שדה רחב, הדמיה בזמן אמת של אותות פצע מקומיים ומערכתיים ב Arabidopsis

Summary

איתות סידן מערכתי המופעל על ידי גלוטמט חוץ-תאי הוא קריטי לגיוס תגובות הגנת הצמח לפצעים מכניים ולתקפת אוכלי עשב בצמחים. מאמר זה מתאר שיטה לדמיין את הדינמיקה המרחבית והטמפורלית של שני גורמים אלה באמצעות צמחי תאליאנה ערבידופסיס המבטאים ביוסנסורים פלואורסצנטיים רגישים לסידן וגלוטמט.

Abstract

צמחים מגיבים ללחצים מכניים כגון פצעים ואוכלי עשב על ידי גרימת תגובות הגנה הן בחלקים הפגועים והן בחלקים הלא פגומים. עם פציעת עלה, מתרחשת עלייה בריכוז יון הסידן הציטוזולי (Ca²⁺ אות) באתר הפצע. אות זה מועבר במהירות לעלים לא פגומים, שם מופעלות תגובות ההגנה. המחקר האחרון שלנו גילה כי גלוטמט דולף מהתאים הפצועים של העלה לתוך apoplast סביבם משמש אות פצע. גלוטמט זה מפעיל ערוצים חדירים דמויי קולטן גלוטמט Ca²⁺ , מה שמוביל להפצת אותות Ca²⁺ למרחקים ארוכים ברחבי הצמח. המאפיינים המרחביים והטמפורליים של אירועים אלה ניתן ללכוד עם הדמיה בזמן אמת של צמחים חיים המבטאים biosensors פלואורסצנטי מקודד גנטית. כאן אנו מציגים שיטת הדמיה כלל-צמחית בזמן אמת כדי לנטר את הדינמיקה של אותות Ca²⁺ ושינויים בגלוטמט אפופלסטי המתרחשים בתגובה לפציעה. גישה זו משתמשת במיקרוסקופ פלואורסצנטי רחב שדה ובצמחי Arabidopsis מהונדסים המבטאים חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) המבוסס על Ca²⁺ וביו-סנסורים גלוטמטים. בנוסף, אנו מציגים מתודולוגיה כדי לעורר בקלות פצע-induced, גלוטמט מופעלות מהירות למרחקים ארוכים Ca^{2 +} התפשטות אות. פרוטוקול זה יכול להיות מיושם גם על מחקרים על לחצים צמחיים אחרים כדי לעזור לחקור כיצד איתות מערכתי צמח עשוי להיות מעורב ברשתות האיתות והתגובה שלהם.

Introduction

צמחים אינם יכולים לברוח מלחצים ביוטיים, למשל, חרקים הניזונים מהם, ולכן הם פיתחו חישת מתח מתוחכמת ומערכות העברת אותות כדי לזהות ואז להגן על עצמם מפני אתגרים כגון אוכלי עשב¹. עם פציעה או התקפת אוכלי עשב, צמחים ליזום תגובות הגנה מהירה כולל הצטברות של חומצה ג'אסמונית phytohormone (JA) לא רק באתר הפצוע, אלא גם באיברים דיסטליים ניזוק². JA זה אז הן מפעילה תגובות הגנה ברקמות שנפגעו ישירות וגורם מראש הגנות בחלקים ניזוקו של הצמח. ב Arabidopsis, הצטברות של JA הנגרמת על ידי פציעה זוהתה עלים דיסטליים, שלמים בתוך דקות ספורות של נזק במקומות אחרים במפעל מציע כי אות מהיר למרחקים ארוכים מועבר מן העלה הפצוע³. מספר מועמדים, כגון Ca^{2 +}, מינים חמצן תגובתי (ROS), ואותות חשמליים, הוצעו לשמש אותם פצע למרחקים ארוכים אלה בצמחים^4,5.

Ca²⁺ הוא אחד האלמנטים המגוונים ביותר בכל מקום שליח שני באורגניזמים אוקריוטיים. בצמחים, לעיסת זחל ופציעה מכנית גורמים לעלייה דרסטית בריכוז ציטוזולי Ca²⁺ ([Ca²⁺]_ציט)הן בעל הפצוע והן בעלים מרוחקים לא מבוססים^6,7. אות Ca²⁺ מערכתי זה מתקבל על ידי חלבונים תאיים Ca²⁺חישה, אשר מובילים להפעלת מסלולי איתות הגנה במורד הזרם, כולל JA biosynthesis^8,9. למרות דיווחים רבים כאלה התומכים בחשיבות של Ca^{2 +} אותות בתגובות פצע הצמח, מידע על המאפיינים המרחביים והטמפורליים של Ca^{2 +} אותות הנגרמים על ידי פציעה מוגבל.

הדמיה בזמן אמת באמצעות מחווני Ca²⁺ מקודדים גנטית היא כלי רב עוצמה לניטור וכימות הדינמיקה המרחבית והטמפורלית של אותות Ca²⁺ . עד כה פותחו גרסאות של חיישנים כאלה המאפשרות הדמיה של אותות Ca²⁺ ברמה של תא יחיד, לרקמות, איברים ואפילו צמחים שלמים¹⁰. הביוסנסור הראשון המקודד גנטית עבור Ca²⁺ המשמש בצמחים היה אקוורין החלבון הביולומינסנטי המופק ממדוזה Aequorea victoria¹¹. למרות חלבון chemiluminescent זה שימש כדי לזהות Ca^{2 +} שינויים בתגובה לחצים שונים בצמחים^{12,13,14,15,16,17,18}, זה לא מתאים היטב עבור הדמיה בזמן אמת בשל אות זוהר נמוך מאוד שהיא מייצרת. Förster תהודה העברת אנרגיה (FRET)מבוסס Ca^{2 +} אינדיקטורים, כגון הגמלים הצהובים, שימשו גם בהצלחה כדי לחקור את הדינמיקה של מגוון של Ca^{2 +} אירועי איתות במפעלים^{19,20,21,22,23,24}. חיישנים אלה תואמים לגישות הדמיה ובדרך כלל מורכבים מ- Ca^{2 +} חלבון מחייב calmodulin (CaM) ופפטיד מחייב CaM (M13) מתוך קינאז שרשרת אור מיוסין, כל התמזגו בין שני חלבוני פלואורופור, בדרך כלל חלבון פלואורסצנטי ציאן (CFP) וגרסה חלבון פלואורסצנטי צהוב (YFP)¹⁰. Ca²⁺ מחייב CaM מקדם את האינטראקציה בין CaM ו M13 המוביל לשינוי קונפורמציה של החיישן. שינוי זה מקדם העברת אנרגיה בין CFP ו- YFP, אשר מגביר את עוצמת הפלואורסצנטיות של YFP תוך הפחתת פליטת הפלואורסצנטיות מן CFP. ניטור מעבר זה מ- CFP לפלואורסצנטיות YFP מספק מדד לעלייה ברמת Ca²⁺ . בנוסף לחיישני FRET אלה, חלבון פלואורסצנטי יחיד (FP)מבוסס Ca²⁺ biosensors, כגון GCaMP ו- R-GECO, תואמים גם הם לגישות הדמיה צמחית ומשמשים באופן נרחב לחקר [Ca²⁺] שינויים_בציט בשל הרגישות הגבוהה שלהם וקלות השימוש^{25,26,27,28,29,30}. GCaMPs מכילים GFP יחיד שעבר מוטציה מעגלית (cp), שוב התמזגו עם CaM ופפטיד M13. האינטראקציה התלויה ב- Ca²⁺בין CaM ל- M13 גורמת לשינוי קונפורמי בחיישן המקדם שינוי במצב הפרוטונציה של cpGFP, ומשפר את אות הפלואורסצנטי שלו. לכן, כמו Ca^{2 +} רמות עלייה, אות cpGFP עולה.

כדי לחקור את הדינמיקה של Ca^{2 +} אותות שנוצרו בתגובה לפצעים מכניים או האכלת אוכלי עשב, השתמשנו בצמחי תלתנא ערבידופסיס מהונדסים המבטאים גרסה GCaMP, GCaMP3, ומיקרוסקופ פלואורסצנטי שדה רחב⁶. גישה זו הצליחה לדמיין העברה מהירה של אות Ca²⁺ למרחקים ארוכים מאתר הפצע על עלה לצמח כולו. לכן, עלייה [Ca²⁺]_ציט זוהה מיד באתר הפצע אבל זה Ca^{2 +} אות הופץ אז לעלים השכנים דרך כלי הדם בתוך כמה דקות של פציעה. יתר על כן, מצאנו כי העברת אות הפצע המערכתי המהיר הזה מבוטלת בצמחי Arabidopsis עם מוטציות בשני גנים דמויי קולטן גלוטמט, קולטן גלוטמט כמו (GLR), GLR3.3, ו GLR3.6⁶. GLRs מופיעים לתפקד כמו חומצת אמינו מגודר Ca^{2 +} ערוצי מעורבים בתהליכים פיזיולוגיים מגוונים, כולל תגובת פצע³, צמיחת צינור אבקה³¹, פיתוח שורש³², תגובה קרה³³, וחסינות מולדת³⁴. למרות פונקציה פיזיולוגית רחבה ומובנה זו של GLRs, מידע על המאפיינים הפונקציונליים שלהם, כגון הספציפיות שלהם ליגנד, סלקטיביות היונים, לוקליזציה תת תאית, מוגבלים³⁵. עם זאת, מחקרים אחרונים דיווחו כי GLR3.3 ו GLR3.6 הם מקומיים פלום ו xylem, בהתאמה. ל- GLRs של צמחים יש קווי דמיון לקולטני גלוטמט יונוטרופיים (iGluRs)³⁶ ביונקים, המופעלים על ידי חומצות אמינו, כגון גלוטמט, גליצין ו- D-serine במערכת העצבים של היונקים³⁷. אכן, הוכחנו כי היישום של גלוטמט 100 מ"מ, אבל לא חומצות אמינו אחרות, באתר הפצע גורם מהיר, למרחקים ארוכים Ca^{2 +} אות Arabidopsis, המציין כי גלוטמט חוץ תאיים סביר פועל כאות פצע בצמחים⁶. תגובה זו מבוטלת glr3.3/glr3.6 מוטנט מציע כי גלוטמט עשוי לפעול דרך אחד או שניהם של ערוצים אלה דמויי קולטן ואכן, AtGLR3.6 הוכח לאחרונה להיות מגודר על ידי רמות אלה של גלוטמט³⁸.

