Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Wide-Field, Realtidsavbildning av lokala och systemiska sårsignaler i Arabidopsis

Published: June 4, 2021 doi: 10.3791/62114
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 1,2
1Department of Biochemistry and Molecular Biology, Saitama University, 2Department of Botany, University of Wisconsin

Summary

Extracellulära glutamat-utlöst systemisk kalcium signalering är avgörande för induktion av växt försvar svar på mekanisk sårning och växtätande attack i växter. Denna artikel beskriver en metod för att visualisera den rumsliga och tidsmässiga dynamiken hos båda dessa faktorer med Arabidopsis thaliana växter som uttrycker kalcium- och glutamatkänsliga fluorescerande biosensorer.

Abstract

Växter reagerar på mekaniska påfrestningar som sår och växtätande genom att inducera försvarssvar både i de skadade och i de distala oskadade delarna. Vid sårning av ett blad sker en ökning av cytosolisk kalciumjonkoncentration (Ca2 + signal) på sårplatsen. Denna signal överförs snabbt till oskadade löv, där försvarssvar aktiveras. Vår senaste forskning visade att glutamat som läcker från de sårade cellerna i bladet till apoplasten runt dem fungerar som en sårsignal. Detta glutamat aktiverar glutamatreceptorliknande Ca2 + genomsläppliga kanaler, vilket sedan leder till långdistans Ca2 + signalutbredning i hela växten. De rumsliga och tidsmässiga egenskaperna hos dessa händelser kan fångas med realtidsavbildning av levande växter som uttrycker genetiskt kodade fluorescerande biosensorer. Här introducerar vi en växtomfattande avbildningsmetod i realtid för att övervaka dynamiken hos både Ca2+ -signalerna och förändringar i apoplastiskt glutamat som uppstår som svar på sårning. Detta tillvägagångssätt använder ett brett fält fluorescensmikroskop och transgena Arabidopsis växter som uttrycker gröna fluorescerande protein (GFP) -baserade Ca2 + och glutamat biosensorer. Dessutom presenterar vi metodik för att enkelt framkalla sårinducerad, glutamat-utlöst snabb och långdistans Ca2 + signalutbredning. Detta protokoll kan också tillämpas på studier om andra växtspänningar för att hjälpa till att undersöka hur systemisk signalering av anläggningar kan vara involverade i deras signal- och svarsnätverk.

Introduction

Växter kan inte fly från biotiska påfrestningar, t.ex. insekter som matar på dem, så de har utvecklat sofistikerade stressavkänning och signaltransduktionssystem för att upptäcka och sedan skydda sig mot utmaningar som växtätande1. Vid sår eller växtätare attack initierar växter snabba försvarssvar inklusive ackumulering av fytohormone jasmonic syra (JA) inte bara på den skadade platsen utan också i oskadade distala organ2. Denna JA utlöser sedan båda försvarssvaren i de direkt skadade vävnaderna och inducerar förebyggande försvar i de oskadade delarna av växten. I Arabidopsisupptäcktes ackumuleringen av JA som inducerats genom sårning i distala, intakta löv inom bara några minuter efter skador någon annanstans i växten vilket tyder på att en snabb och långdistanssignal överförs från det såradebladet 3. Flera kandidater, såsom Ca2+, reaktiva syrearter (ROS) och elektriska signaler, har föreslagits att fungera som dessa långdistanssårsignaler i växter4,5.

Ca2+ är ett av de mest mångsidiga och allestädes närvarande andra budbärarelementen i eukaryota organismer. I växter orsakar larvtuggning och mekanisk sårning drastiska ökningar av cytosolic Ca2 + koncentrationen ([Ca2 +]cyt) både i det sårade bladet och i ovävda avlägsna blad6,7. Denna systemiska Ca2 + signal tas emot av intracellulära Ca2 +-avkänningsproteiner, vilket leder till aktivering av nedströms försvarssignaleringsvägar, inklusive JA biosyntes8,9. Trots många sådana rapporter som stöder vikten av Ca2 + signaler i växt sår svar, information om rumsliga och tidsmässiga egenskaper hos Ca2 + signaler framkallas genom sårning är begränsad.

