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Bioengineering

Elektrische und magnetische Feldgeräte zur Stimulation biologischer Gewebe

Published: May 15, 2021 doi: 10.3791/62111
Automatic Translation
1,2, 2,3, 1,2, 1,4
1Biomimetics Laboratory, Instituto de Biotecnología, Universidad Nacional de Colombia, 2Numerical Methods and Modeling Research Group (GNUM), Universidad Nacional de Colombia, 3Design, Analysis and Development of Engineering Systems Research group (GIDAD), Fundación Universitaria Los Libertadores, 4School of Health and Sports Sciences, Master Program in Epidemiology, Fundación Universitaria del Área Andina

Summary

Dieses Protokoll beschreibt den schrittweisen Prozess zum Bau von elektrischen und magnetischen Stimulatoren, die zur Stimulierung biologischer Gewebe verwendet werden. Das Protokoll enthält eine Richtlinie zur Simulation von rechengestützten elektrischen und magnetischen Feldern und zur Herstellung von Stimulatoren.

Abstract

Elektrische Felder (EFs) und Magnetfelder (MFs) wurden von der Gewebetechnik häufig verwendet, um die Zelldynamik wie Proliferation, Migration, Differenzierung, Morphologie und molekulare Synthese zu verbessern. Variablen wie Reizstärke und Stimulationszeiten müssen jedoch bei der Stimulierung von Zellen, Geweben oder Gerüsten berücksichtigt werden. Angesichts der Unterschiedlichen von EFs und MFs je nach zellulärer Reaktion bleibt unklar, wie Geräte gebaut werden können, die angemessene biophysikalische Reize erzeugen, um biologische Proben zu stimulieren. Tatsächlich fehlt es an Beweisen für die Berechnung und Verteilung, wenn biophysikalische Reize angewendet werden. Dieses Protokoll konzentriert sich auf die Entwicklung und Herstellung von Geräten zur Erzeugung von EFs und MFs und die Implementierung einer Berechnungsmethode zur Vorhersage der biophysikalischen Reizverteilung innerhalb und außerhalb biologischer Proben. Das EF-Gerät bestand aus zwei parallelen Edelstahlelektroden, die sich oben und unten in biologischen Kulturen befinden. Elektroden wurden an einen Oszillator angeschlossen, um Spannungen (50, 100, 150 und 200 Vp-p) bei 60 kHz zu erzeugen. Die MF-Vorrichtung bestand aus einer Spule, die mit einem Transformator energetisiert wurde, um einen Strom (1 A) und eine Spannung (6 V) bei 60 Hz zu erzeugen. Eine Polymethylmethacrylat-Unterstützung wurde gebaut, um die biologischen Kulturen in der Mitte der Spule zu lokalisieren. Die Rechensimulation erläuterte die homogene Verteilung von EFs und MFs innerhalb und außerhalb von biologischem Gewebe. Dieses Rechenmodell ist ein vielversprechendes Werkzeug, das Parameter wie Spannungen, Frequenzen, Gewebemorphologien, Wellplattentypen, Elektroden und Spulengröße ändern kann, um die EFs und MFs zu schätzen, um eine zelluläre Reaktion zu erreichen.

Introduction

Es wurde gezeigt, dass EFs und MFs die Zelldynamik verändern, die Proliferation stimulieren und die Synthese der Hauptmoleküle erhöhen, die mit der extrazellulären Matrix von Geweben verbunden sind1. Diese biophysikalischen Reize können auf unterschiedliche Weise angewendet werden, indem bestimmte Einstellungen und Geräte verwendet werden. In Bezug auf die Vorrichtungen zur Erzeugung von EFs verwenden direkt gekoppelte Stimulatoren Elektroden, die in Kontakt mit biologischen Proben in vitro stehen oder direkt in Gewebe von Patienten und Tieren in vivo2implantiert werden; Es gibt jedoch immer noch Einschränkungen und Mängel, die eine unzureichende Biokompatibilität durch die kontaktgebundenen Elektroden, Veränderungen des pH-Wertes und des molekularen Sauerstoffgehalts1umfassen. Im Gegenteil, indirekte Kopplungsvorrichtungen erzeugen EFs zwischen zwei Elektroden, die parallel zu biologischen Proben3platziert werden, was eine nicht-invasive alternative Technik ermöglicht, um biologische Proben zu stimulieren und direkten Kontakt zwischen Geweben und Elektroden zu vermeiden. Diese Art von Gerät kann auf zukünftige klinische Anwendungen extrapoliert werden, um Verfahren mit minimaler Invasion für den Patienten durchzuführen. In Bezug auf Geräte, die MFs erzeugen, erzeugen induktive Koppelstimulatoren einen zeitverändernden elektrischen Strom, der durch eine Spule fließt, die sich um Zellkulturenbefindet 4,5. Schließlich gibt es kombinierte Geräte, die EFs und statische MFs verwenden, um transiente elektromagnetische Felder zu erzeugen1. Da es unterschiedliche Konfigurationen gibt, um biologische Proben zu stimulieren, ist es notwendig, Variablen wie Spannung und Häufigkeit zu berücksichtigen, wenn biophysikalische Reize angewendet werden. Spannung ist eine wichtige Variable, da sie das Verhalten biologischer Gewebe beeinflusst; zum Beispiel hat sich gezeigt, dass Zellmigration, Orientierung und Genexpression von der Amplitude der angelegten Spannung3,6,7,8,9,10abhängen. Frequenz spielt eine wichtige Rolle bei der biophysikalischen Stimulation, da nachgewiesen wurde, dass diese natürlich in vivo auftreten. Es wurde gezeigt, dass hohe und niedrige Frequenzen positive Auswirkungen auf Zellen haben; insbesondere in zellmembranspannungsverkabelten Calciumkanälen oder endoplasmatischem Retikulum, die unterschiedliche Signalwege auf intrazellululärer Ebene1,7,11auslösen.

Nach den oben genannten, eine Vorrichtung zur Erzeugung von EFs besteht aus einem Spannungsgenerator mit zwei parallelen Kondensatoren12verbunden. Dieses Gerät wurde von Armstrong et al. implementiert, um sowohl die proliferative Rate als auch die molekulare Synthese von Chondrozyten13zu stimulieren. Eine Anpassung dieses Geräts wurde von Brighton et al. durchgeführt, die die Zellkultur-Well-Platten modifizierten, indem sie ihre oberen und unteren Deckel bohrten. Die Löcher wurden mit Deckrutschen gefüllt, wo die bodenbeschaffenen Gläser zur Kultur biologischen Gewebes verwendet wurden. Elektroden wurden auf jedem Abdeckungsschlitten platziert, um EFs14zu erzeugen. Dieses Gerät wurde verwendet, um Chondrozyten, Osteoblasten und Knorpelexplante elektrisch zu stimulieren, was eine Zunahme der Zellproliferation14,15,16 und molekulare Synthese3,17zeigt. Das von Hartig et al. entwickelte Gerät bestand aus einem Wellengenerator und einem Spannungsverstärker, die mit parallelen Kondensatoren verbunden waren. Elektroden wurden aus hochwertigem Edelstahl in einem Isoliergehäuse hergestellt. Das Gerät wurde verwendet, um Osteoblasten zu stimulieren, zeigt eine signifikante Zunahme der Proliferation und Proteinsekretion18. Das von Kim et al. verwendete Gerät bestand aus einem biphasischen Stromstimulatorchip, der mit einem Herstellungsverfahren von komplementären Halbleitern von Hochspannungsmetalloxid hergestellt wurde. Eine Kultur-Well-Platte wurde entwickelt, um Zellen über eine leitfähige Oberfläche mit elektrischer Stimulation zu kultivieren. Elektroden wurden in Gold über Siliziumplatten19beschichtet. Dieses Gerät wurde verwendet, um Osteoblasten zu stimulieren, zeigt eine Zunahme der Proliferation und die Synthese des vaskulären endotheliale Wachstumsfaktor19, und stimulierung der Produktion von alkalischer Phosphatase-Aktivität, Kalziumablagerung und Knochen morphogene Proteine20. In ähnlicher Weise wurde dieses Gerät verwendet, um die proliferative Rate und Expression des vaskulären endotheliaalen Wachstumsfaktors der mesenchymalen Stammzellen des menschlichen Knochenmarks zu stimulieren21. Das von Nakasuji et al. entworfene Gerät bestand aus einem Spannungsgenerator, der mit Platinplatten verbunden war. Elektroden wurden gebaut, um das elektrische Potenzial an 24 verschiedenen Punkten zu messen. Dieses Gerät wurde verwendet, um Chondrozyten zu stimulieren, zeigt, dass EFs nicht verändern Zellmorphologie und erhöhte Proliferation und molekulare Synthese22. Das von Au et al. verwendete Gerät bestand aus einer Glaskammer, die mit zwei Kohlenstoffstäben ausgestattet war, die mit einem Herzstimulator mit Platindrähten verbunden waren. Dieser Stimulator wurde verwendet, um Kardiomyozyten und Fibroblasten zu stimulieren, Die Zelldehnung und Fibroblastenausrichtung zu verbessern23.

Verschiedene MF-Geräte wurden auf Basis von Helmholtz-Spulen hergestellt, um verschiedene Arten biologischer Proben zu stimulieren. Zum Beispiel, Helmholtz-Spulen wurden verwendet, um die Proliferation und molekulare Synthese von Chondrozyten24,25zu stimulieren, die proteoglykanische Synthese von Gelenkknorpelexplanten26zu verbessern, die Genupregulation im Zusammenhang mit der Knochenbildung von Osteoblasten-ähnlichen Zellen zu verbessern27, und die Proliferation und molekulare Expression von Endothelzellen zu erhöhen28. Helmholtz-Spulen erzeugen MFs in zwei Spulen, die sich eine vor der anderen befinden. Die Spulen müssen mit einem Abstand in Höhe des Radius der Spulen platziert werden, um ein homogenes MF zu gewährleisten. Der Nachteil der Verwendung von Helmholtz-Spulen liegt in den Spulenabmessungen, da sie groß genug sein müssen, um die erforderliche MF-Intensität zu erzeugen. Darüber hinaus muss der Abstand zwischen den Spulen ausreichend sein, um eine homogene Verteilung von MFs um biologische Gewebe zu gewährleisten. Um Probleme zu vermeiden, die durch Helmholtz-Spulen verursacht werden, wurden verschiedene Studien auf die Herstellung von Magnetspulen konzentriert. Magnetspulen basieren auf einem Rohr, das mit Kupferdraht gewickelt wird, um MFs zu erzeugen. Kupferdrahteingänge können direkt an den Ausgang oder ein Netzteil angeschlossen werden, um die Spule zu beleben und MFs in der Mitte des Magneten zu erzeugen. Je mehr Umdrehungen die Spule hat, desto größer ist die MF erzeugt. Die MF-Magnitude hängt auch von der Spannung und dem Strom ab, die angewendet werden, um die Spule29zu beleben. Magnetspulen wurden verwendet, um magnetisch verschiedene Arten von Zellen wie HeLa, HEK293 und MCF730 oder mesenchymale Stammzellen31zu stimulieren.

Geräte, die von verschiedenen Autoren verwendet werden, haben weder die angemessene Größe der Elektroden noch die richtige Länge der Spule berücksichtigt, um sowohl EFs als auch MFs homogen zu verteilen. Darüber hinaus erzeugen Geräte feste Spannungen und Frequenzen und begrenzen deren Verwendung, um bestimmte biologische Gewebe zu stimulieren. Aus diesem Grund wird in diesem Protokoll eine numerische Simulationsrichtlinie durchgeführt, um sowohl kapazitive Systeme als auch Spulen zu simulieren, um eine homogene Verteilung von EFs und MFs über biologische Proben zu gewährleisten und so den Kanteneffekt zu vermeiden. Darüber hinaus wird gezeigt, dass die Konstruktion von elektronischen Schaltungen Spannungen und Frequenz zwischen den Elektroden und der Spule erzeugt, wodurch EFs und MFs entstehen, die Einschränkungen überwinden, die durch impedanziert von Zellkultur-Wellplatten und Luft verursacht werden. Diese Modifikationen werden die Schaffung von nicht-invasiven und adaptiven Bioreaktoren ermöglichen, um jedes biologische Gewebe zu stimulieren.

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Protocol

1. Simulation von EFs und MFs

HINWEIS: Die Simulation von EFs und MFs wurde in COMSOL Multiphysics durchgeführt.

  1. Wählen Sie eine achsensymmetrische 2D-Konfiguration aus, um beide Domänen elektrisch und magnetisch darzustellen.
  2. Wählen Sie in der Physikkonfiguration entweder die Schnittstelle elektrischer Strom aus, um EFs in parallelen Elektroden zu berechnen, oder die Magnetfeldschnittstelle, um MFs um Spulen zu berechnen.
  3. Wählen Sie in der Studienkonfiguration Frequenzdomäne aus, um die Reaktion eines linearen oder linearisierten Modells zu berechnen, das einer harmonischen Anregung für eine oder mehrere Frequenzen ausgesetzt ist.
  4. Sobald Sie sich innerhalb der Schnittstelle befinden, um mit dem Erstellen des Modells zu beginnen, folgen Sie den nächsten Schritten entsprechend dem Modell des Interesses.
    1. Erstellen eines Modells für EFs
      1. Erstellen Sie Geometrien. Wählen Sie im Modell-Generator Geometrieaus. Suchen Sie dann den Einheitenabschnitt und wählen Sie mm. Wählen Sie auf der Geometriesymbolleiste Rechteck aus, und geben Sie die Bemaßungen jeder Komponente in das Feld Größe und Form der Rechteckfenstereinstellungen ein. Die Geometrie besteht aus Luft, zwei parallelen Elektroden, einer Kulturgutplatte, Kulturmedien und einer biologischen Probe, die in diesem Fall durch ein Gerüst aus Hyaluronsäure - Gelatinehydrogel dargestellt wird (siehe Maße jedes Elements in Tabelle 1). Nachdem alle Geometrien erstellt wurden, klicken Sie auf Alle Objekte erstellen.
      2. Erstellen Sie Auswahlen. Klicken Sie auf der Symbolleiste Definitionenauf Explizit, um eine Auswahl für die Metalldomäne zu erstellen. Wählen Sie die Geometrien aus, die die Elektroden darstellen. Klicken Sie anschließend mit der rechten Maustaste auf Explizit 1, um es umzubenennen. Geben Sie Metall in das neue Beschriftungstextfeld ein.
        1. Auf der Symbolleiste "Definitionen"klicken Sie hingegen auf Komplement. Suchen Sie den Abschnitt Eingabeentitäten im Fenster Komplementeinstellungen. Klicken Sie dann unter Auswahl zum Invertieren auf Hinzufügen und wählen Sie Metall in der Auswahl aus, um die Liste im Dialogfeld Hinzufügen umzukehren. Klicken Sie anschließend mit der rechten Maustaste in Komplement 1, um ihn umzubenennen. Geben Sie die Domäne Modell in das neue Beschriftungstextfeld ein.
      3. Erstellen Sie Grenzen. Klicken Sie auf der Symbolleiste Definitionen auf Explizit. Suchen Sie anschließend den Abschnitt Eingabeentitäten im Fenster Einstellungen für Explizit und wählen Sie in der Liste geometrische Entitätsebene die Option Begrenzung aus. Wählen Sie hier alle Grenzen für die untere Elektrode aus. Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf Explicit 2, um sie umzubenennen. Geben Sie Bodengrenzen in das neue Beschriftungstextfeld ein. Wiederholen Sie diese Schritte, wählen Sie jedoch alle Grenzen für die obere Elektrode aus. Klicken Sie anschließend mit der rechten Maustaste auf Explizit 3, um es umzubenennen. Geben Sie Terminalgrenzen in das neue Beschriftungstextfeld ein.
      4. Fügen Sie elektrische Ströme hinzu. Klicken Sie im Fenster Modell-Generator unter Komponente 1 auf Elektrische Ströme (ec). Suchen Sie dann den Abschnitt Domänenauswahl im Fenster Elektrische Ströme. Wählen Sie in der Auswahlliste Modelldomäneaus. Klicken Sie auf der Werkzeugleiste Physikauf Grenzen, und wählen Sie Boden. Suchen Sie anschließend den Abschnitt "Grenzenauswahl" im Fenster Bodeneinstellungen, und wählen Sie In der Auswahlliste Bodengrenzen aus.
        1. Klicken Sie danach auf Grenzen, und wählen Sie Terminal auf der Physik-Symbolleisteaus. Suchen Sie schließlich den Abschnitt "Grenzenauswahl" im Fenster Terminaleinstellungen, und wählen Sie In der Auswahlliste Terminalgrenzen aus. Suchen Sie hier den Terminalabschnitt und wählen Sie Spannung aus der Terminalliste und geben Sie 100 V ein.
      5. Fügen Sie Materialien hinzu. Klicken Sie auf der Home-Symbolleiste auf Material hinzufügen, um das Fenster Material hinzufügen zu öffnen. Suchen Sie Luft und Edelstahl und fügen Sie sie dem Model Builder-Fenster hinzu. Klicken Sie dann auf der Home Toolbar auf Leeres Material und fügen Sie drei neue Rohlingsmaterialien für Kulturmedien, Gerüste (Hydrogel) und Polystyrol (Kulturgutplatte) hinzu.
      6. Wählen Sie ein leeres Material aus, um die dielektrischen Eigenschaften zuzuweisen. Suchen Sie die Liste Materialeigenschaften im Fenster Materialeinstellungen, und wählen Sie relative Permittivität und elektrische Leitfähigkeit aus der Optionsliste Grundlegende Eigenschaften aus. Die dielektrischen Eigenschaften für Kulturmedien, Hydrogel und Kulturbrunnen platte sind in Tabelle 2 zu finden. Wiederholen Sie diesen Vorgang für alle leeren Materialien.
      7. Weisen Sie jedes Material den zuvor erstellten Geometrien zu. Wählen Sie das Luftmaterial aus dem Modell-Generator-Fenster aus. Wählen Sie dann die Domänen aus, die der Luft aus dem Grafikfenster entsprechen. Wiederholen Sie diesen Schritt für alle erstellten Materialien. Stellen Sie sicher, dass jede Domäne dem richtigen Material entspricht. Um sicherzustellen, dass alle Materialien korrekt zugewiesen sind, klicken Sie im Fenster Modell-Generator auf jedes Material, und beobachten Sie, ob die Domänen im Grafikfenster blau hervorgehoben sind.
      8. Erstellen Sie ein Netz. Klicken Sie im Modell-Generator-Fenster mit der rechten Maustaste auf Netz 1, und wählen Sie Freie Dreiecksauswahlaus. Wiederholen Sie diesen Schritt, indem Sie Größeauswählen. Wählen Sie im Fenster Netzeinstellung Aus der Liste Sequenztyp die Option Netzgesteuert vom Benutzer aus. Erweitern Sie dann die Netzoptionen im Modell-Generator-Fenster, und klicken Sie auf Größe.
      9. Suchen Sie Elementgrößenparameter im Fenster Größeneinstellung und geben Sie 1 mm für maximale Elementgröße, 0,002 mm für minimale Elementgröße, 1,1 für maximale Elementwachstumsrate, 0,2 für Krümmungsfaktor und 1 für die Auflösung enger Bereiche ein. Erweitern Sie dann die Netzoptionen im Modell-Generator-Fenster, und klicken Sie auf Freie Dreiecks1. Wählen Sie hier alle zu vernetzenden Domänen aus. Klicken Sie schließlich im Fenster Netzeinstellung auf Alle erstellen.
      10. Erstellen Sie eine Studie. Klicken Sie im Fenster Modell-Generator auf Studie 1. Suchen Sie dann den Abschnitt Studieneinstellungen im Fenster Studieneinstellungen, und deaktivieren Sie das Kontrollkästchen Standarddiagramme generieren. Erweitern Sie den Knoten Studie 1 im Modell-Generator-Fenster, und klicken Sie auf Schritt 1: Frequenzdomäne. Suchen Sie schließlich den Abschnitt Studieneinstellungen im Fenster Frequenzbereichseinstellungen, und geben Sie 60 kHz in das Textfeld Frequenzen ein.
      11. Berechnen Sie die Studie. Klicken Sie auf der Symbolleiste "Studie" auf Standard-Solver anzeigen. Erweitern Sie dann den Knoten Study 1 Solver Configurations im Fenster Model Builder. Erweitern Sie den Knoten Lösung 1 (sol1) im Modell-Generator-Fenster; Klicken Sie anschließend im Fenster Stationäre Solver-Einstellungen auf Stationärer Solver 1, und suchen Sie den Abschnitt Allgemein, und geben Sie 1e-6 in das Textfeld Relative Toleranz ein. Klicken Sie schließlich auf der Studiensymbolleisteauf Berechnen .
      12. Plot-Ergebnisse. Wählen Sie den Abschnitt Ergebnisse auf der Startseitensymbolleiste aus, und fügen Sie 2D-Plotgruppe hinzu. Klicken Sie dann im Fenster Modell-Generator mit der rechten Maustaste auf 2D-Plotgruppe 1, und wählen Sie Flächeaus. Suchen Sie dann den Abschnitt Daten im Fenster Oberflächeneinstellungen, und wählen Sie Precursoraus. Suchen Sie anschließend den Abschnitt Ausdruck im Fenster Oberflächeneinstellungen. Klicken Sie hier auf das Plussymbol (+), um ein neues Fenster zu öffnen und die folgende Route aus der Auswahlliste zu finden (Modell - Komponente 1 - Elektrische Ströme - Elektrisch). Wählen Sie hier ec.normE - EF Normaus. Klicken Sie schließlich im Fenster Oberflächeneinstellungen auf Grafik, um die Ergebnisse darzustellen.
    2. Erstellen eines Modells für MFs
      1. Erstellen Sie Geometrien. Wählen Sie im Modell-Generator Geometrieaus. suchen Sie dann den Einheitenabschnitt und wählen Sie mm aus. Wählen Sie auf der Geometriesymbolleiste Rechteck aus, und geben Sie die Bemaßungen der einzelnen Komponenten in das Feld Größe und Form der Rechteckfenstereinstellungen ein. Die Geometrie besteht aus Luft und Kooper (siehe Bemaßungen jedes Elements in Tabelle 1). Nachdem alle Geometrien erstellt wurden, klicken Sie auf Alle Objekte erstellen.
      2. Fügen Sie Materialien hinzu. Klicken Sie auf der Home-Symbolleiste auf Material hinzufügen, um das Fenster Material hinzufügen zu öffnen. Suchen Sie Luft und Kupfer und fügen Sie sie dem Model Builder-Fenster hinzu. Die dielektrischen Eigenschaften für Kupfer sind in Tabelle 2aufgeführt.
      3. Erstellen Sie Grenzen. Klicken Sie im Fenster Modell-Generator auf Magnetfeld. Suchen Sie hier die Gleichungsliste im Fenster Magnetfelder-Einstellungen, und wählen Sie In der Liste Gleichungsform die Option Frequenzbereichsgleichung aus. Wählen Sie in der Häufigkeitsliste Von Solveraus. Suchen Sie anschließend im Fenster Modell-Generator das Gesetz von Ampere in der Magnetfeld-Liste. Im Typ 293.15[K] in Temperatur,1[atm] in Absolutdruck aus der Liste Der Eingänge Modell. Wählen Sie dann in der Liste Materialtyp im Fenster Rechtseinstellungen von Ampere die Option Volumenkörper aus. Stellen Sie sicher, dass elektrische Leitfähigkeit, Relative Permittivität und relative Durchlässigkeit dem Von-Material in der Liste entsprechen.
      4. Suchen Sie die Axialsymmetrie in der Liste Magnetfeld im Fenster Modell-Generator. Stellen Sie sicher, dass die axiale Symmetrielinie sowohl in der Liste "Grenzauswahl" als auch im Grafikfenster hervorgehoben ist. Suchen Sie dann die magnetische Isolierung in der Liste Magnetfeld im Fenster Modell-Generator. Stellen Sie sicher, dass die Grenzen der Geometrie sowohl in der Liste "Grenzauswahl" als auch im Grafikfenster hervorgehoben sind.
      5. Suchen Sie die Anfangswerte in der Liste Magnetfeld im Fenster Modell-Generator. Wählen Sie zuvor erstellte Geometrien aus und fügen Sie sie im Fenster Anfangswerteeinstellungen in die Domänenauswahl ein.
      6. Einführung von Spulenfunktionen. Suchen Sie mehrere Coils in der Liste Magnetfeld im Fenster Modell-Generator. Wählt hier die Geometrie aus, die die Spule darstellt, und schließt sie im Fenster Mehrere Spuleneinstellungen in die Domänenauswahl ein.
      7. Suchen Sie die Liste "Mehrere Coils" im Fenster "Mehrere Coil-Einstellung". Suchen Sie hier die Spulenanregungsliste und wählen Sie Stromaus; danach geben Sie 1[A] in der Coil-Stromliste, 450 in der Anzahl der Umdrehungen und 6e7[S/m] in der Coil-Leitfähigkeit ein.
      8. Suchen Sie den Spulendrahtquerschnittund und wählen Sie den nordamerikanischen Kabeldurchmesser (Brown & Sharpe) aus der Liste und geben Sie 18 in der AWG-Option ein. Stellen Sie sicher, dass relative Permittivität und relative Durchlässigkeit dem Material von in der Liste entsprechen.
      9. Erstellen Sie ein Netz. Wählen Sie im Fenster Netzeinstellung Aus der Liste Sequenztyp die Option Netzgesteuert von der Physik aus. Suchen Sie anschließend die Elementgrößenparameter im Fenster Netzeinstellung, und wählen Sie Extrem fein aus. Wählen Sie schließlich alle Domänen aus, die vernetzt werden sollen, und klicken Sie im Fenster Netzeinstellung auf Alle erstellen.
      10. Erstellen Sie eine Studie. Klicken Sie im Fenster Modell-Generator auf Studie 1. Suchen Sie dann den Abschnitt Studieneinstellungen im Fenster Studieneinstellungen, und deaktivieren Sie das Kontrollkästchen Standarddiagramme generieren. Erweitern Sie den Knoten Studie 1 im Modell-Generator-Fenster, und klicken Sie auf Schritt 2: Frequenzdomäne. Suchen Sie schließlich den Abschnitt Studieneinstellungen im Fenster Frequenzbereichseinstellungen, und geben Sie 60 Hz in das Textfeld Frequenzen ein.
      11. Berechnen Sie die Studie. Klicken Sie auf der Symbolleiste "Studie" auf Standard-Solver anzeigen. Erweitern Sie dann den Knoten Study 1 Solver Configurations im Fenster Model Builder. Erweitern Sie den Knoten Lösung 1 (sol1) im Modell-Generator-Fenster; Klicken Sie anschließend im Fenster Stationäre Solver-Einstellungen auf Stationärer Solver 1, und suchen Sie den Abschnitt Allgemein und geben Sie 1e-6 im Feld Relativer Toleranztext ein. Klicken Sie schließlich auf der Studiensymbolleisteauf Berechnen .
      12. Plot-Ergebnisse. Wählen Sie den Abschnitt Ergebnisse auf der Startseitensymbolleiste aus, und fügen Sie 2D-Plotgruppe hinzu. Klicken Sie dann im Fenster Modell-Generator mit der rechten Maustaste auf 2D-Plotgruppe 1, und wählen Sie Flächeaus. Suchen Sie dann den Abschnitt Daten im Fenster Oberflächeneinstellungen, und wählen Sie Precursoraus.
      13. Suchen Sie den Abschnitt Ausdruck im Fenster Oberflächeneinstellungen. Klicken Sie hier auf das Plussymbol (+), um ein neues Fenster zu öffnen und die folgende Route aus der Auswahlliste zu finden (Modell - Komponente 1 - Magnetisches Feld - Magnetisch). Wählen Sie hier mf.normB - Magnetische Flussdichte Norm. Klicken Sie schließlich im Fenster Oberflächeneinstellungen auf Grafik, um die Ergebnisse darzustellen.

2. Konstruktion und Herstellung der elektrischen und magnetischen Stimulationsgeräte

  1. Die elektrische Stimulatorvorrichtung
    HINWEIS: Es besteht aus einer Schaltung auf Basis des Wien Bridge Oszillators und zwei parallelen Edelstahlelektroden. Die Schaltung ist ein RC-Oszillator der Phasenverschiebung, der ein positives und negatives Feedback verwendet. Der Wiener Brückenoszillator besteht aus einem Bleilag-Netzwerk, das die Eingangsspannung durch die Kombination zweier Arme der Brücke teilt: einen Widerstand R5 mit kondensator C2 in Serie und ein Widerstand R6 mit kondensator C3 parallel (Abbildung 1A). Diese Komponenten modulieren die Frequenz des Oszillators. Um das elektrische Stimulator-Gerät zu bauen, gehen Sie wie folgt vor:
    1. Berechnen Sie die Frequenz mit der Resonanzfrequenzgleichung (1).
      Equation 1
      Wobei R = R5 = R6 Widerstände sind und C = C2 = C3 Kondensatoren sind. Sowohl R als auch C werden in den beiden Armen der Brücke platziert (Abbildung 1A). Verwenden Sie R5 = R6 = 2,6 k' und C2 = C3 = 1 nF, um eine Frequenz von 60 kHz zu erhalten. Widerstände und Kondensatoren können berechnet werden, wenn eine andere Frequenz erforderlich ist.
    2. Gestalten Sie die Schaltung so, dass die Spannungsverstärkung des Verstärkers automatisch die Amplitudenänderungen des Ausgangssignals kompensiert. In Abbildung 1A ist es möglich, das Schema der Schaltung zu beobachten, während in Tabelle der Materialien Abschnitt sind die elektronischen Komponenten aufgeführt, um die Schaltung zu bauen.
    3. Berechnen Sie die Kombination von Widerständen, um die vier Ausgangsspannungen zu erzeugen. Wie in Abbildung 1Adargestellt, verwenden Sie eine Kombination der Widerstände R11, R12, R13 und R14 (äquivalenter Widerstand von 154 Ω), um eine Spannung von 50 Vp-p zu erzeugen; Widerstände R17, R18 und R19 in Reihe (äquivalenter Widerstand von 47,3 Ω), um eine Spannung von 100 Vp-p zu erhalten; Widerstände R9 und R10 in Reihe (äquivalenter Widerstand von 25,3 Ω), um eine Spannung von 150 Vp-p zu erzeugen; und eine Kombination der Widerstände R15 und R16 (äquivalenter Widerstand von 16,8 Ω), um eine Spannung von 200 Vp-p zu erhalten.
    4. Verwenden Sie einen Transistor (TIP 31C) und einen Ferritkerntransformator, um eine Signalverstärkungsstufe zu implementieren. Ein toroidaler Ferritkern wurde verwendet, um einen AWG 24 Kupferdraht zu wickeln, der eine Beziehung 1:200 vervollständigte. Verwenden Sie zwei Kondensatoren (C4 und C5) von 100 nF parallel vor dem Transformator, um das Signal zu korrigieren (Abbildung 1A).
    5. Bereiten Sie die Leiterplatte mithilfe eines PCB-Fertigungsdienstes eines Drittanbieters vor. Das Schema der Schaltung ist in Abbildung 1dargestellt. Legen Sie alle Komponenten mit antistatischer Pinzette auf die Leiterplatte. Verwenden Sie Zinnlöt- und Lötkolben, um alle Komponenten zu löten.
    6. Herstellung eines Kunststoffgehäuses mit Eingangssteckverbindern zum Schutz der Schaltung. Implementieren Sie drei Eingangsanschlüsse, um die Schaltung zu beleben (12 V, -12 V und Masse). Verwenden Sie zwei Eingangsanschlüsse, um die Elektroden anzuschließen. Schließen Sie drei Schalter ein, um die Widerstandskombination zu ändern, um die vier Ausgangsspannungen zu erhalten. Montieren Sie den elektronischen Stromkreis in das Kunststoffgehäuse (Abbildung 1B).
    7. Herstellung von zwei parallelen Edelstahlelektroden (200 x 400 x 2 mm) und Löteingangssteckverbindern an jeder Kante. Die Elektroden befinden sich über Teflon- oder Acrylstützen, um jeglichen Kontakt mit der Metalloberfläche des Inkubators zu eliminieren (Abbildung 1C).
    8. Verwenden Sie einen Autoklaven bei 394,15 K (121 °C) für 30 Minuten, um die Elektroden zu sterilisieren und ultraviolett über Nacht zu verwenden, um die Drähte zu sterilisieren, die mit dem Inkubator in Berührung kommen.
    9. Testen Sie das elektrische Stimulationsgerät. Stellen Sie das Netzteil in Reihe ein, um eine Ausgangsspannung von +12 V und -12 V zwischen dem Boden und positiven und negativen Klemmen zu erzeugen. Überprüfen Sie die Ausgangsspannung des Netzteils mit einem Multimeter. Schließen Sie jeden Ausgang des Netzteils an den richtigen Eingang des elektrischen Stimulaators (+12 V, -12 V und Masse) an. Schließen Sie jede Elektrode am richtigen Eingangsstecker des elektrischen Stimulaators an. Die Polarität ist nicht wichtig, da wir an AC-Strom arbeiten. Legen Sie eine Kultur-Well-Platte zwischen die Elektroden und überprüfen Sie das Ausgangssignal mit einem Oszilloskop. Stellen Sie die Schalter des elektrischen Stimulaators ein, um die vier Ausgangsspannungen (50, 100, 150 und 200 Vp-p) zu erzeugen.
    10. Sicherheitsempfehlungen. Um Probleme beim Übertragen oder Entfernen der Elektroden aus dem Inkubator zu vermeiden, stellen Sie sicher, dass die Kabel nicht verheddert sind. Trennen Sie Kabel vom Oszillator, bevor Sie die Elektroden aus dem Inkubator entfernen. Platzieren Sie die Elektroden niemals ohne die Acryl- oder Teflonstützen.
  2. Das magnetische Stimulatorgerät
    1. Schätzen Sie die Anzahl der Umdrehungen, um eine homogene MF innerhalb der Spule zu garantieren, indem Sie die Gleichung (2) verwenden, die das MF in einer Magnetspule beschreibt.
      Equation 2
      wobei μ0 die magnetische Durchlässigkeit des Vakuums (4π×10-7) ist, ist N die Anzahl der Umdrehungen des Kupferdrahtes, I ist der Strom, und h, der größer als sein Durchmesser sein sollte, ist die Länge der Magnetspule.
    2. Bestimmen Sie die Anzahl der Umdrehungen, indem Sie eine Länge (h) von 250 mm, Strom von 1 A und ein Bint = 2mTwählen.
    3. Herstellung der Spule. Bauen Sie ein Polyvinylchlorid (PVC) Rohr mit einer Länge von 250 mm und einem Durchmesser von 84 mm, um einen AWG 18 Kupferdraht mit 450 Umdrehungen zu wickeln (Abbildung 2A). Die Abmessungen wurden basierend auf dem verfügbaren Platz im Inkubator ausgewählt.
    4. Herstellung einer Zellkultur Gut-Platte Unterstützung. Bauen Sie eine Polymethylmethacrylat (PMMA) Unterstützung, um sicherzustellen, dass Well-Platten von 35 mm waren immer in der Mitte der Spule, wo MFs homogen sind (Abbildung 2A).
    5. Herstellung eines Transformators zur Erhöhung des Stroms der Schaltung. Bauen Sie einen Transformator mit einer Leistung von 1 A - 6 V AC, um eine maximale MF von 2 mT zu erreichen. Die Eingangsspannung des Transformators betrug 110 V AC bei 60 Hz. Diese Parameter entsprechen der Ausgangsspannung und Frequenz eines Südamerikanischen Auslasses.
    6. Schließen Sie die Schaltung an. Der Transformator ist direkt an den Auslass angeschlossen. Verwenden Sie einen variablen Widerstand (Rheostat), um den Strom zu variieren und MFs von 1 bis 2 mT zu generieren. Schließen Sie eine Sicherung an, um die Schaltung zu schützen (Abbildung 2B).
    7. Verwenden Sie Ultraviolett über Nacht, um die Drähte zu sterilisieren, die mit dem Inkubator in Kontakt sind. Wickeln Sie die Spule mit transparenter Stretchfolie und verwenden Sie Ethanol, um die Spule zu sterilisieren.
    8. Testen Sie das MF-Gerät. Verwenden Sie ein Teslameter, um die MF-Magnitude innerhalb der Spule zu messen. Die Teslametersonde befand sich in der Mitte der Spule, so dass mFs und Ströme gleichzeitig gemessen werden konnten.
    9. Variieren Sie die MF-Magnitude. Verwenden Sie ein Rheostat, um den Widerstand der Schaltung zu ändern (Abbildung 2B). Ein Widerstandswert von 0,7 Ω wurde verwendet, um MFs von 1 mT zu generieren.
    10. Sicherheitsempfehlungen. Um Probleme beim Übertragen oder Entfernen des Magneten aus dem Inkubator zu vermeiden, stellen Sie sicher, dass die Kabel nicht verheddert sind. Trennen Sie Kabel vom Transformator, bevor Sie den Magneten aus dem Inkubator entfernen. Platzieren Sie den Magnet niemals ohne die PMMA-Unterstützung. Greifen Sie sowohl die PMMA-Unterstützung von der Basis als auch vom Magneten beim Übertragen oder Entfernen aus dem Inkubator fest.

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Representative Results

Computational Simulation
Die Verteilungen von EFs und MFs sind in Abbildung 3dargestellt. Einerseits konnte die homogene Verteilung der EF im kapazitiven System beobachtet werden (Abbildung 3A). Der EF wurde dargestellt, um die Größe des Feldes innerhalb der biologischen Probe im Detail zu beobachten (Abbildung 3B). Diese Simulation war nützlich, um die Größe der Elektroden zu parametrisieren und herzustellen, um den Kanteneffekt zu vermeiden. Andererseits konnte die homogene Verteilung der durch die Magnetspule erzeugten MFs beobachtet werden (Abbildung 3C). Das MF wurde dargestellt, um die Größe des Feldes innerhalb der Spule im Detail zu beobachten (Abbildung 3D). Diese Simulation war wichtig, um die Entfernung zu messen, in der die MF identisch ist, und die PMMA-Unterstützung zu bauen. Diese Unterstützung gewährleistet eine homogene Verteilung des MF nicht nur in der Mitte der Spule, sondern auch in den zu stimulierenden biologischen Proben.

Signale, die von elektrischen und magnetischen Stimulatoren erzeugt werden
Ausgangssignale, die durch elektrischen Stimulator erzeugt werden, sind in Abbildung 4dargestellt. Es ist wichtig zu betonen, dass die vom Oszilloskop erfassten Signale direkt in den Elektroden aufgenommen wurden, da die Messung direkt an die Ausgangskabel genommen wird, die Spannungen höher sein werden (Abbildung 4A). Diese Spannungsvariation wird durch die Kapazität der Elektroden gegeben. Die Ausgangsspannung oszilliert in einem Bereich von ± 5V bei 60 kHz; Beispielsweise betrugen die Ausgangssignale 54,9 Vp-p (Abbildung 4B), 113 Vp-p (Abbildung 4C), 153 Vp-p (Abbildung 4D) und 204 Vp-p (Abbildung 4E) für 50, 100, 150 bzw. 200 Vp-p.

Das vom magnetischen Stimulator erzeugte Ausgangssignal ist in Abbildung 5dargestellt. Das vom Oszilloskop aufgenommene Signal wurde direkt in den Ausgangskabeln der Spule aufgenommen (Abbildung 5A). Die Ausgangsspannung oszilliert im Bereich von ± 15V p-p bei 60 Hz (Abbildung 5B).

Figure 1
Abbildung 1. Elektrisches Stimulationsgerät. A) Schaltung, die Spannungen von 50, 100, 150 und 200 Vp-p bei 60 kHz Sinus-Wellenform erzeugt. B) Gedruckte Leiterplatte im Gehäuse. C) Elektroden im Inkubator. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 2
Abbildung 2. MagnetischeStimulationsvorrichtung. A) Schematische Darstellung des magnetischen Stimulators und der PMMA-Unterstützung. B) Schaltung, um die MFs zu generieren. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 3
Abbildung 3. Computational Simulation von EFs und MFs. A) Verteilung von EFs innerhalb und außerhalb des kapazitiven Systems. B) Verteilung von EFs innerhalb des Hydrogels, die Interessensregion ist rot angegeben. C) Verteilung von MFs innerhalb und außerhalb der Spule. D) Verteilung von MFs in der Mitte der Spule, wird der Interessenbereich in einem roten Detail angegeben. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 4
Abbildung 4. Sinusförmiges Signal, das durch elektrischen Stimulator erzeugt wird. A) Signalverifizierung, die vom elektrischen Stimulator erzeugt wird. B) Signal bei 50 Vp-p. C) Signal bei 100 Vp-p. D) Signal bei 150 Vp-p. E) Signal bei 200 Vp-p. Alle Messungen schwingen in einem Bereich von ± 5V bei 60 kHz. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 5
Abbildung 5. Sinusförmiges Signal, das vom magnetischen Stimulator erzeugt wird. A) Signalverifizierung, die vom magnetischen Stimulator erzeugt wird. B) Signal bei 15 Vp-p bei 60 Hz. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

System Komponenten Breite (mm) Höhe (mm)
Elektrisches System Luft 100 100
Elektroden 50 5
Well-Platte 7 20
Hydrogel 3.5 3.5
Kulturmedien 6 8
Magnetisches System Luft 500 600
Spule 2 250

Tabelle 1. Dimension der Geometrien, die elektrische und magnetische Systeme bilden.

System Komponenten Relative Permittivität (ε) Leitfähigkeit (σ)
Elektrisches System Luft 1 0
Elektroden 1 1.73913 [MS/m]
Well-Platte 3.5 6.2E-9 [S/m]
Hydrogel 8.03E3 7.10E-2 [S/m]
Kulturmedien 2.67E4 7.20E-2 [S/m]
Magnetisches System Spule 1 5.998E7[S/m]

Tabelle 2. Dielektrische Eigenschaften von Elementen, die elektrische und magnetische Systeme bilden.

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Discussion

Behandlungen zur Heilen verschiedener Pathologien, die menschliches Gewebe beeinflussen, sind pharmakologische Therapien32 oder chirurgische Eingriffe33, die versuchen, Schmerzen lokal zu lindern oder betroffene Gewebe durch Explanten oder Transplantationen zu ersetzen. Kürzlich wurde eine autologe Zelltherapie als alternative Therapie zur Behandlung von verletztem Gewebe vorgeschlagen, bei der Zellen vom Patienten isoliert und durch In-vitro-Techniken erweitert werden, um an der Stelle der Verletzung implantiert zu werden34. Angesichts der Tatsache, dass die autologe Zelltherapie nachweislich direkten Einfluss auf die Geweberückgewinnung hat, wurden verschiedene Strategien entwickelt, um die Wirksamkeit dieser Technik zu erhöhen. Zum Beispiel wurden biophysikalische Reize als nicht-invasive alternative Therapie verwendet, um verschiedene Arten von biologischen Proben zu stimulieren, die Zellfunktionalität durch Verbesserung der Zellproliferation und molekularen Synthese35,36zu modulieren. Unter den am häufigsten verwendeten biophysikalischen Reizen, Elektrostimulation und Magnetotherapie wurden weit verbreitet, um Zellen, Gewebeexplante und Gerüste zu stimulieren. Es hat sich herausgebildet, dass Elektrostimulation Schmerzen reduziert und die Heilungsprozesse mehrerer Gewebe erhöht37. In Bezug auf die Magnetotherapie wurde beschrieben, dass dieser Reiz die Integration von Implantaten mit Wirtsgewebe verbessert, Heilungsprozesse beschleunigt, Schmerzen lokal lindert und die Narbenfestigkeit erhöht8,38.

Unter Berücksichtigung der oben genannten wurde die Kombination von Biomaterialien, Zellkultur und externen biophysikalischen Reizen wie EFs und MFs auf In-vitro-Ebene in die Gewebetechnik als alternative therapeutische Technik zur Heilen von verletzten Gewebeneingeführt 8,39. Die Suche nach einem Bioreaktor, der hilft, verschiedene Gewebe zu stimulieren, ob gesund oder von traumatischen Pathologien betroffen, ist jedoch eine Herausforderung. In diesem Zusammenhang zielt das vorliegende Protokoll darauf ab, sowohl elektrische als auch magnetische Stimulatoren zu entwickeln. Derzeit gibt es zwei mögliche Regelungen für die Anwendung von EF. Die erste Methode besteht darin, EFs durch direkte Kopplungssysteme zu generieren, die zur Bewertung der Zellmigration und -ausrichtung40,41,42verwendet werden. Es gibt jedoch Einschränkungen wie Veränderungen in der Biokompatibilität des Zellkulturmediums durch berührungsreiche Elektroden, mögliche Veränderungen des pH-Wertes und molekularer Sauerstoffgehalt1. Darüber hinaus kann die direkt gekoppelte Stimulation hochfrequente Signale nicht verstärken. Der Ausgang variiert tendenziell mit der Zeit, wodurch sich die Versorgungsspannung ändert. Es hat wenig Temperaturstabilität, dadurch ändern sich seine Betriebspunkte und bei niedrigen Frequenzen versagt der Kondensator und fungiert als offener Stromkreis43. Unter Berücksichtigung dieser Einschränkungen wurde die zweite Methode implementiert, bei der externe Parallelelektroden verwendet wurden. Diese Methode des indirekten Kopplungssystems hat eine Zunahme der Zellproliferation und der molekularen Synthese3,7,17,22,44,45; Die von verschiedenen Autoren entwickelten Geräte haben jedoch die Größe von Elektroden nicht berücksichtigt, um homogenE EFs zu verteilen. Beispielsweise erzeugen Geräte feste Spannungen und Frequenzen und begrenzen deren Einsatz bei der Stimulierung bestimmter Zellen und Gewebe. Dementsprechend wurde in dieser Studie die Größe der Elektroden modelliert, um eine homogene Verteilung von EFs über biologische Gewebe zu gewährleisten. Darüber hinaus wurde ein Schaltkreis entwickelt, um eine Frequenz und hohe Spannungen zwischen Elektroden zu erzeugen, wodurch verschiedene EFs erzeugt werden, die die Einschränkungen überwinden, die durch die Impedanz von Zellkultur-Wellplatten und Luft verursacht werden.

Magnetspulen sind vielseitige Geräte, die verwendet werden können, um biologische Proben im Inkubator zu stimulieren, so dass die atmosphärischen Bedingungen stabil bleiben, ohne die physiologischen Eigenschaften biologischer Proben zu beeinträchtigen. Dieser Vorteil erklärt, dass Magnetspulen mehr als Helmholtz-Spulen praktikable Alternativen sind, da diese größer sein müssen, um eine Stimulation in Inkubatoren zu verhindern46. Die Stimulation biologischer Proben außerhalb des Inkubators kann unter anderem bei verschiedenen Themen wie Zellkulturkontamination, Zellstress, pH-Veränderungen der Kulturmedien führen. Angesichts der Tatsache, dass verschiedene Stimulator-Geräte entwickelt wurden, um mehrere Zelltypen und Gewebe zu stimulieren24,25,26,27, ist es relevant, Geräte zu bauen, bei denen MF-Intensitäten variiert werden können, um eine breite Palette von biologischen Proben zu stimulieren29,30. Dementsprechend ist in diesem Protokoll der magnetische Stimulator mit einem Rheostat verbunden, das den Strom, der durch den Magnet fließt, variieren kann, indem er ihren Widerstand und Strom ändert, Parameter, die direkt mit der Generierung von MFs zusammenhängen. Ein weiteres wichtiges Merkmal, das im Moment des Baus magnetischer Geräte zu berücksichtigen ist, ist die Verteilung von MFs. Hier wurde eine Rechensimulation verwendet, um die MF-Verteilung innerhalb der Magnetspule zu simulieren. Diese Simulation ermöglichte es, die Anzahl der Umdrehungen des Kupferdrahtes und die Länge der Spule zu berechnen, um homogene MFs in der Mitte der Spule zu erzeugen. Die Rechensimulation ist ein nützliches Werkzeug, um die Anzahl der zu stimulierenden biologischen Proben zu berechnen und sicherzustellen, dass alle Proben die gleiche Feldstärke erhalten47.

Die in diesem Protokoll entwickelten biophysikalischen Stimulatoren haben einige Einschränkungen. Zunächst erzeugt der für den elektrischen Stimulator entwickelte elektronische Schaltkreis vier Ausgangsspannungen mit einer bestimmten Frequenz. Obwohl die Schaltung die Begrenzung der Erzeugung von Hochspannungen zwischen Elektroden1überwinden, könnte es verbessert werden, um variable Spannungen und Frequenzen zu erzeugen. Die Schaltung kann modifiziert werden, um verschiedene Frequenzen zu erzeugen, nur um entweder Widerstände oder Kondensatoren mit Gleichung (1) zu berechnen; Es ist jedoch möglich, variable Widerstände zu verwenden, um den Widerstandswert manuell zu variieren. Ebenso kann ein variabler Widerstand in der Verstärkungsstufe der Schaltung verwendet werden, um die Ausgangsspannung zu variieren. Zweitens erzeugt der elektronische Schaltkreis des elektrischen Stimulaators sinusförmige Signale. Es wäre nützlich, verschiedene Arten von Signalen wie quadratisch, dreieckig, trapezförmig und Rampe zu erzeugen, da diese Arten von Signalen verwendet werden könnten, um eine breite Palette von Zellen und biologischen Proben zu stimulieren48,49. Um verschiedene Signale zu erzeugen, kann der Operationsverstärker durch einen monolithischen Funktionsgenerator ersetzt werden, der hochwertige Wellenformen mit hoher Stabilität und Genauigkeit bei geringer Amplitude erzeugen kann, und die Amplifikationsstufe kann durch einen nicht invertierenden Operationsverstärker oder eine Stufe mit NPN-Transistoren ersetzt werden. Drittens, obwohl der magnetische Stimulator kleine MF-Größen erzeugt, hat sich gezeigt, dass diese Intensitäten direkte Auswirkungen auf die Dynamik biologischer Probenhaben 24,28,30,38; jedoch könnte das magnetische Gerät verbessert werden, um variable MFs und Frequenzen zu erzeugen, um eine breite Palette von biologischen Geweben zu stimulieren29.

Insgesamt ist dieses Protokoll ein nützliches Instrument, das der wissenschaftlichen Gemeinschaft einen technologischen Beitrag leistet, der an der biophysikalischen Stimulation biologischer Gewebe arbeitet. Diese Geräte werden es Forschern ermöglichen, EFs und MFs zu verwenden, um die Funktion gesunder biologischer Gewebe oder von einer bestimmten Pathologie veränderten Geweben zu stimulieren. In Anbetracht dessen würden in weiteren in vivo-Studien verschiedene Parameter und Variablen wie Elektrodengröße, Anzahl der Umdrehungen der Spule, Reizstärke und Stimulationszeiten bestimmt, um sowohl EFs als auch MFs homogen auf Tiere wie Schweine, Kälber, Meerschweinchen oder Kaninchen zu verteilen. Darüber hinaus können in diesem Protokoll entwickelte Bioreaktoren auf klinische Einstellungen extrapoliert werden, um regenerative Techniken wie die autologe Zellimplantation zu verbessern. Hier können Bioreaktoren eine wichtige Rolle spielen, indem sie biologische Proben auf In-vitro-Ebene stimulieren, um die zellulären und molekularen Eigenschaften von Zellen, Geweben und Gerüsten zu verbessern, bevor sie in den Patienten implantiert werden.

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Disclosures

Die Autoren erklären, dass sie keinen Interessenkonflikt haben.

Acknowledgments

Die Autoren danken der finanziellen Unterstützung durch "Fondo Nacional de Financiamiento para la Ciencia, la Tecnologa, y la Innovacién -Fondo Francisco José de Caldas- Minciencias" und universidad Nacional de Colombia durch das Stipendium Nr. 80740-290-2020 und die Unterstützung durch Valteam Tech - Forschung und Innovation für die Bereitstellung der Ausrüstung und technische Unterstützung in der Ausgabe des Videos.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Electrical stimulator
Operational amplifier Motorola LF-353N ----
Quantity: 1
Resistors ---- ---- 22 kΩ
Quantity: 1
Resistors ---- ---- 10 kΩ
Quantity: 3
Resistors ---- ---- 2.6 kΩ
Quantity: 2
Resistors ---- ---- 2.2 kΩ
Quantity: 1
Resistors ---- ---- 1 kΩ
Quantity: 1
Resistors ---- ---- 220 Ω
Quantity: 2
Resistors ---- ---- 22 Ω
Quantity: 5
Resistors ---- ---- 10 Ω
Quantity: 1
Resistors ---- ---- 6.8 Ω
Quantity: 1
Resistors ---- ---- 3.3 Ω
Quantity: 2
Polyester capacitors ---- ---- 1 nF
Quantity: 2
Polyester capacitors ---- ---- 100 nF
Quantity: 1
VHF Band Amplifier Transistor JFET Toshiba 2SK161 ----
Quantity: 1
Power transistor BJT NPN Mospec TIP 31C ----
Quantity: 1
Zener diode Microsemi 1N4148 ----
Quantity: 1
Switch Toogle Switch SPDT - T13 ----
Quantity: 3
Toroidal ferrite core Caracol ---- T*22*14*8
Quantity: 1
Cooper wire Greenshine ---- AWG – 24
Quantity: 1
Relimate header with female housing ADAFRUIT ---- 8 pin connectors
Quantity: 1
Relimate header with female housing ADAFRUIT ---- 2 pin connectors
Quantity: 1
Female plug terminal connector JIALUN ---- 4mm Lantern Plugs (Plug + Socket) 15 A
Quantity: 1
Aluminum Heat Sink AWIND ---- For TIP 31C transistor
Quantity: 1
Led CHANZON ---- 5 mm red
Quantity: 1
Integrated circuit socket connector Te Electronics Co., Ltd. ---- Double row 8-pin DIP
Quantity: 1
3 pin connectors set STAR ---- JST PH 2.0
Quantity: 3
2 pin screw connectors STAR ---- For PCB
Quantity: 1
3 pin screw connectors STAR ---- For PCB
Quantity: 1
Banana connector test lead JIALUN ---- P1041 - 4 mm - 15 A
Quantity: 7
Bullet connectors to banana plug charge lead JIALUN ---- 4 mm male-male/female-female adapters - 15 A
Quantity: 1
Case ---- ---- ABS
Quantity: 1
Electrodes ---- ---- Stainless – steel
Quantity: 2
Electrode support ---- ---- Teflon
Quantity: 2
Printed circuit board Quantity: 1
Magnetic stimulator
Cooper wire Greenshine ---- AWG – 18
Quantity: 1
AC power plugs ---- ---- 120 V AC – 60 Hz
Quantity: 1
Banana female connector test lead JIALUN ---- 1Set Dual Injection - 4 mm – 15 A
Quantity: 2
Banana male connector test lead JIALUN ---- 1Set Dual Injection - 4 mm 15 A
Quantity: 1
Cell culture well plate support ---- ---- PMMA
Quantity: 1
Fuse Bussmann 2A ----
Quantity: 1
Transformer ---- ---- 1A – 6 V AC
Quantity: 1
Tube ---- ---- PVC
Quantity: 1
Variable rheostat MCP BXS150 10 Ω
Quantity: 1
General equipment
Digital dual source  PeakTech DG 1022Z 2 x 0 - 30 V / 0 - 5 A CC / 5 V / 3 A fijo
Quantity: 1
Digital Oscilloscope Rigol DS1104Z Plus 100 MHz, bandwidth, 4 channels
Quantity: 1
Digital multimeter Fluke F179 Voltage CC – CA (1000 V). Current CC – CA 10 A. Frequency 100 kHz
Quantity: 1

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References

  1. Balint, R., Cassidy, N. J., Cartmell, S. H. Electrical Stimulation: A Novel Tool for Tissue Engineering. Tissue Engineering Part B: Reviews. 19 (1), 48-57 (2013).
  2. Ercan, B., Webster, T. J. The effect of biphasic electrical stimulation on osteoblast function at anodized nanotubular titanium surfaces. Biomaterials. 31 (13), 3684-3693 (2010).
  3. Brighton, C., Wang, W., Clark, C. The effect of electrical fields on gene and protein expression in human osteoarthritic cartilage explants. The Journal of Bone and Joint Surgery-American. 90 (4), 833-848 (2008).
  4. Baerov, R. M., Morega, A. M., Morega, M. Analysis of magnetotherapy effects for post-traumatic recovery of limb fractures. Revue Roumaine des Sciences Techniques- Série électrotechnique et énergétique. 65 (1-2), 145-150 (2020).
  5. Escobar, J. F., et al. In Vitro Evaluation of the Effect of Stimulation with Magnetic Fields on Chondrocytes. Bioelectromagnetics. 41 (1), 41-51 (2019).
  6. Brighton, C., Wang, W., Clark, C. Up-regulation of matrix in bovine articular cartilage explants by electric fields. Biochemical and Biophysical Research Communications. 342 (2), 556-561 (2006).
  7. Xu, J., Wang, W., Clark, C., Brighton, C. Signal transduction in electrically stimulated articular chondrocytes involves translocation of extracellular calcium through voltage-gated channels. Osteoarthritis and Cartilage. 17 (3), 397-405 (2009).
  8. Xia, Y., et al. Magnetic field and nano-scaffolds with stem cells to enhance bone regeneration. Biomaterials. 183, 151-170 (2018).
  9. Richter, A., Bartoš, M., Ferková, Ž Physical Analysis of Pulse Low-Dynamic Magnetic Field Applied in Physiotherapy BT. World Congress on Medical Physics and Biomedical Engineering 2018. , 239-245 (2019).
  10. Miyakoshi, J. Effects of static magnetic fields at the cellular level. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 87, 213-223 (2005).
  11. Zhang, K., Guo, J., Ge, Z., Zhang, J. Nanosecond Pulsed Electric Fields (nsPEFs) Regulate Phenotypes of Chondrocytes through Wnt/β-catenin Signaling Pathway. Scientific Reports. 4 (5836), 1-8 (2014).
  12. Brighton, C. T., Unger, A. S., Stambough, J. L. In vitro growth of bovine articular cartilage chondrocytes in various capacitively coupled electrical fields. Journal of Orthopaedic Research. 2 (1), 15-22 (1984).
  13. Armstrong, P. F., Brighton, C., Star, A. M. Capacitively coupled electrical stimulation of bovine growth plate chondrocytes grown in pellet form. Journal of Orthopaedic Research. 6 (2), 265-271 (1988).
  14. Brighton, C., Townsend, P. Increased cAMP production after short-term capacitively coupled stimulation in bovine growth plate chondrocytes. Journal of Orthopaedic Research. 6 (4), 552-558 (1988).
  15. Brighton, C. T., Jensen, L., Pollack, S. R., Tolin, B. S., Clark, C. Proliferative and synthetic response of bovine growth plate chondrocytes to various capacitively coupled electrical fields. Journal of Orthopaedic Research. 7 (5), 759-765 (1989).
  16. Brighton, C. T., Okereke, E., Pollack, S. R., Clark, C. In vitro bone-cell response to a capacitively coupled electrical field. The role of field strength, pulse pattern, and duty cycle. Clinical Orthopaedics and Related Research. 285, 255-262 (1992).
  17. Wang, W., Wang, Z., Zhang, G., Clark, C., Brighton, C. T. Up-regulation of chondrocyte matrix genes and products by electric fields. Clinical Orthopaedics and Related Research. 427, 163-173 (2004).
  18. Hartig, M., Joos, U., Wiesmann, H. P. Capacitively coupled electric fields accelerate proliferation of osteoblast-like primary cells and increase bone extracellular matrix formation in vitro. European Biophysics Journal. 29 (7), 499-506 (2000).
  19. Kim, I. S., et al. Biphasic electric current stimulates proliferation and induces VEGF production in osteoblasts. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular Cell Research. 1763 (9), 907-916 (2006).
  20. Kim, I., et al. Novel Effect of Biphasic Electric Current on In Vitro Osteogenesis and Cytokine Production in Human Mesenchymal Stromal Cells. Tissue Engineering Part A. 15, 2411-2422 (2009).
  21. Kim, I., et al. Novel action of biphasic electric current in vitro osteogenesis of human bone marrow mesenchymal stromal cells coupled with VEGF production. Bone. 43, 43-44 (2008).
  22. Nakasuji, S., Morita, Y., Tanaka, K., Tanaka, T., Nakamachi, E. Effect of pulse electric field stimulation on chondrocytes. Asian Pacific Conference for Materials and Mechanics. 1, Yokohama, Japan. 13-16 (2009).
  23. Au, H. T. H., Cheng, I., Chowdhury, M. F., Radisic, M. Interactive effects of surface topography and pulsatile electrical field stimulation on orientation and elongation of fibroblasts and cardiomyocytes. Biomaterials. 28 (29), 4277-4293 (2007).
  24. Vanessa, N., et al. In vitro exposure of human chondrocytes to pulsed electromagnetic fields. European Journal of Histochemistry. 51 (3), 203-211 (2007).
  25. Pezzetti, F., et al. Effects of pulsed electromagnetic fields on human chondrocytes: An in vitro study. Calcified Tissue International. 65 (5), 396-401 (1999).
  26. De Mattei, M., et al. Effects of electromagnetic fields on proteoglycan metabolism of bovine articular cartilage explants. Connective Tissue Research. 44 (3-4), 154-159 (2003).
  27. Sollazzo, V., Massari, L., Caruso, A., Mattei, M., Pezzetti, F. Effects of Low-Frequency Pulsed Electromagnetic Fields on Human Osteoblast-Like Cells In Wtro. Electromagnetobiology. 15, 75-83 (2009).
  28. Martino, C. F., Perea, H., Hopfner, U., Ferguson, V. L., Wintermantel, E. Effects of weak static magnetic fields on endothelial cells. Bioelectromagnetics. 31 (4), 296-301 (2010).
  29. Wada, K., et al. Design and implementation of multi-frequency magnetic field generator producing sinusoidal current waveform for biological researches. 2016 18th European Conference on Power Electronics and Applications (EPE'16 ECCE Europe). 2016, 1-8 (2016).
  30. Cho, H., Kim, S., Kim, K. K., Kim, K., Kim, K. Pulsed Electromagnetic Fields Stimulate Cellular Proliferation in Different Types of Cells. IEEE Transactions on Magnetics. 52 (7), 1-4 (2016).
  31. Yan, J., Dong, L., Zhang, B., Qi, N. Effects of extremely low-frequency magnetic field on growth and differentiation of human mesenchymal stem cells. Electromagnetic Biology and Medicine. 29 (4), 165-176 (2010).
  32. Enoch, S., Grey, J. E., Harding, K. G. ABC of wound healing. Non-surgical and drug treatments. BMJ. 332 (7546), 900-903 (2006).
  33. Bhosale, A. M., Richardson, J. B. Articular cartilage: Structure, injuries and review of management. British Medical Bulletin. 87 (1), 77-95 (2008).
  34. Al Hamed, R., Bazarbachi, A. H., Malard, F., Harousseau, J. -L., Mohty, M. Current status of autologous stem cell transplantation for multiple myeloma. Blood Cancer Journal. 9 (4), 44 (2019).
  35. Massari, L., et al. Biophysical stimulation of bone and cartilage: state of the art and future perspectives. International Orthopaedics. 43 (3), 539-551 (2019).
  36. Naskar, S., Kumaran, V., Basu, B. Reprogramming the Stem Cell Behavior by Shear Stress and Electric Field Stimulation: Lab-on-a-Chip Based Biomicrofluidics in Regenerative Medicine. Regenerative Engineering and Translational Medicine. 5 (2), 99-127 (2019).
  37. Hunckler, J., de Mel, A. A current affair: electrotherapy in wound healing. Journal of Multidisciplinary Healthcare. 10, 179-194 (2017).
  38. Henry, S. L., Concannon, M. J., Yee, G. J. The effect of magnetic fields on wound healing: experimental study and review of the literature. Eplasty. 8, 393-399 (2008).
  39. Hiemer, B., et al. Effect of electric stimulation on human chondrocytes and mesenchymal stem cells under normoxia and hypoxia. Molecular Medicine Reports. 18 (2), 2133-2141 (2018).
  40. Chao, P. H., et al. Chondrocyte translocation response to direct current electric fields. Journal of Biomechanical Engineering. 122 (3), 261-267 (2000).
  41. Zhao, M., Bai, H., Wang, E., Forrester, J., McCaig, C. Electrical stimulation directly induces pre-angiogenic responses in vascular endothelial cells by signaling through VEGF receptors. Journal of Cell Science. 117 (3), 397-405 (2004).
  42. Li, X., Kolega, J. Effects of direct current electric fields on cell migration and actin filament distribution in bovine vascular endothelial cells. Journal of Vascular Research. 39 (5), 391-404 (2002).
  43. Singh, B., Dixit, A. Multistage amplifier and tuned amplifier. Analog Electronics. , Laxmi publications (P) LTD. Boston, MA. 87-131 (2007).
  44. Esfandiari, E., et al. The effect of high frequency electric field on enhancement of chondrogenesis in human adipose-derived stem cells. Iranian Journal Basic Medical Sciences. 4 (3), 571-576 (2014).
  45. Mardani, M., et al. Induction of chondrogenic differentiation of human adipose-derived stem cells by low frequency electric field. Advanced Biomedical Research. 5 (97), 1-7 (2016).
  46. Karaman, O., Gümüşay, M., Demirci, E. A., Kaya, A. Comparative assessment of pulsed electromagnetic fields (PEMF) and pulsed radio frequency energy (PRFE) on an in vitro wound healing model. International Journal of Applied Electromagnetics and Mechanics. 57, 427-437 (2018).
  47. Glinka, M., et al. Test chambers for cell culture in static magnetic field. Journal of Magnetism and Magnetic Materials. 331, 208-215 (2013).
  48. Vacek, T. P., et al. Electrical stimulation of cardiomyocytes activates mitochondrial matrix metalloproteinase causing electrical remodeling. Biochemical and Biophysical Research Communications. 404 (3), 762-766 (2011).
  49. Okutsu, S., et al. Electric Pulse Stimulation Induces NMDA Glutamate Receptor mRNA in NIH3T3 Mouse Fibroblasts. The Tohoku Journal of Experimental Medicine. 215 (2), 181-187 (2008).

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Bioengineering Ausgabe 171 Elektrisches Feld Magnetfeld Biophysikalische Reize Stimulator Biologisches Gewebe
Elektrische und magnetische Feldgeräte zur Stimulation biologischer Gewebe
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Saiz Culma, J. J., Escobar Huertas,… More

Saiz Culma, J. J., Escobar Huertas, J. F., Garzón-Alvarado, D. A., Vaca-Gonzalez, J. J. Electric and Magnetic Field Devices for Stimulation of Biological Tissues. J. Vis. Exp. (171), e62111, doi:10.3791/62111 (2021).

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