בצמחים, בנוסף לתפקידו כחומצת אמינו מבנית, גלוטמט הוצע גם כרגולטור התפתחותי מרכזי³⁹; עם זאת, הדינמיקה המרחבית והטמפורלית שלו מובנת היטב. בדיוק כמו Ca^{2 +}, מספר אינדיקטורים מקודדים גנטית גלוטמט פותחו כדי לפקח על הדינמיקה של חומצת אמינו זו בתאים^{חיים 40,41}. iGluSnFR הוא ביו-סנסור גלוטמט יחיד מבוסס GFP המורכב מ- cpGFP וחלבון מחייב גלוטמט (GltI) מ Escherichia coli^42,43. השינוי הקונפורמי של iGluSnFR, המושרה על ידי גלוטמט מחייב GltI, תוצאות פליטת פלואורסצנטיות GFP משופרת. כדי לחקור אם גלוטמט חוץ-תאי פועל כמולקולה איתות בתגובת פצע הצמח, חיברנו את רצף iGluSnFR עם רצף הפרשת פפטיד אות chitinase בסיסי (CHIB-iGluSnFR) כדי להתאים את biosensor זה בחלל האפופלסטיק⁶. גישה זו אפשרה הדמיה של כל שינוי בריכוז הגלוטמט האפופלוסי ([Glu]_apo) באמצעות צמחי Arabidopsis מהונדסים המבטאים חיישן זה. גילינו עליות מהירות באות iGluSnFR באתר הפציעה. נתונים אלה תומכים ברעיון כי גלוטמט דולף מתוך התאים הפגועים / רקמות כדי apoplast על הפציעה ופועל כאות נזק הפעלת GLRs ומוביל למרחקים ארוכים Ca^{2 +} אות בצמחים⁶.

כאן, אנו מתארים שיטת הדמיה כלל-צמחית בזמן אמת באמצעות biosensors מקודדים גנטית כדי לפקח ולנתח את הדינמיקה של Ca²⁺ למרחקים ארוכים אותות גלוטמט חוץ תאיים בתגובה לפציעה⁶. הזמינות של מיקרוסקופיה פלואורסצנטית רחבת שדה וצמחים מהונדסים המבטאים ביו-סנסורים מקודדים גנטית מספקת גישה רבת עוצמה אך מיושמת בקלות לזיהוי אותות למרחקים ארוכים המועברים במהירות, כגון גלי Ca²⁺ .

Protocol

1. הכנת חומר צמחי

1. במיקרו-צינורית של 1.5 מ"ל, פני השטח מעקרים את הזרעים של הצמח Arabidopsis thaliana (הצטרפות קול-0) המבטאים GCaMP3 או CHIB-iGluSnFR על ידי טלטול עם 20% (v /v) NaClO במשך 3 דקות ולאחר מכן לשטוף 5 פעמים עם מים מזוקקים סטריליים.
   הערה: הקווים המהונדסים של Arabidopsis המבטא GCaMP3 או CHIB-iGluSnFR תוארו בעבר⁶.
2. במכסה המנוע סטרילי, לזרוע 13 משטח מעוקר זרעים על צלחת פטרי פלסטיק 10 ס"מ מרובע מלא 30 מ"ל סטרילי (autoclaved) Murashige ו Skoog (MS) בינוני [1x MS מלחים, 1% (w/v) סוכרוז, 0.01% (w/v) מיונוציטול, 0.05% (w/v) MES ו-0.5% (w/v) מסטיק גלן; pH 5.7 מותאם עם 1N KOH]. החלף את המכסה ולעטוף עם קלטת כירורגית.
3. לאחר הדגירה בחושך ב 4 מעלות צלזיוס במשך 2 ימים, למקם את הצלחות אופקית ב 22 מעלות צלזיוס בתא צמיחה תחת אור רציף (90-100 מיקרומול m^-2 s^-1) במשך כ 2 שבועות לפני השימוש. לאחר שבועיים, לספור את מספר העלים Arabidopsis מן הבכור לצעיר⁴⁴ (איור 1). תגובות הפצע מעדיפות לעבור מהעלה הפגום (n) לעלים ממוספרים n ± 3 ו- n ± 5⁶.
   הערה: בפרוטוקול זה, צלחת פטרי תיפתח להדמיית הפצע ואפקטי גלוטמט תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי. לכן, השלבים הבאים בניסוי זה צריכים להתבצע בתנאי חדר מבוקר טמפרטורה ולחות. הסיבה לכך היא כי Ca^{2 +} אותות הם גם עוררו על ידי שינויים בתנאים סביבתיים אלה. ידוע גם כי האור הכחול, הנפלט מהמיקרוסקופ במהלך ההקלטה לצורך עירור הפלואורסצנטיות של חלבון הביוסנסור, עשוי לגרום לעלייה של ריכוז Ca²⁺ ציטוזולי⁴⁵ ולכן יש להסתגל להקרנת האור הכחול במשך מספר דקות לפני תחילת הניסוי.

