נתון על הומאוסטזיס מתקבלים בצורה הטובה ביותר כאשר ריבאונד הומיאוסטטי מוערך על פני תקופת התאוששות 48 שעות.

חשוב לציין כי מניעת זבובים של שינה במהלך היום אינו מגדיל בעקביות את כונן השינה4. לפיכך, הפעלת פרוטוקול מניעת שינה 24 שעות באור דולק והמשך עד למחרת לא תשפר בנוסף את שנת ההתאוששות בהשוואה לפרוטוקול מניעת שינה של 12 שעות החל מכיבוי אורות. למעשה, ריבאונד השינה המחושב עשוי להיות נמוך יותר שכן הוא יכלול שינה בשעות היום ללא הונוסטטיות בנוסף לשינה בלילה. התצפית כי מניעת שינה בשעות היום אינה גורמת ריבאונד הומיאוסטטי יכול לשמש עם זאת כדי לשלוט על השפעות מבלבלות פוטנציאליות של השיטה של מניעת שינה. לכן, זבובים שינה מקופחת לילה SNAP משווים זבובים שמקבלים גירוי דומה בשעות היום7.

בנוסף לשימוש עבור מניעת שינה מוחלטת, על ידי שינוי תדירות הגירוי, SNAP יכול לשמש גם כדי להגביל באופן כרוני ולשבור שינה7,42, ובכך לחקות תנאים של אובדן שינה כרוני בבני אדם. כמו כן, על ידי מתן גירויים בשלבים של הגדלת תדירות, SNAP יכול לשמש גם כדי למדוד סף עוררות8. ה- SNAP הוא אפוא דרך יעילה לשלול ולהגביל שינה של זבובים, להעריך את התגובה ההומיאוסטטית ולמדוד מאפייני שינה אחרים.

ה- SNAP יכול להתאים לאינקובטור זבובי מעבדה סטנדרטי, אך בהחלט יפריע לזבובים באינקובטור שאינם חלק מהניסוי. למרבה המזל, ה- SNAP יכול להיות ממוקם במיקום מבודד כדי למנוע מזבובים למחסור בשינה מבלי להפריע לניסויים מתמשכים אחרים. מאז שנת ההתאוששות היא שבירה, יש לנקוט זהירות כדי להבטיח כי שנת ההתאוששות מתרחשת במקום שקט.

מחקרים משלימים של מניעת שינה, כלים גנטיים ופרמקולוגיים פותחו כדי לשפר את השינה בזבובים8,43,44. לכן, היכולת לווסת שינה בקלות דו-כיוונית תאפשר מחקר שינה זבוב להמשיך לספק תובנות עמוקות על ויסות שינה ותפקוד.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכה על ידי מענקי NIH 5R01NS051305-14 ו 5R01NS076980-08 ל- PJS.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Locomotor activity tubes
Fisher Tissue Prep Wax Thermo Fisher 13404-122 Wax used for sealing tubes
Glass tubes Wale Apparatus 244050 We cut 5mm diameter Pyrex glass tubes into 65mm long tubes to record sleep. Pre-cut tubes can also be purchased.
Nutri Fly Bloomington Formulation fly food Genesee Scientific 66-113 Labs might use their own fly food recipe. It is important that sleep be recorded on the same food that flies were reared in.
Rotary glass cutting tool Dremel Multi Pro 395 Used to cut 65mm long glass tubes 
Monitoring Sleep
DAM System and DAMFileScan software Trikinetics Software used to acquire data from DAM monitors and save the acquired data in an appropriate format
Data acquisition computer Lenovo Idea Centre AIO3 A equivalent computer from any manufacturer can substitute
Drosophila Activity Monitors Trikinetics DAM2 These monitors are used to record flies' locomotor activity
Environment Monitor Trikinetics DEnM Not essential, but an easy way to monitor environmental conditions in the chamber where sleep is recorded
Light Controller Trikinetics LC4 A convenient way to control the timing of when the SNAP is turned on and off
Power Supply Interface Unit for DAM Trikinetics PSIU-9 Required for data acquisition computers to record Trikinetics locomotor acitvity data
RJ11 connector 7001-64PC Multicomp DAM monitors accept RJ11 jacks
Splitters Trikinetics SPLT5 Used to connect upto 5 DAM monitors
Telephone cable wire Radioshack 278-367 Phone cables to acquire data from DAM monitors
Sleep Deprivation
Power supply Gw INSTEK GPS-30300 Power supply for the SNAP
Sleep Nullifying Apparatus Washington University School of Medicine machine shop

