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Biology

아라비도시스에서 지역 및 전신 상처 신호의 넓은 필드, 실시간 이미징

Published: June 4, 2021 doi: 10.3791/62114
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 1,2
1Department of Biochemistry and Molecular Biology, Saitama University, 2Department of Botany, University of Wisconsin

Summary

세포외 글루타메이트 트리거 전신 칼슘 신호는 식물의 기계적 상처 및 초식 공격에 대한 식물 방어 대응의 유도에 매우 중요합니다. 이 문서에서는 칼슘과 글루타민염에 민감한 형광 바이오 센서를 표현하는 아라비도시스 탈리아나 식물을 사용하여 이러한 두 요인의 공간 적 및 측두동을 시각화하는 방법을 설명합니다.

Abstract

식물은 손상된 부품과 손상되지 않은 부품 모두에서 방어 반응을 유도하여 상처및 허브아이보리와 같은 기계적 응력에 반응합니다. 잎이 감기 시, 세포색 칼슘 이온 농도의 증가 (Ca2+ 신호) 상처 부위에서 발생. 이 신호는 방어 응답이 활성화되는 손상되지 않은 나뭇잎으로 빠르게 전송됩니다. 우리의 최근 연구는 그(것)들의 주위에 apoplast로 잎의 부상당한 세포에서 누설하는 글루타민이 상처 신호 역할을 한다는 것을 밝혔습니다. 이 글루타민은 글루타민산 수용체와 같은 Ca2+ 투과성 채널을 활성화하여 공장 전체에서 장거리 Ca2+ 신호 전파로 이어집니다. 이러한 이벤트의 공간적 및 현세적 특성은 유전적으로 인코딩된 형광 바이오 센서를 표현하는 살아있는 식물의 실시간 이미징으로 캡처할 수 있습니다. 여기서 우리는 상처에 대응하여 발생하는 아포가소성 글루타민의 Ca2+ 신호 및 변경의 역학을 모니터링하는 식물 전체의 실시간 이미징 방법을 소개합니다. 이 접근법은 광야 형광 현미경 및 녹색 형광 단백질 (GFP)기반Ca2+ 및 글루타민산 바이오 센서를 표현하는 형질 전환 성 애기장 식물을 사용합니다. 또한, 우리는 쉽게 상처 유도, 글루타민시 트리거 빠른 장거리 Ca2 + 신호 전파를 유도하는 방법론을 제시한다. 이 프로토콜은 또한 공장 시스템 신호가 신호 및 응답 네트워크에 어떻게 관여할 수 있는지 조사하는 데 도움이 되는 다른 플랜트 스트레스에 대한 연구에 적용할 수 있습니다.

Introduction

식물은 생물학적 스트레스, 예를 들어 곤충이 먹이를 주는 것에서 벗어날 수 없으므로 정교한 응력 감지 및 신호 변환 시스템을 진화하여 허브 리보리1과같은 문제로부터 자신을 감지하고 보호합니다. 상처 나 초식 포동 공격에 따라 식물은 부상당한 부위뿐만 아니라 손상되지 않은 탈설 기관2에서식물 호르몬 자스모산 (JA)의 축적을 포함한 신속한 방어 반응을 시작합니다. 이 JA는 둘 다 직접 손상된 조직에서 방어 반응을 유발하고 공장의 손상되지 않은 부분에서 방어를 선제적으로 유도합니다. 애기독증에서,상처에 의해 유도된 JA의 축적은 식물내 다른 곳에서 손상된 단 몇 분 이내에 손상된 단 몇 분 이내에 손상된 잎에서 검출되었다3. Ca2+,반응성 산소 종(ROS) 및 전기 신호와 같은 여러 후보는 식물4,5에서이러한 장거리 상처 신호로 작용하도록 제안되었습니다.

Ca2+는 진핵 생물에서 가장 다재다능하고 유비쿼터스 두 번째 메신저 요소 중 하나입니다. 식물에서, 애벌레 츄잉 및 기계적 상처는 분광성 Ca2+ 농도 ([Ca2+]cyt)의급격한 증가를 일으키는 원인이 되며, 모두 상처 입은 잎과 상처가 없는 먼 잎6,7. 이러한 전신 Ca2+ 신호는 세포내 Ca2+-센싱 단백질에 의해 수신되며, 이는 JA 생합성8,9를포함한 다운스트림 방어 신호 경로의 활성화로 이어진다. 식물 상처 반응에서 Ca2+ 신호의 중요성을 뒷받침하는 수많은 보고서에도 불구하고 상처로 유도된 Ca2+ 신호의 공간 및 측두적인 특성에 대한 정보는 제한적입니다.

