Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

تصوير واسع المجال وفي الوقت الحقيقي للإشارات الجرح المحلية والجهازية في Arabidopsis

Published: June 4, 2021 doi: 10.3791/62114
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 1,2
1Department of Biochemistry and Molecular Biology, Saitama University, 2Department of Botany, University of Wisconsin

Summary

إن إشارات الكالسيوم الجهازية التي تسببها الغلوتامات خارج الخلية أمر بالغ الأهمية لتحريض استجابات الدفاع النباتي على الجرح الميكانيكي وهجوم الحيوانات العاشبة في النباتات. توضح هذه المقالة طريقة لتصور الديناميكيات المكانية والزمنية لكل من هذين العاملين باستخدام نباتات Arabidopsis thaliana التي تعبر عن أجهزة الاستشعار الحيوية الفلورية الحساسة للكالسيوم والغلوتامات.

Abstract

تستجيب النباتات للضغوط الميكانيكية مثل الجرح وآكلي الأعشاب من خلال تحفيز الاستجابات الدفاعية سواء في الأجزاء التالفة أو البعيدة. عند جرح ورقة، تحدث زيادة في تركيز أيونات الكالسيوم الخلوية (Ca2+ إشارة) في موقع الجرح. يتم إرسال هذه الإشارة بسرعة إلى الأوراق غير التالفة ، حيث يتم تنشيط الاستجابات الدفاعية. كشفت أبحاثنا الأخيرة أن الغلوتامات المتسربة من الخلايا المصابة من الورقة إلى الأبوبلاست من حولهم بمثابة إشارة جرح. هذا الغلوتامات ينشط مستقبلات الغلوتامات مثل قنوات Ca2+ نفاذية، مما يؤدي بعد ذلك إلى انتشار إشارة Ca2+ لمسافات طويلة في جميع أنحاء المصنع. ويمكن التقاط الخصائص المكانية والزمانية لهذه الأحداث من خلال التصوير في الوقت الحقيقي للنباتات الحية التي تعبر عن أجهزة الاستشعار البيولوجية الفلورية المشفرة وراثيا. هنا نقدم طريقة تصوير على مستوى النبات في الوقت الحقيقي لمراقبة ديناميكيات كل من إشارات Ca2 + والتغيرات في الغلوتامات المبرمج التي تحدث استجابة للإصابة. يستخدم هذا النهج مجهر مضان واسع المجال ونباتات أربيدوبسي المعدلة وراثيا تعبر عن بروتين الفلورسنت الأخضر (GFP) القائم على Ca2+ و أجهزة الاستشعار الحيوية الغلوتامات. بالإضافة إلى ذلك، نقدم منهجية للحصول بسهولة على انتشار إشارة Ca2+ الناجم عن الجروح والغلوتامات. ويمكن تطبيق هذا البروتوكول أيضا على الدراسات المتعلقة بضغوط النباتات الأخرى للمساعدة في التحقيق في كيفية مشاركة الإشارات النظامية النباتية في شبكات الإشارات والاستجابة الخاصة بها.

Introduction

لا يمكن للنباتات الهروب من الضغوط الحيوية ، على سبيل المثال ، الحشرات التي تتغذى عليها ، لذلك فقد تطورت أنظمة متطورة لاستشعار الإجهاد ونقل الإشارات للكشف عن ثم حماية نفسها من تحديات مثل عشبي1. عند الجرح أو هجوم عشبي ، تبدأ النباتات استجابات دفاعية سريعة بما في ذلك تراكم حمض الجاسموني النباتي (JA) ليس فقط في موقع الجرحى ولكن أيضا في الأعضاء البعيدة غير التالفة2. هذا JA ثم يؤدي كل من الاستجابات الدفاعية في الأنسجة التالفة مباشرة ويحفز بشكل استباقي الدفاعات في الأجزاء غير التالفة من المصنع. في Arabidopsis، تم الكشف عن تراكم JA الناجم عن الجرح في أوراق بعيدة وسليمة في غضون دقائق قليلة من الضرر في مكان آخر في المصنع مما يشير إلى أن إشارة سريعة وطويلة المدى يتم إرسالها من ورقة الجرحى3. وقد اقترح العديد من المرشحين، مثل Ca2 +، وأنواع الأكسجين التفاعلية (ROS)، والإشارات الكهربائية، لتكون بمثابة هذه الإشارات الجرح لمسافات طويلة في النباتات4،5.

Ca2 + هي واحدة من العناصر رسول الثاني الأكثر تنوعا وفي كل مكان في الكائنات الحية eukaryotic. في النباتات، مضغ كاتربيلر والميكاميكالية تسبب زيادات كبيرة في تركيز Ca2+ الخلوية ([Ca2+]cyt) سواء في ورقة الجرحى أو في أوراق بعيدة غير مذبذبة6،7. يتم تلقي هذه الإشارة Ca2 + الجهازية بواسطة بروتينات الاستشعار Ca2 +داخل الخلية ، والتي تؤدي إلى تنشيط مسارات إشارات الدفاع المصب ، بما في ذلك التمثيل الحيوي JA8،9. على الرغم من العديد من هذه التقارير التي تدعم أهمية إشارات Ca2 + في استجابات جرح النبات ، فإن المعلومات حول الخصائص المكانية والزمنية لإشارات Ca2 + الناجمة عن الإصابة محدودة.

