Summary
ゲノムは核空間内で異なる構造に編成され、染色体立体構造の捕捉技術によって明らかにすることができる。核内Hi-C法は、ショウジョウバエ細胞株におけるクロマチン相互作用のゲノム全体のコレクションを提供し、制限フラグメントレベルでメガベース解像度で探索できる接触マップを生成する。
Abstract
ゲノムは、ドメイン間の相互作用を分離する境界によって区切られたトポロジカルに関連付けられたドメイン(TAD)に編成される。ショウジョウバエでは、TADの形成と境界の根底にあるメカニズムはまだ調査中です。ここで説明する核内Hi-C法の適用は 、ノッチ 遺伝子を単離するTAD境界における建築タンパク質(AP)結合部位の機能を解剖するのに役立った。APの損失を引き起こすドメイン境界の遺伝子改変は、TAD融合、転写欠陥、および長距離トポロジカル変化をもたらす。これらの結果は、ショウジョウバエにおけるドメイン境界形成および遺伝子発現制御に対する遺伝要素の寄与を示す証拠を提供した。ここでは、核内Hi-C法について詳細に説明し、これはプロトコルと共に実験の品質を評価するための重要なチェックポイントを提供する。また、異なるゲノムスケールでゲノム相互作用を分析するために必要なシーケンシング読み取り数と有効なHi-Cペアも示されています。CRISPR/Cas9は、この核内Hi-Cプロトコルを用いたゲノム相互作用の調節要素の遺伝子編集と高解像度プロファイリングを、遺伝的要素の構造機能の調査のための強力な組み合わせとなり得る。
Introduction
真核生物では、ゲノムは第1相間の核空間内の特定の領域を占める染色体に分割される。染色体を形成するクロマチンは、転写的に寛容であるアクセス可能なクロマチンの1つと、転写的に抑制的なコンパクトクロマチンの2つの主要な状態に分けることができます。これらのクロマチン状態は、核空間で分離し、めったに混ざらず、核2に2つの異なるコンパートメントを形成する。サブメガベーススケールでは、境界は、染色体組織3、4、5をマークするTADと呼ばれる高周波クロマチン相互作用のドメインを分離します。哺乳類では、TAD境界は、凝集およびCCCTC結合因子(CTCF)6、7、8によって占められます。凝集複合体は、安定したクロマチンループ9、10、13、14を形成するためにゲノム配列において収束配向で配置されたCTCF結合部位においてクロマチンを押し出し、停止する。CTCFDNA結合部位の境界または凝集タンパク質の存在量の減少における遺伝的破壊は、調節要素間の異常な相互作用、TAD形成の喪失、および遺伝子発現調節緩和9、10、11、13、14をもたらす。
ショウジョウバエでは、TAD間の境界は、境界元素関連因子32 kDa(BEAF-32)、モチーフ1結合タンパク質(M1BP)、中心タンパク質190(CP190)、毛深翼(SuHW)の抑制剤、CTCFを含むいくつかのAPによって占められており、活性なトーン修飾およびポリメラーゼII.17において濃縮される。ショウジョウバエでは、TADが転写13、17、19の結果として現れ、境界形成および絶縁特性における独立APの正確な役割はまだ調査中であると示唆されている。したがって、ショウジョウバエのドメインが類似した転写状態の領域の凝集の唯一の結果であるかどうか、またはCTCFを含むAPが境界形成に寄与するかどうかは、完全に特徴づけられるままである。染色体立体構造キャプチャ技術の開発と次世代シーケンシングを通じて、ゲノム接点の高解像度の探索が可能になった。Hi-Cプロトコルは、クロマチンフラグメント間のスプリアスライゲーション産物を回避するために「溶液中」2を行うライゲーションステップで最初に記載した。しかし、いくつかの研究は、データ中の有用なシグナルが溶液20,21になかった部分的に溶解した核で形成されたライゲーション生成物から来たという認識を指摘した。
次に、単細胞Hi-C実験22の一部として核内部のライゲーションを行うようにプロトコルを改変した。核内Hi-Cプロトコルは、その後、ゲノム距離の全範囲にわたってより一貫したカバレッジを生み出し、より少ない技術的なノイズ23、24でデータを生成するために、細胞集団Hi-Cに組み込まれた。ここで詳細に説明するプロトコルは、核内Hi-Cプロトコル23,24の集団に基づいており、ショウジョウバエ25のノッチ遺伝子遺伝子座遺伝子のドメイン境界からCTCFおよびM1BPのDNA結合モチーフを遺伝的に除去した結果を調査するために使用された。この結果は、境界でAPのDNA結合モチーフを変更することは、ノッチドメイン形成、ノッチ座を取り巻く領域におけるより大きなトポロジカル欠陥、および遺伝子発現調節緩和に大きな影響を及ぼすことを示している。これは、ドメイン境界における遺伝的要素が、ショウジョウバエ25におけるゲノムトポロジーおよび遺伝子発現の維持にとって重要であることを示している。
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Protocol
1. 固定
- 1000万のシュナイダーのライン2プラス(S2R+)細胞から始め、室温(RT)で10%のウシ胎児血清(FBS)を含むシュナイダー培地で17.5mLの細胞懸濁液を調製する。
- メタノールフリーホルムアルデヒドを添加し、2%の最終濃度を得る。RTで10分間混ぜてインキュベートし、毎分混ぜるように注意してください。
注意:ホルムアルデヒドは有害な化学物質です。適切な安全衛生規則に従い、ヒュームフードで作業してください。 - グリシンを加えて反応を焼き付け、0.125Mの最終濃度を達成し、混合する。RTで5分間インキュベートし、氷の上で15分間インキュベートします。