유전자 인코딩 된 Ca2+ 지표를 사용하여 실시간 이미징은 Ca2+ 신호의 공간 및 시간 역학을 모니터링하고 정량화하는 강력한 도구입니다. 현재까지 단일 셀 수준에서 조직, 장기 및 전체식물(10)까지Ca2+ 신호를 시각화할 수 있도록 이러한 센서의 버전이 개발되었습니다. 식물에 사용되는 Ca2+를 위한 최초의 유전자 인코딩 된 바이오 센서는 해파리 Aequorea 빅토리아11에서파생 된 생물 발광 단백질 aequorin이었다. 이러한 화학발광 단백질은 식물12,13,14, 15,16,17,18의다양한 응력에 대한 반응으로 Ca2+ 변화를 검출하는 데 사용되었지만, 발광 신호가 매우 낮기 때문에 실시간 이미징에 적합하지 않다. Förster 공명 에너지 전송 (FRET)기반 Ca2+ 지표, 황 낙타와 같은, 또한 성공적으로 식물19, 20,21,22,23,24에서Ca 2 + 신호 이벤트의 범위의 역학을 조사하는 데 사용되었습니다. 이러한 센서는 이미징 접근법과 호환되며 가장 일반적으로 근산광사슬 키나아제에서 Ca2+ 결합 단백질 칼모둘린(CaM)과 CaM 결합 펩타이드(M13)로 구성되며, 모두 두 개의 형광단백질, 일반적으로 시안 형광단백질(CFP) 및 황형광 단백질(YFP)으로 구성된다. Ca2+ CaM에 바인딩하는 CaM과 M13 간의 상호 작용을 촉진하여 센서의 변형 변화를 촉진합니다. 이러한 변화는 CFP와 YFP 간의 에너지 전달을 촉진하여 YFP의 형광 강도를 증가시키면서 CFP에서 형광 방출을 감소시킵니다. CFP에서 YFP 형광으로의 이러한 변화를 모니터링하면 Ca2+ 수준의 증가를 측정합니다. 이러한 FRET 센서 외에도, 단일 형광 단백질(FP)기반 Ca2+ 바이오 센서(GCaMP 및 R-GECO와 같은)도 식물 이미징 접근법과 호환되며, 높은 감도 및 사용 편의성25,26,27,28,29,30을연구하는 데 널리 사용된다. GCaMpPs는 단일 원형 변록(cp) GFP를 함유하고 있으며, 다시 CaM 및 M13 펩타이드에 융합된다. Ca2+-C13 간의 의존적 상호 작용은 cpGFP의 프로토네이션 상태의 변화를 촉진하는 센서의 변형 변화를 일으켜 형광 신호를 강화합니다. 따라서 Ca2+ 레벨이 상승함에 따라 cpGFP 신호가 증가합니다.

기계적 상처 또는 초식동물 공급에 대응하여 생성된 Ca2+ 신호의 역학을 조사하기 위해, 우리는 GCaMP 변종, GCaMP3 및 광야 형광 현미경 6을 표현하는 형질 아기장 염 탈리아나 식물을사용했습니다. 이 방법은 잎에 상처 부위에서 전체 식물에 장거리 Ca2 + 신호의 신속한 전송을 시각화하는 데 성공했습니다. 따라서 상처 부위에서 [Ca2+]cyt의 증가가 즉시 감지되었지만 이 Ca2+ 신호는 상처후 몇 분 이내에 혈관을 통해 이웃 잎에 전파되었다. 더욱이, 우리는 이 급속한 전신 상처 신호의 전송이 2개의 글루타민산 수용체 같이 유전자, 글루타민산 수용체 같이(GLR), GLR3.3 및 GLR3.6에서돌연변이를 가진 아라비도시스 식물에서 폐지된다는 것을 것을을 발견했습니다. GlR은 상처 반응3,꽃가루 튜브 성장31,근간 작용32,감기 반응33,선천성 면역34를포함한 다양한 생리적 과정에 관여하는 아미노산 게이트 Ca2+ 채널로 기능하는 것으로 보인다. 이러한 잘 이해되고 광범위한 GlR의 광범위한 생리적 기능에도 불구하고, 리간 특이성, 이온 선택성 및 세포외 국소화와 같은 기능적 특성에 대한 정보는35에한정된다. 그러나, 최근 연구는 GLR3.3 및 GLR3.6 phloem와 자일렘에 국한되는 것을 각각 보고했습니다. 식물 GLR은 포유류에서 요노소글루타민체 수용체(iGluRs)36과 유사하며, 포유동물 신경계에서 글루타민트, 글리신 및 D-세린과 같은 아미노산에 의해활성화된다37. 실제로, 우리는 상처 부위에서 100 mM 글루타민산의 적용이 아라비도프시스에서신속하고 장거리 Ca2+ 신호를 유도한다는 것을 보여주었으며, 이는 세포외 글루타민산염이 식물6에서상처 신호로 작용할 가능성이 있음을 나타낸다. 이러한 반응은 글루타민이 이러한 수용체와 같은 채널 중 하나 또는 둘 다를 통해 작용할 수 있음을 시사하는glr3.3/glr3.6 돌연변이체에서 폐지되며, AtGLR3.6은 최근 이러한 글루타메이트(38)의 수준에 의해 문이 있는 것으로 나타났다.

식물에서는, 구조 아미노산으로서의 역할 외에도 글루타민산은 또한 주요 발달레귤레이터(39)로제안되었다. 그러나, 그것의 공간 및 시간 역학 제대로 이해. Ca2+마찬가지로, 글루타민에 대한 여러 유전자 인코딩 된 지표는 살아있는세포40,41에서이아미노산의 역학을 모니터링하기 위해 개발되었습니다. iGluSnFR은 에슈리치아 대장균42,43로부터cpGFP 및 글루타메이트 결합 단백질(GltI)으로 구성된 GFP 기반 단일 FP 글루타민산 바이오센서이다. GltI에 결합하는 글루타메이트에 의해 유도되는 iGluSnFR의 변형 변화는 향상된 GFP 형광 방출을 초래합니다. 세포외 글루타민이 식물 상처 반응에서 신호 분자역할을 하는지 여부를 조사하기 위해 iGluSnFR 서열을 기본 치티나아제 신호 펩타이드 분비 서열(CHIB-iGluSnFR)과 연결하여 이 바이오센서를 아포가성공간에서국소화하였다 6. 이 접근법은 이 센서를 표현하는 형질전환 아라비도시스 식물을 사용하여 종말성 글루타민염 농도([Glu]apo)의변화에 대한 이미징을 가능하게 했습니다. 우리는 상처 부위에서 iGluSnFR 신호의 급속한 증가를 감지했습니다. 이 데이터는 글루타민트가 손상된 세포/조직에서 상처시 아포라스트로 누출되고 GlR을 활성화하고 식물6에서장거리 Ca2+ 신호로 이어지는 손상 신호역할을 한다는 생각을 뒷받침한다.

여기서, 우리는 유전자 로코딩된 바이오 센서를 사용하여 식물 전체의 실시간 이미징 방법을 설명하여 상처6에대한 응답으로 장거리 Ca2+ 및 세포외 글루타민트 신호의 역학을 모니터링하고 분석한다. 유전자 인코딩 된 바이오 센서를 표현하는 광장 형광 현미경 및 형질 형질 검사기및 형질 검사기의 가용성은 Ca2+ 파도와 같이 빠르게 전송되는 장거리 신호를 감지하는 강력하고 쉽게 구현 된 접근 방식을 제공합니다.

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Protocol

1. 식물 재료 준비

  1. 1.5mL 마이크로튜브에서 표면은 GCaMP3 또는 CHIB-iGluSnFR을 3분 동안 20%(v/v) NaClO로 흔들어 서 아기방시스 탈리아나(Col-0 accession) 식물의 씨앗을 살균한 다음 멸균 증류수로 5회 세척합니다.
    참고: GCaMP3 또는 CHIB-iGluSnFR을 표현하는 애기장염의 형질전환선은 이전에설명되었습니다 6.
  2. 멸균 후드에 30mL 멸균(autoclaved) 무라시게와 스쿠그(MS) 매체[1x MS 염)로 채워진 10cm 정사각형 플라스틱 페트리 접시에 13개의 표면 멸균 씨앗을 뿌리고, 1% (w/v) 자당, 0.01% (w/v) myoinositol, 0.05% (w/v) MES 및 0.5% (w/v) 겔란 껌; pH 5.7 조정 1N KOH]. 뚜껑을 교체하고 수술 용 테이프로 포장하십시오.
  3. 2일 동안 4°C에서 어두움으로 배양한 후, 연속광(90-100 μmolm-2 s-1)에서22°C로 수평으로 플레이트를 배치하여 사용하기 전에 약 2주 동안 한다. 2 주 후, 가장 오래된에서 막내44 (그림 1)에서 아라비도시스 잎의 수를 계산합니다. 상처 응답은 손상된 잎(n)에서 번호n ± 3 및 n ± 56로우선적으로 이동한다.
    참고 : 이 프로토콜에서, 페트리 접시는 형광 현미경의 밑에 상처 및 글루타민트 효력을 화상 진찰을 위해 열립니다. 따라서 이 실험의 후속 단계는 온도 및 습도 조절 실 조건하에서 수행되어야 합니다. 이는 Ca2+ 신호도 이러한 환경 조건의 변화에 의해 유도되기 때문입니다. 또한 바이오센서 단백질의 형광을 기록하는 동안 현미경으로부터 방출되는 청색광은 세포색 Ca2+ 농도(45)의 증가를 유도할 수 있으므로 식물은 실험을 시작하기 전에 몇 분 동안 청색 광 조사에 적응해야 한다.

2. 화학 적 준비

  1. 액체 성장 매체 [1/2x MS 염, 1% (w/v) 자당 및 0.05% (w/v) MES; pH 5.1 1 1N KOH로 조정] 100 mM 작업 솔루션을 만들기 위해 용해.
    참고: Ca2+ 역학에 대한 잠재적인 양이온 관련 효과를 방지하기 위해 글루타민산나트륨과 같은 글루타민염의 사용을 피하십시오.

3. 현미경 설정 및 실시간 이미징 수행

  1. 1x 목표 렌즈(NA = 0.156) 및 sCMOS카메라(그림 2)가장착된 전동 형광 스테레오현미경을 켜고 470/40 nm 흥분광으로 조사하고 535/50 nm 필터를 통과하는 방출 광을 획득하도록 장치 설정을 구성한다.
    참고: 모든 GFP 에 민감한 형광 현미경은 GCaMP3 및 iGluSnFR 신호를 실시간으로 감지하는 데 사용할 수 있지만, 넓은 sCMOS 칩을 갖춘 저전력 객관적렌즈와 고감도 카메라는 전체 플랜트에서 신호를 획득하는 것이 좋습니다. 저전력 목표를 통해 전체 Arabidopsis 플랜트의 반응과 매우 민감한 카메라의 사용을 통해 상처 트리거된 Ca2+ 웨이브의 빠른 시간 과정을 캡처하는 데 필요한 빠른 데이터 수집이 가능합니다. 이 연구에서 사용되는 형광 현미경의 경우, 시야 및 측두해상도 분야의 최대 값은 각각 초당 3cm x 3cm 및 30 프레임(fps)입니다.
  2. 뚜껑을 제거하고 접시를 객관적인 렌즈 아래에 놓습니다.
  3. 식물의 형광 신호를 확인한 다음 식물이 새로운 환경 조건에 적응할 때까지 어둠 속에서 약 30 분 동안 기다립니다. 이 적응 단계는 습도의 변화가 상처 관련 사건을 방해할 수 있는 식물의 [Ca2+]시동 고도를 유도하기 때문에 필요합니다.
  4. 초점과 배율을 조정하여 시야에서 전체 식물을 볼 수 있습니다. 현재 프로토콜에서 0.63배배율이 사용되었습니다.
  5. 실시간 이미징을 시작하기 전에 현미경 이미징 소프트웨어를 사용하여 형광 신호를 감지하기 위해 획득 매개 변수를 설정합니다. 현재 프로토콜에서 이미징을 위한 설정은 노출 및 간격 시간이 각각 1.8s 및 2s(즉, 0.5fps)로 설정됩니다. 녹화 시간을 11분으로 설정합니다.
  6. 현미경으로부터 청색광 조사에 식물을 적응시키기 위해 실험을 시작하기 전에 5 분 동안의 이미지는 Run Now를클릭하여 기록을 시작한 다음 사용 중인 현미경 소프트웨어에서 이와 동등한 명령을 클릭하여 녹음을 시작합니다. 평균 기준선 형광을 확인하려면 상처 또는 글루타민트 응용 프로그램(섹션 4 참조)전에 최소 10프레임(즉, 현재 프로토콜에서 최소 20s)을 기록하십시오.
    1. 상처 유발 [Ca2+]시동 및 [글루]아포 변화의 실시간 이미징을 위해, 가위로 잎 L1의 쁘띠올 또는 중간 부위를 잘라냅니다(도3 및 도 4).
    2. 글루타민산염 [Ca2+]cyt 변경의 실시간 이미징을 위해 가위로 메인 정맥을 가로질러 잎 1의 가장자리(끝에서 약 1mm)를 자른다. 적어도 20분 의 회복 기간 후에, 잎의 절단 표면에 100mM 글루타민산염의 10 μL을 적용한다(그림5).
      참고: 이 사전 절단은 응답을 트리거하기 위해 송과미잎 아포플라스트에 대한 글루타메이트 액세스를 허용하는 데 필요했습니다. 또한, 잎 L1의 절단 표면에 증류수 한 방울을 가하는 것은 글루타민을 적용하기 전에 회수 중에 시료가 건조되는 것을 방지하는 데 중요한 것으로 나타났다.
  7. 11분 녹화를 마친 후 데이터를 저장합니다.

4. 데이터 분석

  1. 시간이 지남에 따라 형광 강도 분석을 위해 형광 강도가 분석되어야 하는 장소에서 관심 영역(ROI)을 정의합니다(도6 및 도 7). Ca2+ 웨이브의 속도 계산을 위해 분석을 위해 2개의 ROI(ROI1 및 ROI2)를 정의합니다. 이미징 소프트웨어에서 시간 측정 | 클릭하십시오. | 정의 원. 주석 및 측정 | 클릭하여 ROI1과 ROI2 사이의 거리를 측정합니다. 길이 | 간단한 선 (그림 6).
  2. 측정값을 클릭하여 시간이 지남에 따라 각 ROI에서 원시 형광 값(F)을 측정합니다. 원시 데이터를 스프레드시트 소프트웨어로 내보내 모든 것을 Excel| 클릭하여 각 시점에서 형광 신호를 숫자로 변환합니다. 내보내기.
  3. 기록된 데이터에서 처음 10프레임(즉, 치료 전)에 대한 F의 평균을 계산하여 F0으로정의되는 기준형 형광 값을 결정한다.
  4. ΔF가 형광의 시간 의존적 변화인 방정식 ΔF/F =(F−F0)/F0을사용하여 F 데이터(ΔF/F를 계산하여)를 정규화합니다.
  5. Ca2+ 파속도 파의 경우, 통계 소프트웨어를 사용하여 F0 데이터에서 계산되는 표준 편차(× 2x SD)의 기준을 사용하여 각 ROI(t1 및 t2)의Ca2+ 증가를 나타내는 것으로 사전 자극된 값 보다 중요한 신호 상승 점을 정의합니다. F0 데이터의 95%는 평균에서 2배 SD 내에 속하며, 이는 우연히 이 수준 이상의 신호 증가가 ≤5%임을 나타냅니다. ROI1과 ROI2 사이의 Ca2+ 증가의 시차를 계산하고 ROI1과 ROI2 사이의 거리를 측정한 다음 Ca2+ 웨이브의 속도를 결정합니다.

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Representative Results

[Ca2+]시동및 【글루】아포의 신호 전파는 도 3, 도 4, 무비 S1및 영화 S2에제시된다. GCaMP3(0s)를 발현하는 식물에서 잎 1의 잎 1을 절단하면 혈관 (40 s)을 통해 로컬로 빠르게 유도된 [Ca2+]시트의 상당한 증가를 주도하였다(도3 및 무비 S1). 이어서, 신호는 몇 분 이내에 이웃 잎(잎 3 및 6)(그림3 및 무비 S1)으로급속히 전파되었다.

CHIB-iGluSnFR을 표현하는 식물에서 잎 1을 절단하면 절단 영역(2s)에서 급격한 [글루]아포 증가가 관찰되었습니다. 이 신호는 몇 분 이내에 로컬로 혈관을 통해 전파되었다 (160 s에서) 전신 잎에서 관찰되지 않았다(그림 4 및 영화 S2).

글루타민의 적용에 의해 유발된 Ca2+ 신호 전파의 실시간 이미징의 경우, GCaMP3를 발현하는 식물에서 잎 1의 가장자리(팁에서 약 1mm)가 도 5A 및 Movie S3에도시된 바와 같이 절단하였다. 잎 1의 가장자리를 절단하는 것은 로컬 [Ca2 +]cyt 증가 (40 초)를 발생하지만이 신호는 몇 분 이내에 사라졌다 (124 s). 식물이 회복될 때까지 약 10분 동안 기다린 후, 100mM의 글루타민산염 10μL이 잎 1의 절단 표면에 적용되어 [Ca2+]시트의 로컬(56s)와 비신호 전파(도5B 및 Movie S4)를발생시켰습니다.

전신 잎에 상처에 의해 유도된 [Ca2+]시트의 변화를 측정하기 위해, 도 6A에도시된 바와 같이 GCaMP3를 발현하는 식물에서 2개의 ROI(ROI1 및 ROI2)가 기본 영역 및 잎 6의 끝에 설정되었다. 리프 1의 소각을 절단시 ROI1 및 ROI2에서 GCaMP3 신호 강도의 시간 과정 변화가 측정되었다(도6B). ROI1에서 [Ca2+]시트의 현저한 증가는 ROI2(도6B)보다일찍 검출되었다. 【Ca2+】 시트는 상처 후 약 100초로 정점을 찍었고, 10분 이상 지속되었으며, 2단계(그림6B)를나타냈다.

기계적 상처 시 Ca2+ 파의 속도를 결정하기 위해 ROI1 및 ROI2에서 사전 자극된 값보다 중요한 신호 상승의 시점이 결정되었다(시간 지연; 제4항 참조)(도 6C). ROI1과 ROI2 사이의 거리는 이 경우 2.7mm(그림6A)이었기때문에, 리프 6의 Ca2+ 신호 속도는 0.15 mm/s로 계산되었다. [Glu]아포의 기계적 손상을 측정하기 위해, ROI1은 도 7A에도시된 바와 같이 L1로 표시된 잎의 절단 부위 부근에 설정되었다. 【 글루 】 ROI1의 아포 시그니처는 상처 시 약 100s에서 단일 피크를 나타내고있습니다(그림 7B).

Figure 1
그림 1: 아라비도시스 로제트 잎의 번호. 아라비도시스 잎은 가장 오래된 잎에서 막내(왼쪽 패널)까지 번호가 매겨져 있습니다. 나뭇잎 위치의 회로도가 오른쪽 패널에 표시됩니다. L: 잎, C: 코틸레던. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 2
그림 2: 이 연구에서 사용되는 형광 현미경. [Ca2+]시동 및 [글루]아포 역학은 광야 형광 스테레오 현미경으로 이미지되었다. R: 원격 컨트롤러, O: 1x 객관적렌즈, C: sCMOS 카메라, T: 삼각체 틸팅 튜브, S: 스테이지, P: 식물 소재. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 3
그림 3: 상처 유발 장거리 Ca2+ 신호 전송. GCaMP3를 표현하는 식물에서 잎 1 (L1)의 쁘띠올 (흰색 화살표, 0 s)을 절단하면 전신 잎으로 전달 된 로컬 [Ca2 +]cyt 증가 (빨간색 화살표, 40 s)를 트리거 [잎 3 (L3) 및 잎 6 (L6)] (오렌지 화살표, 80 s). 스케일 바, 5mm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 4
그림 4: 상처 트리거 [글루]아포 고도. CHIB-iGluSnFR을 표현하는 식물에서 잎 1(L1)(흰색 화살표, 0s)을 절단하면 혈관을 통해 전파되는 [Glu]아포(빨간 화살표, 80s)의 빠른 고도가 발생했습니다(주황색 화살표, 160s). 스케일 바, 2mm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 5
도 5: 글루타메이트 트리거 장거리 Ca2+ 신호 전송. (A)GCaMP3(흰색 화살표, 0 s)를 발현하는 식물에서 잎 1(L1)의 가장자리(팁에서 약 1mm)를 절단하여 [Ca2+]시트 증가(빨간색 화살표, 40s)를 일으켰다. (B)L1(흰색 화살표, 0s)의 절단 표면에 100mM 글루타메이트를 적용하여 탈모잎에 빠르게 전파되는 로컬 [Ca2+]시트 증가(빨간색 화살표, 56s)를 일으켰습니다[예를 들어, 잎 3(L3), 잎 4(L4), 잎 6(L6)] (주황색 화살표, 10). 5mm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 6
도 6: [Ca2+]기계적 상처에 대한 응답으로 전신 잎의시트 시그니처. (A)GCaMP3를 발현하는 식물에서 잎 6(L6)의 확장된 이미지가 도 3에도시된다. ROI1(블루 원)과 ROI2(핑크 원)는 각각 베이스 및 팁 영역에 설정하였다. 흰색 화살표는 잎 1의 petiole (L1)의 절단 부위를 나타냅니다. 이 경우 ROI1과 ROI2 사이의 거리는 ROI1 및 ROI2의 [Ca2+]시트 시그니처의 2.7mm(B) 정량화였다. 형광 강도 변화는 이미징 소프트웨어를 사용하여 분석되었다. (C)0s와 80s 사이의 (B)의 데이터 추적이 확장되었습니다. ROI1 및 ROI2의 Ca2+ 증가의 검출 점은 각각 t1 및 t2로정의되었으며, 기준을 사용하여 배합 값(2x SD, 점선)의 표준 편차가 2배 상승하는 기준으로 사용하였다. t2-t 1의 값은 현재 프로토콜에서 시간 지연(Δt)으로 정의되었다. 검은색 화살표는 절단 시간을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 7
도 7: [Glu] 기계적 상처에 대한 응답으로아포 시그니처. (A)CHIB-iGluSnFR을 표현하는 식물에서 잎 1(L1)의 확장된 이미지가 도 4에도시된다. ROI1은 컷 사이트 부근에 설정되었습니다. 흰색 화살표는 절단 영역을 나타냅니다. (B)ROI1에서 [Glu]아포 시그니처의 양은 이미징 소프트웨어를 사용하여 모니터링된다. 검은색 화살표는 절단 시간을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

동영상 S1:기계적 상처 후 장거리 Ca2+ 변속기. 잎 1(L1)의 쁘띠올에서 기계적 상처는 [Ca2+]종잎으로 전염되는시원암증가를 일으켰다[예를 들어, 잎 3(L3) 및 잎 6(L6)]. 이 영화를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

동영상 S2: 절단에 대한 응답으로 아포가소성 글루타민트 수준의 고도. 잎 1 (L1)의 기계적 상처는 [Glu]아포의즉각적인 증가를 일으켰다. 이 영화를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

동영상 S3: 절삭에 대한 응답으로 [Ca2+]시트 레벨의 고도. 잎 1 (L1)의 가장자리에 기계적 상처는 즉각적인, 로컬 [Ca2+]시트 고도를 발생. 이 영화를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

동영상 S4: 글루타민트 의 응용 프로그램은 전신 [Ca2+]cyt 증가를 트리거합니다. 100mM 글루타메이트의 적용은 전신 잎으로 Ca2+ 전송을 트리거 [예를 들어, 잎 3 (L3), 잎 4 (L4) 및 잎 6 (L6)]. 이 영화를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

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Discussion

발전소는 지역화된 외부 환경 자극에 대응한 다음 전체 식물 수준에서 항상성을 유지하는 데 중요합니다. 동물과 같은 첨단 신경계를 장착하지는 않지만, 이동식 전기(및 유압) 신호및 ROS 와 Ca2+46,47의전파와 같은 요인에 따라 기관 안팎에서 신속한 통신을 사용합니다. 위에서 설명한 프로토콜은 상처에 대한 응답으로 Ca2+ 및 아포가소성 글루타민의 역학을 모니터링하여 이 신호 시스템의 활성을 식물 전체에 실시간으로 이미징할 수 있습니다. 이 방법은 높은 현공간 적 해상도와 사용 편의성을 결합한 식물의 신속하고 장거리 신호를 이해하는 강력한 도구를 제공합니다. 이 프로토콜은 또한 Ca2+ 채널 차단제(예를 들어, LaCl 3) 또는 기타 잠재적 키 신호활동의억제제(예를 들어, LaCl 3) 또는 다른 잠재적 키 신호 활동의 억제제(예를 들어, LaCl3)및 같은 약리학적 시약의 효과의 신속한 신호 시스템의 putative 요소에 결함이 있는 돌연변이를 사용하여, 예를 들어, 장거리 상처 신호 신호의 근본적인 분자 메커니즘에 대한 새로운 생리적 통찰력을 제공할 수 있는 잠재력을 제공한다. 

설명된 바이오센서 이미징 방법의 한 가지 중요한 장점은 높은 형광 수율을 가진 단일 FP 바이오 센서를 사용하여 이러한 측정을 하는 데 필요한 장비와 planta 사용을 크게 단순화하는 것입니다. 따라서, 형광계 유전자인코딩된 지표는 2개의 클래스로 나뉩니다: 1) 강도 기반 단일 FP 바이오센서 및 2) 비율메트릭 FRET 계바이오센서(10). 비측정 FRET 기반 센서는 정량적으로 정확하지만, 여기서 사용되는 GCaMP3 및 iGluSnFR을 포함한 강도 기반 Ca2+ 지표는 일반적으로 더 밝은 Ca2+반응성 신호 및 단순한 현미경 요구 사항10으로인해 더 높은 시간적 해상도와 사용 용이성을 모두 제공합니다. 예를 들어, 적색형 단백질 계 단일 FP Ca2+ 지표 R-GECO1은 세포외 ATP 및 식물 방어 유도체 flg22 및 chitin에 대한 반응에서 훨씬 더 큰 신호 변화를 나타내고, 비율YC3.6바이오센서(27)에비해 훨씬 더 큰 신호 변화를 나타내는 것으로 보고되었다. 비측정 FRET 기반 센서의 분석을 위해, 또한 두 파장에서 데이터를 수집하기 위해 여러 필터가 있는 특수 현미경을 사용해야 하는 반면, 단일 FP 기반 바이오 센서는 하나의 파장에서만 데이터를 수집하기 위해 장치를 필요로 하는 반면, 모든 표준 형광현미경(10)에서발견되는 기능. 그러나 단일 FP 바이오 센서를 사용하는 데 몇 가지 단점이 있다는 점에 유의해야 합니다. 이러한 강도 기반의 단일 FP 바이오 센서는 절대 농도 변화를 정량화하거나 여러 시간 또는 며칠 동안 장기 이미징을 하는 것이 바람직하지 않습니다. 이러한 제한은 GCaMP3에 대한 Ca2+ 수준 외에도 이러한 단일 FP 바이오 센서의 신호 강도가 시간이 지남에 따라 변경될 수 있는 셀룰러 pH와 같은 센서 발현 수준 또는 파라미터와 같은 다른 요인에 의해 영향을 받는 것으로 생각되기 때문이다.

현재까지 이러한 유전자 로코딩된 지표의 많은 새로운 변종은 신호 대 노이즈 비율, 동적 범위, 운동 및 센서 안정성을 개선하기 위해 설계되었습니다. 예를 들어, 나카이외(26)가 제1GCaMP를 개발한 후, GEKO와 같은 다양한 연속변종은 돌연변이 발생과 신중한특성화(48,49,50)의조합에 의해 생성되었다. G-GECO(Green-GECO)의 다이나믹 레인지는 GCaMP328보다약 2배 더 큰 것으로 보고되었다. 더욱이, 이러한 지표에서 다른 형광 단백질을 사용한 교체는 B-GECO(Blue-GECO) 및 R-GECO(Red-GECO)와 같은 다른 방출 스펙트럼을 가진 GECO 변이체의 생성으로 이어졌으며, 이는 다색 이미징 응용 분야에서 다른 GFP 스펙트럼 변이체와 함께 이러한 지표를 사용할 수 있게한다. 마찬가지로, GCaMP는 응답 속도와 현재 사용 가능한 신호의 진폭을 위해 향상된 일련의 센서를 통해 지속적으로 개발 및 개선되고 있습니다50. 글루타민산역학을 모니터링하기 위해, FRET 기반 글루타민산 바이오 센서의 시리즈인 iGluSnFR 이외에, 글루타민트(FLIPE)를 위한 플루오레센트 지표 단백질은40개개발되었다. FLIPE는 대장균에서 가져온 글루타메이트 결합 단백질 ybeJ를 통해 연결되는 CFP 및 YFP로 구성된다. 이베제이에 결합하는 글루타메이트의 경우, FRET 효율의 글루타민트 농도 의존성 감소가 관찰된다. 따라서 Ca2+와 글루타민트 모두에 대해 여러 개의 단일 FP 및 비측정 센서를 사용할 수 있습니다. 연구원은 실험 설계 및 고신호:노이즈(단일 FP 센서)와 같은 측정 요인에 대한 요구 사항에 따라 신호 역학을 감지하는 적절한 바이오센서와 매우 정확한 수량(FRET 센서이 뛰어난 경우)에 대해 고려해야 합니다.

상처에 대해 여기에 설명된 넓은 필드, 단일 FP 이미징 방법은 다른 응력 전신 신호 공정에 적용될 때도 유용해야 한다. 방식 발작6,51,52,소금20,가뭄53과 같은 다양한 스트레스 반응에서 장거리 Ca2+ 신호의 중요한 역할을 제안하는 수많은보고가 있음에도 불구하고, 이러한 스트레스 반응6,7,20,52에의해 유도된 급속한 장거리 Ca2+ 신호와 관련된 현수정보를 제공한 연구는 몇 가지 연구뿐입니다. 이 프로토콜에서 광시야 형광 현미경의 사용은 또한 최근도시된바와 같이 잎-잎 통신뿐만 아니라 근대-촬영 통신에서도 모바일 신호 역학의 실시간 관찰을 가능하게 한다. 우리는 애기장염을위한 프로토콜에 집중하더라도, 이 식물 전체 실시간 화상 진찰 방법은 또한 담배 와 같은 그밖 식물 종에 있는 biotic 및 abiotic 응력 반응 둘 다에 있는 전신 Ca2+ 신호의 공간 그리고 측두적인 특성을 이해하는 강력한 공구를 제공합니다30.

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Disclosures

저자는 이해 상충이 없습니다.

Acknowledgments

이 작품은 일본과학진흥협회(17H05007 및 18H05491)에서 MT, 국립과학재단(IOS1557899, MCB20161777) 및 국립항공우주청(NNX14AT25G 및 80NSSSCC191K19)에 보조금을 지원했다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Arabidopsis expressing GCaMP3 Saitama University
Arabidopsis expressing CHIB-iGluSnFR Saitama University
GraphPad Prism 7 GraphPad Software
L-Glutamate FUJIFILM Wako 072-00501 Dissolved in a liquid growth medium [1/2x MS salts, 1% (w/v) sucrose, and 0.05% (w/v) MES; pH 5.1 adjusted with 1N KOH].
Microsoft Excel Microsoft Corporation
Murashige and Skoog (MS) medium FUJIFILM Wako 392-00591 composition: 1x MS salts, 1% (w/v) sucrose, 0.01% (w/v) myoinositol, 0.05% (w/v) MES, and 0.5% (w/v) gellan gum; pH 5.7 adjusted with 1N KOH.
Nikon SMZ25 stereomicroscope Nikon
NIS-Elements AR analysis Nikon
1x objective lens (P2-SHR PLAN APO) Nikon
sCMOS camera (ORCA-Flash4.0 V2) Hamamatsu Photonics C11440-22CU
Square plastic Petri dish Simport D210-16

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생물학 문제 172 칼슘 GCaMP3 유전자 로 코딩 형광 바이오 센서 글루타민 iGluSnFR 장거리 신호 상처
<em>아라비도시스에서</em> 지역 및 전신 상처 신호의 넓은 필드, 실시간 이미징
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Uemura, T., Wang, J., Aratani, Y., Gilroy, S., Toyota, M. Wide-Field, Real-Time Imaging of Local and Systemic Wound Signals in Arabidopsis. J. Vis. Exp. (172), e62114, doi:10.3791/62114 (2021).

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