2. הכנה כימית

1. המסת L-גלוטמט במדיום צמיחה נוזלי [1/2x MS מלחים, 1% (w / v) סוכרוז ו 0.05% (w / v) MES; pH 5.1 מותאם עם 1N KOH] כדי להפוך פתרון עבודה 100 מ"מ.
   הערה: יש להימנע משימוש במלחי גלוטמט כגון נתרן גלוטמט למניעת השפעות אפשריות הקשורות לקטיון על הדינמיקה של Ca²⁺ .

3. הגדרת מיקרוסקופ וביצוע הדמיה בזמן אמת

1. הפעל את סטריאומיקרוסקופ הפלואורסצנטי הממונע המצויד בעדשה אובייקטיבית 1x (NA = 0.156) ומצלמת sCMOS (איור 2)וקבע את תצורת הגדרות ההתקן להקרין עם אור עירור של 470/40 ננומטר ולרכוש אור פליטה העובר דרך מסנן 535/50 ננומטר.
   הערה: כל מיקרוסקופ פלואורסצנטי רגיש ל- GFP יכול לשמש לגילוי אותות GCaMP3 ו- iGluSnFR בזמן אמת, אך עדשה אובייקטיבית בהספק נמוך ומצלמה רגישה מאוד עם שבב SCMOS רחב מומלץ לרכוש אותות מהמפעל כולו. מטרת ההספק הנמוך מאפשרת הדמיה של תגובת מפעל ערבידופסיס שלם ושימוש במצלמה רגישה ביותר מאפשר רכישת נתונים מהירה הדרושה כדי ללכוד את מהלך הזמן המהיר של גל Ca²⁺ המופעל על ידי פצעים. עבור מיקרוסקופ הפלואורסצנטי המשמש במחקר זה, הערכים המרביים של שדה הראייה והרזולוציה הזמנית הם 3 ס"מ x 3 ס"מ ו- 30 מסגרות לשנייה (fps), בהתאמה.
2. מוציאים את המכסה ומניחים את המנה מתחת לעדשה האובייקטיבית.
3. בדוק את אות הפלואורסצנטיות מהצמח ולאחר מכן המתן כ-30 דקות בחושך עד שהצמחים יתאימו את עצמם לתנאים הסביבתיים החדשים. שלב הסתגלות זה נדרש מכיוון ששינויים בלחות מעוררים [Ca²⁺] העלאת_ציט בצמחים שעלולים להפריע לכל אירוע הקשור לפצע.
4. התאם את המיקוד וההגדלה כדי לראות את הצמח כולו בשדה הראייה. בפרוטוקול הנוכחי, נעשה שימוש בהגדלה של 0.63x.
5. לפני שתתחיל בהדמיה בזמן אמת, הגדר את פרמטרי הרכישה כדי לזהות את אותות הפלואורסצנטיות באמצעות תוכנת הדמיה של מיקרוסקופ. ההגדרות עבור דימות בפרוטוקול הנוכחי הן: זמני חשיפה ומרווח מוגדרים ל- 1.8 שניות ו- 2 שניות (כלומר, 0.5 fps), בהתאמה. הגדר את זמן ההקלטה ל- 11 דקות.
6. תמונה במשך 5 דקות לפני תחילת הניסוי כדי להסתגל הצמח להקרין אור כחול מן המיקרוסקופ, ואז להתחיל להקליט על ידי לחיצה על הפעל עכשיו, או הפקודה המקבילה בתוכנת מיקרוסקופ בשימוש. כדי לקבוע את הפלואורסצנטיות הבסיסית הממוצעת, רשום לפחות 10 מסגרות (כלומר, לפחות 20 שניות בפרוטוקול הנוכחי) לפני יישום פציעה או גלוטמט (ראה סעיף 4).
   1. להדמיה בזמן אמת של שינויים באפו [Ca^{2+ ]}ו-[Glu],_חתכו את הפטיולה או את האזור האמצעי של עלה L1 במספריים(איור 3 ואיור 4).
   2. להדמיה בזמן אמת של שינויים_בציט [Ca^{2+ ]}המופעלים על-ידי גלוטמט, חותכים את הקצה (כ-1 מ"מ מקצה) של עלה 1 על פני הווריד הראשי עם מספריים. לאחר תקופת החלמה של 20 דקות לפחות, יש למרוח 10 μL של 100 מ"מ גלוטמט על פני השטח החתוכים של העלה (איור 5).
      הערה: חיתוך מראש זה היה הכרחי כדי לאפשר גישה גלוטמט apoplast העלה על מנת לעורר תגובות. בנוסף, החלת טיפת מים מזוקקים על פני השטח החתוכים של עלה L1 נמצאה קריטית כדי למנוע מהדגימות להתייבש במהלך ההתאוששות לפני החלת גלוטמט.
7. לאחר סיום ההקלטה של 11 דקות, שמור את הנתונים.

4. ניתוח נתונים

1. לניתוח עוצמת הפלואורסצנטיות לאורך זמן, הגדירו אזור עניין (ROI) במקום שבו יש לנתח את עוצמת הפלואורסצנטיות (איור 6 ואיור 7). לחישוב המהירות של גל Ca²⁺ , הגדר 2 החזרי ROIs (ROI1 ו- ROI2) לניתוח. בתוכנת ההדמיה, לחץ על מדידת זמן | הגדרת | מעגל , עיגול. למדוד את המרחק בין ROI1 ו ROI2 על ידי לחיצה על ביאורים ומדידה | | אורך קו פשוט (איור 6).
2. מדוד את ערכי הפלואורסצנטיות הגולמיים (F) בכל החזר על ההשקעה לאורך זמן על-ידי לחיצה על מדידה. יצא נתונים גולמיים לתוכנת גיליון אלקטרוני כדי להמיר את אות הפלואורסצנטי למספרים בכל נקודת זמן על-ידי לחיצה על הכל ל- Excel | יצא.
3. קבע את ערך הפלואורסצנטיות הבסיסי, המוגדר כ- F₀, על-ידי חישוב הממוצע של F מעל 10 המסגרות הראשונות (כלומר, לפני הטיפול) בנתונים המוקלטים.
4. נרמל את נתוני F (על-ידי חישוב ΔF/F) באמצעות המשוואה ΔF/F = (F-F₀)/F₀, כאשר ΔF הוא השינוי תלוי הזמן בפלואורסצנטיות.
5. עבור ניתוח גל מהירות גל Ca²⁺ , הגדר נקודת עליית אות משמעותית מעל הערכים המעוררים מראש כמייצג זיהוי של עלייה של Ca²⁺ בכל החזר השקעה (t₁ ו- t₂) באמצעות הקריטריון של עלייה ל- 2× סטיית התקן (2x SD) המחושבת מנתוני F₀ באמצעות תוכנה סטטיסטית. 95% מנתוני_{ה-F 0} נופלים בטווח של 2x SD מהממוצע, מה שמצביע על כך שעליית האות מעל רמה זו במקרה היא ≤5%. חשב את הפרש הזמן של עליית Ca^{2+ בין} החזר על ההשקעה ל- ROI2 [t₂- t₁ השהיית זמן (Δt)]ומדוד את המרחק בין החזר על ההשקעה ל- ROI2 ולאחר מכן קבע את המהירות של כל גל Ca²⁺ .

Representative Results

הפצת אותות של [Ca²⁺]_ct ו- [Glu]_apo בתגובה לפציעה מוצגת באיור 3, איור 4, סרט S1וסרט S2. חיתוך פטיולה של העלה 1 בצמחים המבטאים GCaMP3 (ב 0 s) הוביל לעלייה משמעותית [Ca²⁺]_ציט כי היה במהירות המושרה באופן מקומי דרך כלי הדם (ב 40 s)(איור 3 ו סרט S1). לאחר מכן, האות הופץ במהירות לעלים שכנים (דף 3 ו-6) תוך דקות ספורות (ב-80 שניות)(איור 3 וסרט S1).

עם חיתוך עלה 1 בצמחים המבטאים CHIB-iGluSnFR, עלייה מהירה [גלו]_{apo נצפתה} סביב האזור לחתוך (ב 2 s). אות זה הופץ דרך כלי הדם באופן מקומי תוך דקות ספורות (ב-160 שניות), אך לא נצפה בעלים מערכתיים(איור 4 וסרט S2).

להדמיה בזמן אמת של הפצת אותות Ca²⁺ המופעלת על ידי יישום גלוטמט, הקצה (כ -1 מ"מ מקצה) של עלה 1 בצמחים המבטאים GCaMP3 נחתך כפי שמוצג באיור 5A ובסרט S3. חיתוך קצה של דף 1 גרם לעלייה מקומית [Ca²⁺]_cyt (ב 40 s) אבל אות זה נעלם בתוך כמה דקות (ב 124 s). לאחר המתנה של כ 10 דקות עבור הצמח להתאושש, 10 μL של 100 מ"מ גלוטמט הוחל על משטח לחתוך של עלה 1, אשר גרם לעלייה מהירה, משמעותית של [Ca^{2 +}]_ציט מקומי (ב 56 s) ו התפשטות אות עלים דיסטליים (ב 104 s) (איור 5B וסרט S4).

כדי למדוד את השינויים ב-[Ca²⁺]_cyt הנגרמים על ידי פציעה בעלה המערכתי, נקבעו שני ROIs (ROI1 ו- ROI2) באזור הבסיס ובקצה העלה 6 בצמחים המבטאים GCaMP3 כפי שמוצג באיור 6A. שינוי מסלול הזמן של עוצמת האות GCaMP3 ב-ROI1 וב-ROI2 עם חיתוך הפטיול של דף 1 נמדד (איור 6B). עלייה משמעותית של [Ca²⁺]_cyt ב ROI1 זוהה מוקדם יותר מזה של ROI2 (איור 6B). [Ca²⁺] _ה-cyt הגיע לשיא של כ-100 שניות לאחר פציעה, נמשך יותר מ-10 דקות והציג שני שלבים (איור 6B).

כדי לקבוע את המהירות של גל Ca²⁺ על פצעים מכניים, נקודת הזמן של עליית אות משמעותית מעל הערכים המעוררים מראש ב- ROI1 ו- ROI2 נקבעה (השהיית זמן; ראה סעיף 4) (איור 6C). מכיוון שהמרחק בין ROI1 ל-ROI2 היה 2.7 מ"מ במקרה זה (איור 6A),מהירות האות Ca²⁺ בעלה 6 חושבה כ- 0.15 מ"מ/s. כדי למדוד את שינויי_האפו [Glu] בתגובה לנזק המכני, ROI1 נקבע בקרבת אתר החיתוך של העלה המסומן כ- L1 כפי שמוצג באיור 7A. [גלו] חתימת _אפו ב-ROI1 הציגה שיא בודד של כ-100 שניות עם פציעתה (איור 7B).

איור 1: מספור עלי רוזט ערבידופסיס. עלי Arabidopsis ממוספרים מהמבוגר לצעיר ביותר (פאנל שמאלי). דיאגרמה סכמטית של מיקום העלים מצוינת בלוח הימני. L: עלה, ג: קוטילדון. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 2: מיקרוסקופ פלואורסצנטי המשמש במחקר זה. [Ca²⁺]_ציט ודינמיקת_אפו [גלו] צולמו עם סטריאומיקרוסקופ פלואורסצנטי רחב שדה. R: שלט רחוק, O: 1x עדשה אובייקטיבית, C: מצלמת sCMOS, T: צינור הטיה Trinocular, S: שלב, P: חומר צמחי. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 3: שידור אותות Ca²⁺ למרחקים ארוכים הנגרמים על-ידי פצעים. חיתוך פטיול (חץ לבן, 0 s) של עלה 1 (L1) במפעל המבטא GCaMP3 עורר עלייה מקומית [Ca²⁺]_cyt (חץ אדום, 40 s) שהועבר עלים מערכתיים [עלה 3 (L3) ועלה 6 (L6)] (חצים כתומים, 80 s). סרגל קנה מידה, 5 מ"מ. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 4: העלאת_{אפו המופעלת} על-ידי פצעים. חיתוך העלה 1 (L1) (חץ לבן, 0 s) בצמחים המבטאים CHIB-iGluSnFR גרם לעלייה מהירה של_אפו [גלו] (חץ אדום, 80 s) שהתפשט דרך כלי הדם (חץ כתום, 160 s). סרגל קנה מידה, 2 מ"מ. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 5: שידור אותות Ca²⁺ למרחקים ארוכים המופעל על-ידי גלוטמט. (A) חיתוך הקצה (כ- 1 מ"מ מקצה) של עלה 1 (L1) בצמחים המבטאים GCaMP3 (חץ לבן, 0 ים) גרם לעלייה [Ca²⁺]_ציט (חץ אדום, 40 שניות). (B)יישום של 100 מ"מ גלוטמט למשטח לחתוך של L1 (חץ לבן, 0 s) גרם מקומי [Ca²⁺] עליית_ציט (חץ אדום, 56 s) כי הופץ במהירות עלים דיסטליים [למשל, עלה 3 (L3), עלה 4 (L4), ועלה 6 (L6)] (חצים כתומים, 104 s). סרגלי קנה מידה, 5 מ"מ. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 6: [Ca²⁺] חתימת_ציט בעלים מערכתיים בתגובה לפציעה מכנית. (A) תמונה מורחבת של דף 6 (L6) בצמחים המבטאים GCaMP3 מוצגת באיור 3. ROI1 (עיגול כחול) ו ROI2 (עיגול ורוד) נקבעו באזור הבסיס והקצה, בהתאמה. חץ לבן מציין את האתר החתוך של פטיולה של עלה 1 (L1). במקרה זה, המרחק בין ROI1 ו ROI2 היה 2.7 מ"מ. (B)כימות של [Ca^{2 +}] חתימות_cyt ב ROI1 ו ROI2. שינויים בעוצמת הפלואורסצנטיות נותחו באמצעות תוכנת הדמיה. (ג)מעקב מורחב אחר נתונים ב- (B) בין 0 s ל- 80 s. נקודות איתור של עלייה של Ca²⁺ ב- ROI1 ו- ROI2 הוגדרו כ- t₁ ו- t₂, בהתאמה, תוך שימוש כקריטריון עלייה עד פי 2 סטיית התקן של ערכי prestimulation (2x SD, קו מנוקד). הערך של t₂ - t₁ הוגדר כהשהיית זמן (Δt) בפרוטוקול הנוכחי. החץ השחור מציין את זמן החיתוך. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 7: חתימת_אפו [Glu] בתגובה לפציעה מכנית. (A) תמונה מורחבת של דף 1 (L1) בצמחים המבטאים CHIB-iGluSnFR מוצגת באיור 4. ROI1 נקבע בקרבת אתר הקיצוץ. חץ לבן מציין את האזור שנחתך. (B)כמות חתימת_אפו [Glu] ב- ROI1 מנוטרת באמצעות תוכנת דימות. החץ השחור מציין את זמן החיתוך. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

סרט S1: למרחקים ארוכים Ca^{2 +} שידור לאחר פציעה מכנית. פצעים מכניים בפטיולה של עלה 1 (L1) גרמו לעלייה [Ca²⁺]_ציט המועברת לעלים דיסטליים [למשל, דף 3 (L3) ועלה 6 (L6)]. אנא לחץ כאן כדי להוריד סרט זה.

