Summary
该协议描述了逐步构建用于刺激生物组织的电刺激器和磁刺激器的过程。该协议包括模拟计算电场和磁场以及制造刺激器设备的准则。
Abstract
电场（EF）和磁场（MFs）已被组织工程广泛应用于改善细胞动力学，如增殖、迁移、分化、形态和分子合成。然而，在刺激细胞、组织或脚手架时，需要考虑这种刺激强度和刺激时间的变量。鉴于EFs和MF因细胞反应而异，尚不清楚如何制造产生足够生物物理刺激以刺激生物样本的设备。事实上，在应用生物物理刺激时，缺乏关于计算和分布的证据。该协议侧重于设计和制造产生EF和MF的设备，并实施计算方法，以预测生物样本内外的生物物理刺激分布。EF 装置由位于生物文化顶部和底部的两个平行不锈钢电极组成。电极连接到振荡器，在 60 kHz 下产生电压（50、100、150 和 200 Vp-p）。MF 设备由线圈组成，该线圈用变压器通电，在 60 Hz 时产生电流 （1 A） 和电压 （6 V）。建造了聚甲基甲基酸酯支撑，以定位线圈中间的生物培养物。计算模拟阐明了生物组织内外EF和MF的均匀分布。此计算模型是一个很有前途的工具，可以修改参数，如电压、频率、组织形态、井板类型、电极和线圈大小，以估计 EF 和 MFs 以实现蜂窝响应。
Introduction
EF和MF已被证明可以改变细胞动力学，刺激增殖和增加与组织1细胞外基质相关的主要分子的合成。这些生物物理刺激可以通过使用特定的设置和设备以不同的方式应用。关于产生EFs的装置，直接耦合刺激器使用电极，这些电极与体外生物样本接触，或直接植入体内患者和动物的组织中：然而，仍然存在一些局限性和缺陷，包括接触中的电极生物相容性不足、pH和分子氧水平的变化1。相反，间接耦合装置在两个电极之间产生EF，它们与生物样品3平行放置，从而允许非侵入性替代技术刺激生物样品，避免组织和电极之间的直接接触。这种类型的设备可以推断到未来的临床应用，以执行程序，以最小的入侵病人。与生成 MF 的设备相关，感应耦合刺激器会产生时间变化的电流，电流流经位于细胞培养物 4、5周围的线圈。最后，还有组合设备，它们使用EF和静态MF生成瞬态电磁场1。鉴于刺激生物样本的配置不同，有必要考虑应用生物物理刺激时的张力和频率等变量。电压是一个重要的变量，因为它影响生物组织的行为：例如，已经表明，细胞迁移，方向和基因表达取决于施加电压3，6，7，8，9，10的振幅。频率在生物物理刺激中起着重要作用，因为已经证明这些频率在体内自然发生。结果表明，高频率和低频对细胞有有益作用：特别是在细胞膜电压门钙通道或内质视网膜中，在细胞内1级、7级、11级触发不同的信号通路。
根据上述情况，用于生成 EF 的设备由连接到两个并行电容器12的电压发生器组成。该装置由阿姆斯特朗等人实施，以刺激13号软骨细胞的增殖率和分子合成。布赖顿等人对该设备进行了改造，他们通过钻取顶部和底部盖子来修改细胞培养井板。孔由盖片填充，底部玻璃用于培养生物组织。每个盖片上都放置电极以生成14EFs 。该装置用于电刺激软骨细胞、骨细胞和软骨系外植，显示细胞增殖增加14、15、16和分子合成3、17。Hartig等人设计的设备由波浪发生器和电压放大器组成，与并行电容器相连。电极由位于绝缘箱中的优质不锈钢制成。该装置用于刺激骨细胞，显示增殖和蛋白质分泌显著增加18。Kim等人使用的设备由双相电流刺激器芯片组成，该芯片采用高压金属氧化物互补半导体的制造工艺制造。培养井板被设计成在导电表面用电刺激培养细胞。电极被涂在镀金硅板19。该装置用于刺激骨细胞，显示血管内皮生长因子19的增殖和合成增加，刺激碱性磷酸活性、钙沉积和骨致癌蛋白20的产生。同样，该装置用于刺激人体骨髓骨髓中微血干细胞21的血管内皮生长因子的增殖率和表达。中尾等人设计的装置由连接到铂板的电压发生器组成。电极的建造是为了测量24个不同点的电能。该装置用于刺激软体细胞，表明EF没有改变细胞形态和增加增殖和分子合成22。Au等人使用的设备包括一个玻璃室，内有两根碳棒，与装有铂金线的心脏刺激器相连。这种刺激器用于刺激心肌细胞和成纤维细胞，改善细胞拉长和成纤维细胞对齐23。
基于赫尔姆霍尔茨线圈制造了不同的MF设备，以刺激几种类型的生物样本。例如，Helmholtz线圈已用于刺激软骨细胞24、25的增殖和分子合成，增强关节软骨去除植物26的蛋白体合成，改善与骨细胞形成相关的基因调节27，增加内皮细胞28的增殖和分子表达。赫尔姆霍尔茨线圈在位于另一个线圈前面的两个线圈中生成 MFs。线圈必须放置在等于线圈半径的距离内，以确保同质 MF。使用赫尔姆霍尔茨线圈的缺点在于线圈尺寸，因为它们需要足够大才能产生所需的 MF 强度。此外，线圈之间的距离必须足够，以确保MF在生物组织周围的均匀分布。为了避免赫尔姆霍尔茨线圈引起的问题，不同的研究一直集中在电磁阀线圈制造上。电磁线圈基于一根管子，该管用铜线缠绕以生成 MFs。铜线输入可以直接连接到插座或电源，为线圈通电，并在电磁阀中心创建 MFs。线圈的转弯越多，产生的 MF 就越大。MF 级级还取决于施加的电压和电流来为线圈29通电。电磁线圈已被用来刺激磁性不同类型的细胞，如赫拉，HEK293和MCF730或中微细胞干细胞31。
不同作者使用的设备没有考虑电极的足够大小或线圈的正确长度，以均匀地分布EF和MF。此外，设备产生固定电压和频率，限制其用于刺激特定的生物组织。因此，在此协议中执行计算模拟指南，以模拟电容系统和线圈，以确保 EF 和 MF 在生物样本上的均匀分布，从而避免边缘效应。此外，还表明电子电路的设计在电极和线圈之间产生电压和频率，从而产生EF和MF，从而克服电池培养井板和空气阻塞造成的局限性。这些修改将允许创建非侵入性和自适应性生物反应器来刺激任何生物组织。
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Protocol
1. 模拟 PF 和 MF
注：在COMSOL多物理中对EF和MF进行了模拟。
- 选择轴对称的 2D 配置以表示电域和磁性两个域。
- 在物理配置中，选择 电流 接口以平行电极计算 PF，或选择 磁场 接口来计算线圈周围的 PF。
- 在研究配置中，选择 频率域 来计算一个或几个频率受到谐波激发的线性或线性模型的反应。
- 一旦进入界面开始构建模型，请根据兴趣模型遵循后续步骤。
- 为 EFs 构建模型
- 创建几何形状。在模型构建器中，选择几何形状。然后，找到单位部分，并选择毫米。在几何工具栏上，选择矩形，并在矩形窗口设置的大小和形状框中键入每个组件的尺寸。几何学由空气、两个平行电极、培养井板、培养介质和生物样本组成，在这种情况下，由透明质酸-明胶水凝胶的脚手架表示（见表1中每个元素的尺寸）。构建所有几何形状后，单击"构建所有对象"。
- 创建选择。在 定义工具栏上，单击 "显式" 以创建金属域的选集。选择表示电极的几何形状。之后，右键单击 "显式1" 以重命名。在新的标签文本字段中键入 金属 。
- 另一方面，在定义工具栏上，单击"补充"。在"补充设置"窗口中定位输入实体部分。然后，在选择中反转，单击"添加"并选择"选择中的金属"，从"添加"对话框中倒置列表。此后，右键单击"补充1"以重命名。在新标签文本字段中键入模型域。
- 创建边界。单击定义工具栏上的"明确"。之后，在"设置"窗口中定位"输入实体"部分以进行"显式"，并从几何实体级别列表中选择"边界"。在这里，选择底部电极的所有边界。右键单击"显式2"以重命名。在新的标签文本字段中键入地面边界。重复这些步骤，但选择上电极的所有边界。此后，右键单击"显式 3"以重命名。在新的标签文本字段中键入终端边界。
- 添加电流。在模型构建器窗口中，在组件 1下单击电流 （ec）。然后，在电流设置窗口中定位域选择部分。从选择列表中选择模型域。在物理工具栏上，单击"边界"并选择"地面"。之后，在"地面设置"窗口中定位边界选择部分，并从选择列表中选择地面边界。
- 之后，单击"边界"并选择物理工具栏上的终端。最后，在终端设置窗口中定位边界选择部分，并从选择列表中选择终端边界：在这里，找到终端部分，并从终端列表和类型100 V中选择电压。
- 添加材料。单击"主机具栏上的添加材料"以打开"添加材料"窗口。搜索空气和不锈钢，并将它们添加到模型构建器窗口。然后，单击家庭工具栏上的空白材料，为培养介质、脚手架（水凝胶）和聚苯乙烯（培养井板）添加三个新的空白材料。
- 选择一个空白材料来分配介电属性。在材料设置窗口中定位材料属性列表，并从基本属性选项列表中选择相对许可性和导电性。文化介质、水凝胶、文化井板的介电性能在表2中。对于所有空白材料重复此过程。
- 将每个材料分配给以前构建的几何形状。选择模型 构建器 窗口中的空气材料：然后，从 图形 窗口中选择与空气对应的域。对于创建的所有材料，重复此步骤。确保每个域对应正确的材料。要确保所有材料都正确分配，请单击 模型构建器 窗口中的每一个材料，并观察 图形 窗口内是否以蓝色突出显示域。