التصوير في الوقت الحقيقي باستخدام مؤشرات Ca2+ المشفرة وراثيا هو أداة قوية لرصد وقياس الديناميكيات المكانية والزمنية لإشارات Ca2+ . حتى الآن، وقد وضعت إصدارات من أجهزة الاستشعار من هذا القبيل التي تمكن التصور من إشارات Ca2 + على مستوى خلية واحدة، إلى الأنسجة والأعضاء وحتى النباتات كلها10. وكان أول جهاز استشعار حيوي مشفرة وراثيا لCa2 + المستخدمة في النباتات aequorin البروتين الإنارة الحيوية المستمدة من قنديل البحر Aequorea فيكتوريا11. على الرغم من أن هذا البروتين chemiluminescent قد استخدمت للكشف عن Ca2 + التغييرات استجابة لضغوط مختلفة في النباتات12،13،14،15،16،17،18، فإنه ليس مناسبا تماما للتصوير في الوقت الحقيقي بسبب إشارة الإنارة منخفضة للغاية التي تنتجها. Förster الرنين نقل الطاقة (FRET) المستندة إلى Ca2 + المؤشرات، مثل cameleons الأصفر، كما استخدمت بنجاح للتحقيق في ديناميات مجموعة من Ca2+ إشارات الأحداث في محطات19،20،21،22،23،24. تتوافق أجهزة الاستشعار هذه مع نهج التصوير وتتكون الأكثر شيوعا من كالمودولين بروتين Ca2 + الملزم (CaM) والببتيد الملزم ل CaM (M13) من سلسلة كيناز ضوء الميوسين ، وكلها تنصهر بين اثنين من بروتينات الفلوروفور ، وعموما بروتين الفلورسنت السماوي (CFP) ومتغير البروتين الفلوري الأصفر (YFP)10. Ca2 + ملزمة لCAM يعزز التفاعل بين CaM و M13 مما يؤدي إلى تغيير تشكيلي للمستشعر. ويعزز هذا التغيير نقل الطاقة بين CFP وYFP، مما يزيد من كثافة الفلورسينس في YFP مع تقليل انبعاثات الفلورسينس من CFP. رصد هذا التحول من CFP إلى فلورية YFP ثم يوفر مقياسا للزيادة في مستوى Ca2 + . بالإضافة إلى أجهزة الاستشعار FRET هذه، فإن أجهزة الاستشعار الحيوية Ca2+ المستندة إلى البروتين الفلوري الواحد (FP)، مثل GCaMP و R-GECO، تتوافق أيضا مع نهج التصوير النباتي وتستخدم على نطاق واسع لدراسة [Ca2+] تغييراتالسيت بسبب حساسيتها العالية وسهولة استخدامها25و26و27و28و29و30. تحتوي GCaMPs على GFP واحد معتبدل بشكل دائري (cp) ، ومرة أخرى تنصهر في CaM والببتيد M13. يؤدي التفاعل المعتمد على Ca2+بين CaM و M13 إلى تغيير تشكيلي في المستشعر يعزز التحول في حالة البروتونات في cpGFP ، مما يعزز إشارة الفلورسنت. وهكذا، مع ارتفاع مستويات Ca2+ ، تزداد إشارة cpGFP.

للتحقيق في ديناميات إشارات Ca2 + المتولدة استجابة للجرح الميكانيكي أو التغذية آكلة الأعشاب ، استخدمنا نباتات أرابيدوسيس ثاليانا المعدلة وراثيا التي تعبر عن متغير GCaMP ، GCaMP3 ، ومجهر مضان واسع المجال6. وقد نجح هذا النهج في تصور انتقال سريع لإشارة Ca2 + لمسافات طويلة من موقع الجرح على ورقة إلى النبات بأكمله. وهكذا، تم الكشف عن زيادة في [Ca2+]cyt على الفور في موقع الجرح ولكن تم نشر هذه الإشارة Ca2+ بعد ذلك إلى الأوراق المجاورة من خلال الأوعية الدموية في غضون بضع دقائق من الجرح. وعلاوة على ذلك، وجدنا أن انتقال هذه الإشارة الجرح الجهازية السريعة يتم إلغاؤها في النباتات Arabidopsis مع الطفرات في اثنين من الجينات مثل مستقبلات الغلوتامات، ومستقبلات الغلوتامات مثل (GLR)، GLR3.3، وGLR3.66. وGLRs يبدو أن تعمل كأحماض أمينية مسور Ca2 + قنوات المشاركة في العمليات الفسيولوجية المتنوعة, بما في ذلك استجابة الجرح3, نمو أنبوب حبوب اللقاح31, تطوير الجذر32, استجابة الباردة33, والمناعة الفطرية34. على الرغم من هذه الوظيفة الفسيولوجية الواسعة المفهومة جيدا ل GLRs ، فإن المعلومات حول خصائصها الوظيفية ، مثل خصوصية الليغند ، والانتقائية الأيونية ، والتوطين دون الخلوي ، محدودة35. ومع ذلك، ذكرت الدراسات الحديثة أن GLR3.3 و GLR3.6 مترجمة في phloem وxylem، على التوالي. GLRs النباتية لها أوجه تشابه مع مستقبلات الغلوتامات الأيونية (iGluRs)36 في الثدييات ، والتي يتم تنشيطها عن طريق الأحماض الأمينية ، مثل الغلوتامات والجليسين وD-سيرين في الجهاز العصبي للثدييات37. في الواقع، أثبتنا أن تطبيق الغلوتامات 100 mM، ولكن ليس غيرها من الأحماض الأمينية، في موقع الجرح يحفز سريعة، لمسافات طويلة Ca2+ إشارة في Arabidopsis،مما يشير إلى أن الغلوتامات خارج الخلية من المرجح أن يكون بمثابة إشارة الجرح في النباتات6. يتم إلغاء هذا الرد في glr3.3/glr3.6 متحولة مما يوحي بأن الغلوتامات قد يكون يتصرف من خلال واحدة أو كل من هذه القنوات مثل مستقبلات وبالفعل, AtGLR3.6 وقد تبين مؤخرا أن بوابات من قبل هذه المستويات من الغلوتامات38.

في النباتات، بالإضافة إلى دورها كحامض أميني هيكلي، كما اقترح الغلوتامات كمنظم التنمية الرئيسية39؛ ومع ذلك، فإن دينامياتها المكانية والزمنية غير مفهومة بشكل جيد. تماما كما لCa2 +, وقد وضعت العديد من المؤشرات المشفرة وراثيا للغلوتامات لرصد ديناميات هذه الأحماض الأمينية في الخلاياالحية 40,41. iGluSnFR هو GFP القائم على واحد FP الجلوتامات الاستشعار الحيوي تتألف من cpGFP وبروتين ملزم الغلوتامات (GltI) من الإشريكية القولونية42،43. التغيير التوافقي ل iGluSnFR ، الذي يسببه ربط الغلوتامات ب GltI ، يؤدي إلى انبعاث فلوري GFP معزز. للتحقيق في ما إذا كان الغلوتامات خارج الخلية بمثابة جزيء إشارة في استجابة جرح النبات ، قمنا بتوصيل تسلسل iGluSnFR مع تسلسل إفراز الببتيد الأساسي للإشارة الشيتاتينية (CHIB-iGluSnFR) لتعريب هذا الاستشعار الحيوي في الفضاء المبرمج6. مكن هذا النهج التصوير من أي تغييرات في تركيز الغلوتامات المبرمج ([غلو]آبو) باستخدام النباتات أربيدوبسيس المعدلة وراثيا التعبير عن هذا الاستشعار. اكتشفنا زيادات سريعة في إشارة iGluSnFR في موقع الجرح. هذه البيانات تدعم فكرة أن تسرب الغلوتامات من الخلايا التالفة / الأنسجة إلى أبوبلاست عند الجرح ويعمل كإشارة ضرر تفعيل GLRs ويؤدي إلى إشارة Ca2 + لمسافات طويلة في النباتات6.