Realtidsavbildning med genetiskt kodade Ca2+-indikatorer är ett kraftfullt verktyg för att övervaka och kvantifiera den rumsliga och tidsmässiga dynamiken hos Ca2+-signaler. Hittills har versioner av sådana sensorer utvecklats som möjliggör visualisering av Ca2 + signaler på nivån för en enda cell, till vävnader, organ och till och med hela växter10. Den första genetiskt kodade biosensorn för Ca2+ som används i växter var det bioluminescerande proteinet aequorin som härrör från maneterna Aequorea victoria11. Även om detta chemiluminescent protein har använts för att upptäcka Ca2 + förändringar som svar på olika påfrestningar iväxter 12,13,14,15,16,17,18, det är inte väl lämpat för realtidsavbildning på grund av den extremt låga luminescent signalen den producerar. Förster Resonance Energy Transfer (FRET)-baserade Ca2+ indikatorer, såsom gula kamelonerna, har också framgångsrikt använts för att undersöka dynamiken i en rad Ca2 + signaleringshändelser i växter19,20,21,22,23,24. Dessa sensorer är kompatibla med bildframställningsmetoder och består oftast av Ca2 + bindande proteinkalmodulin (CaM) och en CaM-bindande peptid (M13) från en myosin ljuskedjekinas, alla smälta mellan två fluorforproteiner, i allmänhet ett cyanfluorescerande protein (CFP) och en gul fluorescerande proteinvariant (YFP)10. Ca2+ bindning till CaM främjar interaktionen mellan CaM och M13 vilket leder till en konformationsförändring av sensorn. Denna förändring främjar energiöverföring mellan den gemensamma fiskeripolitiken och YFP, vilket ökar YFP:s fluorescensintensitet samtidigt som fluorescensutsläppen från den gemensamma fiskeripolitiken minskar. Övervakningen av denna övergång från den gemensamma fiskeripolitiken till YFP-fluorescensen ger sedan ett mått på ökningen på Ca2+-nivå. Förutom dessa FRET-sensorer är en fluorescerande protein (FP)-baserade Ca2 + biosensorer, såsom GCaMP och R-GECO, också kompatibla med växtavbildningsmetoder och används ofta för att studera [Ca2 +]cytförändringar på grund av deras höga känslighet och användarvänlighet25,26,27,28,29,30. GCaMPs innehåller en enda cirkulärt permuterad (cp) GFP, återigen smält till CaM och M13-peptiden. Den Ca2+beroende interaktionen mellan CaM och M13 orsakar en konformationell förändring i sensorn som främjar en förändring i protoneringstillståndet för cpGFP, vilket förbättrar dess fluorescerande signal. Således, när Ca2 + nivåer stiger, ökar cpGFP-signalen.

För att undersökadynamiken hos Ca 2 + signaler som genereras som svar på mekanisk sårning eller växtätare utfodring, har vi använt transgena Arabidopsis thaliana växter som uttrycker en GCaMP variant, GCaMP3, och ett brett fält fluorescensmikroskop6. Detta tillvägagångssätt har lyckats visualisera snabb överföring av en långdistans Ca2 + signal från sårplatsen på ett blad till hela växten. Således upptäcktes en ökning av [Ca2 +]cyt omedelbart på sårplatsen men denna Ca2 + signal spreds sedan till de närliggande bladen genom vaskulaturen inom några minuter efter sådd. Dessutom fann vi att överföringen av denna snabba systemiska sårsignal avskaffas i Arabidopsis växter med mutationer i två glutamat receptor-liknande gener, glutamat receptorn som (GLR), GLR3.3 och GLR3.66. GLR verkar fungera som aminosyra gated Ca2 + kanaler involverade i olika fysiologiska processer, inklusivesårrespons 3,pollenrör tillväxt31,rotutveckling32,kallrespons 33, och medfödd immunitet34. Trots denna välförståeliga, breda fysiologiska funktion hos GLR, är information om deras funktionella egenskaper, såsom deras ligand specificitet, jon selektivitet och subcellulär lokalisering, begränsade35. Nyligen genomförda studier rapporterade dock att GLR3.3 och GLR3.6 är lokaliserade i phloem respektive xylem. Växt GLR har likheter med jonotropa glutamatreceptorer (iGluR)36 hos däggdjur, som aktiveras av aminosyror, såsom glutamat, glycin och D-serin i däggdjurens nervsystem37. Vi visade faktiskt att tillämpningen av 100 mM glutamat, men inte andra aminosyror, på sårplatsen inducerar en snabb, långdistans Ca2 + signal i Arabidopsis, vilket indikerar att extracellulär glutamat sannolikt fungerar som en sårsignal i växter6. Detta svar avskaffas i glr3.3/glr3.6 mutant tyder på att glutamat kan agera genom en eller båda av dessa receptorliknande kanaler och faktiskt, AtGLR3.6 visade sig nyligen vara gated av dessa nivåer av glutamat38.