- 构建网格。右键单击模型构建器窗口中的网格 1，然后选择"免费三角形"。通过选择大小重复此步骤。在网格设置窗口中，从序列类型列表中选择由用户控制的网格。然后，在模型构建器窗口中扩展网格选项并单击"大小"。
- 在大小设置窗口中定位元素大小参数，在最大元素大小中定位 1 mm 类型，在最小元素大小中定位 0.002 mm，在最大项目增长率中定位 1.1，在曲率因子中定位 0.2，在狭窄区域分辨率方面为 1。然后，在模型构建器窗口中扩展网格选项，然后单击"免费三角形 1"。在这里，选择要网格化的所有域。最后，单击"在网格设置窗口中构建所有"。
- 创建研究。单击模型构建器窗口中的研究 1。然后，将"研究设置"部分定位到"研究设置"窗口中，然后清除生成默认图复选框。在模型构建器窗口中扩展研究 1节点，然后单击步骤 1：频率域。最后，在频率域设置窗口中定位"研究设置"部分，在频率文本字段中键入 60 kHz。
- 计算研究。单击"在研究工具栏上显示默认解算器"。然后，在模型构建器窗口中扩展研究 1 解算器配置节点。在模型构建器窗口中扩展解决方案 1 （sol1）节点;之后，单击静止解算器设置窗口中的固定解算器 1，并在相对公差文本字段中定位一般部分和类型 1e-6。最后，单击"学习工具栏"上的计算。
- 绘图结果。选择主工具栏上的结果部分，并添加2D 绘图组。然后，在模型构建器窗口中右键单击2D 绘图组 1并选择Surface。然后，在"表面设置"窗口中定位数据部分，然后选择前体。之后，将表达部分定位在"表面设置"窗口中：在这里，单击加号（+）符号以打开新窗口，并从选择列表中查找后续路线（型号 - 组件 1 - 电流 - 电流）。在这里，选择ec.规范 - EF 规范。最后，单击"表面设置"窗口中的图形以绘制结果。
- 为 MFs 构建模型
- 创建几何形状。在 模型构建器中，选择 几何：然后，找到 单位 部分并选择毫米。在几 何工具栏 上选择 矩形 ，并在矩 形窗口 设置的大小和形状框中键入每个组件的尺寸。几何形状由空气和库珀组成（参见 表 1中每个元素的尺寸）。构建所有几何形状后，单击 "构建所有对象"。
- 添加材料。单击"主机具栏上的添加材料"以打开"添加材料"窗口。搜索空气和铜，并将它们添加到模型构建器窗口。铜的介电特性在表2中。
- 创建边界。单击模型构建器窗口上的磁场。在这里，在磁场设置窗口上定位方程列表，并从方程表单列表中选择频率域方程。在频率列表中从解算器中选择。之后，在模型构建器窗口中的磁场列表中查找安培定律。在温度293.15 [K] 类型中，输入模型列表中的绝对压力为 1 [atm]。然后，从安培定律设置窗口中的材料类型列表中选择固体。确保电导率、相对许可性和相对渗透性与列表中的"从"材料对应。
- 在模型构建器窗口中的磁场列表中定位轴向对称性。确保在边界选择列表和图形窗口中突出显示轴向对称线。然后，在模型生成器窗口中的磁场列表中定位磁隔离。确保在边界选择列表和图形窗口中突出显示几何形状的边界。
- 在模型生成器窗口中的磁场列表中查找初始值。从初始值设置窗口中选择以前构建的几何形状并将其包含在域选择中。
- 引入线圈功能。在模型构建器窗口中的磁场列表中定位多个线圈。在这里，选择表示线圈的几何形状，并从多个线圈设置窗口将它们包含在域选择中。
- 在 多个线圈 设置窗口上定位 多个线圈 列表;在这里，找到线圈激发列表，并选择 当前：此后，线圈电流列表中的 1[A] 类型、圈导率中的 450 圈数和 6e7[S/m] 。
- 定位 线圈 线横截面区域，并在 AWG 选项中从列表中选择北美电缆直径（棕色和夏普）和类型 18。确保相对许可性和相对渗透性与列表中的材料相对应。
- 构建网格。在网格设置窗口中，从序列类型列表中选择由物理控制的网格。之后，在网格设置窗口中定位元素大小参数，然后选择非常精细。最后，选择要网格化的所有域，然后单击"在网格设置窗口中构建所有域"。
- 创建研究。单击模型构建器窗口中的研究 1。然后，将"研究设置"部分定位到"研究设置"窗口中，然后清除生成默认图复选框。在模型构建器窗口中扩展研究 1节点，然后单击步骤 2：频率域。最后，在频率域设置窗口中定位"研究设置"部分，在频率文本字段中定位 60 Hz 类型。
- 计算研究。单击"在研究工具栏上显示默认解算器"。然后，在模型构建器窗口中扩展研究 1 解算器配置节点。在模型构建器窗口中扩展解决方案 1 （sol1）节点;之后，单击静止解算器设置窗口中的固定解算器 1，并在相对公差文本字段中定位一般部分和类型 1e-6。 最后，单击"学习工具栏"上的计算。
- 绘图结果。选择主工具栏上的结果部分，并添加2D 绘图组。然后，在模型构建器窗口中右键单击2D 绘图组 1并选择Surface。然后，在"表面设置"窗口中定位数据部分，然后选择前体。
- 在"表面设置"窗口中定位表达部分。在这里，单击加号 （+） 符号以打开新窗口，并从选择列表中查找后续路线（型号 - 组件 1 - 磁场 - 磁性）。在这里，选择mf.normB-磁通量密度规范。最后，单击"表面设置"窗口中的图形以绘制结果。
- 为 EFs 构建模型
2. 电气和磁刺激装置的设计和制造
- 电气刺激装置
注：它由基于温桥振荡器和两个平行不锈钢电极的电路组成。电路是相变的RC振荡器，使用正反馈和负反馈。Wien 桥振荡器由铅滞后网络组成，该网络将输入电压除以桥的两个臂的组合：电阻器 R5 带电容器 C2 在系列中，和电阻器 R6 带电容器 C3 并行（图1A).这些组件调节振荡器的频率。要构建电气刺激器设备，请遵循以下步骤：- 使用共振频率方程 （1） 计算频率。
其中R=R 5=R 6 是电阻器，C=C=C3是电容器。 R和C都放置在桥的两臂（图 1A）中。使用R5 = R6 = 2.6 kΩ 和C2 = C3 = 1 nF 以获得 60 kHz 的频率。如果需要不同的频率，可以计算电阻器和电容器。 - 设计电路的方式使放大器的电压增益自动补偿输出信号的振幅变化。在 图 1A 中，可以观察电路的方案，而在 "材料表" 部分中列出了构建电路的电子元件。
- 计算电阻器的组合以生成四个输出电压。如图1A所示，使用电阻器R11、R 12、R 13和R14（等效电阻为154 Ω）组合产生50 Vp-p的电压：电阻器R17、R 18和R19系列（等效电阻为 47，3 Ω），电压为 100 Vp-p：电阻器R9和R10系列（等效电阻为 25，3 Ω），产生 150 Vp-p 的电压：电阻器 R 15和R16（等效电阻为 16，8 Ω）的组合，以获得 200 Vp-p 的电压。
- 使用晶体管（TIP 31C）和铁氧体芯变压器实现信号放大阶段。一个托罗伊达尔铁氧体核心被用来风AWG 24铜线，完成关系1：200。在变压器前，在变压器前并行使用 100 nF 的两个电容器（C4 和 C5）来校正信号 （图 1A）。
- 使用第三方多氯联苯制造服务准备多氯联苯。电路的示意图图以 图 1提供。将所有组件都放在多氯联苯上，并配有防静电钳子。使用锡焊机和焊接铁焊接所有组件。
- 用输入连接器制造塑料外壳以保护电路。实施三个输入连接器，为电路（12 V、-12 V 和地面）提供动力。使用两个输入连接器连接电极。包括三个开关来改变电阻器组合以获得四个输出电压。将电子电路组装成塑料盒（图1B）。
- 制造两个平行不锈钢电极（200 x 400 x 2 mm）和焊接器输入连接器到每个边缘。电极位于铁氟龙或丙烯酸支架上，以消除与孵化器金属表面的任何接触（图 1C）。
- 使用 394.15 K （121 °C） 的高压灭菌器 30 分钟，对电极进行消毒，并在夜间使用紫外线对与孵化器接触的电线进行消毒。
- 测试电气刺激装置。系列调整电源，在地面和正负终端之间产生 +12 V 和 -12 V 的输出电压。用多米验证电源的输出电压。在电气刺激器的正确输入中连接电源的每个输出（+12 V、-12 V 和地面）。将每个电极连接到电气刺激器的正确输入连接器中。极性并不重要，因为我们正在研究交流电流。在电极之间放置培养井板，用示波器验证输出信号。调整电气刺激器的开关以产生四个输出电压（50、100、150 和 200 Vp-p）。
- 安全建议。在从孵化器中传输或移除电极时，要避免出现任何问题，请确保电缆不会缠绕。在从孵化器中取出电极之前，先将电缆与振荡器断开。没有丙烯酸或特氟隆支架，切勿放置电极。
- 使用共振频率方程 （1） 计算频率。
- 磁刺激装置
- 使用等式 （2） 来估计转弯次数，以保证线圈内的同质 MF，该方程描述电磁阀线圈内的 MF。
其中μ 0是真空的磁渗透性（4 π×10-7），N是铜线的转弯次数，我是电流，h，应该大于其直径，是电磁线圈的长度。 - 通过选择长度 （h） 为 250 mm、电流为 1 A 和 Bint = 2mT来确定转弯次数。
- 制造线圈。建造一个长度为250毫米、直径为84毫米的聚氯乙烯管，使AWG 18铜线完成450圈（图2A）。尺寸是根据孵化器内的可用空间选择的。
- 制造细胞培养井板支撑。构建聚甲基甲基酸酯 （PMMA） 支撑，以确保 35 mm 的井板始终位于 MFs 均匀的线圈中间（图 2A）。
- 制造变压器以增加电路电流。构建输出为 1 A - 6 V AC 的变压器，以达到 2 mT 的最大 MF。变压器的输入电压为 110 V AC，为 60 Hz。这些参数与南美出口的输出电压和频率相对应。
- 连接电路。变压器直接连接到插座。使用可变电阻器（流体）来改变电流并生成 1 到 2 mT 的 MF。连接保险丝以保护电路（图2B）。
- 夜间使用紫外线对与孵化器接触的电线进行消毒。用透明拉伸膜包裹线圈，并使用乙醇对线圈进行消毒。
- 测试MF设备。使用特斯拉计测量线圈内的 MF 级。特斯拉计探针位于线圈的中心，允许同时测量 MF 和电流。
- 改变MF级。使用流变来修改电路的电阻（图 2B）。电阻值为 0.7 Ω用于生成 1 mT 的 MF。
- 安全建议。在从孵化器中转移或移除电磁阀时，要避免出现任何问题，请确保电缆不会缠绕。在从孵化器中取出电磁阀之前，先将电缆与变压器断开。没有 PMMA 支持，切勿放置电磁阀。从孵化器转移或移除时，牢牢抓住基地和电磁阀的 PMMA 支持。
- 使用等式 （2） 来估计转弯次数，以保证线圈内的同质 MF，该方程描述电磁阀线圈内的 MF。
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Representative Results
计算模拟
3 图中显示了 EF 和 MF 的分布。一方面，可以观察电容系统（图3A）中EF的均匀分布。绘制了EF图，以详细观察生物样本（图3B）内场的大小。这种模拟有助于对电极的大小进行参数化，并制造它们以避免边缘效应。另一方面，可以观察电磁线圈（图3C）产生的MF的均匀分布。MF 被绘制为详细观察线圈内场的大小 （图 3D）。此模拟是测量 MF 相同位置的距离并构建 PMMA 支持的重要指标。这种支持确保MF的均匀分布不仅在线圈的中心，而且在生物样本中受到刺激。
电和磁刺激器产生的信号
电刺激器产生的输出信号显示在 图 4 中。重要的是要强调，示波器捕获的信号是直接在电极中拍摄的，因为无论测量是否直接到输出电缆，电压都会更高（图4A）。这种电压变化是由电极电容引起的。输出电压在 60 kHz 下在 5V ±范围内振荡：例如，输出信号为 54.9 Vp-p（图 4B）、113Vp-p （图4C）、153Vp-p （图4D）和 204 Vp-p （图4E），分别为 50、100、150 和 200 Vp-p。
磁刺激器产生的输出信号显示在 图 5 中。示波器捕获的信号直接在线圈的输出电缆（图 5A）中获取。输出电压在 60 Hz （图 5B） 下在 15V p-p ±范围内振荡。
图1。电气刺激装置。A）在 60 kHz 的西恩波形下产生 50、100、150 和 200 Vp-p 的紧张状态的电路。B）在箱子内打印电路板。C）孵化器内的电极。请单击此处查看此图的较大版本。
图2。磁刺激装置。A） 磁刺激器设备和 PMMA 支持的示意图表示。B） 电路生成 Mfs。请单击此处查看此图的更大版本。
图3。EF 和 MF 的计算模拟。A） 电容系统内外的 EF 分布。 B） 水凝胶内的 PF 分布，感兴趣的区域以红色细节表示。 C） 线圈内外的 MF 分布。 D） 在线圈中心分布的 MF，感兴趣的区域以红色细节表示。 请单击此处查看此图的较大版本。
图4。由电刺激器产生的鼻窦信号。A） 电气刺激器生成的信号验证。 B） 信号在 50 Vp - p. C） 信号在 100 Vp - p. D） 信号在 150 Vp - p. E） 信号在 200 Vp - p.所有测量在 60 kHz 的 5V ±范围内摆动。 请单击此处查看此图的较大版本。
图5。磁刺激器产生的鼻窦信号。 A） 磁刺激器产生的信号验证。 B） 信号在 15 Vp - p 在 60 Hz. 请点击这里查看此图的更大版本。
| 系统 | 组件 | 宽度（毫米） | 高度（毫米） |
| 电气系统 | 空气 | 100 | 100 |
| 电极 | 50 | 5 | |
| 井板 | 7 | 20 | |
| 水 凝 胶 | 3.5 | 3.5 | |
| 文化媒体 | 6 | 8 | |
| 磁性系统 | 空气 | 500 | 600 |
| 线圈 | 2 | 250 |
表1。 构成电气和磁性系统的几何尺寸。
| 系统 | 组件 | 相对许可（ε） | 导电性（σ） |
| 电气系统 | 空气 | 1 | 0 |
| 电极 | 1 | 1.73913 [MS/m] | |
| 井板 | 3.5 | 6.2E-9 [S/m] | |
| 水 凝 胶 | 8.03E3 | 7.10E-2 [S/m] | |
| 文化媒体 | 2.67E4 | 7.20E-2 [S/m] | |
| 磁性系统 | 线圈 | 1 | 5.998E7[S/m] |
表2。 组成电和磁系统的元素的介电特性。
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Discussion
用于治疗影响人体组织的不同病理的治疗方法是药理疗法32或手术干预33，寻求减轻局部疼痛或用外植或移植取代受影响的组织。最近，自体细胞疗法被提议作为治疗受伤组织的替代疗法，其中细胞从患者身上分离出来，并通过体外技术扩大，植入损伤34的部位。鉴于自体细胞疗法已证明对组织恢复有直接影响，已开发出不同的策略，以提高该技术的有效性。例如，生物物理刺激已被用作一种非侵入性替代疗法，通过改善细胞增殖和分子合成35，36来刺激几种类型的生物样本，调节细胞功能。在最常用的生物物理刺激中，电刺激和磁疗法已广泛应用于刺激细胞、组织外植和脚手架。事实证明，电刺激可以减轻疼痛，增加几个组织37的愈合过程。关于磁疗，据介绍，这种刺激改善植入物与宿主组织的整合，加速愈合过程，减轻疼痛局部和增加疤痕强度8，38。
考虑到上述情况，生物材料、细胞培养和外部生物物理刺激（如EFs和MF）在体外层面的结合，已引入组织工程，作为治疗受伤组织8、39的替代治疗技术。然而，找到一种生物反应器，帮助刺激不同的组织，无论是健康或创伤性病理的影响，是一个挑战。在这方面，本议定书旨在开发电气和磁性刺激器。目前，有两个可能的计划来应用EFs。第一种方法包括通过直接耦合系统生成EF，用于评估细胞迁移和方向40、41、42。然而，有一些局限性，如通过接触中的电极改变细胞培养介质的生物相容性，pH和分子氧水平1的可能变化。此外，直接耦合刺激不能放大高频信号。输出往往随时间而变化，从而产生供应电压变化。它几乎没有温度稳定性，由于这个它的操作点的变化和在低频电容器失败，并作为一个开放的电路43。考虑到这些限制，第二种方法被实施，其中使用了外部并行电极。这种间接耦合系统方法证明细胞增殖和分子合成增加3、7、17、22、44、45：然而，不同作者开发的设备没有考虑电极的大小来均匀地分布EFs。例如，设备产生固定电压和频率，限制其用于刺激特定的细胞和组织。因此，在这项研究中，对电极的大小进行了建模，以确保EF在生物组织上的均匀分布。此外，电路设计用于在电极之间产生频率和高压，从而产生不同的 PF，从而克服细胞培养井板和空气阻塞造成的局限性。
电磁线圈是多功能装置，可用于刺激孵化器内的生物样本，使大气条件保持稳定，而不会影响生物样本的生理特征。这一优势阐明，电磁阀线圈是可行的替代品比赫尔姆霍尔茨线圈，因为这些需要更大的尺寸，防止刺激孵化器46。在孵化器外刺激生物样本会导致细胞培养污染、细胞应力、培养介质的pH次变化等几个问题。鉴于已开发出不同的刺激器设备，以刺激多种细胞类型和组织24、25、26、27，因此，在制造MF强化度可以变化以刺激各种生物样本的装置方面，29、30是相关的。因此，在此协议中，磁刺激器连接到风湿剂，流体可以通过修改其电阻和电流来改变流经电磁阀的电流，这些参数与 MFs 的生成直接相关。在构建磁性设备时需要考虑的另一个重要特征是 MF 的分布。在这里，使用计算模拟模拟电磁线圈内的 MF 分布。此模拟允许计算铜线的转弯次数和线圈的长度，从而在线圈中间生成均匀的 MF。计算模拟是计算要刺激的生物样本数量的有用工具，确保所有样品获得相同的场强度47。
本协议中开发的生物物理刺激器存在一些局限性。首先，专为电刺激器设计的电子电路在特定频率下产生四个输出电压。虽然电路克服了电极1之间产生高压的局限性，但可以改进以产生可变电压和频率。电路可以修改，以产生不同的频率，只需使用方程计算电阻器或电容器 （1）：但是，可以使用可变电阻器手动更改电阻器值。同样，可变电阻器可能用于电路的放大阶段，以改变输出电压。其次，电刺激器的电子电路产生鼻窦信号。它将有助于产生不同类型的信号，如方形，三角形，梯形和坡道，因为这些类型的信号可以用来刺激广泛的细胞和生物样本48，49。为了生成不同类型的信号，操作放大器可以由单体函数发生器取代，该发电机可以产生高稳定性和精度的高质量波形，低振幅，放大阶段可以替换为非倒置操作放大器或带 NPN 晶体管的阶段。第三，即使磁刺激器产生小的MF级，也证明这些强度对生物样本24、28、30、38的动力学有直接影响：然而，磁性装置可以改进，以产生可变的MF和频率，以刺激广泛的生物组织29。
总的来说，该议定书是一个有用的工具，它为致力于生物组织生物物理刺激的科学界提供了技术贡献。这些设备将允许研究人员使用EF和MF来刺激健康生物组织或那些被特定病理学改变的组织的功能。在进一步的体内研究中，将确定不同的参数和变量，如电极大小、线圈转弯次数、刺激强度和刺激时间，以便在猪、小牛、豚鼠或兔子等动物中均匀地分布EF和MF。此外，本协议中设计的生物反应器可以推断为临床设置，以改进再生技术，如自体细胞植入。在这里，生物反应器可以通过 刺激体外 水平的生物样本，在植入患者之前改善细胞、组织和脚手架的细胞和分子特征来发挥重要作用。
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Disclosures
作者宣称他们没有利益冲突。
Acknowledgments
作者感谢"国家金融基金会"提供的财政支持， 通过第80740-290-2020号赠款和 Valteam技术-研究与创新 为提供视频版设备和技术支持而获得的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Electrical stimulator | |||
| Operational amplifier | Motorola | LF-353N | ---- Quantity: 1 |
| Resistors | ---- | ---- | 22 kΩ Quantity: 1 |
| Resistors | ---- | ---- | 10 kΩ Quantity: 3 |
| Resistors | ---- | ---- | 2.6 kΩ Quantity: 2 |
| Resistors | ---- | ---- | 2.2 kΩ Quantity: 1 |
| Resistors | ---- | ---- | 1 kΩ Quantity: 1 |
| Resistors | ---- | ---- | 220 Ω Quantity: 2 |
| Resistors | ---- | ---- | 22 Ω Quantity: 5 |
| Resistors | ---- | ---- | 10 Ω Quantity: 1 |
| Resistors | ---- | ---- | 6.8 Ω Quantity: 1 |
| Resistors | ---- | ---- | 3.3 Ω Quantity: 2 |
| Polyester capacitors | ---- | ---- | 1 nF Quantity: 2 |
| Polyester capacitors | ---- | ---- | 100 nF Quantity: 1 |
| VHF Band Amplifier Transistor JFET | Toshiba | 2SK161 | ---- Quantity: 1 |
| Power transistor BJT NPN | Mospec | TIP 31C | ---- Quantity: 1 |
| Zener diode | Microsemi | 1N4148 | ---- Quantity: 1 |
| Switch | Toogle Switch | SPDT - T13 | ---- Quantity: 3 |
| Toroidal ferrite core | Caracol | ---- | T*22*14*8 Quantity: 1 |
| Cooper wire | Greenshine | ---- | AWG – 24 Quantity: 1 |
| Relimate header with female housing | ADAFRUIT | ---- | 8 pin connectors Quantity: 1 |
| Relimate header with female housing | ADAFRUIT | ---- | 2 pin connectors Quantity: 1 |
| Female plug terminal connector | JIALUN | ---- | 4mm Lantern Plugs (Plug + Socket) 15 A Quantity: 1 |
| Aluminum Heat Sink | AWIND | ---- | For TIP 31C transistor Quantity: 1 |
| Led | CHANZON | ---- | 5 mm red Quantity: 1 |
| Integrated circuit socket connector | Te Electronics Co., Ltd. | ---- | Double row 8-pin DIP Quantity: 1 |
| 3 pin connectors set | STAR | ---- | JST PH 2.0 Quantity: 3 |
| 2 pin screw connectors | STAR | ---- | For PCB Quantity: 1 |
| 3 pin screw connectors | STAR | ---- | For PCB Quantity: 1 |
| Banana connector test lead | JIALUN | ---- | P1041 - 4 mm - 15 A Quantity: 7 |
| Bullet connectors to banana plug charge lead | JIALUN | ---- | 4 mm male-male/female-female adapters - 15 A Quantity: 1 |
| Case | ---- | ---- | ABS Quantity: 1 |
| Electrodes | ---- | ---- | Stainless – steel Quantity: 2 |
| Electrode support | ---- | ---- | Teflon Quantity: 2 |
| Printed circuit board | Quantity: 1 | ||
| Magnetic stimulator | |||
| Cooper wire | Greenshine | ---- | AWG – 18 Quantity: 1 |
| AC power plugs | ---- | ---- | 120 V AC – 60 Hz Quantity: 1 |
| Banana female connector test lead | JIALUN | ---- | 1Set Dual Injection - 4 mm – 15 A Quantity: 2 |
| Banana male connector test lead | JIALUN | ---- | 1Set Dual Injection - 4 mm 15 A Quantity: 1 |
| Cell culture well plate support | ---- | ---- | PMMA Quantity: 1 |
| Fuse | Bussmann | 2A | ---- Quantity: 1 |
| Transformer | ---- | ---- | 1A – 6 V AC Quantity: 1 |
| Tube | ---- | ---- | PVC Quantity: 1 |
| Variable rheostat | MCP | BXS150 | 10 Ω Quantity: 1 |
| General equipment | |||
| Digital dual source | PeakTech | DG 1022Z | 2 x 0 - 30 V / 0 - 5 A CC / 5 V / 3 A fijo Quantity: 1 |
| Digital Oscilloscope | Rigol | DS1104Z Plus | 100 MHz, bandwidth, 4 channels Quantity: 1 |
| Digital multimeter | Fluke | F179 | Voltage CC – CA (1000 V). Current CC – CA 10 A. Frequency 100 kHz Quantity: 1 |
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