هنا، ونحن نصف طريقة التصوير في الوقت الحقيقي على نطاق النبات باستخدام أجهزة الاستشعار الحيوية المشفرة وراثيا لرصد وتحليل ديناميات إشارات Ca2 + بعيدة المدى والجلوتامات خارج الخلية ردا على الجرح6. يوفر توافر المجهر الفلوري واسع المجال والنباتات المعدلة وراثيا التي تعبر عن أجهزة الاستشعار الحيوية المشفرة وراثيا نهجا قويا ، ولكن يسهل تنفيذه للكشف عن الإشارات البعيدة المدى التي تنتقل بسرعة ، مثل موجات Ca2 + .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. إعداد المواد النباتية

  1. في 1.5 مل ميكروبتوب، سطح تعقيم بذور أربيدوبسيس تاليانا (كول-0 الانضمام) مصنع التعبير عن إما GCaMP3 أو CHIB-iGluSnFR عن طريق هز مع 20٪ (v/v) NaClO لمدة 3 دقائق ثم يغسل 5 مرات مع الماء المقطر العقيم.
    ملاحظة: خطوط المعدلة وراثيا من Arabidopsis التعبير عن GCaMP3 أو CHIB-iGluSnFR وقد وصفت سابقا6.
  2. في غطاء محرك السيارة العقيم، زرع 13 بذور تعقيم السطح على طبق بيتري البلاستيك 10 سم مربع مليئة 30 مل معقمة (autoclaved) موراشيج وسكوغ (MS) المتوسطة [1x أملاح MS، 1٪ (ث/v) السكروز، 0.01٪ (ث/v) ميوينوزيتول، 0.05٪ (ث/v) MES و0.5٪ (ث/v) علكة الجيلان؛ درجة الحموضة 5.7 معدلة مع 1N KOH]. استبدل الغطاء والتفاف مع الشريط الجراحي.
  3. بعد الحضانة في الظلام عند 4 درجة مئوية لمدة يومين، ضع اللوحات أفقيا عند 22 درجة مئوية في غرفة نمو تحت ضوء مستمر (90-100 ميكرومول م-2 ثانية -1)لمدة أسبوعين تقريبا قبل الاستخدام. بعد أسبوعين، عد عدد أوراق أرابيدوسيس من أكبر إلى أصغر44 (الشكل 1). استجابات الجرح تتحرك بشكل تفضيلي من ورقة التالفة (ن) إلى أوراق مرقم ن ± 3 و n ± 56.
    ملاحظة: في هذا البروتوكول، سيتم فتح طبق بيتري لتصوير آثار الجرح والغلوتامات تحت المجهر الفلوري. لذلك، ينبغي أن تتم الخطوات اللاحقة في هذه التجربة في ظل ظروف الغرفة التي تسيطر عليها درجة الحرارة والرطوبة. وذلك لأن إشارات Ca2+ يتم الحصول عليها أيضا من خلال التغيرات في هذه الظروف البيئية. ومن المعروف أيضا أن الضوء الأزرق، المنبعث من المجهر أثناء التسجيل لإثارة مضان بروتين الاستشعار الحيوي، قد يثير زيادة في تركيز Ca2+ 45 الخلوية، وبالتالي يجب أن تتكيف مع النبات لتشعيع الضوء الأزرق لعدة دقائق قبل بدء التجربة.

2. التحضير الكيميائي

  1. حل L-الجلوتامات في وسط نمو سائل [أملاح MS 1/2x، 1٪ (ث / v) السكروز و 0.05٪ (ث / v) MES؛ درجة الحموضة 5.1 المعدلة مع 1N KOH] لجعل حل عمل 100 mM.
    ملاحظة: تجنب استخدام أملاح الغلوتامات مثل الغلوتامات الصوديوم لمنع الآثار المحتملة المرتبطة بالتكون على ديناميكيات Ca2+ .

3. إعداد المجهر وإجراء التصوير في الوقت الحقيقي

  1. قم بتشغيل مجسم المجسم المفلور المزود بعدسة هدف 1x (NA = 0.156) وكاميرا sCMOS(الشكل 2)وتكوين إعدادات الجهاز لتشعيعها بضوء إثارة 470/40 نانومتر والحصول على ضوء انبعاث يمر عبر فلتر 535/50 نانومتر.
    ملاحظة: يمكن استخدام أي مجهر مضان حساس ل GFP للكشف عن إشارات GCaMP3 و iGluSnFR في الوقت الفعلي ، ولكن يوصى بعدسة موضوعية منخفضة الطاقة وكاميرا حساسة للغاية مع رقاقة sCMOS واسعة للحصول على إشارات من المصنع بأكمله. يسمح هدف الطاقة المنخفضة بتصوير استجابة محطة Arabidopsis بأكملها واستخدام كاميرا حساسة للغاية يسمح بالحصول السريع على البيانات اللازمة لالتقاط المسار الزمني السريع لموجة Ca2+ التي تسببها الجروح. بالنسبة للمجهر الفلوري المستخدم في هذه الدراسة، فإن القيم القصوى لمجال الرؤية والدقة الزمنية هي 3 سم × 3 سم و 30 إطارا في الثانية (FPS)، على التوالي.
  2. إزالة الغطاء ووضع الطبق تحت العدسة الهدف.
  3. تحقق من إشارة الفلورسينس من المصنع ثم انتظر لمدة 30 دقيقة تقريبا في الظلام حتى تتكيف النباتات مع الظروف البيئية الجديدة. هذه الخطوة التكيف مطلوب لأن التغيرات في الرطوبة تثير [Ca2+] ارتفاعسيت في النباتات التي يمكن أن تتداخل مع أي أحداث ذات صلة بالجروح.
  4. ضبط التركيز والتكبير لرؤية المصنع كله في مجال الرؤية. في البروتوكول الحالي، تم استخدام تكبير 0.63x.
  5. قبل البدء في التصوير في الوقت الحقيقي، قم بإعداد معلمات الاستحواذ للكشف عن إشارات الفلورسينس باستخدام برنامج تصوير المجهر. إعدادات التصوير في البروتوكول الحالي هي: التعرض وأوقات الفاصل الزمني المحددة إلى 1.8 ثانية و 2 ثانية (أي 0.5 إطارا في الثانية) على التوالي. تعيين وقت التسجيل إلى 11 دقيقة.
  6. صورة لمدة 5 دقائق قبل بدء التجربة لتأقلم النبات مع تشعيع الضوء الأزرق من المجهر ، ثم بدء التسجيل عن طريق النقر على تشغيل الآن، أو الأمر المكافئ في برنامج المجهر المستخدم. لتحديد متوسط مضان خط الأساس، سجل ما لا يقل عن 10 إطارات (أي 20 s على الأقل في البروتوكول الحالي) قبل الجرح أو تطبيق الغلوتامات (انظر القسم 4).
    1. للتصوير في الوقت الحقيقي من الجرح الناجم [Ca2 +]cyt و [غلو] apo التغييرات، وقطع petiole أو المنطقة الوسطى من ورقة L1 مع مقص (الشكل 3 والشكل 4).
    2. للتصوير في الوقت الحقيقي من الغلوتامات التي أثارها [Ca2 +] تغييراتسيت، وقطع حافة (حوالي 1 ملم من طرف) من ورقة 1 عبر الوريد الرئيسي مع مقص. بعد فترة نقاهة لا تقل عن 20 دقيقة، ضعي 10 ميكرولتر من الغلوتامات 100 م على سطح الورقة المقطوع(الشكل 5).
      ملاحظة: كان هذا القطع المسبق ضروريا للسماح بوصول الغلوتامات إلى النبات المبرمج من أجل تحريك الاستجابات. وبالإضافة إلى ذلك، تم العثور على تطبيق قطرة من الماء المقطر على سطح قطع من ورقة L1 أن تكون حاسمة لمنع العينات من الجفاف أثناء الانتعاش قبل تطبيق الغلوتامات.
  7. بعد الانتهاء من تسجيل 11 دقيقة، حفظ البيانات.

4. تحليل البيانات

  1. لتحليل كثافة الفلورية مع مرور الوقت، حدد منطقة الاهتمام (ROI) في المكان الذي يتم فيه تحليل كثافة الفلورسينس(الشكل 6 والشكل 7). لحساب سرعة موجة Ca2+ ، حدد 2 ROIs (ROI1 و ROI2) للتحليل. في برنامج التصوير، انقر على | قياس الوقت تعريف | دائرة. قياس المسافة بين ROI1 و ROI2 بالنقر على التعليقات التوضيحية والقياس | طول | خط بسيط (الشكل 6).
  2. قياس قيم الفلورسينس الخام (F) في كل عائد استثمار مع مرور الوقت عن طريق النقر على قياس. تصدير البيانات الخام إلى برنامج جدول البيانات لتحويل إشارة مضان إلى أرقام في كل نقطة زمنية عن طريق النقر على الكل إلى Excel | تصدير.
  3. تحديد قيمة الفلورسينس الأساسية، التي تعرف بأنها F0،عن طريق حساب متوسط F على الإطارات العشرة الأولى (أي قبل المعالجة) في البيانات المسجلة.
  4. تطبيع البيانات F (عن طريق حساب ΔF / F) باستخدام المعادلة ΔF / F = (F−F0) / F0، حيث ΔF هو التغير المعتمد على الوقت في الفلورسينس.
  5. بالنسبة لتحليلموجة سرعة الموجة Ca 2+ ، حدد نقطة ارتفاع إشارة كبيرة فوق القيم المحفزة مسبقا على أنها تمثل اكتشاف زيادة Ca2 + في كل عائد استثمار(t1 و t2)باستخدام معيار الارتفاع إلى 2× الانحراف المعياري (2x SD) الذي يتم حسابه من بيانات F0 باستخدام البرامج الإحصائية. 95٪ من بيانات F0 تقع ضمن 2x SD من المتوسط، مما يشير إلى أن ارتفاع الإشارة فوق هذا المستوى عن طريق الصدفة هو ≤5٪. حساب الفرق الزمني للزيادة Ca2 + بين ROI1 و ROI2 [t2- t1 time-lag (Δt)] وقياس المسافة بين ROI1 و ROI2 ، ثم تحديد سرعات أي موجة Ca2 + .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

يتم عرض نشر إشارة [Ca2 +]cyt و [Glu] apo ردا على الجرح في الشكل 3، الشكل 4، فيلم S1، والفيلم S2. قطع petiole من ورقة 1 في النباتات التي تعبر عن GCaMP3 (في 0 ق) أدى إلى زيادة كبيرة في [Ca2 +]cyt التي تم حثها بسرعة محليا من خلال الأوعية الدموية (في 40 ق) (الشكل 3 والفيلم S1). في وقت لاحق، تم نشر إشارة بسرعة إلى الأوراق المجاورة (ورقة 3 و 6) في غضون بضع دقائق (في 80 ق)(الشكل 3 والفيلم S1).

عند قطع ورقة 1 في النباتات التي تعبر عن CHIB-iGluSnFR، لوحظت زيادة سريعة [غلو]آبو في جميع أنحاء منطقة القطع (في 2 ق). تم نشر هذه الإشارة من خلال الأوعية الدموية محليا في غضون دقائق قليلة (في 160 ق) ولكن لم يلاحظ في الأوراق النظامية(الشكل 4 والفيلم S2).

للتصوير في الوقت الحقيقي من Ca2 + نشر إشارة الناجمة عن تطبيق الغلوتامات، تم قطع الحافة (حوالي 1 ملم من طرف) من ورقة 1 في النباتات التي تعبر عن GCaMP3 كما هو مبين في الشكل 5A والفيلم S3. قطع حافة ورقة 1 تسبب المحلية [Ca2 +]زيادة cyt (في 40 ق) ولكن هذه الإشارة اختفت في غضون بضع دقائق (في 124 ق). بعد انتظار ما يقرب من 10 دقيقة للمصنع لاسترداد, 10 μL من 100 mM الغلوتامات تم تطبيقها على سطح قطع ورقة 1, مما تسبب في زيادة سريعة وكبيرة من [Ca2+] سيت محليا (في 56 ق) وانتشارإشارة إلى أوراق البعيدة (في 104 ق) (الشكل 5B والفيلم S4).

لقياس التغيرات في [Ca2 +]cyt الناجمة عن الجرح في ورقة النظامية، تم تعيين اثنين من ROIs (ROI1 و ROI2) في منطقة قاعدة وطرف من ورقة 6 في النباتات التي تعبر عن GCaMP3 كما هو مبين في الشكل 6A. تم قياس تغيير المسار الزمني لكثافة إشارة GCaMP3 في ROI1 و ROI2 عند قطع البتول من ورقة 1 (الشكل 6B). تم الكشف عن زيادة كبيرة في [Ca2 +]cyt في ROI1 في وقت أبكر من ROI2 (الشكل 6B). [Ca2+] بلغت ذروتها في حوالي 100 s cyt بعد الجرح، واستمرت لأكثر من 10 دقيقة، وعرضت مرحلتين(الشكل 6B).

لتحديد سرعات موجة Ca2+ عند الإصابة الميكانيكية، تم تحديد النقطة الزمنية لارتفاع إشارة كبيرة فوق القيم المحفزة مسبقا في ROI1 و ROI2 (الفارق الزمني؛ انظر القسم 4) (الشكل 6C). لأن المسافة بين ROI1 و ROI2 كانت 2.7 مم في هذه الحالة (الشكل 6A)، تم حسابسرعة إشارة Ca 2+ في الورقة 6 على أنها 0.15 مم / ثانية. لقياس التغيرات [غلو]آبو ردا على الضرر الميكانيكي، تم تعيين ROI1 في محيط موقع قطع ورقة ملحوظ كما L1 كما هو مبين في الشكل 7A. [غلو] وقد أظهرت توقيع آبو في ROI1 ذروة واحدة في حوالي 100 ق عند الجرح(الشكل 7B).

Figure 1
الشكل 1: ترقيم أوراق وردية Arabidopsis. يتم ترقيم أوراق Arabidopsis من الأكبر سنا إلى الأصغر (اللوحة اليسرى). يتم الإشارة إلى رسم تخطيطي لموقف الأوراق في اللوحة اليمنى. L: ورقة، C: كوتيلونس. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2:تم تصويرمجهر مضان يستخدم في هذه الدراسة. [Ca2+]cyt و [Glu]apo ديناميات مع مجسم مفلور واسع المجال. R: وحدة تحكم عن بعد، O: عدسة الهدف 1x، C: كاميرا sCMOS، T: أنبوب إمالة Trinocular، S: المرحلة، P: المواد النباتية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3:الجرح الناجم عن المسافات الطويلة Ca 2 + إرسالإشارة. قطع petiole (السهم الأبيض، 0 ق) من ورقة 1 (L1) في النبات التعبير عن GCaMP3 أثار المحلية [Ca2 +]زيادة سيت (السهم الأحمر، 40 ق) التي انتقلت إلى أوراق النظامية [ورقة 3 (L3) وورقة 6 (L6)] (السهام البرتقالية، 80 s). شريط المقياس، 5 مم. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4: الجرح الناجم عن [غلو] ارتفاعآبو. قطع ورقة 1 (L1) (السهم الأبيض، 0 ق) في النباتات التي تعبر عن CHIB-iGluSnFR تسبب ارتفاع سريع من [غلو]آبو (السهم الأحمر، 80 ق) التي انتشرت من خلال الأوعية الدموية (السهم البرتقالي، 160 ق). شريط المقياس، 2 مم. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 5
الشكل 5: الغلوتامات التي أثارها لمسافات طويلة Ca2 + نقل إشارة. (أ) قطع الحافة (حوالي 1 ملم من طرف) من ورقة 1 (L1) في النباتات التي تعبر عن GCaMP3 (السهم الأبيض, 0 ق) تسبب في زيادة [Ca2 +]cyt (السهم الأحمر, 40 ق). (ب)تطبيق الغلوتامات 100 mM على سطح قطع L1 (السهم الأبيض، 0 s) تسبب المحلية [Ca2+]زيادة السيت (السهم الأحمر، 56 ق) التي انتشرت بسرعة إلى أوراق البعيدة [على سبيل المثال، ورقة 3 (L3)، ورقة 4 (L4)، وورقة 6 (L6)] (السهام البرتقالية، 104 ق). أشرطة المقياس، 5 مم. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 6
الشكل 6: [Ca2+] توقيعالسيت في الأوراق النظامية استجابة للجرح الميكانيكي. (A) تظهر صورة موسعة للورقة 6 (L6) في النباتات التي تعبر عن GCaMP3 في الشكل 3. تم تعيين ROI1 (الدائرة الزرقاء) و ROI2 (الدائرة الوردية) في منطقة القاعدة والطرف ، على التوالي. يشير السهم الأبيض إلى موقع القطع من البتيول ورقة 1 (L1). في هذه الحالة، كانت المسافة بين ROI1 و ROI2 2.7 مم (B) كميا [Ca2+] توقيعاتالسيت في ROI1 و ROI2. تم تحليل تغيرات كثافة الفلورسينس باستخدام برامج التصوير. (ج)أثر موسع للبيانات في (ب) بين 0 s و 80 s. تم تعريف نقاط الكشف عن زيادة Ca2+ في ROI1 و ROI2 على أنها t1 و t2، على التوالي ، باستخدام معيار ارتفاع إلى 2x الانحراف المعياري لقيم التحفيز المسبق (2x SD ، خط منقط). تم تعريف قيمة t2 - t1 على أنها الفارق الزمني(Δt)في البروتوكول الحالي. السهم الأسود يشير إلى وقت القطع. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 7
الشكل 7: [غلو]apo التوقيع ردا على الجرح الميكانيكي. (أ) صورة موسعة من ورقة 1 (L1) في النباتات التي تعبر عن CHIB-iGluSnFR يظهر في الشكل 4. تم تعيين ROI1 في المنطقة المجاورة لموقع القطع. يشير السهم الأبيض إلى منطقة القطع. (ب)يتم رصد كمية [Glu]apo التوقيع في ROI1 باستخدام برامج التصوير. السهم الأسود يشير إلى وقت القطع. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

فيلم S1: طويل المسافة Ca2 + انتقال بعد الجرح الميكانيكي. تسبب الجرح الميكانيكي في petiole من ورقة 1 (L1) زيادة [Ca2 +]cyt تنتقل إلى أوراق البعيدة [على سبيل المثال، ورقة 3 (L3) وورقة 6 (L6)]. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الفيلم.

فيلم S2: ارتفاع مستويات الغلوتامات المبرمج استجابة للقطع. تسبب الجرح الميكانيكي للرقة 1 (L1) في زيادة فورية في [غلو]آبو. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الفيلم.

فيلم S3: ارتفاع [Ca2 +]مستوياتcyt ردا على القطع. تسبب الجرح الميكانيكي على حافة ورقة 1 (L1) على الفور، المحلية [Ca2 +] ارتفاعcyt. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الفيلم.

فيلم S4: تطبيق الغلوتامات مشغلات النظامية [Ca2+]يزيدسيت. تطبيق الغلوتامات 100 mM أثار Ca2 + انتقال إلى أوراق الجهازية [على سبيل المثال، ورقة 3 (L3)، ورقة 4 (L4) وورقة 6 (L6)]. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الفيلم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

الإشارات النظامية مهمة للنباتات للاستجابة للمحفزات البيئية الخارجية المحلية ومن ثم الحفاظ على التوازن على مستوى النبات بأكمله. على الرغم من أنها ليست مجهزة جهاز عصبي متقدم مثل الحيوانات، فإنها تستخدم الاتصالات السريعة داخل وبين الأجهزة على حد سواء على أساس عوامل مثل الكهربائية المتنقلة (وربما الهيدروليكية) إشارات وموجات نشر ROS وكا2 + 46،47. يسمح البروتوكول المذكور أعلاه بالتصوير على مستوى النبات في الوقت الفعلي لنشاط نظام الإشارات هذا من خلال مراقبة ديناميكيات Ca2 + والغلوتامات المبرمج استجابة للإصابة. توفر هذه الطريقة أداة قوية لفهم الإشارات السريعة والطويلة المدى في النباتات التي تجمع بين الدقة العالية للفضفضة وسهولة الاستخدام. يوفر هذا البروتوكول أيضا إمكانية توفير رؤى فسيولوجية جديدة في الآليات الجزيئية الكامنة وراء إشارات الجرح لمسافات طويلة ، على سبيل المثال ، باستخدام المسوخ المعيبة في العناصر المفترضة لنظام الإشارات السريعة أو استكشاف آثار الكواشف الدوائية مثل حاصرات قنوات Ca2 + (على سبيل المثال ، LaCl3)أو مثبطات أنشطة الإشارات الرئيسية الأخرىالمحتملة 6.