- 遠心分離機 400 × G RT で 5 分間、4 °C で 10 分間;上清を捨てる25 mLの冷たいリン酸緩衝生理食塩分でペレットを慎重に再懸濁します。
- 400×gで400gで4°Cで10分間遠心し、上清を捨てます。
注: プロトコルを続行する場合は、手順 2.1 に進み、lysis を使用します。それ以外の場合は、ペレットを液体N2 にフラッシュフリーズし、ペレットを-80°Cに保存します。
2. リシス
- 氷冷ライシスバッファー(10 mM Tris-HCl、pH 8;非イオン界面活性剤の0.2%)( 材料表参照)、10 mM NaCl;1xプロテアーゼ阻害剤)の1mLで細胞を再懸濁し、氷冷ライシスバッファーで体積を10 mLに調整します。106 細胞/mLの1×の濃度を得るためにボリュームを調整します。氷の上で30分間インキュベートし、チューブを反転して2分ごとに混合します。
- 4°Cで5分間300×gで核を遠心し、上清を慎重に捨てます。ペレット1xを1mLの冷たいリシスバッファーで洗浄し、マイクロ遠心チューブに移します。ペレット1xを1mLの冷たい1.25x制限バッファーで洗浄し、各細胞ペレットを360 μLの1.25x制限バッファーに再懸濁します。
- 1管当たり10%ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)11μL(最終濃度0.3%)を加え、ピペット処理で慎重に混合し、37°Cで45分間インキュベートし、700-950rpmで振ります。インキュベーション中に数回塊を破壊するために上下にピペット。
- 非イオン性界面活性剤(10%溶液、材料表を参照)をチューブあたり75μL(10%溶液、 材料表を参照)を加えてSDSをクエンチし、37°Cで45分間インキュベートし、950rpmで振る。インキュベーション中に塊を混乱させるために数回上下にピペット。
注:束が大きく、破壊しにくい場合は、SDSおよび界面活性剤の処理中に回転速度を400rpmに下げます。塊がピペット処理によって分解しにくい場合は、サンプルを2つに分割します。制限バッファー、SDS、および界面活性剤の量を調整する。透過処理を進めます。次に、最小速度(200×g)で核を回転させ、上清を慎重に捨て、サンプルを1X制限バッファに一緒にプールし、消化を進めます。未消化サンプル(UD)として10μLアリコートを取る。
3. 酵素消化
- 1チューブ当たりMbo Iの200単位(U)を加えてクロマチンを消化し、回転しながら4時間から一晩(950rpm)の範囲の37°Cでインキュベートします。
- 翌日、チューブあたりMbo Iを50U追加し、回転しながら2時間37°Cでインキュベートします(950 rpm)。
- 60°Cで20分間チューブをインキュベートすることにより酵素を不活性化する。チューブを氷の上に置きます。
注:10 μL アリコートを消化サンプルとして取ります (D)。
4. DNAのビオチン化終了
- 制限フラグメントのオーバーハングを埋め、DNAの端にビオチンを付けるには、10 mM dCTPをそれぞれ1.5 μL追加し、 dGTP、dTTP、0.4 mMビオチンdATPの20 μL、トリス低EDTA(TLE)バッファーの17.5 μL[10 mM Tris-HCl、0.1 mM EDTA、pH 8.0]、および10 μLの5 U/μLの5 U/μLの全ての断片に断片する。慎重に混ぜ、37°Cで75分間インキュベートします。 30 sの場合は10 sごとに700 rpmで振ります。ライゲーションミックスを準備しながら、氷の上にすべてのチューブを置きます。
5. ライゲーション
- 各消化クロマチン混合物を、ライゲーションミックス(10xライゲーションバッファーの100 μL、10 mg/mLのウシ血清アルブミンの10 μL、T4 DNAリガーゼの15 U、および425 μLの二重蒸留水[ddH2O])に移します。穏やかなピペットで十分に混ぜ、16°Cで一晩インキュベートします。
6. 架橋反転とDNA精製
- 1管あたり50mg/mLプロテイナーゼKを50μL加えてタンパク質を分解し、37°Cで2時間インキュベートします。温度を65°Cに上げることで逆クロスリンクし、一晩インキュベートします。
- 10 mg/mL RNase Aの20 μLを加えてRNAを分解し、37°Cで1時間インキュベートします。
- フェノール:クロロホルム抽出を行い、その後エタノール沈殿を行います。
- 1体積のフェノールクロロホルムを加え、反転によって十分に混ぜ合わせて均質な白相を得る。
注:フェノールは有害な化学物質です。適切な安全衛生規則に従ってください。ヒュームフードで作業します。 - 15,000×gで遠心分離機を15分間使用します。水相を新しい2 mLマイクロ遠心チューブに移します。TLEバッファの100 μLで下層のバック抽出を行い、水相を同じ2 mLチューブに移します。
- 100%エチルアルコール(EtOH)の2体積、酢酸ナトリウム3Mの0.1容量、20mg/mLグリコーゲンの2μLを加えることによってDNAを沈殿させます。2時間から一晩の範囲の期間-20°Cでインキュベートする。
- 4°Cで30分間15,000×gで回転し、氷冷70%EtOHでペレット2倍を洗います。 RTでペレットを乾燥させ、TLEバッファの100 μLで再懸濁します。メーカーの指示に従ってDNAと蛍光計に選択的に結合する蛍光色素を用いてDNAを定量化する(材料表)。
注: プロトコルはここで一時停止することができます。ライゲーション製品は、4 °C(短期)または-20°Cで長期間保存します。品質管理のために、合字サンプル(L)として材料のアリコート(100 ng)を使用してください。
- 1体積のフェノールクロロホルムを加え、反転によって十分に混ぜ合わせて均質な白相を得る。
7. Hi-C テンプレートの品質を評価する
- 消化および結紮の定性的制御
- 架橋を反転させることでUDおよびDアリコートからDNAを精製し、フェノール:クロロホルム抽出およびエタノール沈殿を上述のように行う。
- 1.5%アガロースゲルにUD、D、およびLサンプルの100 ngをロードします。Dサンプルの約500bpを中心としたスミアとLサンプルの高分子量バンドを探します(代表的な結果を参照)。
- 消化効率定量制御
注: 消化効率をより正確に評価するには、UD および D サンプルをテンプレートとして使用し、次のように設計されたプライマーを使用して定量的ポリメラーゼ連鎖反応 (qPCR) を実行します。- 消化に使用される酵素のDNA制限部位を含むDNA断片を増幅するプライマーペア(本プロトコルではMbo I)を、ステップ7.2.3の式でRと呼ぶ。
- 消化に使用される酵素の制限部位を含まない制御DNA断片を増幅するプライマーペアを設計する(本プロトコルのMbo I)、ステップ7.2.3の式でCと呼ばれる。
- 増幅のサイクル閾値(Ct値)を使用して、以下の式に従って制限効率を計算します。
% 制限 = 100 - 100/2{(CtR - CtC)D - (CtR - CtC)UD}
ここでCtRはフラグメントRのCt値を指し、CtCはサンプルDおよびサンプルUDのフラグメントCのCt値を指す。
注:制限率は、制限DNA部位を含まないコントロール(C)DNA断片と比較して制限酵素が制限(R)DNA断片を切断する効率を反映している。80%≥の制限効率が推奨されます。
- 既知の相互作用の検出
- PCRを実行して内部ライゲーションコントロールを増幅し、短距離および/または中距離または長期相互作用を調べます(代表的な結果を参照)。
- あるいは、プライマーが隣接する制限フラグメントにおいて前方または逆方向にあるライゲーション生成物を増幅する設計プライマー。
- 充填およびビオチン標識制御
- 上述したように、ゲノム中の隣接する制限断片間の既知の相互作用またはライゲーション産物の増幅および消化によってHi-Cマーキングおよびライゲーション効率を検証する。
注:Mbo Iサイト(GATC)の正常な充填およびライゲーションは、結紮接合部で制限酵素Cla I(ATCGAT)の新しい部位を生成し、Mbo Iサイトを再生します。 - PCR産物を Mbo I、Cla I、またはその両方で消化します。サンプルを1.5〜2%ゲルで実行した後、カットバンドとノーカットバンド26の強度を定量することにより、3CおよびHi-Cライゲーション接合部の相対数を推定する。
注:70%>の効率が望まれます(代表的な結果を参照)。
- 上述したように、ゲノム中の隣接する制限断片間の既知の相互作用またはライゲーション産物の増幅および消化によってHi-Cマーキングおよびライゲーション効率を検証する。
8. 超音波処理
- サンプルを超音波処理して200-500 bp DNA断片を得る。このプロトコルで使用される装置(材料表を参照)については、サンプル(5~10 μg)を1管当たりdH2Oの130 μLで希釈し、400 bp:充填レベルに超音波処理するように装置を設定します。関税係数: 10% ;ピークインシデント電力(w):140;バーストあたりのサイクル数: 200;時間(s):80。
9. ビオチン除去/終了修復
注:以下に示すステップは、Hi-C DNAの5 μgに合わせて調整されています。
- ビオチン除去を行うために、サンプル(130 μL)を新しいマイクロ遠心分離管に移します。10xライゲーションバッファーの16 μL、10 mM dATP の 2 μL、T4 DNA ポリメラーゼの 5 μL (15U)、および 7 μL の ddH2O (全容量の 160 μL) を加えます。20°Cで30分間インキュベートします。
- 10 mM dNTPs 5 μL、10xライゲーションバッファー4 μL、T4ポリヌクレオチドキナーゼ5 μL(10 U/μL)、クレノウ1 μL、および25 μLのddH2O(総体積200μL)を加えます。20°Cで30分間インキュベートします。
10. サイズの選択
- 主に250-550 bpサイズの範囲の断片を選択するには、最初に0.6xで順次固相可逆固定化(SPRI)サイズ選択を行い、次いでメーカーの指示に従って0.90倍を選択し、100 μLのTLEを使用してDNAを溶出させます。
11. ビオチンプルダウン/Aテーリング/アダプターライゲーション
注:磁性ビーズを渦で再懸濁して、回転ホイールでサンプルを3分間回転させてから、サンプルを短時間回転させて磁気スタンドに置きます。ビーズを磁石に貼り付け、上澄み物を捨て、次の洗浄工程を進めます。回転ホイールの代わりに回転するサーモブロックで55°Cでの打ち付けを行います。
- TLEを使用して、最終ボリュームをサンプルあたり300 μLに設定します。ビーズ洗浄バッファーを準備する:1xトゥイーンバッファー(TB)(TB:5 mMトリスHCl pH 8.0、 0.5 mM EDTA, 1 M NaCl, 0.05% トゥイーン), 0.5x TB, 1x No-Tween バッファー (NTB) (5 mM トリス HCl pH 8.0, 0.5 mM EDTA, 1 M NaCl), 2x NTB.
- ストレプトアビジンにリンクされた磁気ビーズをライブラリごとに150 μL( 材料表を参照)を使用します。ビーズ2xを400μLの1tbで洗います。その後、ビーズを300 μL 2x NTBで再懸濁します。
- ビーズを300 μL Hi-C材料と混合し、回転ホイールでRTで30分間インキュベートし、ビオチンがストレプトアビジンビーズに結合できるようにします。
- 400 μLの0.5x TBでビーズを洗浄し、55°Cで3分間インキュベートし、750 rpmで回転します。1x制限バッファーの200 μLでビーズを洗浄します。
- ビーズを100 μLのdATPテーリングミックス(5 μLの10 mM dATP、10x制限バッファの10 μL、クレノウエキソ-5 μL、ddH2Oの80 μL)で再懸濁します。37°Cで30分間インキュベートします。
- 上清を取り除き、55°Cで3分間インキュベートし、750rpmで回転させることで、ビーズ2xを0.5x TBの400 μLで洗浄します。
- 1x NTBの400 μLでビーズを洗浄し、1xライゲーションバッファーを100 μLで洗浄します。
- ビーズを50 μLの1xライゲーションバッファーに再懸濁し、懸濁液を新しいチューブに移します。4 μL のプレアニール型 PE アダプター (15 μM ストック) と 2 μL の T4 リガーゼ (400 U/μL、すなわち 800 U/チューブ) を追加します。RTで2時間インキュベートする。
注: PE 1.0 および PE 2.0 アダプタ (30 μM ストック) の両方の等量を追加し、RT で 10 分間インキュベートすることでアダプタを事前アニールします( 資料表を参照)。 - 上清を取り除き、400 μLのTBでビーズを2倍洗ってビーズを取り戻します。1x NTBの200 μLでビーズを洗浄し、1x制限バッファを100 μLで洗浄し、ビーズを40 μLの1x制限バッファで再中断します。
12. PCR増幅
- 25 μL ボリュームの PCR を 5、6、7、8 サイクルで設定します。PCR ごとに、次の方法を使用します。
反応レシピ ハイCビーズ 2.5 μL 10 μM PE PCR プライマー 1(材料表) 0.75 μL 10 μM PE PCR プライマー 2(材料表) 0.75 μL 10 mM dNTP 0.6 μL 5x反応バッファー 5 μL DNAポリメラーゼ 0.3 μL ddH2O 14.65 μL トータル 25 μL サイクル 温度 時間 1 98°C 30 s n サイクル 98°C 10 s 65°C 30 s 72°C 30 s 1 72°C 7分
13. 最終 PCR 増幅
- 上記と同じ条件と選択したサイクル数を使用して、最終PCR増幅を行います。50 μL反応で、5 μLのHi-Cビーズをテンプレートとしてサンプルを分割します。
- すべてのPCR反応を収集し、新鮮なチューブに転送します。磁石を使用してストレプトアビジンビーズを除去し、上清(PCR産物)を回収します。新しいチューブにビーズを移し、ステップ11.2.9に示すようにビーズを洗浄し、バックアップとして4°Cの1x制限バッファーに保管します。
- メーカーの指示に従って、SPRIビーズの量0.85倍を使用してPCR製品を精製してください。TLEバッファの30 μLとエルルート。
- 蛍光計測器を使用してHi-Cライブラリを定量化し、チップベースのキャピラリー電気泳動によりライブラリの品質を確認します。
- 最後の品質チェックポイントとして、ステップ12.1で説明したのと同じ条件を使用して10サイクルを使用してPCR反応を行うテンプレートとして、Hi-Cライブラリの1μLを使用します。PCR産物を2つのマイクロ遠心分離チューブに分けます:1つをCla Iで消化し、もう1つをコントロールとして未消化のままにします。1.5-2%アガロースゲルで製品を実行します(代表的な結果を参照)。
- 適切なシーケンスプラットフォーム上で 50 bp または 75 bp ペアエンドシーケンスに進みます。
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Representative Results
以下に、Hi-C プロトコルが正常に機能した結果を示します (図 1Aの Hi-C プロトコル ワークフローの概要を参照してください)。核のHi-C実験の間にはいくつかの品質管理のチェックポイントがある。サンプルアリコートは、(UD)および(D)後に、結紮後(L)と同様にクロマチン制限ステップを回収した。架橋を逆転させ、DNAを精製し、アガロースゲル上で動かした。Mbo Iとの制限が成功した場合、200-1000 bpのスミアが観察された(図1B)。分子の予想サイズは、選択した制限酵素に依存する。ライゲーションが成功した場合、ゲルの上部に高分子量帯が見られた(図1B)。消化効率は、プロトコルに詳述するqPCRによっても確認することができる。許容可能な消化効率は80%以上である(図1C)。
Hi-Cライゲーション効率を詳細に評価するために、プライマーは、プライマーが隣接する制限フラグメントの前方または逆方向にある内部ライゲーション生成物制御を増幅するように設計することができる。あるいは、プライマーは、既知の相互作用を増幅するように設計することができる。 図2A は、ショウジョウバエ25における既知の中距離(300kb)相互作用の増幅を示す。Hi-Cライゲーション産物(ビオチンマーキング、フィルイン、ライゲーションが正常に発生した)は、増幅中に回収されたPCR産物の消化によって推定することができます。充填および結紮後、Hi-Cアンプリコンは、鈍エンドライゲーション時に保存される元のMbo I部位に新しいCla I制限部位を含む。Cla Iの制限が完全でない場合、充填反応とビオチンマーキングは非効率的になります。70% 以上の消化効率は、シーケンス後のライブラリの有用でない読み取りの大部分を避けるために推奨されます (図 2A、3Cの Cla I 消化と Hi-C テンプレートの比較)。
最終的なHi-Cライブラリを増幅するのに十分な数のPCR増幅サイクルを決定するために、プロトコルに記載されているように、ビーズ上の所定のライブラリの2.5 μLを使用してPCR反応を設定しました。最終的な増幅のためのPCRサイクルの数は、スミアが可視であるサイクル数より1サイクル少ない(図2B)。この場合、PCR増幅の4サイクルが選択された。最終的な品質チェックポイントとして、Hi-Cライブラリのアリコートが再増幅され、Cla Iで消化されました。ライブラリの消化のレベル(スミアサイズの減少)は有効なHi-Cペアの豊富さを示し、ライブラリから得られる有用な読み取りの割合を反映している(図2C)。上位サイズ範囲(UDサンプルに存在するサイズによって決定される)とUDおよびDサンプルの底部サイズ範囲の比は、CLA I消化が効率的であれば、UDに対して1 >、消化されたサンプルに対して1≤比率を生成する必要があります。
ペアエンドシーケンス処理の後、FASTQ ファイル ( 表1) は HiCPro28を使用して処理され、生成された統計は MultiQC28を使用してプロットされます。HiCPro の代替ツールは、同様の結果を生成する HiCUP30パイプラインです (図示しません)。図3および表2は、シーケンス読み取りの詳細な統計情報を示す。トリミング後の完全な読み取りアライメントとアライメントが報告されます。これら 2 つのカテゴリは、有効な Hi-C ペアを見つけるために以降の分析で使用される、正常に整列された読み取りに対応します。アライメント後トリミングカテゴリとは、第1のステップでは整列しなかったライゲーション接合部にまたがる読み取りを指し、ライゲーション部位でトリミングして5'端位をゲノム28に再調整する(図3B、Cおよび表2)。接触統計によると、Hi-Cライブラリは、82.2%の有効なペアと7.6%の非有用な読み取りが同じフラグメント自己円、同じフラグメントのダングルエンド、再ライゲーション、フィルタリングペア、ダンプペアカテゴリ(図3A、図3D、および表2)に分類される高品質であった。さらに、PCR重複の数は非常に少なく、ライブラリの複雑さが高く、PCRサイクルが最小限のアーティファクトを導入したことを示しています(図3Eおよび表2)。
一意の有効なHi-Cペアを使用して、ペア分布の基本的な分析をHiCPro27を使用して実行しました。この実験では、20 kbp ≤46.5%のユニークシスコンタクト、20kbp>47.1%のユニークシスコンタクト、および5.8%のユニークなトランスコンタクトを得ました(図3D)。シスからトランス有効なペアへの分布は、同じ染色体内で検出された相互作用の大部分を用いてHi-C実験が成功すると予想される結果に対応した。トランスコンタクトの割合が高い場合は、非効率的な固定を示します。HiCPro27のHi-C有効対を用いて、行列を反復補正および固有ベクトル分解(ICE)30によって正規化し、1kbおよび5kbの分解行列をHiCPlotter30、31、32を用いて生成した。1 kb および 5 kb の解像度で正規化された接触マトリックスは、ショウジョウバエのノッチ遺伝子の軌跡に対して提示されます (図 4A、図 4C、および図 4D)。図4Aでは、ノッチ遺伝子遺伝子座は、AP、ドメインlおよびII、ならびに遺伝子座に沿ったヒストン修飾と共に見ることができる(図4Aおよび表1)。CRISPR-Cas9の削除の設計には、CTCFとM1BPのモチーフが含まれていました(図4B)。
ノッチ座の5'境界(5pN-delta343,表1)でCTCFとM1BPの両方のDNA結合部位を含む領域を削除すると、クロマチン接触の劇的な変化が見られ、ノッチ座内の相互作用が失われ、野生型(WT)と比較して上流TADとの接触が得られる(図4C、D)。最後に、図4Eは、ノッチ遺伝子5'UTRからの制限フラグメントレベルにおけるWTおよび変異型相互作用プロファイルの詳細なパノラマを示し、ノッチ遺伝子遺伝子座との接触の割合の減少および上流ドメインとの接触の増加を示す。ノッチ遺伝子5'UTRの仮想4CビューはHiC-Pro27を用いて得られた。別のツールは、SeqMonk(SeqMonk(RRID:SCR_001913) http:www.bioinformatics.babraham.ac.uk/プロジェクト/セクモンク/で利用可能なHi-Cその他のエンド定量化です。図4に示す全ての結果は、アルザテ・メヒアらら25で説明したように、WTおよび変異型S2R+ショウジョウバエ細胞に核内Hi-Cプロトコルを適用することによって得られた。
図1: 核内ハイC消化およびライゲーション制御. (A) Hi-C プロトコルの概要細胞はホルムアルデヒドと架橋され、クロマチンセグメント(DNA断片:ピンク、パープル)とタンパク質との間に共有結合が生じます。クロマチンは制限酵素(はさみで表される)で消化され、この例では、Mbo I.得られた粘着性末端は、ビオチン化dATP(ダークブルーの円)を含むヌクレオチドで満たされる。DNAは精製され、ビオチン化された接合部はストレプトアビジンコーティングされた磁気ビーズ(灰色の円)を使用して濃縮される。相互作用フラグメントは、次世代のペアエンドシーケンスによって識別されます。(B)2つの生物学的複製(Hi-C 1およびHi-C2)のHi-C消化およびライゲーションの品質管理。Hi-Cライブラリは1.5%のアガロースゲルで解決されました。両方の消化、D、ライブラリは約600 bpのスミアとして実行されます。リゲーテッドサンプル、Ligは、未消化UDサンプルと同様に10kbより大きいかなりタイトなバンドとして実行されます。シグナル強度の違いは、ゲルにロードされたDNAの量が不均一に起因します。(C)(B)と同じ2つの生物学的複製物に対する定量的ポリメラーゼ連鎖反応によるHi-C消化定量制御(Hi-C1及びHi-C2)をプロトコルに詳述したサイクル閾値を用いた。正常な消化は80%の制限≥。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:核中ハイCフィルインおよび鈍エンドライゲーションコントロール(A)充填およびビオチン標識評価染色体Xで300kb離れた断片間の既知の相互作用をコントロールとして使用し、黒矢印(B)のスキームの上部を参照)、プライマー1(左)、プライマー2(右)、表1を用いて増幅し、347bp増幅を生成した。Hi-Cライゲーション生成物は、ライゲーション部位の消化により3C実験で製造されたものと区別することができる。Hi-C接合は、鈍い末端結紮時に形成されるように、元のMbo IサイトでCla Iによって消化された。Hi-Cおよび3C接合は、結合時に制限部位が再生する際にMbo Iで消化された(ゲルの左)。対照的に、3C接合部はMbo IサイトでCla Iによって消化されたのではなく、Mbo I.によってのみCla Iを使用してHi-Cおよび3C製品の消化プロファイルを比較した。53 bpフラグメントは、Hi-C生成物を消化して得られた(Mbo I部位で形成されたCla I部位の制限と、この領域に既に存在するCla I部位の制限のため)。この断片は、利用可能な唯一のCla Iサイトが既に地域に存在していたものであったため、3C産物の消化では観察されなかった。(B) 異なるPCRサイクルを用いたHi-CライブラリのPCR増幅後、1.5%のアガロースゲルで製品を実行した。400-1000 bpの塗抹が予想され、観察された。最終的な増幅 PCR の適切な数サイクルは、スミアがちょうど見えるよりもすぐに低い数として取られる必要があります。(C) 最終図書館 Cla I 消化.最終的なライブラリのアリコートは、Cla Iで再増幅され、消化されました。スミアのサイズ縮小により、ライブラリー内の分子の大部分が有効なHi-Cペアであることを確認した。このゲルの密度分析は、代表結果セクションで詳述されているように、UNとDサンプルの比率を得るために行うことができる。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:Hi-CライブラリのHiC-Pro統計量 (A)有効なHi-Cペアの概略表現と、実験中に生成し、HiCPro27 でフィルタリングすることができる異なるタイプの非有効なペアを表現する(表2)。これには、連続した配列に陥る読み取り、ダングルエンド、同じ断片、自己円、再ライゲーション、およびPCR重複が含まれます。(B) マッピング統計。整列に失敗した読み取りは(グレー)表示され、トリミング後に完全に整列した読み取りと読み取り値の両方がそれぞれ青と水色で表示されます。これら 2 つのカテゴリは、以降の解析で考慮される有用な読み取りを表します。(C) ペアリング統計。マルチ整列読み取り(濃いオレンジ色)は、ゲノム内の複数の領域に整列された読み取りを表します。一意に整列(ダークブルー)読み取りは、ゲノム内で一度整列された読み取りペアを表し、シングルトン(ライトオレンジ)は、両方の読み取りで1つのゲノム領域が配列された読み取りペアを表します。(D) 統計のフィルタリング。有効な読み取りペア(青)は、(A)に記載されているように、成功したHi-Cライゲーション製品を表します。自己フラグメント自己円(薄いピンク)は、(A)に示されているのと同じゲノムフラグメントを表すため、有用でない読み取りです。同じフラグメントのダングリング端(オレンジ)は、単一の制限フラグメントがシーケンスされた読み取りを表します。フィルター処理およびダンプされたペア(茶色)も、サイズが間違っているか、ライゲーション生成物を再構築できなかった、有用でない読み取り値です。最後に、再ライゲーション読み取り(赤)は、隣接する2つの断片が再連結された読み取りを表し、したがって有用でない情報を生成する。(E) ゲノム内の有効な読み取りペアの接触分布。ユニークなシスコンタクト(青)は、ユニークなトランスコンタクト(緑)よりも頻繁です。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図4:WTおよび変異型S2R+細胞のハイC接触行列および仮想4C分析(A)ノッチ遺伝子遺伝子座を中心とした1 kbの分解能で、50 kb領域のHi-C正規化ヒートマップ。この軌跡に対するTAD分離スコア32が示され、ノッチ座を2つの位相ドメイン(ドメイン1およびドメイン2)に分割するとともに示されている。AP の ChIP-seq データ、RNA Pol II、および S2/S2R+ セル34、35、36、37のヒストン マークは、ヒートマップの下に示されています (表 1)。ノッチドメイン 1 境界の位置は、ライト グリーンで強調表示されます。(B)B1境界CRISPR変異体の概略表現。緑色の四角形は、削除された 343 bp 領域を示します。はさみはCRISPR媒介ゲノム編集に使用されるsgRNAを示す。AP のモチーフ バインド サイトは、CTCF および M1BP のボックスとして表示されます。(A) に示されている DNA 結合 AP のピークサミットも35.(C) WT および変異細胞のノッチの中心となる 50 kb の領域をカバーする 1 kb の解像度で、Hi-C 正規化ヒートマップ。左、wtと変異細胞間の相互作用頻度の2の違いのlog2のHi-Cヒートマップ。(D) WT および変異細胞の 5 kb の解像度でノッチの中心となる 250 kb のリージョンをカバーする Hi-C 正規化ヒートマップ。左、wtと変異細胞間の相互作用頻度の2の違いのlog2のHi-Cヒートマップ。(E)WTおよび変異細胞の仮想-4Cは、5'UTRのノッチを視点として用いた。上流のkirredomain-2内の視点と領域との相互作用の割合は、WTおよび変異細胞の両方に対するノッチドメイン1、ノッチドメイン2、および下流dncドメインを示す25を示す。略語: WT = 野生型;TAD = トポロジカルに関連付けられたドメイン;ChIP = クロマチン免疫沈降;AP = 建築タンパク質;RNA Pol = RNA ポリメラーゼ;S2R+ = S2受容体プラス;sg RNA = 単一ガイド RNA;UTR = 未翻訳領域。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
| 実験 | 見本 | GEO アクセス番号 |
| 欠く | CP190 | GSM1015404 |
| 欠く | スフ | GSM1015406 |
| 欠く | モッズ(mdg4) | GSM1015408 |
| 欠く | CTCF | GSM1015410 |
| 欠く | Ibf1 | GSM1133264 |
| 欠く | Ibf2 | GSM1133265 |
| 欠く | ビーフ32 | GSM1278639 |
| 欠く | ピタ | GSM1313420 |
| 欠く | ジッシック | GSM1313421 |
| 欠く | RNA PolII | GSM2259975 |
| 欠く | H3K4me1 | GSM2259983 |
| 欠く | H3K4me3 | GSM2259985 |
| 欠く | H3K27ac | GSM2259987 |
| 欠く | MSL2 | GSM2469507 |
| 欠く | H4K16ac | GSM2469508 |
| 欠く | M1BP | GSM2706055 |
| 欠く | GAF | GSM2860390 |
| 欠く | インプット | GSM1015412 |
| ハイC | S2R+ WT細胞 | GSE136137 |
| ハイC | S2R+ 5pN-デルタ343セル | GSE136137 |
表 1: GEO の受け入数。
| ハイプロ統計 | 読み取り | 百分率 |
| 統計のマッピング | ||
| 完全読み取りアライメント | 131515921 | 82.20% |
| トリムされた読み取り配置 | 16408309 | 10.30% |
| 整列に失敗しました | 12110964 | 7.60% |
| ペアリング統計 | ||
| 一意に整列 | 79428455 | 50.90% |
| シングルトン | 19063418 | 12.20% |
| マルチ整列 | 57700021 | 36.90% |
| 統計のフィルタリング | ||
| 有効なペア | 71373989 | 90.12% |
| 同じフラグメント: 自己円 | 2340697 | 2.90% |
| 同じフラグメント: ダングリングエンド | 2578783 | 3.20% |
| フィルター処理されたペア | 2773043 | 3.50% |
| ダンプされたペア | 196565 | 0.20% |
| お問い合わせ統計 | ||
| ユニーク: シス ≤ 20 kbp | 33108815 | 46.50% |
| ユニーク: シス > 20 kbp | 33539888 | 47.10% |
| ユニーク:トランス | 4133602 | 5.80% |
| 重複読み取りペア | 398400 | 0.60% |
表 2: HiC-Pro 統計
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Discussion
ここで提示される核中のHi-C法は、ショウジョウバエゲノムトポロジーの詳細な探索を高解像度で可能にし、プロモーターおよびエンハンサーなどの調節要素間のクロマチンループからTADおよび大きなコンパートメント識別25までの異なるゲノムスケールでのゲノム相互作用の図を提供する。同じ技術は、いくつかの修飾33を有する哺乳類組織にも効率的に適用されている。例えば、単細胞懸濁液の代わりに組織を処理する場合、組織は70μmのフィルターを通してふるいにかけ、そしてDounceホモジナイザーを使用して材料を均質化しながら、リシスステップを行う。さらに、哺乳類のゲノムがショウジョウバエゲノムより25倍大きいほど、1~5kbの分解能マトリックスを構築するのに必要な有効な読み取りペアの数が多くなります。核内Hi-C法は、結紮前65°Cで1%SDSを有する核ライシスの回避において、元のHi-C法2とは異なり、したがって核完全性を維持し、7mLの代わりに1mLで結紮することにより、24.
このプロトコルには、高効率を保証するための重要な手順がいくつかあります。消化と充填非効率性を導入できる最初のステップは、0.3%のSDSパーメアビライゼーションおよび界面活性剤治療中の塊の形成です。塊が大きく、破壊しにくい場合、SDSおよび界面活性剤の処理中に回転速度を400rpmに下げるべきです。配管によって凝集が分解しにくい場合、透過処理を進める前に制限バッファー、SDS、非イオン界面活性剤を使用してボリュームを調整して、サンプルを 2 つに分割する必要があります。次に、核は最小速度(200×g)で遠心し、上清は慎重に廃棄され、サンプルは消化を進める前に450 μLの1x制限バッファに一緒にプールする必要があります。第二に、消化効率の推定は、充填およびライゲーションに十分なDNA断片を提供するために重要である。定性的評価の際に、消化が非効率的であることが判明した場合、4時間から一晩の範囲の制限酵素で第2ラウンドの消化を行う必要があります。
第3に、結紮効率の推定が重要である。定性的評価の際に、結紮が非効率的であることが判明した場合(すなわち、高分子量帯の代わりに、消化された試料に対して観察されたのと同様のスミアが観察される)、200×gで核を遠心し、新鮮な10xライゲーションバッファーおよびリガライジを使用してそれらを再懸濁させることによって、結紮を繰り返すべきである。第四に、Hi-C有効な製品の割合は、Cla I(Mbo Iのオリジナル消化)と予想される相互作用のPCRアンプリコンを消化することによって推定されるべきである。期待される相互作用の増幅と消化の効率が高く、Hi-C接合の成功と形成を確認します。増幅酵素が効率的でない場合、分子の大部分はHi-C製品の代わりに3Cになり、ライブラリが配列決定される場合は、これを考慮する必要があります。これは、代表結果セクションに記載されているように、最終的なライブラリCla I消化制御を行うことによっても確認することができる。最後に、PCR の重複を避けるために、PCR サイクルの数を少ない値に選択することが重要です。シーケンスの際に、読み取りペアの重複の割合が高い場合、PCR サイクルの数はさらに減少する必要があります。
この核内Hi-C技術には、いくつかの制限があります。まず、ここで説明するプロトコルは、細胞集団に対して行われるHi-C実験を表す。したがって、ゲノム接触の頻度のシグナルは、可変的な個々の立体構造を有する数百万のゲノムを表す。ゲノム接触のセットを単一ゲノムから得るためには、単一細胞のHi-C実験22が推奨される。第二に、Hi-Cは近位DNA断片の結紮に基づいている。したがって、ゲノム領域が大きなタンパク質クロマチン複合体の一部である場合、断片間の距離が結紮を妨げる可能性があります。例えば、ハイC38ではトランスコンタクトが不十分に表現されているのが示されている。さらに、Hi-Cはペアエンドシーケンシングで終了し、ゲノム接点のペアを取得します。しかし、複数のDNA断片が同じクロマチン複合体内で同時に相互作用することができる。クロマチン複合体中の複数のDNA断片の同一性を得るために、代替シーケンシング方法をHi-C39に適用することができ、または、ライゲーションが行われない異なる実験戦略を採用することができる38、40、41。最後に、Hi-Cはゲノム接触を測定するが、相互作用を媒介するタンパク質の同一性を明らかにしていない。別の方法は、特定の目的タンパク質42によって媒介されるゲノム相互作用、または特定のゲノム要素43におけるタンパク質のアンサンブルの同一性を同定するために適用されなければならない。
結論として、ショウジョウバエゲノム(表2)についてここで説明したものとして高品質のHi-C実験を用いて、マトリックスは広い解像度(1、5 kb、50 kb以下)で構築することができます(図4参照)。さらに、ゲノムの特定の領域を制限フラグメントレベルで評価しなければならない場合、データを使用して、所望の視点の仮想4C景観を構築することができる(例えば、図4EのNotch遺伝子5'UTR)。SeqMonk の Hi-C 他端ツールは、この風景の視覚化を可能にする非常にユーザーフレンドリーなオプションです。この景観に、SeqMonk の一部でもある 4C 定量化ツールを適用すると、統計的に有意な接触が得られます。
ここで説明する核中のHi-C実験を、TAD境界で変化したAP DNA結合部位を有する変異細胞株の集合に適用すると、境界で遺伝要素が必要であり、ドメイン内のショウジョウバエゲノムを構造化し、Arzate-Mejíaららが完全に議論したように遺伝子発現調節を維持することが明らかになった。従って、CRISPR/Cas9システムを用いた調節要素の遺伝的編集は、ここで説明する核内Hi-Cプロトコルを用いたゲノム相互作用の高解像プロファイリングと組み合わせることで、遺伝的要素の構造機能をテストする強力な戦略となり得る。
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Disclosures
著者らは競合する利益を宣言しない。
Acknowledgments
この研究は、UNAM技術イノベーション研究支援プログラム(PAPIIT)助成金番号IN207319と科学技術国家評議会(CONACyT-FORDECyT)助成金番号303068によって支援されました。A.E.-L.科学技術国家評議会(CONACyT)CVU番号968128によってサポートされている修士課程の学生です。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 16% (vol/vol) paraformaldehyde solution | Agar Scientific | R1026 | |
| Biotin-14-dATP | Invitrogen | CA1524-016 | |
| ClaI enzyme | NEB | R0197S | |
| COVARIS Ultrasonicator | Covaris | LE220-M220 | |
| Cut Smart | NEB | B72002S | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) 1x | Life Technologies | 41965-039 | |
| Dynabeads MyOne Streptabidin C1 | Invitrogen | 65002 | |
| Fetal bovine serum (FBS) sterile filtered | Sigma | F9665 | |
| Klenow Dna PolI large fragment | NEB | M0210L | |
| Klenow exo(-) | NEB | M0210S | |
| Ligation Buffer | NEB | B020S | |
| MboI enzyme | NEB | R0147M | |
| NP40-Igepal | SIGMA | CA-420 | Non-ionic surfactant for addition in lysis buffer |
| PE adapter 1.0 | Illumina | 5'-P-GATCGGAAGAGCGGTTCAGCAG GAATGCCGAG-3' |
|
| PE adapter 2.0 | Illumina | 5'-ACACTCTTTCCCTACACGACGCT CTTCCGATCT-3' |
|
| PE PCR primer 1.0 | Illumina | 5'-AATGATACGGCGACCACCGAGAT CTACACTCTTTCCCTACACGACG CTCTTCCGATCT-3' |
|
| PE PCR primer 2.0 | Illumina | 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAG ATCGGTCTCGGCATTCCTGCTGA ACCGCTCTTCCGATCT-3' |
|
| Phenol: Chloroform:Isoamyl Alcohol 25:24:1 | SIGMA | P2069 | |
| Primer 1 (known interaction, Figure 2A) | Sigma | 5'-TCGCGGTAATTTTGCGTTTGA-3' | |
| Primer 2 (known interactions, Figure 2A) | Sigma | 5'-CCTCCCTGCCAAAACGTTTT-3' | |
| Protease inhibitor cocktail tablet | Roche | 4693132001 | |
| Proteinase K | Roche | 3115879001 | |
| Qubit | ThermoFisher | Q33327 | |
| RNAse | Roche | 10109142001 | |
| SPRI Beads | Beckman | B23318 | |
| T4 DNA ligase | Invitrogen | 15224-025 | |
| T4 DNA polymerase | NEB | M0203S | |
| T4 polynucleotide kinase (PNK) | NEB | M0201L | |
| TaqPhusion | NEB | M0530S | DNA polymerase |
| Triton X-100 | Non-ionic surfactant for quenching of SDS |
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