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Nath, R. D., et al. The Jellyfish Cassiopea Exhibits a Sleep-like State. Current Biology. 27 (19), 2984-2990 (2017).
  2. Vorster, A. P., Krishnan, H. C., Cirelli, C., Lyons, L. C. Characterization of sleep in Aplysia californica. Sleep. 37 (9), 1453-1463 (2014).
  3. Zhdanova, I. V., Wang, S. Y., Leclair, O. U., Danilova, N. P. Melatonin promotes sleep-like state in zebrafish. Brain Research. 903 (1-2), 263-268 (2001).
  4. Shaw, P. J., Cirelli, C., Greenspan, R. J., Tononi, G. Correlates of sleep and waking in Drosophila melanogaster. Science. 287 (5459), 1834-1837 (2000).
  5. Hendricks, J. C., et al. Rest in Drosophila is a sleep-like state. Neuron. 25 (1), 129-138 (2000).
  6. Ganguly-Fitzgerald, I., Donlea, J., Shaw, P. J. Waking experience affects sleep need in Drosophila. Science. 313 (5794), 1775-1781 (2006).
  7. Seugnet, L., Suzuki, Y., Vine, L., Gottschalk, L., Shaw, P. J. D1 receptor activation in the mushroom bodies rescues sleep-loss-induced learning impairments in Drosophila. Current Biology. 18 (15), 1110-1117 (2008).
  8. Donlea, J. M., Thimgan, M. S., Suzuki, Y., Gottschalk, L., Shaw, P. J. Inducing sleep by remote control facilitates memory consolidation in Drosophila. Science. 332 (6037), 1571-1576 (2011).
  9. Seidner, G., et al. Identification of Neurons with a Privileged Role in Sleep Homeostasis in Drosophila melanogaster. Current Biology. 25 (22), 2928-2938 (2015).
  10. Li, X., Yu, F., Guo, A. Sleep deprivation specifically impairs short-term olfactory memory in Drosophila. Sleep. 32 (11), 1417-1424 (2009).
  11. Melnattur, K., et al. A conserved role for sleep in supporting Spatial Learning in Drosophila. Sleep. , 197 (2020).
  12. Seugnet, L., Suzuki, Y., Donlea, J. M., Gottschalk, L., Shaw, P. J. Sleep deprivation during early-adult development results in long-lasting learning deficits in adult Drosophila. Sleep. 34 (2), 137-146 (2011).
  13. Donlea, J. M., Ramanan, N., Shaw, P. J. Use-dependent plasticity in clock neurons regulates sleep need in Drosophila. Science. 324 (5923), 105-108 (2009).
  14. Bushey, D., Tononi, G., Cirelli, C. Sleep and synaptic homeostasis: structural evidence in Drosophila. Science. 332 (6037), 1576-1581 (2011).
  15. Huang, S., Piao, C., Beuschel, C. B., Götz, T., Sigrist, S. J. Presynaptic Active Zone Plasticity Encodes Sleep Need in Drosophila. Current Biology. 30 (6), 1077-1091 (2020).
  16. Kirszenblat, L., et al. Sleep regulates visual selective attention in Drosophila. Journal of Experimental Biology. 221, Pt 24 (2018).
  17. Singh, P., Donlea, J. M. Bidirectional Regulation of Sleep and Synapse Pruning after Neural Injury. Current Biology. 30 (6), 1063-1076 (2020).
  18. Stanhope, B. A., Jaggard, J. B., Gratton, M., Brown, E. B., Keene, A. C. Sleep Regulates Glial Plasticity and Expression of the Engulfment Receptor Draper Following Neural Injury. Current Biology. 30 (6), 1092-1101 (2020).
  19. Kayser, M. S., Yue, Z., Sehgal, A. A critical period of sleep for development of courtship circuitry and behavior in Drosophila. Science. 344 (6181), 269-274 (2014).
  20. Kayser, M. S., Mainwaring, B., Yue, Z., Sehgal, A. Sleep deprivation suppresses aggression in Drosophila. Elife. 4, 07643 (2015).
  21. Szuperak, M., et al. A sleep state in Drosophila larvae required for neural stem cell proliferation. Elife. 7, (2018).
  22. Vaccaro, A., et al. Sleep Loss Can Cause Death through Accumulation of Reactive Oxygen Species in the Gut. Cell. 181 (6), 1307-1328 (2020).
  23. Kempf, A., Song, S. M., Talbot, C. B., Miesenböck, G. A potassium channel β-subunit couples mitochondrial electron transport to sleep. Nature. 568 (7751), 230-234 (2019).
  24. Donlea, J. M., Pimentel, D., Miesenböck, G. Neuronal machinery of sleep homeostasis in Drosophila. Neuron. 81 (4), 860-872 (2014).
  25. Liu, S., Liu, Q., Tabuchi, M., Wu, M. N. Sleep Drive Is Encoded by Neural Plastic Changes in a Dedicated Circuit. Cell. 165 (6), 1347-1360 (2016).
  26. Pimentel, D., et al. Operation of a homeostatic sleep switch. Nature. 536 (7616), 333-337 (2016).
  27. Sitaraman, D., et al. Propagation of Homeostatic Sleep Signals by Segregated Synaptic Microcircuits of the Drosophila Mushroom Body. Current Biology. 25 (22), 2915-2927 (2015).
  28. Foltenyi, K., Greenspan, R. J., Newport, J. W. Activation of EGFR and ERK by rhomboid signaling regulates the consolidation and maintenance of sleep in Drosophila. Nature Neuroscience. 10 (9), 1160-1167 (2007).
  29. Seugnet, L., et al. Notch signaling modulates sleep homeostasis and learning after sleep deprivation in Drosophila. Current Biology. 21 (10), 835-840 (2011).
  30. Seugnet, L., Galvin, J. E., Suzuki, Y., Gottschalk, L., Shaw, P. J. Persistent short-term memory defects following sleep deprivation in a Drosophila model of Parkinson disease. Sleep. 32 (8), 984-992 (2009).
  31. Tabuchi, M., et al. Sleep interacts with aβ to modulate intrinsic neuronal excitability. Current Biology. 25 (6), 702-712 (2015).
  32. Melnattur, K., Zhang, B., Shaw, P. J. Disrupting flight increases sleep and identifies a novel sleep-promoting pathway in Drosophila. Science Advances. 6 (19), 2166 (2020).
  33. Thimgan, M. S., Suzuki, Y., Seugnet, L., Gottschalk, L., Shaw, P. J. The perilipin homologue, lipid storage droplet 2, regulates sleep homeostasis and prevents learning impairments following sleep loss. PLOS Biology. 8 (8), (2010).
  34. Keene, A. C., et al. Clock and cycle limit starvation-induced sleep loss in Drosophila. Current Biology. 20 (13), 1209-1215 (2010).
  35. Shaw, P. J., Tononi, G., Greenspan, R. J., Robinson, D. F. Stress response genes protect against lethal effects of sleep deprivation in Drosophila. Nature. 417 (6886), 287-291 (2002).
  36. Andretic, R., Shaw, P. J. Essentials of sleep recordings in Drosophila: moving beyond sleep time. Methods Enzymol. 393, 759-772 (2005).
  37. Seugnet, L., et al. Identifying sleep regulatory genes using a Drosophila model of insomnia. Journal of Neuroscience. 29 (22), 7148-7157 (2009).
  38. Bushey, D., Huber, R., Tononi, G., Cirelli, C. Drosophila Hyperkinetic mutants have reduced sleep and impaired memory. Journal of Neuroscience. 27 (20), 5384-5393 (2007).
  39. Geissmann, Q., et al. Ethoscopes: An open platform for high-throughput ethomics. PLOS Biology. 15 (10), 2003026 (2017).
  40. Faville, R., Kottler, B., Goodhill, G. J., Shaw, P. J., van Swinderen, B. How deeply does your mutant sleep? Probing arousal to better understand sleep defects in Drosophila. Scientific Reports. 5, 8454 (2015).
  41. Huber, R., et al. Sleep homeostasis in Drosophila melanogaster. Sleep. 27 (4), 628-639 (2004).
  42. Klose, M., Shaw, P. Sleep-drive reprograms clock neuronal identity through CREB-binding protein induced PDFR expression. bioRxiv. , (2019).
  43. Dissel, S., et al. Sleep restores behavioral plasticity to Drosophila mutants. Current Biology. 25 (10), 1270-1281 (2015).
  44. Gerstner, J. R., Vanderheyden, W. M., Shaw, P. J., Landry, C. F., Yin, J. C. Fatty-acid binding proteins modulate sleep and enhance long-term memory consolidation in Drosophila. PLoS One. 6 (1), 15890 (2011).

Tags

מדעי המוח גיליון 166 שינה דרוזופילה הומאוסטזיס ריבאונד מניעת שינה הגבלת שינה
מנגנון ביטול השינה: שיטה יעילה ביותר למניעת <em>שינה של דרוסופילה</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Melnattur, K., Morgan, E., Duong,… More

Melnattur, K., Morgan, E., Duong, V., Kalra, A., Shaw, P. J. The Sleep Nullifying Apparatus: A Highly Efficient Method of Sleep Depriving Drosophila. J. Vis. Exp. (166), e62105, doi:10.3791/62105 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter