Summary
このプロトコルは、生物学的組織を刺激するために使用される電気および磁気刺激装置の両方を構築するためのステップバイステップのプロセスを記述する。このプロトコルには、計算上の電界と磁場をシミュレートし、刺激装置の製造をシミュレートするためのガイドラインが含まれています。
Abstract
電界(EF)や磁場(MF)は、増殖、移動、分化、形態、分子合成などの細胞ダイナミクスを改善するために、組織工学によって広く使用されてきました。しかし、細胞、組織、または足場を刺激する際には、刺激強度や刺激時間などの変数を考慮する必要があります。EFとMFは細胞の反応によって変化することを考えると、生物学的サンプルを刺激するために十分な生物物理学的刺激を生成するデバイスを構築する方法は不明です。実際、生物物理学的刺激が適用される場合の計算と分布に関する証拠が不足しています。このプロトコルは、EFやMFを生成するデバイスの設計と製造、および生物学的サンプルの内外の生物物理学的刺激分布を予測する計算方法論の実施に焦点を当てています。EF装置は、生物学的培養物の上部と下部に位置する2つの平行なステンレス鋼電極で構成された。電極を発振器に接続して、60kHzで電圧(50、100、150、200 Vp-p)を発生させた。MF装置はコイルで構成され、変圧器で通電し、60Hzで電流(1A)と電圧(6V)を発生させた。ポリメチルメタクリレート支持体は、コイルの真ん中に生物学的培養物を見つけるために構築されました。計算シミュレーションは、生物学的組織の内外のEFとMFの均質な分布を解明した。この計算モデルは、電圧、周波数、組織形態、ウェルプレートタイプ、電極およびコイルサイズなどのパラメータを変更して、細胞応答を達成するためにEFsおよびMFを推定できる有望なツールです。
Introduction
EFおよびMFは、細胞のダイナミクスを改変し、組織1の細胞外マトリックスに関連する主分子の増殖を刺激し、合成を増加させることが示されている。これらの生物物理学的刺激は、特定の設定やデバイスを使用して、さまざまな方法で適用することができます。EFを生成するデバイスに関しては、直接結合刺激装置は、生体外の生体試料に接触しているか、生体内で患者および動物の組織に直接移植された電極を使用する2;しかしながら、電極間の接触による生体適合性の不十分、pHおよび分子酸素レベル1の変化を含む制限および欠陥が依然として存在する。逆に、間接的なカップリングデバイスは、生物学的サンプル3と並行して配置される2つの電極間にEFを生成し、生物学的サンプルを刺激し、組織と電極の間の直接接触を避けるために非侵襲的な代替技術を可能にする。このタイプの装置は患者への最低の侵略のプロシージャを行うために将来の臨床適用に外挿することができる。MFを生成するデバイスに関連して、誘導結合刺激装置は、細胞培養4、5の周りに位置するコイルを流れる時間変動電流を作成します。最後に、EF と静的 MF を使用して一過性電磁界1を生成する複合デバイスがあります。生物学的サンプルを刺激する構成が異なることを考えると、生体物理学的刺激を適用する際には、緊張や周波数などの変数を考慮する必要があります。電圧は生体組織の挙動に影響を与えるため、重要な変数です。例えば、細胞の移動、配向、遺伝子発現は印加電圧3、6、7、8、9、10の振幅に依存することが示されている。生体内で発生することが証明されているので、周波数は生体物理学的刺激に重要な役割を果たします。高低周波数は細胞に有益な効果を有することが実証されている。特に、細胞膜の電圧ゲート型カルシウムチャネルまたは小胞体では、細胞内レベル1、7、11において異なるシグナル伝達経路を引き起こす。
上記に従って、EFsを生成する装置は、2つの並列コンデンサ12に接続された電圧発生器から構成される。この装置は、アームストロングらによって実施され、軟骨細胞13の増殖速度および分子合成の両方を刺激する。この装置の適応は、上蓋と底蓋を掘削することによって細胞培養井戸プレートを改変したBrightonららによって行われた。穴はカバースライドで満たされ、下の眼鏡は生物学的組織を培養するために使用された。電極は各カバースライドに配置され、EFs14を生成した。この装置は、軟骨細胞、骨芽細胞および軟骨外植物を電気的に刺激するために用いられ、細胞増殖14、15、16および分子合成3、17の増加を示す。 Hartigらによって設計された装置は、平行コンデンサに接続された波発生器と電圧増幅器で構成されていた。電極は絶縁の場合に置かれた高品質のステンレス鋼から成っていた。この装置は、骨芽細胞を刺激するために使用され、増殖およびタンパク質分泌18の有意な増加を示す。Kimらが使用する装置は、高電圧金属酸化物の相補半導体の製造プロセスを用いて製造された二相電流刺激チップで構成されていた。培養井戸プレートは、電気刺激で導電性表面上の細胞を培養するように設計された。電極はシリコンプレート19の上に金で被覆した。この装置は、骨芽細胞を刺激するために使用され、血管内皮増殖因子19の増殖及び合成の増加を示し、アルカリホスファターゼ活性の産生を刺激し、カルシウム沈着及び骨形態形成タンパク質20を刺激する。同様に、本装置は、ヒト骨髄間葉系幹細胞21の血管内皮増殖因子の増殖速度および発現を刺激するために用いた。中鈴路らで設計された装置は、白金プレートに接続された電圧発生器で構成された。電極は24の異なった点で電位を測定するために造られた。この装置は軟骨細胞を刺激するために用いられ、EFは細胞形態を変化させなかったことを示し、増殖および分子合成22を増加させた。Auらで使用される装置は、白金線で心臓刺激装置に接続された2本のカーボンロッドを備えたガラス室から構成された。この刺激剤は、心筋細胞および線維芽細胞を刺激するために用いられ、細胞伸長及び線維芽細胞の配向性23を改善する。
さまざまなMFデバイスは、いくつかのタイプの生物学的サンプルを刺激するために、ヘルムホルツコイルに基づいて製造されています。例えば、ヘルムホルツコイルは、軟骨細胞24,25の増殖および分子合成を刺激するために使用されてきたが、関節軟骨外植物26のプロテオグリカン合成を増強し、骨芽細胞様細胞27の骨形成に関連する遺伝子のアップレギュレーションを改善し、内皮細胞28の増殖および分子発現を増加させる。ヘルムホルツコイルは、一方が他方のコイルの前に位置する2つのコイル全体でMFを生成します。コイルは、均質なMFを確保するために、コイルの半径と等しい距離で配置する必要があります。ヘルムホルツコイルを使用することの欠点は、必要なMF強度を生成するのに十分な大きさである必要があるため、コイル寸法にあります。さらに、コイル間の距離は、生物学的組織の周りのMFの均質な分布を確保するために十分でなければなりません。ヘルムホルツコイルによる問題を回避するために、ソレノイドコイルの製造にさまざまな研究が焦点を当てています。ソレノイドコイルは、銅線で巻かれたチューブをベースにしてMFを生成します。銅線入力をコンセントまたは電源に直接接続してコイルを通電し、ソレノイドの中央にMFsを作成することができます。コイルの回転数が多いほど、生成されるMFは大きくなります。MFの大きさはまた、コイル29を通電するために印加される電圧および電流に依存する。ソレノイドコイルは、HeLa、HEK293およびMCF730または間葉系幹細胞31のような磁気的に異なる種類の細胞を刺激するために使用されてきた。
異なる著者が使用するデバイスは、電極の十分なサイズまたはEFとMFの両方を均質に分配するためにコイルの正しい長さを考慮していません。さらに、デバイスは固定電圧と周波数を生成し、特定の生体組織を刺激するための使用を制限します。このため、このプロトコルでは、容量性システムとコイルの両方をシミュレーションして、生物学的サンプル上のEFとMFの均質な分布を保証し、エッジ効果を回避するための計算シミュレーションガイドラインが実施される。また、電子回路の設計により、電極とコイルの間に電圧と周波数が発生し、細胞培養井戸プレートや空気のインピーダンスによる制限を克服するEFやMFが生まれることが示されています。これらの改変は、非侵襲的で適応性のあるバイオリアクターを作成し、任意の生物学的組織を刺激することを可能にする。
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Protocol
1. EFとMFのシミュレーション
メモ: EF と MF のシミュレーションは、COMSOL マルチフィジックスで行われました。
- 軸対称の 2D 構成を選択して、ドメインの電気と磁気の両方を表します。
- 物理構成では、平行電極で EF を計算する 電流 インタフェースか、コイルの周囲の MFs を計算する 磁界 を選択します。
- スタディ設定で、[ 周波数領域] を選択して、1 つまたは複数の周波数の高調波励振を受けた線形または線形化モデルの応答を計算します。
- インタフェース内でモデルの構築を開始したら、対象のモデルに従って次の手順に従います。
- EF のモデルの構築
- ジオメトリを作成します。[モデル ビルダ] で、[ジオメトリ] を選択します。次に、[単位]セクションを見つけてmmを選択します。[ジオメトリ] ツールバーの[四角形] を選択し、[四角形ウィンドウ] 設定の[サイズとシェイプ] ボックスに各コンポーネントのサイズを入力します。幾何学は、空気、2つの平行電極、培養井戸板、培養媒体および生物学的試料によって構成され、この場合はヒアルロン酸-ゼラチンヒドロゲルの足場で表される(表1の各要素の寸法を参照)。すべてのジオメトリを作成したら、[すべてのオブジェクトを構築 ]をクリックします。
- 選択を作成します。[ 定義] ツールバーの [ 明示的] をクリックして、金属ドメインの選択を作成します。電極を表すジオメトリを選択します。その後 、[Explicit 1] を右クリックして名前を変更します。新しいラベルテキストフィールドに 「金属 」と入力します。
- 一方、定義ツールバーの [補数] をクリックします。[補完設定]ウィンドウで[入力エンティティ]セクションを見つけます。次に、[反転する選択]で[追加]をクリックし、[追加]ダイアログボックスの[反転する選択]リストで[金属]を選択します。その後、名前を変更するには、補数 1で右クリックします。新しいラベル テキスト フィールドに「モデル ドメイン」と入力します。
- 境界を作成します。[定義] ツールバーの [明示的] をクリックします。[設定] ウィンドウの[明示的] の[入力エンティティ] セクションを見つけ、[ジオメトリエンティティレベル] リストから [境界] を選択します。ここでは、底電極のすべての境界を選択します。名前を変更するには、[明示的な 2]を右クリックします。新しいラベル テキスト フィールドに「地表境界」と入力します。これらの手順を繰り返しますが、上部電極のすべての境界を選択します。その後、名前を変更するには[Explicit 3]を右クリックします。新しいラベルテキストフィールドに「端子境界」と入力します。
- 電流を追加します。[モデル ビルダ]ウィンドウの[コンポーネント 1]で、[電流(ec)]をクリックします。次に、[電流設定]ウィンドウで[ドメイン選択]セクションを見つけます。[選択] ボックスの一覧で、[モデル ドメイン] を選択します。[物理演算] ツールバーの [境界] をクリックし、[地面] を選択します。次に、[地盤設定]ウィンドウで[境界の選択]セクションを見つけ、[選択]リストから[地面の境界]を選択します。
- その後、[境界] をクリックし、[物理演算] ツールバーの[ターミナル] を選択します。最後に、[端子設定]ウィンドウで[境界の選択]セクションを見つけ、[選択]リストから[端子境界]を選択します。ここで、端子セクションを見つけて、端子リストから電圧を選択し、100 Vと入力します。
- 材料を追加します。[ホーム]ツールバーの[マテリアルを追加]をクリックして、[材料を追加]ウィンドウを開きます。空気とステンレス鋼を検索し、モデルビルダーウィンドウに追加します。次に、ホーム ツールバーの[ブランク材料] をクリックし、培養メディア、スキャフォールド (ヒドロゲル) およびポリスチレン (培養ウェルプレート) の 3 つの新しい空白の材料を追加します。
- 空の材料を選択して、誘電特性を割り当てます。[材料設定]ウィンドウで[材料特性]リストを見つけ、[基本プロパティ]オプションリストから相対誘電率と電気伝導率を選択します。培養媒体、ヒドロゲルおよび培養用の誘電体特性は、表2に記載されている。すべての空白の材料に対してこの手順を繰り返します。
- 前に構築したジオメトリに各マテリアルを割り当てます。 [モデル ビルダー ]ウィンドウを形成する空気材料を選択します。次に、[ グラフィック ]ウィンドウから空気に対応するドメインを選択します。作成されたすべての材料に対してこの手順を繰り返します。各ドメインが正しいマテリアルに対応していることを確認します。すべてのマテリアルが正しく割り当てられていることを確認するには、[ モデル ビルダー] ウィンドウで各マテリアルをクリックし、その領域が [グラフィックス] ウィンドウ内で青色でハイライト表示されているかどうかを確認します。
- メッシュを構築します。[モデル ビルダ]ウィンドウで[メッシュ 1]を右クリックし、[自由三角形]を選択します。[サイズ]を選択して、この手順を繰り返します。[メッシュ設定]ウィンドウで、[シーケンスタイプ]リストから[ユーザによって制御されるメッシュ]を選択します。次に、[モデル ビルダ] ウィンドウの[メッシュ] オプションを展開し、[サイズ] をクリックします。
- [サイズ設定]ウィンドウで[要素サイズパラメータ]を見つけ、要素の最大サイズは1mm、最小要素サイズは0.002 mm、最大項目成長率は1.1、曲率係数は0.2、狭い領域の分解能は1 mmと入力します。次に、[モデル ビルダ] ウィンドウで[メッシュ] オプションを展開し、[自由三角形 1]をクリックします。ここでは、メッシュ化するすべてのドメインを選択します。最後に、[メッシュ設定]ウィンドウで[すべて構築]をクリックします。
- スタディを作成します。モデルビルダウィンドウで[スタディ 1]をクリックします。次に、[スタディ設定]ウィンドウで[スタディ設定]セクションを見つけ、[デフォルトプロットを生成]チェック ボックスをオフにします。[モデル ビルダ] ウィンドウで[スタディ 1]ノードを展開し、[ステップ 1: 周波数領域]をクリックします。最後に、[周波数ドメイン設定]ウィンドウでスタディ設定セクションを見つけ、[周波数]テキストフィールドに「60 kHz」と入力します。
- スタディを計算します。[スタディ] ツールバーの[既定のソルバーを表示] をクリックします。次に、[モデル ビルダ]ウィンドウで[スタディ 1 ソルバー構成]ノードを展開します。[モデル ビルダ] ウィンドウで[ソリューション 1 (sol1)]ノードを展開します。その後、[固定ソルバ設定]ウィンドウで[固定ソルバー 1]をクリックし、[一般]セクションを見つけ、[相対許容値]テキストフィールドに「1e-6」と入力します。最後に、スタディ ツールバーの (計算) をクリックします。
- 結果をプロットします。[ホーム] ツールバーの [結果] セクションを選択し、[2D プロット グループ] を追加します。次に、[モデル ビルダ]ウィンドウで[2D プロット グループ 1]を右クリックし、[サーフェス]を選択します。次に、[サーフェス設定]ウィンドウで[データ]セクションを見つけ、[前駆体]を選択します。次に、[サーフェス設定]ウィンドウで[式]セクションを見つけます。ここで、プラス記号(+)をクリックして新しいウィンドウを開き、選択リストから次のルートを見つけます(モデル - コンポーネント1 - 電流 - 電気)。ここでは、ec.normE - EF ノルムを選択します。最後に、[サーフェス設定]ウィンドウで[グラフィック]をクリックして結果をプロットします。
- MFs のモデルの構築
- ジオメトリを作成します。[ モデル ビルダ] で、[ ジオメトリ] を選択します。次に、[ 単位] セクションを見つけて[mm]を選択します。[ ジオメトリ] ツールバー で [矩形]を 選択し、[ 四角形のウィンドウ 設定]の[サイズと形状]ボックスに各コンポーネントの寸法を入力します。ジオメトリは、空気とクーパーによって構成されます( 表1の各要素の寸法を参照)。すべてのジオメトリを作成したら、[ すべてのオブジェクトを構築 ]をクリックします。
- 材料を追加します。[ホーム]ツールバーの[マテリアルを追加]をクリックして、[材料を追加]ウィンドウを開きます。空気と銅を検索し、[モデルビルダー ] ウィンドウに追加します。銅の誘電特性は表2にあります。
- 境界を作成します。モデルビルダウィンドウで[磁場]をクリックします。ここで、[磁界設定]ウィンドウで[数式]リストを見つけ、[計算式フォーム]リストから[周波数領域方程式]を選択します。[頻度]ボックスの一覧で、[ソルバーから] を選択します。その後、モデルビルダウィンドウの磁場リストでアンペアの法則を見つけます。温度のタイプ 293.15[K]では、入力モデルリストからの絶対圧力の1[atm]。次に、アンペアの[法設定]ウィンドウの[材料タイプ]リストから[ソリッド]を選択します。電気伝導度、相対誘電率、相対透磁率がリストの From マテリアルに対応していることを確認します。
- モデル ビルダウィンドウの[磁場] リストで軸対称を見つけます。軸対称線が[境界選択]リストと[グラフィックス]ウィンドウの両方でハイライトされていることを確認します。次に、モデル ビルダウィンドウの[磁場] リストで[磁気分離]を見つけます。ジオメトリの境界が、[境界選択]リストと[グラフィックス]ウィンドウの両方でハイライトされていることを確認します。
- モデル ビルダウィンドウの[磁場] リストで初期値を探します。以前に構築したジオメトリを選択し、[初期設定]ウィンドウから[ドメインの選択]に含めます。
- コイルの特徴を紹介します。モデル ビルダウィンドウの[磁界] リストで複数のコイルを探します。ここでは、コイルを表すジオメトリを選択し、[複数コイル設定]ウィンドウから[ドメイン選択]に含めます。
- [複数コイル設定]ウィンドウで[複数コイル]リストを見つけます。ここで、コイル励起リストを見つけ、電流を選択します。その後、コイル電流リストに1[A]、コイル伝導率で「回転数」に450、6e7[S/m]と入力します。
- コイルワイヤ断面積を見つけ、AWG オプションのリストから北米ケーブル直径(ブラウン&シャープ)を選択し、タイプ 18 を選択します。[相対の導力] と [相対透磁率] がリストの [材料] に対応していることを確認します。
- メッシュを構築します。[メッシュ設定]ウィンドウで、[シーケンスタイプ]リストから[物理によって制御されるメッシュ]を選択します。[メッシュ設定]ウィンドウで[要素サイズパラメータ]を見つけて、[非常に細かい]を選択します。最後に、メッシュ化するすべてのドメインを選択し、[メッシュ設定]ウィンドウで[すべて構築]をクリックします。
- スタディを作成します。モデルビルダウィンドウで[スタディ 1]をクリックします。次に、[スタディ設定]ウィンドウで[スタディ設定]セクションを見つけ、[デフォルトプロットを生成]チェック ボックスをオフにします。[モデル ビルダ] ウィンドウで[スタディ 1]ノードを展開し、[ステップ 2: 周波数領域]をクリックします。最後に、[周波数ドメイン設定]ウィンドウでスタディ設定セクションを見つけ、[周波数]テキストフィールドに「60 Hz」と入力します。
- スタディを計算します。[スタディ] ツールバーの[既定のソルバーを表示] をクリックします。次に、[モデル ビルダ]ウィンドウで[スタディ 1 ソルバー構成]ノードを展開します。[モデル ビルダ] ウィンドウで[ソリューション 1 (sol1)]ノードを展開します。その後、[固定ソルバ設定]ウィンドウで[固定ソルバー 1]をクリックし、[一般]セクションを見つけ、[相対許容値]テキストフィールドに「1e-6」と入力します。最後に、スタディ ツールバーの (計算) をクリックします。
- 結果をプロットします。[ホーム] ツールバーの [結果] セクションを選択し、[2D プロット グループ] を追加します。次に、[モデル ビルダ]ウィンドウで[2D プロット グループ 1]を右クリックし、[サーフェス]を選択します。次に、[サーフェス設定]ウィンドウで[データ]セクションを見つけ、[前駆体]を選択します。
- [サーフェス設定]ウィンドウで[式]セクションを見つけます。ここで、プラス記号(+)をクリックして新しいウィンドウを開き、選択リストから次のルートを見つけます(モデル - コンポーネント1 - 磁界 - 磁性)。ここでは、mf.normB - 磁束密度ノルムを選択します。最後に、[サーフェス設定]ウィンドウで[グラフィック]をクリックして結果をプロットします。
- EF のモデルの構築
2. 電気・磁気刺激装置の設計・製造
- 電気刺激装置
メモ:それはウィーン橋発振器と2つの平行なステンレス鋼の電極に基づいて回路によって構成される。回路は位相シフトのRC発振器で、正と負のフィードバックを使用します。ウィーンブリッジオシレータは、ブリッジの2つの腕の組み合わせによって入力電圧を分割するリードラグネットワークによって構成されています:抵抗器 R5 コンデンサ付き C2 直列で、抵抗器 R6 コンデンサ付き C3 並列 (図 1A).これらのコンポーネントは、オシレータの周波数を調節します。電気刺激装置装置を構築するには、次の手順に従います。- 共振周波数方程式(1)を使用して周波数を計算します。
ここでR=R5=R6 は抵抗器、C=C2=C3はコンデンサである。 RとCの両方がブリッジの2本の腕に置かれます(図1A)。R5 = R6 = 2.6 kΩ、C 2 = C3 = 1 nF を使用して、60 kHz の周波数を取得します。抵抗器とコンデンサは、別の周波数が必要な場合に計算することができます。 - アンプの電圧ゲインが出力信号の振幅変化を自動的に補正するような方法で回路を設計します。 図1A では回路のスキームを観察することができるが、 材料表 セクションには回路を構築するための電子部品がリストされている。
- 4つの出力電圧を生成するために抵抗の組み合わせを計算します。図1Aに示すように、抵抗R11、R12、R13、R14(154 Ωの等価抵抗)を組み合わせて50 Vp-pの電圧を生成します。 抵抗R 17、R 18およびR19の直列(47,3 Ωの等価抵抗)は100 Vp-pの電圧を得る。抵抗R 9およびR10の直列(25,3 Ωの等価抵抗)は150 Vp-pの電圧を発生させる。抵抗R15とR16(16,8 Ωの等価抵抗)の組み合わせとを組み合わせて、200 Vp-pの電圧を得る。
- トランジスタ(TIP 31C)とフェライトコアトランスを使用して信号増幅ステージを実装します。AWG 24銅線を巻くためにトロイダルフェライトコアを使用し、1:200の関係を完了しました。信号を整流する前に、100 nFの2つのコンデンサ(C4とC5)を並列に使用して信号を整流する(図1A)。
- サードパーティのPCB製造サービスを使用してPCBを準備します。回路の概略図を 図 1に示します。すべてのコンポーネントを帯電防止ピンセットでPCBに配置します。すべてのコンポーネントはんだ付けには、はんだとはんだを使用してください。
- 回路を保護するために、入力コネクタ付きプラスチックケースを製造します。3つの入力コネクタを実装して回路(12V、-12 V、グランド)を通電します。2つの入力コネクタを使用して電極を接続します。4つの出力電圧を得るために抵抗の組み合わせを変更する3つのスイッチを含める。電子回路をプラスチックケースに組み立てます(図1B)。
- 2つの平行なステンレス鋼電極(200 x 400 x 2 mm)と各エッジへのはんだ入力コネクタを製造します。電極は、インキュベーターの金属表面との接触を排除するためにテフロンまたはアクリル支持体の上に配置されています(図1C)。
- 394.15 K (121 °C) のオートクレーブを 30 分間使用して電極を殺菌し、夜間に紫外線を使用してインキュベーターに接触しているワイヤを殺菌します。
- 電気刺激装置をテストします。電源を直列に調整して、グランド端子とマイナス端子の間に+12 Vと-12 Vの出力電圧を生成します。マルチメータで電源の出力電圧を確認します。電源装置の各出力を電気刺激装置の正しい入力(+12 V、-12 Vおよび接地)に接続します。電気刺激装置の正しい入力コネクタの各電極を接続します。我々はAC電流に取り組んでいるので、極性は重要ではありません。電極の間に培養井戸プレートを配置し、オシロスコープで出力信号を確認します。電気刺激装置のスイッチを調整して、4つの出力電圧(50、100、150、200 Vp-p)を生成します。
- 安全に関する推奨事項。インキュベーターから電極を取り外す際の問題を回避するため、ケーブルが絡まないようにしてください。インキュベーターから電極を取り外す前に、発振器からケーブルを外してください。アクリルやテフロンサポートなしで電極を配置しないでください。
- 共振周波数方程式(1)を使用して周波数を計算します。
- 磁気刺激装置
- 式(2)を用いてコイル内部の均質なMFを保証するターン数を推定し、そのMFをソレノイドコイル内部に記述する。
ここでμ 0は真空の透磁率(4 π×10-7)、Nは銅線の回転数、Iは電流、直径より大きくする必要があるhはソレノイドコイルの長さである。 - 250 mm の長さ (h) 、電流 1 A、Bint = 2mTを選択して、ターン数を決定します。
- コイルを製造する。長さ250mm、直径84mmのポリ塩化ビニル(PVC)チューブを構築し、AWG 18銅線を巻き、450回転を完了します(図2A)。寸法は、インキュベーター内の使用可能なスペースに基づいて選択された。
- 細胞培養のウェルプレートサポートを製造する。ポリメチルメタクリレート(PMMA)サポートを構築して、MFが均質なコイルの真ん中に35mmのウェルプレートが常に配置されていることを確認します(図2A)。
- 回路の電流を増やすために変圧器を製造する。出力が 1 A - 6 V AC のトランスを構築し、最大 MF 2 mT に到達します。変圧器の入力電圧は60Hzで110V ACであった。これらのパラメータは、南米のアウトレットの出力電圧と周波数に対応します。
- 回路を接続します。変圧器は出口に直接接続される。電流を変化させ、1 mT から 2 mT までの MF を生成するには、可変抵抗(レオスタット)を使用します。ヒューズを接続して回路を保護します(図2B)。
- 夜間に紫外線を使用して、インキュベーターと接触しているワイヤーを殺菌します。コイルを透明なストレッチフィルムで包み、エタノールを使用してコイルを殺菌します。
- MF デバイスをテストします。テスラメーターを使用して、コイル内のMFの大きさを測定します。テスラメータープローブはコイルの中央に位置し、MFと電流を同時に測定することができました。
- MF の大きさを変更します。回路の抵抗を変更するためにレオスタットを使用します(図2B)。抵抗値 0.7 Ωを使用して、1 mT の MF を生成しました。
- 安全に関する推奨事項。インキュベーターからソレノイドを転送または取り外す際の問題を回避するために、ケーブルが絡まないようにしてください。インキュベーターからソレノイドを取り外す前に、トランスからケーブルを外してください。PMMA サポートなしでソレノイドを配置しないでください。インキュベーターから移管または除去する際には、ベースとソレノイドの両方のPMMA支持体をしっかりとつかみます。
- 式(2)を用いてコイル内部の均質なMFを保証するターン数を推定し、そのMFをソレノイドコイル内部に記述する。
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Representative Results
計算シミュレーション
図 3に、EF および MF の分布を示します。一方で、容量性システムにおけるEFの均質な分布を観察することが可能であった(図3A)。EFは、生体試料内のフィールドの大きさを詳細に観察するためにプロットした(図3B)。このシミュレーションは、電極のサイズをパラメータ化し、エッジ効果を回避するためにそれらを製造するのに有用であった。一方、ソレノイドコイルによって発生するMFの均質分布を観察することが可能であった(図3C)。MFは、コイル内のフィールドの大きさを詳細に観察するためにプロットされた(図3D)。このシミュレーションは、MFが同じ距離を測定し、PMMAサポートを構築することが重要でした。このサポートは、コイルの中心だけでなく、刺激される生物学的サンプルにおいてもMFの均質な分布を保証します。
電気・磁気刺激装置によって生成される信号
電気刺激装置によって生成される出力信号を図4に示す。オシロスコープで捕捉された信号が直接電極に取り込まれたことを強調することは、測定が出力ケーブルに直接取られるかどうか、電圧が高くなる(図4A)。この電圧変動は、電極の静電容量によって与えられる。出力電圧は、60 kHzで5V±の範囲で振動します。たとえば、出力信号は 54.9 Vp-p (図 4B)、113 Vp-p (図 4C)、153Vp-p (図 4D)および 204 Vp-p (図 4E)で、それぞれ 50、100、150、200 Vp-p です。
磁気刺激装置によって生成される出力信号を図5に示す。オシロスコープで捕捉された信号は、コイルの出力ケーブルに直接取り込まれた(図5A)。出力電圧は、60 Hzで15Vp-p±の範囲で振動します(図5B)。
図 1.電気刺激装置。A) 60 kHzの正波形で50、100、150および200 Vp-pの緊張を発生させる回路。B)ケース内のプリント基板。C)インキュベーター内の電極。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 2.磁気刺激装置。)磁気刺激装置およびPMMAサポートの概略表現。B)MFs を生成する回路.この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 3.EF と MF の計算シミュレーション。A) 容量システムの内外でのEFの分布。 B) ヒドロゲル内のEFsの分布は、対象領域が赤い詳細に示される。 C) コイルの内外のMFの分布。 D) コイルの中心におけるMFの分布は、対象領域が赤い詳細に示される。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 4.電気刺激装置によって生成される中弦波信号。A) 電気刺激装置によって生成される信号検証。 B) 50 Vp-p. C) 100 Vp-p. D での信号 ) 信号 150 Vp-p. E) 信号 200 Vp-p.すべての測定は60 kHzで5V±の範囲で振動する。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 5.磁気刺激装置によって生成される中弦波信号。 A) 磁気刺激装置によって生成される信号検証。 B) 60 Hzで15 Vp-pで信号を出 してください。
| 制 | コンポーネント | 幅 (mm) | 高さ(mm) |
| 電気システム | 空気 | 100 | 100 |
| 電極 | 50 | 5 | |
| ウェルプレート | 7 | 20 | |
| ハイドロゲル | 3.5 | 3.5 | |
| 文化メディア | 6 | 8 | |
| 磁気システム | 空気 | 500 | 600 |
| コイル | 2 | 250 |
表 1. 電気および磁気システムを構成する幾何学の次元。
| 制 | コンポーネント | 相対導力 (ε) | 導電率(σ) |
| 電気システム | 空気 | 1 | 0 |
| 電極 | 1 | 1.73913 [MS/m] | |
| ウェルプレート | 3.5 | 6.2E-9 [S/m] | |
| ハイドロゲル | 8.03E3 | 7.10E-2 [S/m] | |
| 文化メディア | 2.67E4 | 7.20E-2 [S/m] | |
| 磁気システム | コイル | 1 | 5.998E7[S/m] |
表 2. 電気・磁気システムを構成する元素の誘電特性
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Discussion
ヒト組織に影響を及ぼす異なる病理を治癒するために使用される治療は、局所的に痛みを和らげるか、または影響を受けた組織を外植または移植に置き換えようとする薬理学的療法32または外科的介入33である。近年、自家細胞療法は、傷害組織を治療するための代替療法として提案されており、そこで細胞は患者から単離され、インビトロ技術を介して、傷害34の部位に移植される。自家細胞療法が組織回復に直接影響を及ぼすことが示されていることを考えると、この技術の有効性を高めるために異なる戦略が開発された。例えば、生物物理学的刺激は、いくつかの種類の生物学的サンプルを刺激する非侵襲的代替療法として使用されてきたが、細胞増殖および分子合成35,36を改善することによって細胞機能を調節する。最も使用される生物物理学的刺激の中で、電気刺激および磁気療法は細胞、組織の外植物および足場を刺激するために広く適用されている。電気刺激が痛みを軽減し、いくつかの組織の治癒過程を増加させることが証明されている37.磁気療法に関しては、この刺激は宿主組織とのインプラントの統合を改善し、治癒プロセスを加速し、局所的に痛みを和らげ、瘢痕強度8,38を増加させることが記載されている。
上記を考慮すると、生体材料、細胞培養、EFやMFなどの外部生物物理刺激との組み合わせにより、インビトロレベルで、負傷した組織8,39を治癒する代替治療技術として組織工学に導入されている。しかし、健康であろうと外傷性病理の影響を受けるかどうかにかかわらず、異なる組織を刺激するのに役立つバイオリアクターを見つけることは困難です。この文脈において、本プロトコルは、電気的および磁気刺激器の両方を開発することを目的としている。現在、EF を適用するためのスキームは 2 つあります。最初の方法は、直接結合システムを介してEFを生成する方法で構成され、細胞の移動と方向を評価するために使用される40、41、42。しかし、電極が接触して細胞培養培地の生体適合性に変化を起すなどの制限があり、pHおよび分子酸素レベル1の変化の可能性がある。さらに、直接結合刺激は高周波信号を増幅できない。出力は時間によって変化する傾向が生じ、電源電圧の変化を生じさせる。これは、その動作点が変化し、低周波数でコンデンサが故障し、開回路43として機能するため、ほとんど温度安定性を有しない。これらの制限を考慮して、第2の方法を実施し、そこで外部並列電極を用いた。この間接的なカップリングシステム法は、細胞増殖および分子合成の増加を示している3,7,17,22, 44,45;しかし、異なる著者によって開発されたデバイスは、均質なEFを分配する電極の大きさを考慮していない。例えば、デバイスは固定電圧と周波数を生成し、特定の細胞や組織を刺激する際の使用を制限します。従って、本研究では、電極の大きさを、生物学的組織上のEFの均質な分布を確保するためにモデル化された。また、電極間の周波数と高電圧を発生させる回路が設計されており、細胞培養井戸プレートと空気のインピーダンスによる限界を克服する異なるEFを作成しました。
ソレノイドコイルは、インキュベーター内の生物学的サンプルを刺激するために使用できる汎用性の高いデバイスであり、生物学的サンプルの生理学的特徴に影響を与えることなく、大気条件が安定したままであることを可能にします。この利点は、ソレノイドコイルがヘルムホルツコイルよりも実行可能な代替手段であることを解明し、これらはサイズが大きく、インキュベーター46内の刺激を防ぐ必要がある。インキュベーターの外部の生体試料の刺激は、細胞培養汚染、細胞ストレス、培養培地のpH変化などのいくつかの問題を導くことができる。いくつかの細胞タイプおよび組織24、25、26、27を刺激するために異なる刺激装置が開発されたことを考えると、MF強度を変化させ、広範囲の生物学的サンプル29,30を刺激することができる装置を構築することが重要である。したがって、このプロトコルでは磁気刺激器はレオスタットに接続され、抵抗と電流を改変することによってソレノイドを流れる電流を変化させることができる、MFsの生成に直接関係するパラメータである。磁気デバイスを構築する際に考慮すべきもう一つの重要な特徴は、MFの分布です。ここでは、ソレノイドコイル内部のMF分布をシミュレーションするために計算シミュレーションを使用しました。このシミュレーションでは、銅線の回転数とコイルの長さを計算し、コイルの中央に均質なMFを生成することができました。計算シミュレーションは、刺激される生体サンプルの数を計算するのに便利なツールであり、すべてのサンプルが同じフィールド強度47を受け取ることを保証する。
このプロトコルで開発された生物物理学的刺激装置にはいくつかの制限がある。まず、電気刺激装置用に設計された電子回路は、特定の周波数で4つの出力電圧を生成します。回路は電極1間の高電圧生成の限界を克服したが、可変電圧及び周波数を生成するように改善することができた。回路は、単に方程式(1)を使用して抵抗またはコンデンサのいずれかを計算する異なる周波数を生成するように変更することができます。ただし、可変抵抗器を使用して、手動で抵抗値を変えさせることは可能です。同様に、可変抵抗器は、出力電圧を変化させる回路の増幅段階で使用することができる。第2に、電気刺激器の電子回路は、中弦波信号を生成する。これらのタイプのシグナルは、広範囲の細胞および生物学的サンプル48,49を刺激するために使用することができるので、正方形、三角形、台形および傾斜などの異なる種類の信号を生成することは有用であろう。信号の異なるタイプを生成するために、演算増幅器は、低振幅で高い安定性と精度の高品質の波形を生成することができ、増幅段階は非反転型オペアンプまたはNPNトランジスタとのステージに置き換えることができるモノリシック関数発生器に置き換えることができます。第三に、磁気刺激器は微小なMFの大きさを発生するが、これらの強度は、生物学的サンプル24、28、30、38のダイナミクスに直接影響を与える。しかし、磁気デバイスは、生物組織29の広い範囲を刺激するために可変的なMFと周波数を生成するように改善することができた。
全体として、このプロトコルは、生物組織の生物物理学的刺激に取り組む科学界に技術的貢献を提供する有用なツールです。これらのデバイスは、研究者が健康な生体組織または特定の病理によって変化したものの機能を刺激するためにEFとMFを使用することを可能にする。さらにインビボ研究でこれを考えると、電極の大きさ、コイルの回転数、刺激強度、刺激時間などの異なるパラメータと変数は、豚、子牛、モルモット、ウサギなどの動物にEFとMFの両方を均一に分配するように決定されます。さらに、このプロトコルで設計されたバイオリアクターは、自己細胞移植などの回生技術を改善するために臨床設定に外挿することができます。ここで、バイオリアクターは、生体試料を刺激することによって重要な役割を果たし、 インビトロレベルで 、患者に移植される前に細胞、組織および足場の細胞および分子的特徴を改善する。
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Disclosures
著者らは、利益相反はないと宣言している。
Acknowledgments
著者らは、「フォンド・ナシオナル・デ・フィナンシアミエント・パラ・ラ・シエンシア、 ラ・テクノロジア、イ・ラ・イノバシオン -フォンド・フランシスコ・ホセ・デ・カルダス-ミンシエンシアス」とコロンビア大学ナシオナル・デ・コロンビア交付金第80740-290-2020号とヴァルチームテックが受けたサポート - ビデオ版の機器と技術サポートを提供するための 研究と革新 。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Electrical stimulator | |||
| Operational amplifier | Motorola | LF-353N | ---- Quantity: 1 |
| Resistors | ---- | ---- | 22 kΩ Quantity: 1 |
| Resistors | ---- | ---- | 10 kΩ Quantity: 3 |
| Resistors | ---- | ---- | 2.6 kΩ Quantity: 2 |
| Resistors | ---- | ---- | 2.2 kΩ Quantity: 1 |
| Resistors | ---- | ---- | 1 kΩ Quantity: 1 |
| Resistors | ---- | ---- | 220 Ω Quantity: 2 |
| Resistors | ---- | ---- | 22 Ω Quantity: 5 |
| Resistors | ---- | ---- | 10 Ω Quantity: 1 |
| Resistors | ---- | ---- | 6.8 Ω Quantity: 1 |
| Resistors | ---- | ---- | 3.3 Ω Quantity: 2 |
| Polyester capacitors | ---- | ---- | 1 nF Quantity: 2 |
| Polyester capacitors | ---- | ---- | 100 nF Quantity: 1 |
| VHF Band Amplifier Transistor JFET | Toshiba | 2SK161 | ---- Quantity: 1 |
| Power transistor BJT NPN | Mospec | TIP 31C | ---- Quantity: 1 |
| Zener diode | Microsemi | 1N4148 | ---- Quantity: 1 |
| Switch | Toogle Switch | SPDT - T13 | ---- Quantity: 3 |
| Toroidal ferrite core | Caracol | ---- | T*22*14*8 Quantity: 1 |
| Cooper wire | Greenshine | ---- | AWG – 24 Quantity: 1 |
| Relimate header with female housing | ADAFRUIT | ---- | 8 pin connectors Quantity: 1 |
| Relimate header with female housing | ADAFRUIT | ---- | 2 pin connectors Quantity: 1 |
| Female plug terminal connector | JIALUN | ---- | 4mm Lantern Plugs (Plug + Socket) 15 A Quantity: 1 |
| Aluminum Heat Sink | AWIND | ---- | For TIP 31C transistor Quantity: 1 |
| Led | CHANZON | ---- | 5 mm red Quantity: 1 |
| Integrated circuit socket connector | Te Electronics Co., Ltd. | ---- | Double row 8-pin DIP Quantity: 1 |
| 3 pin connectors set | STAR | ---- | JST PH 2.0 Quantity: 3 |
| 2 pin screw connectors | STAR | ---- | For PCB Quantity: 1 |
| 3 pin screw connectors | STAR | ---- | For PCB Quantity: 1 |
| Banana connector test lead | JIALUN | ---- | P1041 - 4 mm - 15 A Quantity: 7 |
| Bullet connectors to banana plug charge lead | JIALUN | ---- | 4 mm male-male/female-female adapters - 15 A Quantity: 1 |
| Case | ---- | ---- | ABS Quantity: 1 |
| Electrodes | ---- | ---- | Stainless – steel Quantity: 2 |
| Electrode support | ---- | ---- | Teflon Quantity: 2 |
| Printed circuit board | Quantity: 1 | ||
| Magnetic stimulator | |||
| Cooper wire | Greenshine | ---- | AWG – 18 Quantity: 1 |
| AC power plugs | ---- | ---- | 120 V AC – 60 Hz Quantity: 1 |
| Banana female connector test lead | JIALUN | ---- | 1Set Dual Injection - 4 mm – 15 A Quantity: 2 |
| Banana male connector test lead | JIALUN | ---- | 1Set Dual Injection - 4 mm 15 A Quantity: 1 |
| Cell culture well plate support | ---- | ---- | PMMA Quantity: 1 |
| Fuse | Bussmann | 2A | ---- Quantity: 1 |
| Transformer | ---- | ---- | 1A – 6 V AC Quantity: 1 |
| Tube | ---- | ---- | PVC Quantity: 1 |
| Variable rheostat | MCP | BXS150 | 10 Ω Quantity: 1 |
| General equipment | |||
| Digital dual source | PeakTech | DG 1022Z | 2 x 0 - 30 V / 0 - 5 A CC / 5 V / 3 A fijo Quantity: 1 |
| Digital Oscilloscope | Rigol | DS1104Z Plus | 100 MHz, bandwidth, 4 channels Quantity: 1 |
| Digital multimeter | Fluke | F179 | Voltage CC – CA (1000 V). Current CC – CA 10 A. Frequency 100 kHz Quantity: 1 |
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