إحدى المزايا الهامة لطريقة التصوير بالمساء الحيوي الموصوفة هي استخدام أجهزة الاستشعار الحيوية أحادية FP ذات العائد الفلوري العالي ، مما يبسط بشكل كبير كل من المعدات المطلوبة لإجراء هذه القياسات واستخدامها في بلانتا. وهكذا، تنقسم المؤشرات المشفرة وراثيا المستندة إلى الفلورسينس إلى فئتين: 1) أجهزة الاستشعار البيولوجية أحادية FP القائمة على الكثافة و2) أجهزة الاستشعار الحيوية المستندة إلى FRET10. على الرغم من أن أجهزة الاستشعار المستندة إلى FRET النسبة دقيقة كميا ، فإن مؤشرات Ca2 + المستندة إلى الكثافة ، بما في ذلك GCaMP3 و iGluSnFR المستخدمة هنا ، توفر دقة زمنية أعلى وسهولة استخدام بسبب إشارة Ca2 +-responsive الأكثر إشراقا ومتطلبات المجهر الأبسط10. على سبيل المثال، تم الإبلاغ عن مؤشر R-GECO1 القائم على البروتين الأحمر الفلوري أحادي FP Ca2+ لإظهار تغيير إشارة أكبر بكثير استجابة لATP خارج الخلية ومحفزات الدفاع النباتي flg22 والتشيتين، بالمقارنة مع نسبة YC3.6 الاستشعار الحيوي27. لتحليل أجهزة الاستشعار المستندة إلى FRET، من الضروري أيضا استخدام مجهر متخصص مع مرشحات متعددة لجمع البيانات على طولين موجيين، في حين تتطلب أجهزة الاستشعار الحيوية أحادية FP الجهاز لجمع البيانات في طول موجي واحد فقط، وهي قدرة موجودة في جميع المجاهر الفلورية القياسية10. ومع ذلك، من المهم ملاحظة أن هناك بعض العيوب من استخدام أجهزة الاستشعار الحيوية FP واحد. لا يفضل استخدام هذه الواجهات الحيوية ذات الكثافة الأحادية FP لتحديد تغيرات التركيز المطلقة أو التصوير طويل الأجل على مدى ساعات أو أيام عديدة. هذا القيد لأنه بالإضافة إلى، على سبيل المثال، مستوى Ca2+ ل GCaMP3، يعتقد أن كثافة الإشارة من هذه أجهزة الاستشعار الحيوية أحادية FP تتأثر بعوامل أخرى مثل مستوى تعبير المستشعر أو المعلمات مثل الرقم الحموضة الخلوي الذي قد يتغير بمرور الوقت.

وحتى الآن، تم تصميم العديد من المتغيرات الجديدة لهذه المؤشرات المشفرة وراثيا لتحسين نسبة الإشارة إلى الضوضاء، والنطاق الديناميكي، والحركية، واستقرار أجهزة الاستشعار. على سبيل المثال، بعد أن طور ناكاي وآخرون26 أول GCaMP، تم إنشاء مختلف المتغيرات المتعاقبة، مثل GECOs من خلال مزيج من تكوين الطفرات والتوصيف الدقيق48و49و50. وقد أبلغ عن أن النطاق الدينامي ل G-GECO (Green-GECO) أكبر بنحو ضعفين من النطاق الذي يبلغ GCaMP328. وعلاوة على ذلك، أدى استبدال البروتينات الفلورية المختلفة في هذه المؤشرات إلى توليد متغيرات GECO مع أطياف انبعاثات مختلفة، مثل B-GECO (Blue-GECO) وR-GECO (Red-GECO)، مما يتيح استخدام هذه المؤشرات جنبا إلى جنب مع المتغيرات الطيفية الأخرى GFP في تطبيقات التصوير متعددة الألوان28. وبالمثل، واصلت GCaMP لتطوير وتحسين مع سلسلة من أجهزة الاستشعار تعزيز لسرعة الاستجابة وسعة إشارة متاحة الآن50. لرصد ديناميات الغلوتامات، بخلاف iGluSnFR، سلسلة من أجهزة الاستشعار الحيوية الغلوتامات FRET القائم، وقد وضعت البروتينات مؤشر FLuorescent للغلوتامات (FLIPE)40. FLIPE يتكون من CFP و YFP التي ترتبط عن طريق بروتين الجلوتامات ملزمة ybeJ مأخوذة من القولونية E.. عند ربط الغلوتامات إلى ybeJ ، لوحظ انخفاض يعتمد على تركيز الغلوتامات في كفاءة FRET. لذلك ، لكل من Ca2 + والغلوتامات هناك العديد من أجهزة الاستشعار أحادية FP ونسبة القياس المتاحة. يجب على الباحثين النظر في جهاز الاستشعار الحيوي المناسب للكشف عن ديناميكيات الإشارة اعتمادا على التصميم التجريبي ومتطلبات عوامل القياس مثل الإشارة العالية: الضوضاء (أجهزة استشعار FP أحادية) مقابل الحاجة إلى كمية دقيقة للغاية (حيث تتفوق مستشعرات FRET).

يجب أن تكون طريقة التصوير واسعة المجال والفردية FP الموصوفة هنا للجرح مفيدة أيضا عند تطبيقها على عمليات الإشارات الجهازية الإجهادية الأخرى. على الرغم من وجود العديد من التقارير التي تشير إلى دور حاسم لمسافات طويلة Ca2 + الإشارات في استجابات الإجهاد المختلفة، مثل هجوم عشبي6،51،52، الملح20، والجفاف53، إلا أن عددا قليلا من الدراسات قدمت معلومات عن المسافات الطويلة السريعة Ca2 + الإشارات الناجمة عن هذه الاستجابات الإجهاد6،7،20،52. استخدام المجهر الفلوري واسعة المجال في هذا البروتوكول يسمح أيضا المراقبة في الوقت الحقيقي من ديناميات إشارة المحمول ليس فقط في الاتصالات من ورقة إلى ورقة ولكن أيضا من الجذر إلى تبادل لاطلاق النار الاتصالات كما هو مبين مؤخرا38. على الرغم من أننا ركزنا على بروتوكولات ل Arabidopsis، فإن طريقة التصوير في الوقت الحقيقي على نطاق النبات توفر أيضا أداة قوية لفهم الخصائص المكانية والزمنية للإشارات النظامية Ca2 + في استجابات الإجهاد الحيوي والأبايوتي في الأنواع النباتية الأخرى مثل التبغ30.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ولا يوجد لدى أصحاب البلاغ أي تضارب في المصالح.

Acknowledgments

وقد دعم هذا العمل بمنح من الجمعية اليابانية لتعزيز العلوم (17H05007 و 18H05491) إلى MT والمؤسسة الوطنية للعلوم (IOS1557899 وMCB2016177) والإدارة الوطنية للملاحة الجوية والفضاء (NNX14AT25G و 80NSSC19K0126) إلى SG.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Arabidopsis expressing GCaMP3 Saitama University
Arabidopsis expressing CHIB-iGluSnFR Saitama University
GraphPad Prism 7 GraphPad Software
L-Glutamate FUJIFILM Wako 072-00501 Dissolved in a liquid growth medium [1/2x MS salts, 1% (w/v) sucrose, and 0.05% (w/v) MES; pH 5.1 adjusted with 1N KOH].
Microsoft Excel Microsoft Corporation
Murashige and Skoog (MS) medium FUJIFILM Wako 392-00591 composition: 1x MS salts, 1% (w/v) sucrose, 0.01% (w/v) myoinositol, 0.05% (w/v) MES, and 0.5% (w/v) gellan gum; pH 5.7 adjusted with 1N KOH.
Nikon SMZ25 stereomicroscope Nikon
NIS-Elements AR analysis Nikon
1x objective lens (P2-SHR PLAN APO) Nikon
sCMOS camera (ORCA-Flash4.0 V2) Hamamatsu Photonics C11440-22CU
Square plastic Petri dish Simport D210-16