I växter, förutom dess roll som en strukturell aminosyra, glutamat har också föreslagits som en viktig utvecklingsregulator39; dess rumsliga och tidsmässiga dynamik är dock dåligt förstådd. Precis som för Ca2 +har flera genetiskt kodade indikatorer för glutamat utvecklats för att övervaka dynamiken hos denna aminosyra i levande celler40,41. iGluSnFR är en GFP-baserad glutamatbiosensor med en enda FP bestående av cpGFP och ett glutamatbindande protein (GltI) från Escherichia coli42,43. Den konformationsmässiga förändringen av iGluSnFR, som induceras av glutamatbindning till GltI, resulterar i ett förbättrat GFP-fluorescensutsläpp. För att undersöka om extracellulär glutamat fungerar som en signalmolekyl i växtsårsrespons, kopplade vi iGluSnFR-sekvensen med den grundläggande chitinassignalpeptidutsöndringssekvensen (CHIB-iGluSnFR) för att lokalisera denna biosensor i det apoplastiska utrymmet6. Detta tillvägagångssätt möjliggjorde avbildning av eventuella förändringar i den apoplastiska glutamatkoncentrationen ([Glu]apo) med hjälp av transgena Arabidopsis-växter som uttrycker denna sensor. Vi upptäckte snabba ökningar i iGluSnFR signalen på sårplatsen. Dessa data stöder tanken att glutamat läcker ut ur de skadade cellerna /vävnaderna till apoplasten vid sårning och fungerar som en skadesignal som aktiverar GLR och leder till långdistans Ca 2 + -signalen i växter6.

Här beskriver vi en växtomfattande realtidsavbildningsmetod med genetiskt kodade biosensorer för att övervaka och analyseradynamiken hos långdistans Ca 2 + och extracellulära glutamatsignaler som svar på sår6. Tillgången till fluorescensmikroskopi och transgena växter som uttrycker genetiskt kodade biosensorer ger ett kraftfullt, men ändå lätt implementerat tillvägagångssätt för att upptäcka snabbt överförda långdistanssignaler, såsom Ca2 + vågor.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Förberedelse av växtmaterial

  1. I en 1,5 ml mikrotube steriliserar ytan fröna från Arabidopsis thaliana (Col-0 anslutning) växt som uttrycker antingen GCaMP3 eller CHIB-iGluSnFR genom att skaka med 20% (v/v) NaClO i 3 min och sedan tvätta 5 gånger med sterilt destillerat vatten.
    OBS: De transgena linjerna i Arabidopsis som uttrycker GCaMP3 eller CHIB-iGluSnFR har beskrivits tidigare6.
  2. I en steril huva sår du 13 ytsteriliserade frön på en 10 cm fyrkantig petriskål i kvadrat fylld med 30 ml sterila (autoklaverade) Murashige- och Skoog-medel [1x MS-salter, 1% (w/v) sackaros, 0,01% (w/v) myoinositol, 0,05% (w/v) MES och 0,5% (w/v) gellan tuggummi; pH 5,7 justerat med 1N KOH]. Sätt tillbaka locket och linda med kirurgisk tejp.
  3. Efter inkubation i mörker vid 4 °C i 2 dagar, placera plattorna horisontellt vid 22 °C i en tillväxtkammare under kontinuerligt ljus (90-100 μmol m-2 s-1)i cirka 2 veckor före användning. Efter 2 veckor, räkna antalet Arabidopsis löv från äldsta tillyngsta 44 (Figur 1). Sårsvar rör sig företrädesvis från det skadade bladet (n) till blad numrerade n ± 3 och n ± 56.
    OBS: I detta protokoll öppnas Petri-skålen för avbildning av såret och glutamateffekter under ett fluorescensmikroskop. Därför bör efterföljande steg i detta experiment utföras under temperatur- och fuktighetskontrollerade rumsförhållanden. Detta beror på att Ca2 + signaler också framkallas av förändringar i dessa miljöförhållanden. Det är också känt att det blå ljuset, som avges från mikroskopet under registrering för excitation av biosensorproteinets fluorescens, kan framkalla en ökning av cytosolisk Ca2 + koncentration45 och därför bör växten acklimatiseras till blåljusbestrålningen i flera minuter innan experimentet påbörjas.