סרט S2: העלאת רמות גלוטמט אפופלסטי בתגובה לחיתוך. פציעה מכנית של העלה 1 (L1) גרמה לעלייה_{מיידית באפו}[גלו] . אנא לחץ כאן כדי להוריד סרט זה.

סרט S3: העלאת [Ca²⁺]רמות_ציט בתגובה לחיתוך. פציעה מכנית בקצה עלה 1 (L1) גרמה לגובה_ציט מיידי, מקומי [Ca²⁺]. אנא לחץ כאן כדי להוריד סרט זה.

סרט S4: יישום של גלוטמט מפעיל מערכתית [Ca²⁺]_ציט מגביר. יישום גלוטמט של 100 מ"מ הפעיל שידור Ca²⁺ לעלים מערכתיים [למשל, דף 3 (L3), עלה 4 (L4) ועלה 6 (L6)]. אנא לחץ כאן כדי להוריד סרט זה.

Discussion

איתות מערכתי חשוב לצמחים להגיב לגירויים סביבתיים חיצוניים מקומיים ולאחר מכן לשמור על הומאוסטזיס שלהם ברמת צמח שלמה. למרות שהם אינם מצוידים במערכת עצבים מתקדמת כמו בעלי חיים, הם משתמשים בתקשורת מהירה הן בתוך ובין איברים המבוססים על גורמים כגון אותות חשמליים ניידים (ואולי הידראוליים) וגלים מתפשטים של ROS ו- Ca^2+ 46,47. הפרוטוקול המתואר לעיל מאפשר הדמיה כלל-צמחית בזמן אמת של פעילות מערכת איתות זו באמצעות ניטור הדינמיקה של Ca²⁺ וגלוטמט אפופלסטי בתגובה לפציעה. שיטה זו מספקת כלי חזק להבנת אותות מהירים ובינעירוניים בצמחים המשלבים רזולוציה מרחבית גבוהה וקלות שימוש. פרוטוקול זה מציע גם את הפוטנציאל לספק תובנות פיזיולוגיות חדשות על המנגנונים המולקולריים שבבסיס הפצעים למרחקים ארוכים, למשל, באמצעות מוטנטים פגומים באלמנטים פואטיים של מערכת האיתות המהירה או חקר ההשפעות של ריאגנטים פרמקולוגיים כגון חוסמי ערוצי Ca²⁺ (למשל, LaCl₃) או מעכבים של פעילויות איתות פוטנציאליות אחרות⁶.

אחד היתרונות החשובים של שיטת ההדמיה biosensor המתוארת הוא השימוש biosensors יחיד FP עם תשואה פלואורסצנטית גבוהה, מאוד לפשט הן את הציוד הנדרש כדי לבצע מדידות אלה שלהם בשימוש planta. לפיכך, אינדיקטורים מקודדים גנטית מבוססי פלואורסצנטיות מחולקים לשני סוגים: 1) ביו-חושים מבוססי אינטנסיביות של FP יחיד ו- 2) ביוסנסורים מבוססי FRET¹⁰. למרות חיישנים מבוססי FRET ratiometric הם מדויקים כמותית, מבוססי אינטנסיביות Ca^{2 +} אינדיקטורים, כולל GCaMP3 ו iGluSnFR המשמשים כאן, לספק הן רזולוציה זמנית גבוהה יותר וקלות השימוש בשל שלהם בדרך כלל בהיר Ca^{2 +}- אות מגיב ודרישות מיקרוסקופ פשוט שלהם¹⁰. לדוגמה, דווח כי^מחוון R-GECO1 המבוסס על חלבון אדום-פלואורסצנטי, R-GECO1, הראה שינוי אות גדול בהרבה בתגובה ל- ATP חוץ-תאי ולגורמים להגנת הצמח flg22 וצ'יטין, בהשוואה ליחס בין YC3.6 biosensor²⁷. לצורך ניתוח חיישנים מבוססי RATIOMETRIC FRET, יש צורך גם להשתמש במיקרוסקופ מיוחד עם מסננים מרובים כדי לאסוף נתונים בשני אורכי גל, ואילו biosensors מבוססי FP יחיד דורשים מהמכשיר לאסוף את הנתונים באורך גל אחד בלבד, יכולת שנמצאת בכל מיקרוסקופי הפלואורסצנטיות הסטנדרטיים¹⁰. עם זאת, חשוב לציין כי ישנם כמה חסרונות של שימוש biosensors יחיד FP. ביוסנסורים מבוססי אינטנסיביות אלה, חד-תכליתיים, אינם מועדפים לכימות שינויי ריכוז מוחלטים או להדמיה ארוכת טווח על פני שעות או ימים רבים. מגבלה זו נובעת מכך שבנוסף לרמת Ca²⁺ עבור GCaMP3, עוצמת האות מביו-סנסורים חד-תכליתיים אלה נחשבת מושפעת מגורמים אחרים כגון רמת ביטוי החיישן או פרמטרים כגון pH סלולרי שעשוי להשתנות עם הזמן.

עד כה, גרסאות חדשות רבות של אינדיקטורים מקודדים גנטית אלה תוכננו כדי לשפר את יחס האות לרעש, טווח דינמי, קינטיקה ויציבות חיישן. לדוגמה, לאחר Nakai et al.²⁶ פיתח את GCaMP הראשון, גרסאות רצופות שונות, כגון GECOs נוצרו על ידי שילוב של mutagenesis ואפיון זהיר^48,49,50. הטווח הדינמי של G-GECO (גרין-GECO) דווח להיות גדול בערך פי שניים מזה של GCaMP3²⁸. יתר על כן, ההחלפה בחלבונים פלואורסצנטיים שונים באינדיקטורים אלה הובילה ליצירת גרסאות GECO עם ספקטרום פליטה שונה, כגון B-GECO (Blue-GECO) ו- R-GECO (Red-GECO), המאפשר שימוש באינדיקטורים אלה לצד גרסאות ספקטרליות אחרות של GFP ביישומי הדמיה צבעוניים²⁸. באופן דומה, GCaMP המשיך להיות מפותח ומשופר עם סדרה של חיישנים משופרים למהירות התגובה משרעת של האות עכשיו להיות זמין⁵⁰. לניטור דינמיקת גלוטמט, מלבד iGluSnFR, סדרה של ביו-סנסורים גלוטמט מבוססי FRET, פותחו⁴⁰חלבוני מחוון FLuorescent עבור גלוטמט (FLIPE). FLIPE מורכב CFP ו YFP המקושרים באמצעות חלבון מחייב גלוטמט ybeJ נלקח E. coli. על גלוטמט מחייב ybeJ, ירידה תלוית ריכוז גלוטמט של יעילות FRET נצפתה. לכן, הן עבור Ca²⁺ והן עבור גלוטמט ישנם חיישנים מרובים של FP יחיד ו- ratiometric זמינים. החוקרים צריכים לשקול את biosensor המתאים כדי לזהות דינמיקה אות בהתאם לתכנון הניסוי ודרישות עבור גורמי מדידה כגון אות גבוה:רעש (חיישני FP יחיד) לעומת צורך כמויות מדויקת מאוד (שם חיישני FRET מצטיינים).

שיטת ההדמיה החד-תכליתית הרחבה המתוארת כאן לפציעה צריכה להיות שימושית גם כאשר היא מוחלת על תהליכי איתות מערכתיים אחרים של מתח. למרות נוכחותם של דיווחים רבים המציעים תפקיד מכריע של Ca²⁺ למרחקים ארוכים איתות בתגובות מתח שונות, כגון התקפת אוכלי עשב^6,51,52, מלח²⁰, ובצורת⁵³, רק כמה מחקרים סיפקו את המידע spatiotemporal הקשורים מהיר למרחקים ארוכים Ca^{2 +} אותות הנגרמים על ידי תגובות מתח אלה^6,7,20,52. השימוש במיקרוסקופ פלואורסצנטי רחב שדה בפרוטוקול זה מאפשר גם תצפית בזמן אמת על דינמיקת האותות הניידים לא רק בתקשורת עלה עלה, אלא גם בתקשורת שורש לירות כפי שהוצג לאחרונה³⁸. למרות שהתמקדנו בפרוטוקולים עבור Arabidopsis, שיטת הדמיה זו בזמן אמת ברחבי הצמח מספקת גם כלי חזק להבנת המאפיינים המרחביים והטמפורליים של Ca²⁺ מערכתית איתות הן בתגובות מתח ביוטיות ואביוטיות במיני צמחים אחרים כגון טבק³⁰.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Arabidopsis expressing GCaMP3	Saitama University
Arabidopsis expressing CHIB-iGluSnFR	Saitama University
GraphPad Prism 7	GraphPad Software
L-Glutamate	FUJIFILM Wako	072-00501	Dissolved in a liquid growth medium [1/2x MS salts, 1% (w/v) sucrose, and 0.05% (w/v) MES; pH 5.1 adjusted with 1N KOH].
Microsoft Excel	Microsoft Corporation
Murashige and Skoog (MS) medium	FUJIFILM Wako	392-00591	composition: 1x MS salts, 1% (w/v) sucrose, 0.01% (w/v) myoinositol, 0.05% (w/v) MES, and 0.5% (w/v) gellan gum; pH 5.7 adjusted with 1N KOH.
Nikon SMZ25 stereomicroscope	Nikon
NIS-Elements AR analysis	Nikon
1x objective lens (P2-SHR PLAN APO)	Nikon
sCMOS camera (ORCA-Flash4.0 V2)	Hamamatsu Photonics	C11440-22CU
Square plastic Petri dish	Simport	D210-16