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wu, J., Baldwin, I. T. Herbivory-induced signalling in plants: perception and action. Plant, Cell & Environment. 32 (9), 1161-1174 (2009).
  2. Howe, G. A., Major, I. T., Koo, A. J. Modularity in Jasmonate Signaling for Multistress Resilience. Annual Review of Plant Biology. 69 (1), 387-415 (2018).
  3. Mousavi, S. A. R., Chauvin, A., Pascaud, F., Kellenberger, S., Farmer, E. E. GLUTAMATE RECEPTOR-LIKE genes mediate leaf-to-leaf wound signalling. Nature. 500 (7463), 422-426 (2013).
  4. Gilroy, S., et al. Electric Signals: Key Mediators of Rapid Systemic Signaling in Plants. Plant Physiology. 171 (3), 1606-1615 (2016).
  5. Choi, W. -G., Hilleary, R., Swanson, S. J., Kim, S. -H., Gilroy, S. Rapid, long-distance electrical and calcium signaling in plants. Annual Review of Plant Biology. 67 (1), 287-307 (2016).
  6. Toyota, M., et al. Glutamate triggers long-distance, calcium-based plant defense signaling. Science. 361 (6407), 1112-1115 (2018).
  7. Nguyen, C. T., Kurenda, A., Stolz, S., Chételat, A., Farmer, E. E. Identification of cell populations necessary for leaf-to-leaf electrical signaling in a wounded plant. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (40), 10178-10183 (2018).
  8. Lecourieux, D., Ranjeva, R., Pugin, A. Calcium in plant defence-signalling pathways. New Phytologist. 171 (2), 249-269 (2006).
  9. Farmer, E. E., Gao, Y. -Q., Lenzoni, G., Wolfender, J. -L., Wu, Q. Wound- and mechanostimulated electrical signals control hormone responses. New Phytologist. 227 (4), 1037-1050 (2020).
  10. Palmer, A. E., Qin, Y., Park, J. G., McCombs, J. E. Design and application of genetically encoded biosensors. Trends in Biotechnology. 29 (3), 144-152 (2011).
  11. Ridgway, E. B., Ashley, C. C. Calcium transients in single muscle fibers. Biochemical and Biophysical Research Communications. 29 (2), 229-234 (1967).
  12. Kiegle, E., Moore, C. A., Haseloff, J., Tester, M. A., Knight, M. R. Cell-type-specific calcium responses to drought, salt and cold in the Arabidopsis root. The Plant Journal. 23 (2), 267-278 (2000).
  13. Zhu, X., Feng, Y., Liang, G., Liu, N., Zhu, J. -K. Aequorin-based luminescence imaging reveals stimulus- and tissue-specific Ca2+ dynamics in Arabidopsis plants. Molecular Plant. 6 (2), 444-455 (2013).
  14. Kwaaitaal, M., Huisman, R., Maintz, J., Reinstädler, A., Panstruga, R. Ionotropic glutamate receptor (iGluR)-like channels mediate MAMP-induced calcium influx in Arabidopsis thaliana. Biochemical Journal. 440 (3), 355-373 (2011).
  15. Vatsa, P., et al. Involvement of putative glutamate receptors in plant defence signaling and NO production. Biochimie. 93 (12), 2095-2101 (2011).
  16. Toyota, M., Furuichi, T., Sokabe, M., Tatsumi, H. Analyses of a gravistimulation-specific Ca2+ signature in Arabidopsis using parabolic flights. Plant Physiology. 163 (2), 543-554 (2013).
  17. Toyota, M. Hypergravity stimulation induces changes in intracellular calcium concentration in Arabidopsis seedlings. Advances in Space Research. 39, 1190-1197 (2007).
  18. Stephan, A. B., Kunz, H. -H., Yang, E., Schroeder, J. I. Rapid hyperosmotic-induced Ca2+ responses in Arabidopsis thaliana exhibit sensory potentiation and involvement of plastidial KEA transporters. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (35), 5242-5249 (2016).
  19. Nagai, T., Yamada, S., Tominaga, T., Ichikawa, M., Miyawaki, A. Expanded dynamic range of fluorescent indicators for Ca2+ by circularly permuted yellow fluorescent proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (29), 10554-10559 (2004).
  20. Choi, W. -G., Toyota, M., Kim, S. -H., Hilleary, R., Gilroy, S. Salt stress-induced Ca2+ waves are associated with rapid, long-distance root-to-shoot signaling in plants. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (17), 6497-6502 (2014).
  21. Evans, M. J., Choi, W. -G., Gilroy, S., Morris, R. J. A ROS-assisted calcium wave dependent on the AtRBOHD NADPH oxidase and TPC1 cation channel propagates the systemic response to salt stress. Plant Physiology. 171 (3), 1771-1784 (2016).
  22. Hilleary, R., et al. Tonoplast-localized Ca2+ pumps regulate Ca2+ signals during pattern-triggered immunity in Arabidopsis thaliana. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (31), 18849-18857 (2020).
  23. Lenglet, A., et al. Control of basal jasmonate signalling and defence through modulation of intracellular cation flux capacity. New Phytologist. 216 (4), 1161-1169 (2017).
  24. Choi, W. -G., Swanson, S. J., Gilroy, S. High-resolution imaging of Ca2+, redox status, ROS and pH using GFP biosensors. The Plant Journal. 70 (1), 118-128 (2012).
  25. Nagai, T., Sawano, A., Park, E. S., Miyawaki, A. Circularly permuted green fluorescent proteins engineered to sense Ca2. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (6), 3197-3202 (2001).
  26. Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. A high signal-to-noise Ca2+ probe composed of a single green fluorescent protein. Nature Biotechnology. 19 (2), 137-141 (2001).
  27. Keinath, N. F., et al. Live cell imaging with R-GECO1 sheds light on flg22- and Chitin-induced transient [Ca2+]cyt patterns in Arabidopsis. Molecular Plant. 8 (8), 1188-1200 (2015).
  28. Zhao, Y., et al. An expanded palette of genetically encoded Ca2+ indicators. Science. 333 (6051), 1888-1891 (2011).
  29. Vincent, T. R., et al. Real-time in vivo recording of Arabidopsis calcium signals during insect feeding using a fluorescent biosensor. JoVE. (126), e56142 (2017).
  30. DeFalco, T. A., et al. Using GCaMP3 to study Ca2+ signaling in nicotiana species. Plant and Cell Physiology. 58 (7), 1173-1184 (2017).
  31. Michard, E., et al. Glutamate receptor-like genes form Ca2+ channels in pollen tubes and are regulated by Pistil D-Serine. Science. 332 (6028), 434-437 (2011).
  32. Singh, S. K., Chien, C. -T., Chang, I. -F. The Arabidopsis glutamate receptor-like gene GLR3.6 controls root development by repressing the Kip-related protein gene KRP4. Journal of Experimental Botany. 67 (6), 1853-1869 (2016).
  33. Li, H., et al. Tomato GLR3.3 and GLR3.5 mediate cold acclimation-induced chilling tolerance by regulating apoplastic H2O2 production and redox homeostasis. Plant, Cell & Environment. 42 (12), 3326-3339 (2019).
  34. Li, F., et al. Glutamate receptor-like channel3.3 is involved in mediating glutathione-triggered cytosolic calcium transients, transcriptional changes, and innate immunity responses in Arabidopsis. Plant Physiology. 162 (3), 1497-1509 (2013).
  35. Wudick, M. M., Michard, E., Oliveira Nunes, C., Feijó, J. A. Comparing plant and animal glutamate receptors: common traits but different fates. Journal of Experimental Botany. 69 (17), 4151-4163 (2018).
  36. De Bortoli, S., Teardo, E., Szabò, I., Morosinotto, T., Alboresi, A. Evolutionary insight into the ionotropic glutamate receptor superfamily of photosynthetic organisms. Biophysical Chemistry. 218, 14-26 (2016).
  37. Janovjak, H., Sandoz, G., Isacoff, E. Y. A modern ionotropic glutamate receptor with a K+ selectivity signature sequence. Nature Communications. 2 (1), 232 (2011).
  38. Shao, Q., Gao, Q., Lhamo, D., Zhang, H., Luan, S. Two glutamate- and pH-regulated Ca2+ channels are required for systemic wound signaling in Arabidopsis. Science Signaling. 13 (640), (2020).
  39. Forde, B. G., Lea, P. J. Glutamate in plants: metabolism, regulation, and signalling. Journal of Experimental Botany. 58 (9), 2339-2358 (2007).
  40. Okumoto, S., et al. Detection of glutamate release from neurons by genetically encoded surface-displayed FRET nanosensors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (24), 8740-8745 (2005).
  41. Hires, S. A., Zhu, Y., Tsien, R. Y. Optical measurement of synaptic glutamate spillover and reuptake by linker optimized glutamate-sensitive fluorescent reporters. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (11), 4411-4416 (2008).
  42. Marvin, J. S., et al. An optimized fluorescent probe for visualizing glutamate neurotransmission. Nature Methods. 10 (2), 162-170 (2013).
  43. Marvin, J. S., et al. Stability, affinity, and chromatic variants of the glutamate sensor iGluSnFR. Nature Methods. 15 (11), 936-939 (2018).
  44. Farmer, E., Mousavi, S. A. R., Lenglet, A. Leaf numbering for experiments on long distance signalling in Arabidopsis. Protocol Exchange: Preprint server. , (2013).
  45. Harada, A., Shimazaki, K. -i Phototropins and blue light-dependent calcium signaling in higher plants. Photochemistry and Photobiology. 83 (1), 102-111 (2007).
  46. Huber, A. E., Bauerle, T. L. Long-distance plant signaling pathways in response to multiple stressors: the gap in knowledge. Journal of Experimental Botany. 67 (7), 2063-2079 (2016).
  47. Choi, W. -G., et al. Orchestrating rapid long-distance signaling in plants with Ca2+, ROS and electrical signals. The Plant Journal. 90 (4), 698-707 (2017).
  48. Tallini, Y. N., et al. Imaging cellular signals in the heart in vivo: cardiac expression of the high-signal Ca2+ indicator GCaMP2. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (12), 4753-4758 (2006).
  49. Tian, L., et al. Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators. Nature Methods. 6 (12), 875-881 (2009).
  50. Chen, T. -W., et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).
  51. Vincent, T. R., et al. Interplay of plasma membrane and vacuolar ion channels, together with BAK1, elicits rapid cytosolic calcium elevations in Arabidopsis during aphid feeding. The Plant Cell. 29 (6), 1460-1479 (2017).
  52. Meena, M. K., et al. The Ca2+ channel CNGC19 regulates Arabidopsis defense against spodoptera herbivory. The Plant Cell. 31 (7), 1539-1562 (2019).
  53. Cheong, Y. H., et al. CBL1, a calcium sensor that differentially regulates salt, drought, and cold responses in arabidopsis. The Plant Cell. 15 (8), 1833-1845 (2003).

Tags

علم الأحياء، العدد 172، الكالسيوم، GCaMP3، أجهزة الاستشعار الحيوية الفلورية المشفرة وراثيا، الغلوتامات، iGluSnFR، إشارة لمسافات طويلة، جرح
تصوير واسع المجال وفي الوقت الحقيقي للإشارات الجرح المحلية والجهازية في <em>Arabidopsis</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Uemura, T., Wang, J., Aratani, Y.,… More

Uemura, T., Wang, J., Aratani, Y., Gilroy, S., Toyota, M. Wide-Field, Real-Time Imaging of Local and Systemic Wound Signals in Arabidopsis. J. Vis. Exp. (172), e62114, doi:10.3791/62114 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter