Summary
Questo protocollo descrive il processo passo-passo per costruire stimolatori elettrici e magnetici utilizzati per stimolare i tessuti biologici. Il protocollo include una linea guida per simulare computazalmente campi elettrici e magnetici e la produzione di dispositivi di stimolazione.
Abstract
I campi elettrici (EFs) e i campi magnetici (IF) sono stati ampiamente utilizzati dall'ingegneria tissutale per migliorare la dinamica cellulare come la proliferazione, la migrazione, la differenziazione, la morfologia e la sintesi molecolare. Tuttavia, variabili come la forza degli stimoli e i tempi di stimolazione devono essere considerati quando si stimolano cellule, tessuti o impalcature. Dato che EFs e IF variano a seconda della risposta cellulare, non è chiaro come costruire dispositivi che generino adeguati stimoli biofisici per stimolare campioni biologici. In effetti, mancano prove relative al calcolo e alla distribuzione quando vengono applicati stimoli biofisici. Questo protocollo è focalizzato sulla progettazione e produzione di dispositivi per generare EFs e IF e sull'implementazione di una metodologia computazionale per prevedere la distribuzione di stimoli biofisici all'interno e all'esterno dei campioni biologici. Il dispositivo EF era composto da due elettrodi paralleli in acciaio inossidabile situati nella parte superiore e inferiore delle colture biologiche. Gli elettrodi erano collegati ad un oscillatore per generare tensioni (50, 100, 150 e 200 Vp-p) a 60 kHz. Il dispositivo MF era composto da una bobina, che era eccitata con un trasformatore per generare una corrente (1 A) e una tensione (6 V) a 60 Hz. Fu costruito un supporto di metacrilato polimetile per localizzare le colture biologiche al centro della bobina. La simulazione computazionale ha chiarito la distribuzione omogenea di EF e IF all'interno e all'esterno dei tessuti biologici. Questo modello computazionale è uno strumento promettente in grado di modificare parametri come tensioni, frequenze, morfologie tissutali, tipi di piastre di pozzo, elettrodi e dimensioni della bobina per stimare gli EF e gli IF per ottenere una risposta cellulare.
Introduction
EFs e IF hanno dimostrato di modificare la dinamica cellulare, stimolando la proliferazione e aumentando la sintesi delle principali molecole associate alla matrice extracellulare dei tessuti1. Questi stimoli biofisici possono essere applicati in diversi modi utilizzando impostazioni e dispositivi specifici. Per quanto riguarda i dispositivi per generare EF, gli stimolatori di accoppiamento diretto utilizzano elettrodi che sono a contatto con campioni biologici in vitro o impiantati direttamente nei tessuti di pazienti e animali in vivo2; tuttavia, vi sono ancora limitazioni e carenze che includono l'insufficiente biocompatibilità da parte degli elettrodi a contatto, cambiamenti nei livelli di pH e ossigeno molecolare1. Al contrario, i dispositivi di accoppiamento indiretto generano EF tra due elettrodi, che sono collocati in parallelo aicampioni biologici 3, consentendo una tecnica alternativa non invasiva per stimolare campioni biologici ed evitare il contatto diretto tra tessuti ed elettrodi. Questo tipo di dispositivo può essere estrapolato a future applicazioni cliniche per eseguire procedure con un'invasione minima al paziente. In relazione ai dispositivi che generano MFs, gli stimolatori di accoppiamento induttivi creano una corrente elettrica variabile nel tempo, che scorre attraverso una bobina che si trova intorno allecolture cellulari 4,5. Infine, esistono dispositivi combinati, che utilizzano EFs e IF statici per generare campi elettromagnetici transitori1. Dato che ci sono diverse configurazioni per stimolare campioni biologici, è necessario considerare variabili come tensione e frequenza quando vengono applicati stimoli biofisici. La tensione è una variabile importante, poiché influenza il comportamento dei tessuti biologici; ad esempio, è stato dimostrato che la migrazione cellulare, l'orientamento e l'espressione genica dipendono dall'ampiezza della tensioneapplicata 3,6,7,8,9,10. La frequenza gioca un ruolo importante nella stimolazione biofisica, poiché è stato dimostrato che queste si verificano naturalmente in vivo. È stato dimostrato che le alte e basse frequenze hanno effetti benefici sulle cellule; in particolare, nei canali di calcio gated di tensione della membrana cellulare o reticolo endoplasmatico, che innescano diverse vie di segnalazione alivello intracellulare 1,7,11.
Secondo quanto sopra, un dispositivo per la generazione di EF è costituito da un generatore di tensione collegato a due condensatori paralleli12. Questo dispositivo è stato implementato da Armstrong et al. Un adattamento di questo dispositivo è stato eseguito da Brighton et al. I fori venivano riempiti da vetri di copertura, dove gli occhiali inferiori venivano utilizzati per coltura di tessuti biologici. Gli elettrodi sono stati posizionati su ogni vetrino di copertura per generareEFs 14. Questo dispositivo è stato utilizzato per stimolare elettricamente condrociti, osteoblasti ed espianto cartilagine, mostrando un aumento della proliferazionecellulare 14,15,16 e sintesimolecolare 3,17. Il dispositivo progettato da Hartig et al. Gli elettrodi erano realizzati in acciaio inossidabile di alta qualità situato in una custodia isolante. Il dispositivo è stato utilizzato per stimolare gli osteoblasti, mostrando un significativo aumento della proliferazione e della secrezioneproteica 18. Il dispositivo utilizzato da Kim et al. Una piastra di coltura è stata progettata per coltura di cellule su una superficie conduttiva con stimolazione elettrica. Gli elettrodi erano rivestiti in oro su piastre disilicio 19. Questo dispositivo è stato utilizzato per stimolare gli osteoblasti, mostrando un aumento della proliferazione e della sintesi del fattore di crescita endoteliale vascolare19e stimolando la produzione di attività fosfatasi alcalina, deposizione di calcio e proteine morfogeniche ossee20. Allo stesso modo, questo dispositivo è stato utilizzato per stimolare il tasso proliferativo e l'espressione del fattore di crescita endoteliale vascolare delle cellule staminali mesenchimali del midollo osseoumano 21. Il dispositivo progettato da Nakasuji et al. Gli elettrodi sono stati costruiti per misurare il potenziale elettrico in 24 punti diversi. Questo dispositivo è stato utilizzato per stimolare i condrociti, dimostrando che le EF non alterano la morfologia cellulare e aumentano la proliferazione e la sintesi molecolare22. Il dispositivo utilizzato da Au et al. Questo stimolatore è stato utilizzato per stimolare cardiomiociti e fibroblasti, migliorando l'allungamento cellulare e l'allineamento deifibroblasti 23.
Diversi dispositivi MF sono stati fabbricati sulla base di bobine Helmholtz per stimolare diversi tipi di campioni biologici. Ad esempio, le bobine di Helmholtz sono state utilizzate per stimolare la proliferazione e la sintesi molecolare dei condrociti24,25, migliorare la sintesi proteoglicana degli espianto cartilaginei articolari26,migliorare l'upregolazione genica correlata alla formazione ossea delle cellule osteoblase27e aumentare la proliferazione e l'espressione molecolare delle cellule endoteliali28. Le bobine Helmholtz generano MF attraverso due bobine situate una di fronte all'altra. Le bobine devono essere posizionate con una distanza pari al raggio delle bobine per garantire un MF omogeneo. Lo svantaggio dell'uso delle bobine Helmholtz risiede nelle dimensioni della bobina, perché devono essere abbastanza grandi da generare l'intensità MF richiesta. Inoltre, la distanza tra le bobine deve essere sufficiente a garantire una distribuzione omogenea delle IF attorno ai tessuti biologici. Per evitare problemi causati dalle bobine Helmholtz, diversi studi sono stati focalizzati sulla produzione di bobine solenoidi. Le bobine solenoidi sono basate su un tubo, che viene avvolto con filo di rame per generare MFs. Gli ingressi del filo di rame possono essere collegati direttamente alla presa o a un alimentatore per energizzare la bobina e creare MFs al centro del solenoide. Più giri ha la bobina, maggiore è l'MF generato. La magnitudine MF dipende anche dalla tensione e dalla corrente applicate per energizzare la bobina29. Bobine solenoidi sono state utilizzate per stimolare magneticamente diversi tipi di cellule come HeLa, HEK293 e MCF730 o cellule staminali mesenchimali31.
I dispositivi utilizzati da autori diversi non hanno considerato né la dimensione adeguata degli elettrodi né la lunghezza corretta della bobina per distribuire in modo omogeneo sia i FE che i IF. Inoltre, i dispositivi generano tensioni e frequenze fisse, limitandone l'uso per stimolare specifici tessuti biologici. Per questo motivo, in questo protocollo viene eseguita una linea guida di simulazione computazionale per simulare sia sistemi capacitivi che bobine per garantire una distribuzione omogenea di EFs e MF su campioni biologici, evitando l'effetto bordo. Inoltre, viene dimostrato che la progettazione di circuiti elettronici genera tensioni e frequenza tra gli elettrodi e la bobina, creando EFs e IF che supereranno i limiti causati dall'impedenza delle piastre e dell'aria della coltura cellulare. Queste modifiche consentiranno la creazione di bioreattori non invasivi e adattivi per stimolare qualsiasi tessuto biologico.
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Protocol
1. Simulazione di FEI e IF
NOTA: la simulazione di EFs e IF è stata eseguita in multifisica COMSOL.
- Selezionare una configurazione 2D assimmetrica per rappresentare entrambi i domini elettrico e magnetico.
- Nella configurazione fisica, selezionate l'interfaccia Corrente elettrica per calcolare ef in elettrodi paralleli o l'interfaccia campo magnetico per calcolare le MF attorno alle bobine.
- Nella configurazione di studio, selezionate Dominio frequenza (Frequency Domain) per calcolare la risposta di un modello lineare o linearizzato sottoposto ad eccitazione armonica per una o più frequenze.
- Una volta all'interno dell'interfaccia per iniziare a costruire il modello, seguire i passaggi successivi in base al modello di interesse.
- Creazione di un modello per i FE
- Create geometrie. In Generatore di modelliselezionare Geometria. Individuare quindi la sezione Unità e scegliere mm. Sulla barra degli strumenti Geometria selezionare Rettangolo e digitare le dimensioni di ogni componente nella casella Dimensioni e forma delle impostazioni della finestra rettangolo . La geometria è composta dall'aria, due elettrodi paralleli, una piastra di pozzo di coltura, mezzi di coltura e un campione biologico, che in questo caso è rappresentato da un'impalcatura di acido ialuronico - idrogel di gelatina (vedi dimensioni di ciascun elemento nella tabella 1). Una volta create tutte le geometrie, fare clic su Compila tutti gli oggetti.
- Creare selezioni. Sulla barra degli strumenti Definizionifare clic su Esplicito per creare una selezione per il dominio metallico. Selezionate le geometrie che rappresentano gli elettrodi. Dopo, fare clic con il pulsante destro del mouse su Explicit 1 per rinominarlo. Digitare Metallo nel nuovo campo di testo dell'etichetta.
- Sulla barra degli strumenti Definizioni fare clicsu Complemento. Individuare la sezione Entità di input nella finestra Impostazioni complemento. Quindi, in Selezioni da invertire, fate clic su Aggiungi (Add) e selezionate Metallo (Metal) nell'elenco Selezioni da invertire (Selections to invert) dalla finestra di dialogo Aggiungi (Add). Successivamente, fare clic con il pulsante destro del mouse nel complemento 1 per rinominarlo. Digitare dominio modello nel nuovo campo di testo dell'etichetta.
- Creare limiti. Fare clic su Esplicito sulla barra degli strumenti Definizioni. Dopo, individuate la sezione Entità di input nella finestra Impostazioni per esplicito (Settings) e dall'elenco Livello entità geometrica (Geometric entity level), selezionate Limite (Boundary). Qui, selezionare tutti i limiti per l'elettrodo inferiore. Fare clic con il pulsante destro del mouse su Explicit 2 per rinominarlo. Digitare i limiti di terra nel nuovo campo di testo dell'etichetta. Ripetere questi passaggi ma selezionando tutti i limiti per l'elettrodo superiore. Successivamente, fare clic con il pulsante destro del mouse su Explicit 3 per rinominarlo. Digitare Limiti terminale nel nuovo campo di testo dell'etichetta.
- Aggiungere correnti elettriche. Nella finestra Generatore di modelli, in Componente 1, fate clic su Correnti elettriche (ec). Individuare quindi la sezione Selezione dominio nella finestra Impostazioni correnti elettriche. Nell'elenco Selezione scegliere Dominio modello. Sulla barra degli strumenti Fisicafare clic su Limiti e scegliere Terra. Dopo, individuate la sezione Selezione limite (Boundary Selection) nella finestra Impostazioni terreno (Ground Settings) e scegliete Limiti terra (Ground boundaries) dall'elenco Selezione (Selection).
- Successivamente, fare clic su Limiti e scegliere Terminale sulla barra degli strumenti fisica. Infine, individuate la sezione Selezione limite (Boundary Selection) nella finestra Impostazioni terminale (Terminal Settings) e scegliete Limiti terminale (Terminal boundaries) dall'elenco Selezione (Selection). qui, individuare la sezione Terminale e scegliere Tensione dall'elenco Terminale e digitare 100 V.
- Aggiungere materiali. Fate clic su Aggiungi materiale (Add Material) sulla barra degli strumenti Home per aprire la finestra Aggiungi materiale (Add Material). Cerca aria e acciaio inossidabile e aggiungili alla finestra Model Builder. Quindi, fate clic su Materiale vuoto (Blank Material) sulla barra degli strumenti Home e aggiungete tre nuovi materiali vuoti per i supporti di coltura, l'impalcatura (idrogel) e il polistirolo (piastra del pozzo di coltura).
- Selezionate un materiale vuoto per assegnare le proprietà dielettriche. Individuate l'elenco Proprietà materiale (Material Properties) nella finestra Impostazioni materiale (Material settings) e selezionate la permittività relativa e la conducibilità elettrica dall'elenco delle opzioni Proprietà di base (Basic Properties). Le proprietà dielettriche per i mezzi di coltura, l'idrogel e la piastra di coltura sono nella tabella 2. Ripetere questa procedura per tutti i materiali vuoti.
- Assegnate ogni materiale alle geometrie precedentemente costruite. Selezionate il materiale dell'aria dalla finestra Generatore di modelli (Model Builder). quindi, selezionare i domini che corrispondono all'aria dalla finestra Grafica. Ripetete questo passaggio per tutti i materiali creati. Assicurarsi che ogni dominio corrisponda al materiale corretto. Per assicurarsi che tutti i materiali siano assegnati correttamente, fare clic su ogni materiale dalla finestra Generatore di modelli e osservare se i domini sono evidenziati in blu all'interno della finestra Grafica.
- Costruisci mesh. Fate clic con il pulsante destro del mouse su Mesh 1 nella finestra Generatore modelli (Model Builder) e selezionate Triangolare libero (Free Triangular). Ripetere questo passaggio selezionando Dimensione. Nella finestra Impostazione mesh selezionare Mesh controllato dall'utente dall'elenco Tipo sequenza (Sequence Type). Espandere quindi le opzioni Mesh nella finestra Generatore di modelli e fare clic su Dimensioni.
- Individuare i parametri dimensione elemento nella finestra Impostazione dimensioni e digitare 1 mm per la dimensione massima dell'elemento, 0,002 mm per la dimensione minima dell'elemento, 1,1 per il tasso massimo di crescita dell'articolo, 0,2 per il fattore di curvatura e 1 per la risoluzione delle regioni strette. Espandere quindi le opzioni Mesh nella finestra Generatore di modelli e fare clic su Triangolare libero 1. Qui, selezionare tutti i domini da mesh. Infine, fare clic su Costruisci tutto nella finestra Impostazione mesh.
- Crea studio. Fate clic su Studio 1 (Study 1) nella finestra Generatore modelli (Model Builder). Individuare quindi la sezione Impostazioni studio nella finestra Impostazioni studio e deselezionare la casella di controllo Genera plottamenti predefiniti. Espandere il nodo Studio 1 nella finestra Generatore di modelli e fare clic su Passaggio 1: Dominio frequenza. Individuare infine la sezione Impostazioni studio nella finestra Impostazioni dominio frequenza e digitare 60 kHz nel campo di testo Frequenze.
- Calcola lo studio. Fate clic su Mostra risolutore predefinito (Show Default Solver) sulla barra degli strumenti Studio (Study). Espandere quindi il nodo Configurazioni risolutore Studio 1 nella finestra Generatore di modelli. Espandere il nodo Soluzione 1 (sol1) nella finestra Generatore di modelli; Successivamente, fate clic su Risolutore stazionario 1 nella finestra Impostazioni risolutore stazionario (Stationary Solver Settings) e individuate la sezione Generale e immettete 1e-6 nel campo di testo Tolleranza relativa (Relative Tolerance). Infine, fare clic su Calcola sulla barra degli strumenti studio.
- Risultati della trama. Selezionare la sezione Risultati sulla barra degli strumenti Home e aggiungere 2D Plot Group. Quindi, fate clic con il pulsante destro del mouse su 2D Plot Group 1 nella finestra Generatore modelli (Model Builder) e scegliete Superficie (Surface). Individuare quindi la sezione Dati nella finestra Impostazioni superficie e selezionare Precursor. Dopo, individuate la sezione Espressione (Expression) nella finestra Impostazioni superficie (Surface Settings). qui, fare clic nel simbolo più (+) per aprire una nuova finestra e individuare il percorso seguente dall'elenco di selezione (Modello - Componente 1 - Correnti elettriche - Elettrico). Qui, selezionare ec.normE - EF Norm. Infine, fate clic su Grafica (Graphic) nella finestra Impostazioni superficie (Surface Settings) per tracciare i risultati.
- Creazione di un modello per i file MF
- Create geometrie. In Generatore di modelliselezionare Geometria; quindi, individuare la sezione Unità e scegliere mm. Sulla barra degli strumenti Geometria selezionare Rettangolo e digitare le dimensioni di ogni componente nella casella Dimensioni e forma delle impostazioni della finestra rettangolo . La geometria è composta dall'aria e dal bottaio (vedi dimensioni di ciascun elemento nella tabella 1). Una volta create tutte le geometrie, fare clic su Compila tutti gli oggetti.
- Aggiungere materiali. Fate clic su Aggiungi materiale (Add Material) sulla barra degli strumenti Home per aprire la finestra Aggiungi materiale (Add Material). Cerca aria e rame e aggiungili alla finestra Generatore di modelli. Le proprietà dielettriche del rame sono nella tabella 2.
- Creare limiti. Fate clic su Campo magnetico (Magnetics Field) nella finestra Generatore modelli (Model Builder). Individuare l'elenco Equazione nella finestra Impostazioni campi magnetici e scegliere Equazione dominio di frequenza dall'elenco Modulo equazione. Nell'elenco Frequenza scegliere Dal risolutore. Dopo, individuate la legge di Ampere nell'elenco Campo magnetico (Magnetic Field) nella finestra Generatore modelli (Model Builder). Nel tipo 293.15[K] in Temperature, 1[atm] in Absolute Pressure from the Inputs Model. Quindi, scegliete Solido (Solid) dall'elenco Tipo materiale (Material type) nella finestra Impostazioni legge di Ampere (Ampere's Law Settings). Assicurarsi che la conducibilità elettrica, la permittività relativa e la permeabilità relativa corrispondano al materiale From nell'elenco.
- Individua simmetria assiale nell'elenco Campo magnetico (Magnetic Field) nella finestra Generatore di modelli (Model Builder). Assicurarsi che la linea di simmetria assiale sia evidenziata sia nell'elenco Selezione limite che nella finestra Grafica. Individuare quindi Isolamento magnetico nell'elenco Campo magnetico nella finestra Generatore di modelli. Assicuratevi che i limiti della geometria siano evidenziati sia nell'elenco Selezione limite che nella finestra Grafica.
- Individuare Valori iniziali nell'elenco Campo magnetico nella finestra Generatore di modelli. Selezionate le geometrie create in precedenza e includetele nella selezione del dominio dalla finestra Impostazioni valori iniziali( Initial Values Settings).
- Introdurre le feature di bobina. Individuare Più bobine nell'elenco Campo magnetico (Magnetic Field) nella finestra Generatore di modelli (Model Builder). Qui, seleziona la geometria che rappresenta la bobina e le include nella selezione del dominio dalla finestra Impostazioni bobina multipla.
- Individuate l'elenco Bobina multipla (Multiple Coil) nella finestra Impostazione bobina multipla (Multiple Coil Setting). qui, individuare l'elenco eccitazione bobina e selezionare Corrente; successivamente, tipo 1[A] nell'elenco di corrente della bobina, 450 nel numero di giri e 6e7[S/m] nella conduttività della bobina.
- Individuate l'area di sezione trasversale del filo coil e scegliete il diametro del cavo nordamericano (Brown & Sharpe) dall'elenco e digitate 18 nell'opzione AWG. Assicurarsi che la permittività relativa e la permeabilità relativa corrispondano al materiale From nell'elenco.
- Costruisci mesh. Nella finestra Impostazione mesh (Mesh Setting), selezionate Mesh controllato dalla fisica (Mesh Controlled by the physics) dall'elenco Tipo sequenza (Sequence Type). Dopo, individuate i parametri dimensione elemento (Element Size Parameters) nella finestra Impostazione mesh (Mesh Setting) e selezionate Estremamente fine (Extremely fine). Infine, selezionare tutti i domini da mesh e fare clic su Crea tutto nella finestra Impostazione mesh.
- Crea studio. Fate clic su Studio 1 (Study 1) nella finestra Generatore modelli (Model Builder). Individuare quindi la sezione Impostazioni studio nella finestra Impostazioni studio e deselezionare la casella di controllo Genera plottamenti predefiniti. Espandere il nodo Studio 1 nella finestra Generatore di modelli e fare clic su Passaggio 2: Dominio frequenza. Individuare infine la sezione Impostazioni studio nella finestra Impostazioni dominio frequenza e digitare 60 Hz nel campo di testo Frequenze.
- Calcola lo studio. Fate clic su Mostra risolutore predefinito (Show Default Solver) sulla barra degli strumenti Studio (Study). Espandere quindi il nodo Configurazioni risolutore Studio 1 nella finestra Generatore di modelli. Espandere il nodo Soluzione 1 (sol1) nella finestra Generatore di modelli; successivamente, fate clic su Risolutore stazionario 1 nella finestra Impostazioni risolutore stazionario (Stationary Solver Settings) e individuate la sezione Generale e immettete 1e-6 nel campo Testo tolleranza relativa (Relative tolerance text). Infine, fare clic su Calcola sulla barra degli strumenti studio.
- Risultati della trama. Selezionare la sezione Risultati sulla barra degli strumenti Home e aggiungere 2D Plot Group. Quindi, fate clic con il pulsante destro del mouse su 2D Plot Group 1 nella finestra Generatore modelli (Model Builder) e scegliete Superficie (Surface). Individuare quindi la sezione Dati nella finestra Impostazioni superficie e selezionare Precursor.
- Individuare la sezione Espressione nella finestra Impostazioni superficie. Qui, fare clic nel simbolo più (+) per aprire una nuova finestra e individuare il percorso seguente dall'elenco di selezione (Modello - Componente 1 - Campo Magnetico - Magnetico). Qui, selezionare mf.normB - Norma densità del flusso magnetico. Infine, fate clic su Grafica (Graphic) nella finestra Impostazioni superficie (Surface Settings) per tracciare i risultati.
- Creazione di un modello per i FE
2. Progettazione e produzione dei dispositivi di stimolazione elettrica e magnetica
- Il dispositivo di stimolatore elettrico
NOTA: È composto da un circuito basato sull'oscillatore Wien Bridge e due elettrodi paralleli in acciaio inossidabile. Il circuito è un oscillatore RC dello spostamento di fase, che utilizza un feedback positivo e negativo. L'oscillatore Wien Bridge è composto da una rete lead-lag, che divide la tensione di ingresso per la combinazione di due bracci del ponte: un resistore R5 con un condensatore C2 in serie, e un resistore R6 con un condensatore C3 in parallelo (Figura 1A). Questi componenti modulano la frequenza dell'oscillatore. Per costruire il dispositivo stimolatore elettrico seguire i passaggi successivi:- Calcolare la frequenza utilizzando l'equazione di frequenza risonante (1).
Dove R = R5 = R6 sono resistori e C = C2 = C3 sono condensatori. Sia R che C sono collocati nei due bracci del ponte(figura 1A). Utilizzare R5 = R6 = 2,6 kΩ e C2 = C3 = 1 nF per ottenere una frequenza di 60 kHz. Resistenze e condensatori possono essere calcolati se è richiesta una frequenza diversa. - Progettare il circuito in modo tale che il guadagno di tensione dell'amplificatore compensi automaticamente i cambiamenti di ampiezza del segnale di uscita. Nella figura 1A è possibile osservare lo schema del circuito, mentre nella sezione Table of Materials sono elencati i componenti elettronici per costruire il circuito.
- Calcola la combinazione di resistori per generare le quattro tensioni di uscita. Come mostrato nella figura 1A, utilizzare una combinazione di resistori R11, R12, R13 e R14 (resistenza equivalente di 154 Ω) per generare una tensione di 50 Vp-p; resistori R17, R18 e R19 in serie (resistenza equivalente di 47,3 Ω) per ottenere una tensione di 100 Vp-p; resistori R9 e R10 in serie (resistenza equivalente di 25,3 Ω) per generare una tensione di 150 Vp-p; e una combinazione di resistori R15 e R16 (resistenza equivalente di 16,8 Ω) per ottenere una tensione di 200 Vp-p.
- Utilizzare un transistor (TIP 31C) e un trasformatore a nucleo in ferrite per implementare uno stadio di amplificazione del segnale. Un nucleo di ferrite toroidale è stato utilizzato per avvolgere un filo di rame AWG 24, completando una relazione 1:200. Utilizzare due condensatori (C4 e C 5) di 100 nF in parallelo prima del trasformatore per rettificare il segnale (Figura 1A).
- Preparare il PCB utilizzando un servizio di produzione pcb di terze parti. Il diagramma schematico del circuito è fornito nella figura 1. Posizionare tutti i componenti sul PCB con pinzette antistatiche. Utilizzare saldatura di stagno e ferro da saldare per saldare tutti i componenti.
- Produrre una custodia in plastica con connettori di ingresso per proteggere il circuito. Implementare tre connettori di ingresso per energizzare il circuito (12 V, -12 V e terra). Utilizzare due connettori di ingresso per collegare gli elettrodi. Includere tre interruttori per modificare la combinazione di resistori per ottenere le quattro tensioni di uscita. Assemblare il circuito elettronico nella custodia di plastica( Figura 1B).
- Produrre due elettrodi paralleli in acciaio inossidabile (200 x 400 x 2 mm) e connettori di ingresso di saldatura su ciascun bordo. Gli elettrodi si trovano su supporti in teflon o acrilico per eliminare qualsiasi contatto con la superficie metallica dell'incubatore(Figura 1C).
- Utilizzare un'autoclave a 394,15 K (121 °C) per 30 minuti per sterilizzare gli elettrodi e utilizzare l'ultravioletto durante la notte per sterilizzare i fili a contatto con l'incubatore.
- Testare il dispositivo di stimolazione elettrica. Regolare l'alimentatore in serie per generare una tensione di uscita di +12 V e -12 V tra il suolo e terminali positivi e negativi. Verificare la tensione di uscita dell'alimentatore con un multimetro. Collegare ogni uscita dell'alimentatore nell'ingresso corretto dello stimolatore elettrico (+12 V, -12 V e terra). Collegare ogni elettrodo nel connettore di ingresso corretto dello stimolatore elettrico. La polarità non è importante, poiché stiamo lavorando sulla corrente CA. Posizionare una piastra di coltura tra gli elettrodi e verificare il segnale di uscita con un oscilloscopio. Regolare gli interruttori dello stimolatore elettrico per generare le quattro tensioni di uscita (50, 100, 150 e 200 Vp-p).
- Raccomandazioni in materia di sicurezza. Per evitare problemi durante il trasferimento o la rimozione degli elettrodi dall'incubatore, assicurarsi che i cavi non siano aggrovigliati. Scollegare i cavi dall'oscillatore prima di rimuovere gli elettrodi dall'incubatore. Non posizionare mai gli elettrodi senza i supporti acrilici o in teflon.
- Calcolare la frequenza utilizzando l'equazione di frequenza risonante (1).
- Il dispositivo di stimolatore magnetico
- Stimare il numero di giri per garantire un MF omogeneo all'interno della bobina utilizzando l'equazione (2), che descrive il MF all'interno di una bobina solenoide.
dove μ0 è la permeabilità magnetica del vuoto (4π×10-7), N è il numero di giri del filo di rame, I è la corrente, e h, che dovrebbe essere maggiore del suo diametro, è la lunghezza della bobina solenoide. - Determinare il numero di giri scegliendo una lunghezza (h) di 250 mm, corrente di 1 A e un Bint = 2mT.
- Fabbricazione a partire da prodotti della bobina. Costruire un tubo di cloruro di polivinile (PVC) con una lunghezza di 250 mm e un diametro di 84 mm per avvolgere un filo di rame AWG 18 completando 450 giri(Figura 2A). Le dimensioni sono state scelte in base allo spazio disponibile all'interno dell'incubatore.
- Produrre un supporto per le piastre di coltura cellulare. Costruire un supporto di metacrilato di polimetile (PMMA) per garantire che le piastre di pozzo di 35 mm siano sempre situate al centro della bobina in cui le IF sono omogenee(Figura 2A).
- Produrre un trasformatore per aumentare la corrente del circuito. Costruisci un trasformatore con un'uscita di 1 A - 6 V AC per raggiungere un MF massimo di 2 mT. La tensione di ingresso del trasformatore era di 110 V AC a 60 Hz. Questi parametri corrispondono alla tensione di uscita e alla frequenza di una presa sudamericana.
- Collegare il circuito. Il trasformatore è collegato direttamente alla presa. Utilizzare un resistore variabile (rheostat) per variare la corrente e generare MF da 1 a 2 mT. Collegare un fusibile per proteggere il circuito (Figura 2B).
- Utilizzare l'ultravioletto durante la notte per sterilizzare i fili che sono a contatto con l'incubatore. Avvolgere la bobina con pellicola elastica trasparente e utilizzare l'etanolo per sterilizzare la bobina.
- Testare il dispositivo MF. Usa un teslametro per misurare la magnitudine MF all'interno della bobina. La sonda teslametro si trovava al centro della bobina, permettendo la misurazione simultanea di MFs e correnti.
- Variare la magnitudine MF. Utilizzare un reostato per modificare la resistenza del circuito (Figura 2B). Un valore di resistenza di 0,7 Ω è stato utilizzato per generare MF di 1 mT.
- Raccomandazioni in materia di sicurezza. Per evitare problemi durante il trasferimento o la rimozione del solenoide dall'incubatore, assicurarsi che i cavi non siano aggrovigliati. Scollegare i cavi dal trasformatore prima di rimuovere il solenoide dall'incubatore. Non posizionare mai il solenoide senza il supporto PMMA. Afferrare saldamente sia il supporto PMMA dalla base che il solenoide durante il trasferimento o la rimozione dall'incubatore.
- Stimare il numero di giri per garantire un MF omogeneo all'interno della bobina utilizzando l'equazione (2), che descrive il MF all'interno di una bobina solenoide.
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Representative Results
Simulazione computazionale
Le distribuzioni di FE e MF sono riportate nella figura 3. Da un lato, è stato possibile osservare la distribuzione omogenea dei FE nel sistema capacitivo(figura 3A). L'EF è stato tracciato per osservare in dettaglio l'entità del campo all'interno del campione biologico (figura 3B). Questa simulazione è stata utile per parametrizzare le dimensioni degli elettrodi e produrli per evitare l'effetto bordo. D'altro canto, è stato possibile osservare la distribuzione omogenea degli IF generati dalla bobina solenoide(figura 3C). Il MF è stato tracciato per osservare in dettaglio la grandezza del campo all'interno della bobina (Figura 3D). Questa simulazione è stata importante misurare la distanza in cui l'MF è lo stesso e costruire il supporto PMMA. Questo supporto garantisce una distribuzione omogenea del MF non solo al centro della bobina, ma anche nei campioni biologici da stimolare.
Segnali generati da stimolatori elettrici e magnetici
I segnali di uscita generati dallo stimolatore elettrico sono riportati nella figura 4. È importante sottolineare che i segnali catturati dall'oscilloscopio sono stati direttamente presi negli elettrodi, poiché se la misurazione viene portata direttamente ai cavi di uscita, le tensioni saranno più alte (Figura 4A). Questa variazione di tensione è data dalla capacità degli elettrodi. La tensione di uscita oscilla in un intervallo di ± 5V a 60 kHz; ad esempio, i segnali di uscita erano 54,9 Vp-p (Figura 4B), 113 Vp-p (Figura 4C), 153 Vp-p (Figura 4D) e 204 Vp-p (Figura 4E) rispettivamente per 50, 100, 150 e 200 Vp-p.
Il segnale di uscita generato dallo stimolatore magnetico è mostrato nella figura 5. Il segnale catturato dall'oscilloscopio è stato preso direttamente nei cavi di uscita della bobina (Figura 5A). La tensione di uscita oscilla nell'intervallo ± 15V p-p a 60 Hz (Figura 5B).
Figura 1. Dispositivo di stimolazione elettrica. A) Circuito che genera tensioni di 50, 100, 150 e 200 Vp-p a forma d'onda sine a 60 kHz. B) Circuito stampato all'interno della custodia. C) Elettrodi all'interno dell'incubatore. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2. Dispositivo di stimolazione magnetica. A) Rappresentazione schematica del dispositivo di stimolatore magnetico e supporto PMMA. B) Circuito per generare i file MFs. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3. Simulazione computazionale di EF e IF. A) Distribuzione dei FE all'interno e all'esterno del sistema capacitivo. B) Distribuzione dei FE all'interno dell'idrogel, la regione di interesse è indicata in dettaglio rosso. C) Distribuzione di MF all'interno e all'esterno della bobina. D) Distribuzione di MF al centro della bobina, la regione di interesse è indicata in dettaglio rosso. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4. Segnale sinusoidale generato dallo stimolatore elettrico. A) Verifica del segnale generata dallo stimolatore elettrico. B) Segnale a 50 Vp-p. C) Segnale a 100 Vp-p. D) Segnale a 150 Vp-p. E) Segnale a 200 Vp-p. Tutte le misurazioni oscillano in un intervallo ± 5V a 60 kHz. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5. Segnale sinusoidale generato dallo stimolatore magnetico. A) Verifica del segnale generata dallo stimolatore magnetico. B) Segnale a 15 Vp-p a 60 Hz. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| sistema | Componenti | Larghezza (mm) | Altezza (mm) |
| Impianto elettrico | aria | 100 | 100 |
| elettrodi | 50 | 5 | |
| Piastra del pozzo | 7 | 20 | |
| Idrogel | 3.5 | 3.5 | |
| Mezzi di comunicazione culturali | 6 | 8 | |
| Sistema magnetico | aria | 500 | 600 |
| bobina | 2 | 250 |
La tabella 1. Dimensione delle geometrie che compongono sistemi elettrici e magnetici.
| sistema | Componenti | Permittività relativa (ε) | Conducibilità (σ) |
| Impianto elettrico | aria | 1 | 0 |
| elettrodi | 1 | 1.73913 [MS/m] | |
| Piastra del pozzo | 3.5 | 6.2E-9 [S/m] | |
| Idrogel | 8.03E3 | 7.10E-2 [S/m] | |
| Mezzi di comunicazione culturali | 2.67E4 | 7.20E-2 [S/m] | |
| Sistema magnetico | bobina | 1 | 5.998E7[S/m] |
La tabella 2. Proprietà dielettriche degli elementi che compongono sistemi elettrici e magnetici.
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Discussion
I trattamenti utilizzati per guarire diverse patologie che colpiscono i tessuti umani sono terapie farmacologiche32 o interventi chirurgici33, che cercano di alleviare il dolore localmente o sostituire i tessuti colpiti con espianto o trapianti. Recentemente, la terapia cellulare autologa è stata proposta come terapia alternativa per il trattamento dei tessuti feriti, in cui le cellule sono isolate dal paziente e ampliate, attraverso tecniche in vitro, da impiantare nel sito dellalesione 34. Dato che la terapia cellulare autologa ha dimostrato di avere un'influenza diretta sul recupero dei tessuti, sono state sviluppate diverse strategie per aumentare l'efficacia di questa tecnica. Ad esempio, gli stimoli biofisici sono stati utilizzati come terapia alternativa non invasiva per stimolare diversi tipi di campioni biologici, modulando la funzionalità cellulare migliorando la proliferazione cellulare e la sintesimolecolare 35,36. Tra gli stimoli biofisici più utilizzati, l'elettrostimolazione e la magnetoterapia sono state ampiamente applicate per stimolare cellule, estippie tissutali e impalcature. È stato dimostrato che l'elettrostimolazione riduce il dolore e aumenta i processi di guarigione di diversi tessuti37. Per quanto riguarda la magnetoterapia, è stato descritto che questo stimolo migliora l'integrazione degli impianti con i tessuti ospiti, accelera i processi di guarigione, allevia il dolore localmente e aumenta la forza dellacicatrice 8,38.
Considerando quanto sopra, la combinazione di biomateriali, coltura cellulare e stimoli biofisici esterni come EFs e IF, a livello in vitro, è stata introdotta nell'ingegneria tissutale come tecnica terapeutica alternativa per guarire i tessutiferiti 8,39. Tuttavia, trovare un bioreattore che aiuti a stimolare diversi tessuti, sani o affetti da patologie traumatiche, è una sfida. In questo contesto, il presente protocollo mira a sviluppare stimolatori sia elettrici che magnetici. Attualmente esistono due possibili regimi per l'applicazione dei FE. Il primo metodo consiste nel generare EF attraverso sistemi di accoppiamento diretto, utilizzati per valutare la migrazione el'orientamento delle celle 40,41,42. Tuttavia, ci sono limitazioni come alterazioni della biocompatibilità del mezzo di coltura cellulare da elettrodi a contatto, possibili cambiamenti nei livelli di pH e ossigeno molecolare1. Inoltre, la stimolazione ad accoppiamento diretto non può amplificare i segnali ad alta frequenza. L'uscita tende a variare con il tempo, generando variazioni di tensione di alimentazione. Ha poca stabilità di temperatura, a causa di ciò i suoi punti operativi cambiano e alle basse frequenze il condensatore fallisce e agisce come un circuitoaperto 43. Considerando queste limitazioni, è stato implementato il secondo metodo, in cui sono stati utilizzati elettrodi paralleli esterni. Questo metodo di accoppiamento indiretto ha evidenziato un aumento della proliferazione cellulare e della sintesimolecolare 3,7,17,22,44,45; tuttavia, i dispositivi sviluppati da autori diversi non hanno considerato la dimensione degli elettrodi per distribuire in modo omogeneo eF. Ad esempio, i dispositivi generano tensioni e frequenze fisse, limitandone l'uso nello stimolare cellule e tessuti specifici. Di conseguenza, in questo studio la dimensione degli elettrodi è stata modellata per garantire una distribuzione omogenea dei FE sui tessuti biologici. Inoltre, un circuito è stato progettato per generare una frequenza e alte tensioni tra elettrodi, creando diversi EF che superano i limiti causati dall'impedenza delle piastre e dell'aria della coltura cellulare.
Le bobine solenoidi sono dispositivi versatili che possono essere utilizzati per stimolare campioni biologici all'interno dell'incubatore, consentendo che le condizioni atmosferiche rimangano stabili senza influire sulle caratteristiche fisiologiche dei campioni biologici. Questo vantaggio spiega che le bobine solenoidi sono alternative fattibili più delle bobine Helmholtz, in quanto devono essere di dimensioni maggiori, impedendo la stimolazione all'interno degli incubatori46. La stimolazione di campioni biologici al di fuori dell'incubatore può portare a diversi problemi come la contaminazione della coltura cellulare, lo stress cellulare, i cambiamenti di pH dei mezzi di coltura, tra gli altri. Dato che sono stati sviluppati diversi dispositivi di stimolazione per stimolare diversi tipi cellulari e tessuti24,25,26,27, è rilevante costruire dispositivi in cui le intensità MF possono essere varie per stimolare una vasta gamma di campioni biologici29,30. Di conseguenza, in questo protocollo lo stimolatore magnetico è collegato a un reostato, che può variare la corrente che scorre attraverso il solenoide modificandone la resistenza e la corrente, parametri che sono direttamente correlati alla generazione di MF. Un'altra caratteristica importante da considerare al momento della costruzione di dispositivi magnetici è la distribuzione di MF. Qui, una simulazione computazionale è stata utilizzata per simulare la distribuzione MF all'interno della bobina solenoide. Questa simulazione ha permesso di calcolare il numero di giri del filo di rame e la lunghezza della bobina per generare MF omogenei al centro della bobina. La simulazione computazionale è uno strumento utile per calcolare il numero di campioni biologici da stimolare, garantendo che tutti i campioni ricevano la stessa forza dicampo 47.
Gli stimolatori biofisici sviluppati in questo protocollo hanno alcune limitazioni. In primo luogo, il circuito elettronico progettato per lo stimolatore elettrico genera quattro tensioni di uscita a una frequenza specifica. Sebbene il circuito superi la limitazione della generazione di alte tensioni tra glielettrodi 1, potrebbe essere migliorato per generare tensioni e frequenze variabili. Il circuito può essere modificato per generare frequenze diverse calcolando semplicemente resistori o condensatori usando l'equazione (1); tuttavia, è possibile utilizzare resistori variabili per variare manualmente il valore del resistore. Allo stesso modo, un resistore variabile può essere utilizzato nella fase di amplificazione del circuito per variare la tensione di uscita. In secondo luogo, il circuito elettronico dello stimolatore elettrico genera segnali sinusoidali. Sarebbe utile generare diversi tipi di segnali come quadrato, triangolare, trapezoidale e rampa, poiché questi tipi di segnali potrebbero essere utilizzati per stimolare una vasta gamma di cellule e campioni biologici48,49. Per generare diversi tipi di segnali, l'amplificatore operativo può essere sostituito da un generatore di funzioni monolitiche, che può produrre forme d'onda di alta qualità di alta stabilità e precisione con bassa ampiezza, e lo stadio di amplificazione può essere sostituito da un amplificatore operativo non invertente o da uno stadio con transistor NPN. In terzo luogo, anche se lo stimolatore magnetico genera piccole magnitudini MF, è stato dimostrato che queste intensità hanno un impatto diretto sulla dinamicadei campioni biologici 24,28,30,38; tuttavia, il dispositivo magnetico potrebbe essere migliorato per generare MF variabili e frequenze per stimolare un'ampia gamma di tessuti biologici29.
Nel complesso, questo protocollo è uno strumento utile che fornisce un contributo tecnologico alla comunità scientifica che lavora sulla stimolazione biofisica dei tessuti biologici. Questi dispositivi consentiranno ai ricercatori di utilizzare EF e IF per stimolare la funzione di tessuti biologici sani o di quelli alterati da una particolare patologia. Considerando questo in ulteriori studi in vivo, diversi parametri e variabili come le dimensioni degli elettrodi, il numero di giri della bobina, la forza di stimolo e i tempi di stimolazione sarebbero determinati a distribuire in modo omogeneo sia i FE che i MF in animali come suini, vitelli, porcellini d'India o conigli. Inoltre, i bioreattori progettati in questo protocollo possono essere estrapolati a contesti clinici per migliorare le tecniche rigenerative come l'impianto di cellule autologhe. Qui, i bioreattori possono svolgere un ruolo importante stimolando campioni biologici, a livello in vitro, per migliorare le caratteristiche cellulari e molecolari di cellule, tessuti e impalcature prima di essere impiantati nel paziente.
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Disclosures
Gli autori dichiarano di non avere alcun conflitto di interessi.
Acknowledgments
Gli autori ringraziano il sostegno finanziario fornito da "Fondo Nacional de Financiamiento para la Ciencia, la Tecnología, y la Innovación -Fondo Francisco José de Caldas- Minciencias" e Universidad Nacional de Colombia attraverso la sovvenzione n. 80740-290-2020 e il sostegno ricevuto da Valteam Tech - Research and Innovation per fornire le attrezzature e il supporto tecnico nell'edizione del video.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Electrical stimulator | |||
| Operational amplifier | Motorola | LF-353N | ---- Quantity: 1 |
| Resistors | ---- | ---- | 22 kΩ Quantity: 1 |
| Resistors | ---- | ---- | 10 kΩ Quantity: 3 |
| Resistors | ---- | ---- | 2.6 kΩ Quantity: 2 |
| Resistors | ---- | ---- | 2.2 kΩ Quantity: 1 |
| Resistors | ---- | ---- | 1 kΩ Quantity: 1 |
| Resistors | ---- | ---- | 220 Ω Quantity: 2 |
| Resistors | ---- | ---- | 22 Ω Quantity: 5 |
| Resistors | ---- | ---- | 10 Ω Quantity: 1 |
| Resistors | ---- | ---- | 6.8 Ω Quantity: 1 |
| Resistors | ---- | ---- | 3.3 Ω Quantity: 2 |
| Polyester capacitors | ---- | ---- | 1 nF Quantity: 2 |
| Polyester capacitors | ---- | ---- | 100 nF Quantity: 1 |
| VHF Band Amplifier Transistor JFET | Toshiba | 2SK161 | ---- Quantity: 1 |
| Power transistor BJT NPN | Mospec | TIP 31C | ---- Quantity: 1 |
| Zener diode | Microsemi | 1N4148 | ---- Quantity: 1 |
| Switch | Toogle Switch | SPDT - T13 | ---- Quantity: 3 |
| Toroidal ferrite core | Caracol | ---- | T*22*14*8 Quantity: 1 |
| Cooper wire | Greenshine | ---- | AWG – 24 Quantity: 1 |
| Relimate header with female housing | ADAFRUIT | ---- | 8 pin connectors Quantity: 1 |
| Relimate header with female housing | ADAFRUIT | ---- | 2 pin connectors Quantity: 1 |
| Female plug terminal connector | JIALUN | ---- | 4mm Lantern Plugs (Plug + Socket) 15 A Quantity: 1 |
| Aluminum Heat Sink | AWIND | ---- | For TIP 31C transistor Quantity: 1 |
| Led | CHANZON | ---- | 5 mm red Quantity: 1 |
| Integrated circuit socket connector | Te Electronics Co., Ltd. | ---- | Double row 8-pin DIP Quantity: 1 |
| 3 pin connectors set | STAR | ---- | JST PH 2.0 Quantity: 3 |
| 2 pin screw connectors | STAR | ---- | For PCB Quantity: 1 |
| 3 pin screw connectors | STAR | ---- | For PCB Quantity: 1 |
| Banana connector test lead | JIALUN | ---- | P1041 - 4 mm - 15 A Quantity: 7 |
| Bullet connectors to banana plug charge lead | JIALUN | ---- | 4 mm male-male/female-female adapters - 15 A Quantity: 1 |
| Case | ---- | ---- | ABS Quantity: 1 |
| Electrodes | ---- | ---- | Stainless – steel Quantity: 2 |
| Electrode support | ---- | ---- | Teflon Quantity: 2 |
| Printed circuit board | Quantity: 1 | ||
| Magnetic stimulator | |||
| Cooper wire | Greenshine | ---- | AWG – 18 Quantity: 1 |
| AC power plugs | ---- | ---- | 120 V AC – 60 Hz Quantity: 1 |
| Banana female connector test lead | JIALUN | ---- | 1Set Dual Injection - 4 mm – 15 A Quantity: 2 |
| Banana male connector test lead | JIALUN | ---- | 1Set Dual Injection - 4 mm 15 A Quantity: 1 |
| Cell culture well plate support | ---- | ---- | PMMA Quantity: 1 |
| Fuse | Bussmann | 2A | ---- Quantity: 1 |
| Transformer | ---- | ---- | 1A – 6 V AC Quantity: 1 |
| Tube | ---- | ---- | PVC Quantity: 1 |
| Variable rheostat | MCP | BXS150 | 10 Ω Quantity: 1 |
| General equipment | |||
| Digital dual source | PeakTech | DG 1022Z | 2 x 0 - 30 V / 0 - 5 A CC / 5 V / 3 A fijo Quantity: 1 |
| Digital Oscilloscope | Rigol | DS1104Z Plus | 100 MHz, bandwidth, 4 channels Quantity: 1 |
| Digital multimeter | Fluke | F179 | Voltage CC – CA (1000 V). Current CC – CA 10 A. Frequency 100 kHz Quantity: 1 |
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