Summary
게놈은 핵 공간에서 염색체 형성 포획 기술을 통해 드러나게 할 수 있는 다른 구조물로 조직됩니다. 핵 내 Hi-C 방법은 드로소필라 세포주에서 크로마티닌 상호작용의 게놈 전체 컬렉션을 제공하며, 이는 제한 단편 수준에서 메가베이스 해상도로 탐색할 수 있는 접촉 맵을 생성합니다.
Abstract
게놈은 도메인 간의 상호 작용을 격리하는 경계에 의해 구분되는 토폴로지적으로 연관된 도메인(TADs)으로 구성됩니다. Drosophila에서 TAD 형성과 경계의 기본 메커니즘은 여전히 조사 중입니다. 여기에 설명된 핵 내 Hi-C 방법의 적용은 노치 유전자를 분리하는 TAD 경계에서 건축 단백질(AP)결합 부위의 기능을 해부하는 데 도움이 되었다. AP의 손실을 일으키는 도메인 경계의 유전자 변형은 TAD 융합, 전사 결함 및 장거리 토폴로지 변경을 초래합니다. 이 결과는 Drosophila에 있는 도메인 경계 형성 및 유전자 발현 통제에 유전 요소의 기여를 보여주는 증거를 제공했습니다. 여기서, 핵 내 Hi-C 방법은 프로토콜과 함께 실험의 품질을 평가하기 위한 중요한 체크포인트를 제공하는 상세하게 기술되었다. 또한 다른 게놈 비늘에서 게놈 상호 작용을 분석하기 위해 시퀀싱 판독 및 유효한 Hi-C 쌍의 필요한 숫자가 도시되어 있습니다. CRISPR/Cas9 매개 유전자 편집 은 규제 요소의 유전자 편집 및 이 핵 내 Hi-C 프로토콜을 사용하여 게놈 상호 작용의 고해상도 프로파일링은 유전 적 요소의 구조적 기능의 조사를위한 강력한 조합이 될 수 있습니다.
Introduction
진핵생물에서, 게놈은1단계도중 핵 공간에 있는 특정 영토를 차지하는 염색체로 분할된다. 염색체를 형성하는 염색체는 두 개의 주요 국가로 나눌 수 있습니다: 전사적으로 허용되는 접근 가능한 크로마틴 의 하나, 그리고 전사적으로 억압되는 소형 크로마틴의 다른. 이 크로마틴 상태는 핵2에두 개의 뚜렷한 구획을 형성하여 핵 공간에서 분리하고 거의 혼합되지 않습니다. 서브 메가베이스 척도에서 경계는 염색체조직3,4,5를표시하는 TAD라는 고주파 크로마틴 상호 작용의 도메인을 분리합니다. 포유류에서 TAD 경계는 응집력 및 CCCTC 결합 계수(CTCF)6,7,8에의해 점령된다. 응집력 복합체는 크롬라틴을 압출하고 유전체 서열에서 수렴 방향으로 배치되는 CTCF 결합 부위에서 정지하여 안정적인 크로마틴 루프9,10,13,14를형성한다. CTCF DNA 결합 부위의 유전적 중단은 CTCF 및 응집력 있는 단백질 풍부의 경계 또는 감소로 조절 원소, TAD 형성의 손실 및 유전자 발현 완화9,10, 11,13,14사이의 비정상적인 상호 작용을 초래한다.
드로소필라에서, TAD사이의 경계는 경계 요소 관련 인자 32 kDa(BEAF-32), 모티프 1 결합 단백질(M1BP), 센트로소말 단백질 190(CP190), 털이 날개(SuHW), 및 CTCF를 포함한 여러 EP에 의해 점유되고, 그의 변형 및18,18,폴리머1에서 풍부하게 된다. 드로소필라에서는13,17,19의전사의 결과로 TAD가 나타나고 경계 형성 및 절연 특성에서 독립적 인 AP의 정확한 역할은 아직 조사 중입니다. 따라서, Drosophila의 도메인이 유사한 전사 상태의 영역 집합의 유일한 결과인지 또는 CTCF를 포함한 AP가 경계 형성에 기여하는지 여부는 완전히 특징지어져야 한다. 차세대 시퀀싱과 결합된 염색체 형태 포획 기술의 개발을 통해 고해상도에서 게놈 접촉의 탐사가 가능해졌습니다. Hi-C 프로토콜은 크로마틴 단편 간의 스퓨리어스 결찰 제품을 피하기 위해 "솔루션"2를 수행한 결찰 단계로 처음 설명되었다. 그러나, 여러 연구는 데이터에서 유용한 신호가 용액20,21에없었던 부분적으로 리세드 핵에서 형성된 결찰 제품으로부터 왔다는 것을깨달았다.
그런 다음 프로토콜은 단일 세포 Hi-C실험(22)의일부로 핵 내부의 결찰을 수행하도록 수정하였다. 핵 내 Hi-C 프로토콜은 이후 세포 인구 Hi-C에 통합되어 전체 범위의 게놈 거리에서 보다 일관된 커버리지를 산출하고 덜 기술적노이즈(23,24)로데이터를 생성한다. 여기서 상세히 기술된 프로토콜은, 핵 내의정서(23,24)를 기반으로 하며 드로소필라(Drosophila)의 노치 유전자 궤적에서 도메인 경계에서 CTCF 및 M1BP에대한 DNA 결합 모티브를 유전적으로 제거하는 결과를 조사하는 데 사용되었다. 결과는 경계에 있는 AP를 위한 DNA 결합 모티프를 바꾸는 것은 노치 도메인 형성, 노치 메큐를 둘러싼 지역에 있는 더 큰 토폴로지 결함 및 유전자 발현 변압에 대한 과감한 결과를 가지고 있다는 것을 보여줍니다. 이것은 도메인 경계에 있는 유전 원소가 Drosophila25에있는 게놈 토폴로지 및 유전자 발현의 유지를 위해 중요하다는 것을 표시합니다.
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Protocol
1. 고정
- 1,000만 개의 슈나이더 라인 2 플러스(S2R+) 세포로 시작하여 실온(RT)에서 10%의 태아 소 혈청(FBS)을 함유한 슈나이더 배지에서 세포 현탁액 17.5mL를 준비합니다.
- 메탄올이 없는 포름알데히드를 첨가하여 최종 농도를 2%로 얻습니다. RT에서 10분 동안 혼합하고 인큐베이션을 사용하여 매 분마다 섞어 주시합니다.
참고: 포름알데히드는 유해 화학물질입니다. 적절한 건강 및 안전 규정을 따르고 연기 후드에서 작업하십시오. - 글리신을 첨가하여 반응을 담결하여 0.125 M의 최종 농도를 달성하고 혼합한다. RT에서 5분 동안 배양하고 얼음에 15분이 면됩니다.
- 400 × G의 원심분리기는 RT에서 5분 동안, 그리고 4°C에서 10분 동안; 상부체를 폐기합니다. 차가운 1x 인산염 완충식식염 의 25 mL에서 조심스럽게 펠릿을 다시 중단합니다.
- 4°C에서 10분 동안 400 × g의 원심분리기는 상수부를 폐기합니다.
참고: 프로토콜을 계속 계속하면 용해의 경우 2.1단계로 이동하십시오. 그렇지 않으면, 액체 N2에 펠릿을 플래시 동결하고 -80 °C에 펠릿을 저장합니다.
2. 리시스
- 얼음-차가운 용해 완충제(10m Tris-HCl, pH 8; 비이온 계면활성제의 0.2%)로 세포를 재연하고,10mMM NaCl; 1x 프로테아제 억제제 참조), 얼음 냉기 용해 완충제로 10mL로 체적을 조절한다. 1 × 106 셀/mL의 농도를 얻기 위해 부피를 조정합니다. 30분 동안 얼음에 배양하여 튜브를 반전시켜 2분간격으로 섞습니다.
- 4°C에서 5분 동안 300 × g에서 핵을 원심분리한 다음 주체를 조심스럽게 폐기합니다. 차가운 리시스 버퍼 1mL로 펠릿 1x를 씻고 마이크로 센트심분리기 튜브로 옮춥니까. 1mL의 차가운 1.25x 제한 버퍼로 펠릿 1x를 세척하고 각 셀 펠릿을 1.25x 제한 버퍼의 360 μL로 재보설한다.
- 튜브 당 10% 나트륨 도데딜 황산염(SDS)의 11μL을 넣고 튜브(0.3% 최종 농도)로 조심스럽게 섞고, 37°C에서 45분 동안 배양하고 700-950 rpm에서 흔들어 주세요. 배양 중에 몇 번 덩어리를 방해하기 위해 위아래로 파이프.
- 비이온 계면활성제의 75 μL(10% 용액, 재료표참조)을 튜브당 (1.6% 최종 농도)를 추가하고, 37°C에서 45분 동안 배양하여 950rpm에서 흔들어 SDS를 담급니다. 인큐베이션 중에 덩어리를 방해하기 위해 몇 번 위아래로 파이프.
참고: 덩어리가 크고 방해가 어려운 경우 SDS 및 계면 활성제 치료 중 회전 속도를 400rpm으로 줄입니다. 덩어리가 파이펫팅으로 분해되기 어려운 경우 샘플을 두 개로 분할합니다. 제한 버퍼, SDS 및 계면 활성제의 볼륨을 조정합니다. 투과성화를 진행한다. 다음으로, 최소 속도(200 × g)로핵을 회전시키고, 주체를 조심스럽게 버리고, 1X 제한 버퍼로 샘플을 함께 풀링하고, 소화를 진행한다. 소화되지 않은 샘플(UD)으로 10 μL 알리쿼트를 가져 가라.
3. 효소 소화
- 크롬토닌을 튜브당 Mbo I의 200대(U)를 추가하여 소화하고, 회전시 4시간에서 하룻밤 사이에 37°C에서 배양한다(950rpm).
- 다음 날에는 튜브당 50U의 Mbo I를 추가하고 회전하는 동안 37 °C에서 2 시간 동안 배양하십시오 (950 rpm).
- 20 분 동안 60 °C에서 튜브를 배양하여 효소를 비활성화합니다. 튜브를 얼음 위에 놓습니다.
참고: 소화된 샘플(D)으로 10 μL 알리쿼트를 섭취하십시오.
4. DNA 끝의 생물학적
- 제한 조각 오버행을 채우고 DNA 끝을 비오틴으로 표시하려면 각각 10mM dCTP의 1.5 μL을 추가하십시오. dGTP, dTTP, 0.4mm 비오틴 dATP의 20 μL, 트리스 저-EDTA(TLE) 버퍼의 17.5 μL [10m MM Tris-HCl, 0.1 mM EDTA, pH 8.0], 클렘의 5 U/μL(DNA) 37°C에서 75분 동안 조심스럽게 섞어서 배양합니다. 30 s에 대 한 10 s 마다 700 rpm에서 흔들어. 결찰 믹스를 준비하는 동안 모든 튜브를 얼음 위에 놓습니다.
5. 결찰
- 각 소화된 크로마틴 혼합물을 결찰 혼합으로 별도의 1mL 튜브로 옮기십시오(10x 결찰 버퍼의 100 μL, 10 mg/mL 소 세럼 살부 알부민의 10 μL, T4 DNA 리게아제 의 U 15, 이중 증류수 425 μL[ddH2O]). 부드러운 파이펫팅으로 철저히 섞고 16°C에서 하룻밤 동안 배양합니다.
6. 크로스 링크 반전 및 DNA 정화
- 튜브 당 10 mg / mL Proteinase K의 50 μL을 첨가하여 단백질을 저하시키고 2 시간 동안 37 °C에서 배양하십시오. 온도를 65°C로 높이고 하룻밤 동안 배양하여 크로스링크를 역방향으로 연결합니다.
- RNA를 10 mg/mL RNase A의 20 μL을 첨가하여 RNA를 저하시키고, 1h에 대해 37°C에서 배양한다.
- 페놀:클로로폼 추출을 수행한 다음 에탄올 강수량을 수행합니다.
- 페놀 클로로폼 1부피를 넣고 반전으로 철저히 섞어 균일한 백색 상을 얻습니다.
참고: 페놀은 유해한 화학물질입니다. 적절한 건강 및 안전 규정을 따르십시오. 연기 후드에서 작업. - 15분 × 동안 15,000 g의 원심분리기. 수성 상면을 신선한 2mL 마이크로센심심분리기 튜브로 옮기. TLE 버퍼의 100 μL로 하부 층의 백 추출을 수행하고 수성 위상을 동일한 2mL 튜브로 옮춥니까.
- 100% 에틸 알코올(EtOH), 3M 나트륨 아세테이트의 0.1부, 20 mg/mL 글리코겐의 2μL을 첨가하여 DNA를 침전시한다. -20°C에서 하룻밤 사이에 2h에 이르는 기간 동안 배양한다.
- 4°C에서 30분 동안 15,000 × g에서 회전하고, 얼음차가운 70% EtOH로 펠릿 2x를 세척합니다. RT에서 펠릿을 건조하고 TLE 버퍼의 100 μL에서 다시 중단하십시오. 제조 업체의 지침(재료의 표)에따라 DNA와 불소계에 선택적으로 결합하는 불소 염료를 사용하여 DNA를 정량화한다.
참고: 프로토콜은 여기에서 일시 중지할 수 있습니다. 단기 또는 -20 °C에서 장기적으로 4 °C에서 리기션 제품을 저장합니다. 품질 관리를 위해 리게티드 샘플(L)으로 재료의 알리쿼트(100 ng)를 사용한다.
- 페놀 클로로폼 1부피를 넣고 반전으로 철저히 섞어 균일한 백색 상을 얻습니다.
7. Hi-C 템플릿 품질 평가
- 소화 및 결찰 질적 컨트롤
- 교차 링크를 반전시켜 UD 및 D 알리쿼트에서 DNA를 정화하고, 위에서 설명한 바와 같이 페놀:클로로폼 추출 및 에탄올 침전을 수행한다.
- 1.5% 아가로즈 젤에 UD, D 및 L 샘플의 100 ng를 로드합니다. L 샘플에 대 한 높은 분자 량 대역 대 D 샘플에서 500 bp 를 중심으로 얼룩을 찾습니다 (대표 결과 참조).
- 소화 효율 정량 제어
참고: 소화 효율을 보다 정확하게 평가하기 위해 UD 및 D 샘플을 템플릿으로 사용하여 다음과 같이 설계된 프라이머를 사용하여 정량적 폴리머라제 연쇄 반응(qPCR)을 수행합니다.- 7.2.3 단계에서 포뮬러에서 R이라고 불리는 소화(현재 프로토콜에서 Mbo I)를 위해 사용되는 효소에 대한 DNA 제한 부위를 포함하는 DNA 단편을 증폭시키는 프라이머 쌍을 설계한다.
- 7.2.3 단계에서 C라고 불리는 소화에 사용되는 효소(Mbo I)에 대한 제한 부위를 포함하지 않는 대조군 DNA 단편을 증폭시키는 프라이머 쌍을 설계한다.
- 아래 표시된 수식에 따라 제한 효율을 계산하기 위해 증폭의 주기 임계값(Ct 값)을 사용합니다.
% 제한 = 100 - 100 /2{(CtR - CtC)D - (CtR - CtC)UD}
CtR이 조각 R의 Ct 값을 참조하고 CtC는 샘플 D 및 샘플 UD용 조각 C의 Ct 값을 나타냅니다.
참고: 제한 백분율은 제한 DNA 부위를 포함하지 않는 대조군(C) DNA 단편에 비해 제한된(R) DNA 단편을 분비하는 제한 효소의 효율을 반영한다. 80%≥ 제한 효율을 권장합니다.
- 알려진 상호 작용 감지
- PCR을 수행하여 내부 결찰 제어를 증폭하여 단거리 및/또는 중장거리 상호 작용을 검사합니다(대표 결과 참조).
- 또는 프라이머가 인접한 제한 조각에서 전방 또는 역방향 방향에 있는 계각 생성물을 증폭하도록 설계 할 수 있습니다.
- 채우기 및 비오틴 라벨링 제어
- 위에서 설명한 바와 같이 게놈내의 인접 제한 단편 간의 알려진 상호 작용 또는 결찰 생성물의 증폭 및 소화에 의한 Hi-C 마킹 및 결찰 효율을 검증한다.
참고: Mbo I 사이트(GATC)의 성공적인 채우기 및 결찰은 결찰 접합부에서 제한 효소 Cla I(ATCGAT)에 대한 새로운 부위를 생성하고 Mbo I 사이트를 재생합니다. - Mbo I, Cla I 또는 둘 다로 PCR 제품을 소화합니다. 1.5-2% 젤에서 샘플을 실행한 후, 컷 및 절단 해제밴드(26)의강도를 정량화하여 3C 및 Hi-C 계합 접합의 상대적 수를 추정한다.
참고: 70%> 효율이 필요합니다(대표 결과 참조).
- 위에서 설명한 바와 같이 게놈내의 인접 제한 단편 간의 알려진 상호 작용 또는 결찰 생성물의 증폭 및 소화에 의한 Hi-C 마킹 및 결찰 효율을 검증한다.
8. 초음파 처리
- 200-500 bp DNA 단편을 얻기 위해 샘플을 초음파 처리합니다. 이 프로토콜에 사용되는 계측기의 경우(재료표참조), 튜브당 ddH2O의 130 μL에서 샘플을 희석하고 400 bp로 초음파 처리하도록 계측기를 설정: 채우기 레벨: 10; 관세 요인: 10%; 피크 인시던트 전원(w): 140; 버스트당 사이클: 200; 시간(들): 80.
9. 비오틴 제거/엔드 수리
참고: 아래 표시된 단계는 Hi-C DNA 의 5 μg에 대해 조정됩니다.
- 비오틴 제거를 수행하기 위해 시료(130 μL)를 신선한 미세 원심 분리기 튜브로 옮기십시오. 10x 결찰 버퍼 16μL, 10mM dATP 2μL, T4 DNA 폴리머라제 5μL(15U), ddH2O(총 부피 160μL)를 추가합니다. 20 °C에서 30 분 동안 배양하십시오.
- 10mM dNTPs5 μL, 10배 결찰 버퍼 4μL, T4 폴리뉴클레오티드 키나아제 5μL(10 U/μL), 클레나우 1μL, ddH2O(총부피 200μL)를 추가합니다. 20 °C에서 30 분 동안 배양하십시오.
10. 크기 선택
- 주로 250-550 bp 크기 범위에서 조각을 선택하려면 순차적 고체 위상 가역 고정(SPRI) 크기 선택을 0.6배로 먼저 수행하고 제조업체의 지침에 따라 0.90배, TLE100 μL을 사용하여 DNA를 엘ute한다.
11. 비오틴 풀다운/A-테일링/어댑터 리칭
참고: 소용돌이에 의해 자기 구슬을 다시 일시 중지하고, 회전 휠에서 3분 동안 샘플을 회전한 다음, 샘플을 잠시 회전시켜 자기 스탠드에 놓음으로써 세서스를 수행합니다. 구슬이 자석에 달라붙고, 상체를 버리고, 다음 세척 단계를 진행하도록 한다. 회전 휠 대신 회전하여 열 블록에서 55°C에서 세차작업을 수행합니다.
- 최종 부피를 TLE로 샘플당 300 μL로 구성하여 풀다운합니다. 비드 세척 버퍼 준비: 1x 트위엔 버퍼 (TB) (TB: 5 mM Tris-HCl pH 8.0, 0.5 mM EDTA, 1 M NaCl, 0.05% 트위엔), 0.5x TB, 1x 노-트웬 버퍼(NTB) (5mM Tris-HCl pH 8.0, 0.5 mM EDTA, 1 M NaCl), 2x NTB.
- 라이브러리당 스트렙타비딘과 연결된 자기 구슬 150μL을 사용하십시오(재료표참조). 1x TB의 400 μL로 구슬 2배 세척합니다. 그런 다음 300 μL 2x NTB로 구슬을 다시 일시 중지합니다.
- 구슬을 300 μL Hi-C 재료와 혼합하고 회전 휠에서 30분 동안 RT에서 인큐베이션하여 비오틴이 스트렙타비딘 구슬에 결합할 수 있도록 합니다.
- 구슬을 0.5배 TB400μL로 세척하고 55°C에서 3분 동안 배양하여 750rpm에서 회전합니다. 1x 제한 버퍼의 200 μL에서 구슬을 세척합니다.
- dATP 테일링 믹스의 100 μL (10mM dATP의 5 μL, 10 x 제한 버퍼의 10 μL, Klenow 엑소의 5 μL, ddH2O의 80 μL)의 구슬을 재연합니다. 37 °C에서 30 분 동안 배양하십시오.
- 상류제를 제거하고, 55°C에서 3분 동안 배양하고 750 rpm에서 회전하여 0.5배 TB의 400 μL로 구슬 2x를 세척한다.
- 구슬을 1x NTB의 400 μL로 씻은 다음 1x 결찰 버퍼의 100 μL로 세척합니다.
- 1x 계합 버퍼의 50 μL에서 구슬을 다시 중단하고 현탁액을 새 튜브로 옮기습니다. 사전 어댑터(15μM 스톡)와 T4 리개제 2μL(400 U/μL, 즉 800 U/Tube)의 4μL을 추가합니다. 2 시간 동안 RT에서 인큐베이션하십시오.
참고: PE 1.0 및 PE 2.0 어댑터(30μM 스톡)의 동일한 볼륨을 추가하고 RT에서 10분 동안 인큐베이팅하여 어댑터를 미리 작성합니다(재료 표참조). - 슈퍼나탄을 제거하고 400 μL의 TB로 구슬 2x를 세척하여 구슬을 다시 캡처합니다. 1x NTB의 200 μL로 구슬을 씻은 다음 1배 제한 버퍼의 100 μL로 구슬을 세척하고 1배 제한 버퍼의 40μL로 구슬을 재제한합니다.
12. PCR 증폭
- 5, 6, 7 및 8 사이클로 25 μL 부피의 PcR을 설정합니다. 각 PCR에 대해 다음을 사용하십시오.
반응 레시피 하이-C 구슬 2.5 μL 10 μM PE PCR 프라이머 1 (재료 의 표) 0.75 μL 10 μM PE PCR 프라이머 2 (재료 의 표) 0.75 μL 10mM dNTP 0.6 μL 5x 반응 버퍼 5 μL DNA 폴리머라제 0.3 μL ddH2O 14.65 μL 합계 25 μL 사이클 온도 시간 1 98 °C 30 s n 주기 98 °C 10 s 65 °C 30 s 72 °C 30 s 1 72 °C 7분
13. 최종 PCR 증폭
- 위에서 설명한 것과 동일한 조건과 선택한 사이클 수를 사용하여 최종 PCR 증폭을 수행합니다. 50 μL 반응에서 5 μL의 Hi-C 구슬을 템플릿으로 사용하여 샘플을 분할합니다.
- 모든 PCR 반응을 수집하고 신선한 튜브로 전송합니다. 자석을 사용하여 스트렙타비딘 구슬을 제거하고 상체(PCR 제품)를 복구합니다. 구슬을 신선한 튜브로 옮기고, 11.2.9 단계에서 표시된 대로 구슬을 세척하고, 백업으로서 4°C에서 1x 제한 버퍼에 저장한다.
- 제조업체의 지침에 따라 SPRI 구슬의 부피0.85배를 사용하여 PCR 제품을 정화합니다. 30μL의 TLE 버퍼를 갖춘 엘루트.
- 불소 계측기를 사용하여 Hi-C 라이브러리를 정량화하고 칩 기반 모세관 전기포광에 의한 라이브러리의 품질을 확인합니다.
- 마지막 품질 검사점으로서 Hi-C 라이브러리의 1 μL을 템플릿으로 사용하여 12.1 단계에서 설명된 동일한 조건을 사용하여 10사이클을 사용하여 PCR 반응을 수행합니다. PCR 제품을 두 개의 미세원심분리기 튜브로 나눕니다: Cla I로 하나를 소화하고 다른 하나는 대조군으로 소화되지 않은 상태로 둡니다. 1.5~2% 아가로즈 젤로 제품을 실행합니다(대표 결과 참조).
- 적절한 시퀀싱 플랫폼에서 50bp 또는 75bp 페어링 엔드 시퀀싱으로 진행합니다.
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Representative Results
다음은 성공적인 Hi-C 프로토콜의 결과입니다(그림 1A의Hi-C 프로토콜 워크플로우 요약 참조). 핵 하이-C 실험 중에는 여러 가지 품질 관리 검사점이 있습니다. 샘플 알리쿼트는 (UD) 및 후 (D) 크로마틴 제한 단계뿐만 아니라 결찰 후(L)를 수집하였다. 크로스링크는 반전되었고, DNA는 정제되어 아가로즈 젤로 실행되었다. Mbo에 대한 제한이 성공했을 때 200-1000 bp의 얼룩이 관찰되었습니다(도1B). 분자의 예상 크기는 선택의 제한 효소에 따라 달라집니다. 결찰이 성공하면, 높은 분자량 대역이 겔의 상부에서보였다(도 1B). 소화 효율은 또한 프로토콜에 상세히 설명된 바와 같이 qPCR에 의해 확인될 수 있다. 허용 가능한 소화 효율은 80%이상입니다(그림 1C).
Hi-C 결찰 효율을 자세히 평가하기 위해 프라이머는 프라이머가 인접한 제한 조각에서 전방 또는 역방향 방향에 있는 내부 리그레이션 제품 제어를 증폭하도록 설계될 수 있습니다. 또는 프라이머는 알려진 상호 작용을 증폭하도록 설계될 수 있습니다. 도 2A는 드로소필라(25)에서 공지된 중거리(300kb) 상호작용의 증폭을 나타낸다. Hi-C 결찰 제품(비오틴 마킹, 채우기 및 결찰이 성공적으로 발생한 경우) 증폭시 회수된 PCR 제품의 소화에 의해 추정될 수 있다. 채우기 및 결찰 후 Hi-C 앰플리콘에는 무딘 끝 결찰시 보존되는 원래 Mbo I 사이트에 새로운 Cla I 제한 사이트가 포함됩니다. Cla I에 대한 제한이 완료되지 않으면 채우기 반응 및 비오틴 마킹이 비효율적입니다. 70% 이상의 소화 효율은 시퀀싱 후 라이브러리에 대해 유용하지 않은 읽기의 큰 비율을 갖지 않도록 하는 것이좋습니다(도 2A,3C의 클라 I 소화를 비교하고 Hi-C 템플릿과 비교).
최종 Hi-C 라이브러리를 증폭하기 위해 적절한 수의 PCR 증폭 주기를 결정하기 위해 프로토콜에 설명된 대로 구슬에 지정된 라이브러리의 2.5 μL을 사용하여 PCR 반응을 설정했습니다. 최종 증폭을 위한 PCR 사이클의 수는 얼룩이 보이는 사이클 수보다 한 사이클 미만이다(도2B). 이 경우 PCR 증폭의 4 주기를 선택했다. 최종 품질 검사점으로, Hi-C 라이브러리의 알리쿼트가 다시 증폭되어 Cla I로 소화되었습니다. 라이브러리의 소화 수준(얼룩 크기의 감소)은 유효한 Hi-C 쌍의 풍부를 나타내며라이브러리(그림 2C)에서얻을 수 있는 유용한 읽기의 비율을 반영합니다. UD 및 D 샘플 모두에서 상부 크기 범위(UD 샘플에 존재하는 크기에 의해 결정)와 하단 크기 범위의 비율은 UD에 대한 > 1및 Cla I 소화가 효율적인 경우 소화된 샘플에 대한 ≤ 비율을 생성해야 한다.
페어링 엔드 시퀀싱 후 FASTQ파일(표 1)은HiCPro28을 사용하여 처리되었으며 MultiQC28을사용하여 생성된 통계를 플로팅하였다. HiCPro의 대체 도구는 유사한 결과를 생성하는 HiCUP30 파이프라인입니다(도시되지 않음). 도 3 및 표 2는 시퀀스된 읽기의 자세한 통계 정보를 보여 준다. 트리밍 후 전체 읽기 정렬 및 정렬이 보고됩니다. 이 두 범주는 유효한 Hi-C 쌍을 찾기 위해 후속 해석에 사용되는 성공적으로 정렬된 읽기에 해당합니다. 정렬 후 트리밍 범주는 첫 번째 단계에서 정렬되지 않고 계합 부위에서 트리밍되어게놈(28)에 5'단위를 재정렬하는 계측 접합 접합을 아우르는 판독을 의미한다(그림 3B,C 및 표 2). 접촉 통계에 따르면 Hi-C 라이브러리는 82.2%의 유효 쌍과 7.6%의 비유용읽기가 동일한 단편 셀프 서클, 동일 조각 매달려 단면, 재결진, 필터링된 쌍 및 덤프된 쌍범주(그림 3A, 그림 3D및 표 2)에속하는 고품질임을 보여줍니다. 더욱이, PCR 중복의 수는 매우 낮기 때문에 라이브러리 복잡성이 높고 PCR 주기가 최소한의 아티팩트(그림3E 및 표 2)를도입했음을 나타냅니다.
고유한 유효한 Hi-C 쌍을 사용하여 HiCPro27을사용하여 쌍 분포의 기본 분석을 수행했습니다. 이 실험은 20kbp, 47.1%의 고유 시스 접점은 20kbp, > 20kbp, 5.8%의 고유트랜스 접점은 46.5%≤. 동일한 염색체 내에서 검출된 대부분의 상호작용을 가진 성공적인 Hi-C 실험에 대해 예상되는 결과에 대응하는 Cis의 분포가 유효한 쌍을 트랜스로 변환합니다. 트랜스 접문의 비율이 높음은 비효율적인 고정을 나타냅니다. HiCPro27의Hi-C 유효한 쌍을 사용하여, 행렬은 반복 보정 및 eigenvector 분해(ICE)30에 의해 정상화되었고, 1kb 및 5 kb 해상도 행렬은HiC플로터30,31,32를사용하여 생성되었다. 정규화된 접촉 행렬은 1kb 및 5 kb 해상도로 드로소필라의 노치 유전자 궤적(도4A, 도 4C및 도 4D)에대해 제시된다. 도 4A에서, 노치 유전자 궤적은 궤적(도4A 및 표 1)을따라 AP, 도메인 l 및 II뿐만 아니라 히스톤 변형과 함께 볼 수 있다. CRISPR-Cas9 삭제의 디자인은 CTCF와 M1BP(그림 4B)의모티프를 포함했다.
노치 로커스(5pN-delta343, 표 1)의5' 경계에서 CTCF 및 M1BP DNA 결합 부위를 모두 포함하는 영역의 삭제 시 크로마틴 접점의 극적인 변화는 노치 로커스 내부의 상호 작용손실과 야생형(WT)에비해 상류 태드와의 접촉이득을 통해 관찰될 수 있다. 마지막으로, 도 4E는 노치 유전자 5'UTR로부터제한 단편 수준에서 WT 및 돌연변이 상호 작용 프로파일의 상세한 파노라마를 나타내며, 노치 유전자 궤적과의 접촉 비율의 감소와 업스트림 도메인과의 접촉 증가를 나타낸다. 노치 유전자 5' UTR의 가상 4C 뷰는 HiC-Pro27을사용하여 수득하였다. 대체 도구는 SeqMonk (SeqMonk (RRID:SCR_001913) http:www.bioinformatics.babraham.ac.uk/project/seqmonk/에서 사용할 수 있는 Hi-C 의 다른 끝 정량입니다. 도 4에 제시된 모든 결과는 Arzate-Mejía 외25에의해 기술된 바와 같이 WT 및 돌연변이 S2R+ Drosophila 세포에 있는 핵 하이-C 프로토콜을 적용하여 얻어졌다.
그림 1: 핵 내 Hi-C 소화 및 결찰 제어. (A)Hi-C 프로토콜 개요. 세포는 포름알데히드와 교차 연결되어 크로마티닌 세그먼트 (DNA 단편 : 분홍색, 보라색) 및 단백질 사이의 공유 연결의 결과. 크로마틴은 제한 효소 (가위로 표현됨)로 소화되며,이 예에서 Mbo I. 결과 끈적 끈적한 끝은 바이오티니징 dATP(다크 블루 원)를 포함하는 뉴클레오티드로 채워져 있습니다. DNA는 정제되고, 생체화 접합은 연쇄타비딘 코팅 마그네틱 비즈(회색 원)를 사용하여 풍부해합니다. 상호 작용 조각은 차세대 페어링 형 종단 시퀀싱으로 식별됩니다. (B)두 개의 생물학적 복제에 대한 Hi-C 소화 및 결찰 품질 제어(Hi-C 1 및 Hi-C 2). Hi-C 라이브러리는 1.5%의 아가로즈 젤로 해결되었습니다. 모두 소화, D, 라이브러리는 약 600 bp의 얼룩으로 실행됩니다. Ligated 샘플인 Lig는 소화되지 않은 UD 샘플과 유사한 10kb보다 큰 다소 단단한 대역으로 실행됩니다. 신호 강도의 차이는 젤에 적재 된 DNA의 고르지 않은 양 때문입니다. (C)정량적 중합체 연쇄 반응에 의한 하이-C 소화 정량제어(B) (Hi-C 1 및 Hi-C 2)와 동일한 2개의 생물학적 복제와 동일한 프로토콜에 상세한 사이클 임계값을 이용하여. 성공적인 소화는 80% 제한≥. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 인핵 하이-C 채우기 및 무딘 엔드 결찰 제어. (A)필인 및 비오틴 라벨링 평가. 염색체 X에서 300kb 떨어져 위치한 단편 간의 공지된 상호 작용은 검은 화살표로 표시된 프라이머를 사용하여 제어및 증폭(((계획의 상단참조),프라이머 1(왼쪽), 프라이머 2(오른쪽), 표 1),347bp 앰플리콘을 생성했다. Hi-C 결찰 제품은 결찰 부위의 소화에 의해 3C 실험에서 생산된 제품과 구별될 수 있다. Hi-C 접합부는 원래 Mbo I 사이트에서 Cla I에 의해 소화되었다, 이 무딘 끝 결찰에 형성으로. Hi-C 및 3C 접합부는 결찰 시 제한 부위가 재생됨에 따라 Mbo I로 소화하였다(젤 왼쪽). 대조적으로, 3C 접합은 Mbo I 사이트에서 Cla I에 의해 소화되지 않았지만 Mbo I. Cla I를 사용하여 Hi-C 및 3C 제품의 소화 프로파일을 비교합니다. 53 bp 단편은 Hi-C 제품을 소화함으로써 얻어졌다(Mbo I 사이트에서 형성된 Cla I 사이트의 제한 및 지역에 이미 존재하는 Cla I 사이트의 제한으로 인해). 이 단편은 3C 제품 소화에서 관찰되지 않았으며, 사용할 수 있는 유일한 Cla I 사이트는 이 지역에 이미 존재하고 있는 사이트였다. (B)다른 PCR 사이클을 이용한 Hi-C 라이브러리의 PCR 증폭 후, 제품은 1.5% 아가로즈 젤로 실행되었다. 400-1000 bp의 얼룩이 예상되고 관찰되었다. 최종 증폭 PCR에 대한 적절한 수 주기는 얼룩이 보이는 것보다 즉시 낮은 숫자로 취해야 합니다. (C)최종 라이브러리 클라 I 소화. 최종 라이브러리의 알리쿼트가 다시 증폭되어 Cla I로 소화되었습니다. 얼룩의 크기 감소는 라이브러리에 있는 분자의 큰 비율이 유효한 Hi-C 쌍이었다는 것을 확인했습니다. 본 겔의 밀도 측정 분석은 대표적인 결과 섹션에 상세한 바와 같이 유엔과 D 샘플 간의 비율을 얻기 위해 수행될 수 있다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: HiC 라이브러리의 HiC-Pro 통계. (A)유효한 Hi-C 쌍의 회로도 표현 및 실험 중에 생성및 HiCPro27 (표 2)에의해 필터링 될 수있는 비 유효 쌍의 다른 유형. 여기에는 연속 시퀀스, 매달려 있는 끝, 동일한 조각, 자체 원, 재 결찰 및 PCR 중복으로 떨어지는 읽기가 포함됩니다. (B)매핑 통계. 정렬에 실패한 읽기(회색)가 표시되고 트리밍 후 정렬된 완전히 정렬된 읽기와 읽기가 각각 파란색과 연한 파란색으로 표시됩니다. 이 두 범주는 후속 해석에서 고려되는 유용한 읽기를 나타냅니다. (C)페어링 통계. 다중 정렬된 읽기(다크 오렌지)는 게놈의 여러 영역에 정렬된 판독을 나타냅니다. 고유하게 정렬된(다크 블루) 판독은 게놈에서 한 번 정렬되는 읽기 쌍을 나타내며, 싱글톤(light orange)은 두 읽기 모두에서 단 하나의 게놈 영역이 시퀀스된 읽기 쌍을 나타냅니다. (D)필터링 통계. 유효한 읽기 쌍(파란색)은(A)에설명된 바와 같이 성공적인 Hi-C 리그션 제품을 나타냅니다. 자체 조각 자체 원(라이트 핑크)은(A)에표시된 것과 동일한 게놈 조각을 나타내기 때문에 유용하지 않은 읽기입니다. 동일한 조각 매달려 끝(주황색)은 단일 제한 조각이 시퀀스된 읽기를 나타냅니다. 필터링 및 덤프된 쌍(갈색)은 또한 잘못된 크기또는 결찰 제품을 재구성할 수 없는 유용한 읽기입니다. 마지막으로, 재결합 읽기(빨간색)는 인접한 두 개의 조각이 다시 리게션된 읽기를 나타내므로 유용하지 않은 정보를 생성합니다. (E)유효한 읽기 쌍 게놈내접촉 분포. 고유 시스 접점은(파란색)이 고유한 트랜스 접선(녹색)보다 더 빈번합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: WT 및 돌연변이 S2R+ 셀의 Hi-C 접촉 행렬 및 가상 4C 분석. (A) 노치 유전자 궤적을 중심으로 1kb 해상도로 50kb 영역의 Hi-C 정규화 된 히트맵. 궤적에 대한 TAD 분리점수(32)가 두 개의 토폴로지 도메인(Domain 1 및 Domain 2)으로 노치 궤적의 분할과 함께 표시됩니다. S2/S2R+세포에대한 AP, RNA Pol II 및 히스톤 마크에 대한 ChIP-seq 데이터는 히트맵(표1)아래에도시된다. 노치 도메인 1 경계의 위치는 밝은 녹색으로 강조 표시됩니다. (B)B1 경계 CRISPR 돌연변이의 회로도 표현. 녹색 사각형은 삭제된 343bp 영역을 나타냅니다. 가위는 CRISPR 중재 게놈 편집에 사용되는 sgRNA를 나타냅니다. AP용 모티프 바인딩 사이트는 CTCF 및 M1BP용 상자로 표시됩니다. (A)에표시된 DNA 결합 AP에 대한 피크 정상도35로표시됩니다. (C)WT 및 돌연변이 세포에 대한 노치를 중심으로 50kb 영역을 포함하는 1 kb 해상도에서 Hi-C 정규화 된 히트맵. 왼쪽, WT와 돌연변이 셀 사이의 상호 작용 주파수의 log2 차이의 Hi-C 히트맵. (D)WT 및 돌연변이 셀에 대한 5kb 해상도에서 노치를 중심으로 한 250kb 영역을 포함하는 Hi-C 정규화 된 히트맵. 왼쪽, WT와 돌연변이 셀 사이의 상호 작용 주파수의 log2 차이의 Hi-C 히트맵. (E) 노치의 5' UTR을 관점으로 사용하는 WT 및 돌연변이 세포에 대한 가상-4C. 업스트림 키레도메인-2, 노치 도메인 1, 노치 도메인 2 및 WT 및 돌연변이 셀 모두에 대한 다운스트림 DNC 도메인 내의 관점과 영역 간의 상호작용 비율은25로나타났다. 약어 : WT = 야생 유형; TAD = 토폴로지 관련 도메인; ChIP = 크로마틴 면역 침전; AP = 건축 단백질; RNA 폴 = RNA 폴리머라제; S2R + = S2 수용체 플러스; sg RNA = 단일 가이드 RNA; UTR = 번역되지 않은 영역입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 실험 | 견본 | GEO 가입 번호 |
| 칩 | CP190 | GSM1015404 |
| 칩 | 수호프 (주) | GSM1015406 |
| 칩 | 모드(mdg4) | GSM1015408 |
| 칩 | CTCF | GSM1015410 |
| 칩 | Ibf1 | GSM1133264 |
| 칩 | Ibf2 | GSM133265 |
| 칩 | BEAF32 | GSM1278639 |
| 칩 | 피타 | GSM1313420 |
| 칩 | 지퍼 | GSM1313421 |
| 칩 | RNA 폴리II | GSM259975 |
| 칩 | H3K4me1 | GSM259983 |
| 칩 | H3K4me3 | GSM259985 |
| 칩 | H3K27ac | GSM259987 |
| 칩 | MSL2 | GSM2469507 |
| 칩 | H4K16ac | GSM2469508 |
| 칩 | M1BP | GSM2706055 |
| 칩 | GAF | GSM2860390 |
| 칩 | 입력 | GSM1015412 |
| 하이-C | S2R+ WT 셀 | GSE136137 |
| 하이-C | S2R+ 5pN-델타343 셀 | GSE136137 |
표 1: GEO 가입 번호입니다.
| HiC-Pro 통계 | 읽습니다 | 백분율 |
| 매핑 통계 | ||
| 전체 읽기 정렬 | 131515921 | 82.20% |
| 트리밍된 읽기 정렬 | 16408309 | 10.30% |
| 정렬 실패 | 12110964 | 7.60% |
| 페어링 통계 | ||
| 고유하게 정렬 | 79428455 | 50.90% |
| 단일 | 19063418 | 12.20% |
| 멀티 정렬 | 57700021 | 36.90% |
| 필터링 통계 | ||
| 유효한 쌍 | 71373989 | 90.12% |
| 동일한 조각: 자기 원 | 2340697 | 2.90% |
| 동일한 조각: 매달려 있는 끝 | 2578783 | 3.20% |
| 필터링된 쌍 | 2773043 | 3.50% |
| 덤프된 쌍 | 196565 | 0.20% |
| 연락처 통계 | ||
| 고유: 시스 ≤ 20 kbp | 33108815 | 46.50% |
| 고유: 시스 > 20 kbp | 33539888 | 47.10% |
| 고유: 트랜스 | 4133602 | 5.80% |
| 중복 읽기 쌍 | 398400 | 0.60% |
표 2: HiC-Pro 통계.
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Discussion
여기에 제시된 핵 내 Hi-C 방법은 고해상도로 드로소필라 게놈 토폴로지의 상세한 탐구를 허용하고, 발기인과 증강제 와 같은 조절 요소 간의 크로마틴 루프에서 부터 TAD 및 대형 구획식별(25)에이르기까지 다양한 게놈 비늘에서 게놈 상호 작용의 전망을 제공한다. 동일한 기술은 또한 일부 수정33을가진 포유류 조직에 효율적으로 적용되었습니다. 예를 들어, 단일 세포 현탁액 대신 조직을 처리하는 경우, 조직은 70 μm 필터를 통해 체질되고, 용해 단계는 Dounce 균질화제를 사용하여 물질을 균질화하면서 수행된다. 또한, 포유류 게놈이 Drosophila 게놈보다 25배 더 크므로 1-5 kb 해상도 행렬을 구축하는 데 필요한 유효한 판독 쌍의 수가 더 큽습니다. 상기 핵하이C 방식은 결찰 전 65°C에서 1% SDS로 핵용액을 회피하여 핵 무결성을 보존하고, 7mL23, 24대신 1mL로 회합함으로써 원래의 Hi-C방법 2와다릅니다.
이 프로토콜에는 고효율을 보장하는 몇 가지 주요 단계가 있습니다. 소화와 채우기 비효율성을 도입할 수 있는 첫 번째 단계는 0.3% SDS 퍼메아빌라이제이션 및 계면활성제 치료 중 덩어리형성이다. 덩어리가 크고 방해가 어려운 경우 회전 속도를 SDS 및 계면 활성제 치료 중에 400 rpm으로 줄여야합니다. 파이펫팅에 의해 덩어리가 분해되기 어려운 경우, 시료는 충혈을 진행하기 전에 제한 버퍼, SDS 및 비이온 계면활성제로 볼륨을 조정하여 두 개로 분할되어야 합니다. 다음으로, 핵은 최소 속도(200 × g)로원심분리되어야 하며, 주체는 조심스럽게 폐기하고, 소화를 진행하기 전에 1x 제한 버퍼의 450 μL로 함께 풀링된 샘플이다. 둘째, 소화 효율의 추정은 채우기 및 결찰을 위한 충분한 DNA 단편을 제공하기 위하여 중요합니다. 질적 평가시 소화가 비효율적이는 것으로 판명되면, 2차 소화는 4h에서 하룻밤 사이에 제한 효소로 수행되어야 한다.
셋째, 결찰 효율의 추정이 중요하다. 정성적 평가시, 결찰은 비효율적인 것으로 나타났다(즉, 고분자량 대역 대신, 소화된 시료에 대해 관찰된 것과 유사한 얼룩이 관찰됨), 결찰은 200 ×g에서 핵을 원심분리하고 신선한 10배 리깅 버퍼 및 리그를 사용하여 결찰 혼합에서 다시 중단하여 반복되어야 한다. 넷째, Hi-C 유효한 제품의 백분율은 Cla I와의 예상 상호 작용의 PCR 앰플리콘을 소화하여 추정되어야 합니다(Mbo I 오리지널 소화용). 예상 된 상호 작용의 증폭 및 소화는 Hi-C 접합의 성공적인 결찰 및 형성을 확인합니다. 앰플리콘 소화가 효율적이지 않으면 대부분의 분자는 Hi-C 제품 대신 3C가 될 것이며 라이브러리가 시퀀싱될 경우 고려해야 합니다. 또한 대표 결과 섹션에 설명된 대로 최종 라이브러리 Cla I 소화 제어를 수행하여 확인할 수 있다. 마지막으로, PCR 사이클의 낮은 수를 선택하는 것은 PCR 중복을 피하기 위해 중요하다. 시퀀싱 시퀀싱 시 읽기 쌍 중복의 백분율이 높은 것으로 나타났을 때 PCR 주기의 수는 더 줄여야 합니다.
이 핵 내 Hi-C 기술은 몇 가지 한계가 있습니다. 먼저, 여기서 설명된 프로토콜은 세포 집단에 대해 수행된 Hi-C 실험을 나타낸다. 따라서, 게놈 접촉의 주파수의 신호는 가변 개별 적합성을 가진 게놈의 수백만을 나타냅니다. 단일 게놈으로부터 게놈 접진 세트를 얻으려면 단일 세포 Hi-C실험(22)이 권장됩니다. 둘째, Hi-C는 근위 DNA 단편의 결찰을 기반으로 합니다. 따라서, 게놈 지구가 큰 단백질 염색질 복합체의 일부인 경우에, 단편 사이 거리는 결찰을 방해할 수 있었습니다. 예를 들어 Hi-C38에서트랜스 접점을 제대로 표현하지 못하는 것으로 나타났습니다. 또한 Hi-C는 페어링 된 엔드 시퀀싱으로 마무리되므로 유전체 접점 쌍을 검색합니다. 그러나, 몇몇 DNA 단편은 동일 크로마틴 복합체에서 동시에 상호 작용할 수 있습니다. 크로마틴 복합체에서 다중 DNA 단편의 정체성을 얻기 위해, 대안시퀀싱 방법은 Hi-C39에적용될 수 있고, 또는 다른 실험 전략은 결찰이 수행되지 않는38,40,41을사용할 수 있다. 마지막으로 Hi-C는 유전체 접촉을 측정하지만 상호 작용을 중재하는 단백질의 정체는 밝히지 않습니다. 대안적 방법은 특정 유전체원(43)에서 특정 단백질(42) 또는 단백질의 앙상블의 정체성에 의해 중재된 게놈 상호작용을 식별하기 위해 적용되어야 한다.
결론적으로, 드로소필라 게놈(표2)에대해 여기에 설명된 것과 같은 고품질 의 Hi-C 실험을 통해, 행렬은 광범위한 해상도(1, 5 kb, 50 kb 이하; 도 4참조)로 구축될 수 있다. 부가적으로, 게놈의 특정 영역이 제한 단편 수준에서 평가되어야 하는 경우, 데이터는 원하는 관점의 가상 4C 풍경을 구축하는 데 사용될 수 있다(예를 들어, 도 4E에서 노치 유전자 5' UTR). SeqMonk의 Hi-C 다른 끝 도구는 이 풍경을 시각화할 수 있는 매우 사용자 친화적인 옵션입니다. SeqMonk의 일부인 4C 정량화 도구를 이 환경에 적용하면 통계적으로 유의한 접촉을 얻을 수 있습니다.
TAD 경계에서 변경된 AP DNA 결합 부위를 가진 돌연변이 세포주의 집합에 여기에 설명된 핵내 Hi-C 실험을 적용하여 유전자 원소가 영역에서 드로소필라 게놈을 구조화하고 Arzate-Mejía et al.al.25에 의해 완전히 논의된 바와 같이 유전자 발현 조절을 유지하기 위해 경계에서 유전적 요소가 필요하다고 밝혔다. 따라서, CRISPR/Cas9 시스템을 이용한 조절 원소의 유전자 편집은 여기서 설명된 핵 내 Hi-C 프로토콜을 사용하여 게놈 상호작용의 고해상도 프로파일링과 결합되어, 유전적 원소의 구조적 기능을 테스트하는 강력한 전략이 될 수 있다.
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Disclosures
저자는 경쟁 이익을 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
이 작품은 UNAM 기술 혁신 및 연구 지원 프로그램 (PAPIIT) 교부금 번호 IN207319 및 과학기술 국가 위원회 (CONACyT-FORDECyT) 교부금 번호 303068 의해 지원되었다. A.E.L. 과학 기술 국가 위원회 (CONACyT) CVU 번호 968128 의해 지원 석사 학생입니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 16% (vol/vol) paraformaldehyde solution | Agar Scientific | R1026 | |
| Biotin-14-dATP | Invitrogen | CA1524-016 | |
| ClaI enzyme | NEB | R0197S | |
| COVARIS Ultrasonicator | Covaris | LE220-M220 | |
| Cut Smart | NEB | B72002S | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) 1x | Life Technologies | 41965-039 | |
| Dynabeads MyOne Streptabidin C1 | Invitrogen | 65002 | |
| Fetal bovine serum (FBS) sterile filtered | Sigma | F9665 | |
| Klenow Dna PolI large fragment | NEB | M0210L | |
| Klenow exo(-) | NEB | M0210S | |
| Ligation Buffer | NEB | B020S | |
| MboI enzyme | NEB | R0147M | |
| NP40-Igepal | SIGMA | CA-420 | Non-ionic surfactant for addition in lysis buffer |
| PE adapter 1.0 | Illumina | 5'-P-GATCGGAAGAGCGGTTCAGCAG GAATGCCGAG-3' |
|
| PE adapter 2.0 | Illumina | 5'-ACACTCTTTCCCTACACGACGCT CTTCCGATCT-3' |
|
| PE PCR primer 1.0 | Illumina | 5'-AATGATACGGCGACCACCGAGAT CTACACTCTTTCCCTACACGACG CTCTTCCGATCT-3' |
|
| PE PCR primer 2.0 | Illumina | 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAG ATCGGTCTCGGCATTCCTGCTGA ACCGCTCTTCCGATCT-3' |
|
| Phenol: Chloroform:Isoamyl Alcohol 25:24:1 | SIGMA | P2069 | |
| Primer 1 (known interaction, Figure 2A) | Sigma | 5'-TCGCGGTAATTTTGCGTTTGA-3' | |
| Primer 2 (known interactions, Figure 2A) | Sigma | 5'-CCTCCCTGCCAAAACGTTTT-3' | |
| Protease inhibitor cocktail tablet | Roche | 4693132001 | |
| Proteinase K | Roche | 3115879001 | |
| Qubit | ThermoFisher | Q33327 | |
| RNAse | Roche | 10109142001 | |
| SPRI Beads | Beckman | B23318 | |
| T4 DNA ligase | Invitrogen | 15224-025 | |
| T4 DNA polymerase | NEB | M0203S | |
| T4 polynucleotide kinase (PNK) | NEB | M0201L | |
| TaqPhusion | NEB | M0530S | DNA polymerase |
| Triton X-100 | Non-ionic surfactant for quenching of SDS |
References
- Cremer, T., Cremer, C. Chromosome territories, nuclear architecture and gene regulation in mammalian cells. Nature Review Genetics. 2, 292-301 (2001).
- Lieberman-Aiden, E., et al. Comprehensive mapping of long-range interactions reveals folding principles of the human genome. Science. 326, 289-293 (2009).
- Dixon, J. R., et al. Topological domains in mammalian genomes identified by analysis of chromatin interactions. Nature. 485, 376-380 (2012).
- Sexton, T., et al. Three-dimensional folding and functional organization principles of the Drosophila genome. Cell. 148 (3), 458-472 (2012).
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