2. Kemisk beredning

  1. Lös upp L-glutamat i ett flytande tillväxtmedium [1/2x MS-salter, 1% (w/v) sackaros och 0,05% (w/v) MES; pH 5,1 justerat med 1N KOH] för att göra en 100 mM arbetslösning.
    OBS: Undvik användning av salter av glutamat såsom natriumglutamat för att förhindra potentiella katjonrelaterade effekter på Ca2 + dynamik.

3. Inställning av mikroskop och genomförande av avbildning i realtid

  1. Slå på det motoriserade fluorescensstereomikroskopet som är utrustat med en 1x objektiv (NA = 0,156) och en sCMOS-kamera(bild 2)och konfigurera enhetsinställningarna så att de bestrålas med ett excitationsljus på 470/40 nm och få ett emissionsljus som passerar genom ett 535/50 nm-filter.
    OBS: Alla GFP-känsliga fluorescensmikroskop kan användas för att upptäcka GCaMP3- och iGluSnFR-signaler i realtid, men en objektiv lins med låg effekt och mycket känslig kamera med ett brett sCMOS-chip rekommenderas för att få signaler från hela anläggningen. Lågenergimålet möjliggör avbildning av en hel Arabidopsis-anläggnings svar och användning av en mycket känslig kamera möjliggör det snabba datainsamling som behövs för att fånga den snabba tidsföringen för den sårutlösta Ca2 + -vågen. För fluorescensmikroskopet som används i denna studie är de maximala värdena för synfältet och temporal upplösning 3 cm x 3 cm respektive 30 bilder per sekund (fps).
  2. Ta bort locket och placera skålen under objektivet.
  3. Kontrollera fluorescenssignalen från anläggningen och vänta sedan i cirka 30 minuter i mörkret tills växterna är anpassade till de nya miljöförhållandena. Detta anpassningssteg krävs eftersom förändringar i luftfuktigheten framkallar [Ca2 +]cythöjning i växter som kan störa eventuella sårrelaterade händelser.
  4. Justera fokus och förstoring för att se hela anläggningen inom synfältet. I det aktuella protokollet användes en 0,63x förstoring.
  5. Innan du startar avbildning i realtid ställer du in förvärvsparametrarna för att upptäcka fluorescenssignalerna med hjälp av programvara för mikroskopavbildning. Inställningarna för avbildning i det aktuella protokollet är: exponerings- och intervalltider inställda på 1,8 s respektive 2 s (dvs. 0,5 fps). Ställ in inspelningstiden på 11 min.
  6. Bild i 5 minuter innan experimentet börjar acklimatisera växten till blåljusstrålningen från mikroskopet och börja sedan spela in genom att klicka på Kör nu, eller motsvarande kommando i mikroskopprogramvaran som används. För att bestämma den genomsnittliga baslinjefluorescensen, registrera minst 10 bildrutor (dvs. minst 20 s i det aktuella protokollet) före sårning eller glutamatapplikation (se avsnitt 4).
    1. För realtidsavbildning av sårinducerade [Ca2+]cyt- och [Glu]apo-förändringar, skär petiolen eller mittenregionen av blad L1 med sax (figur 3 och figur 4).
    2. För realtidsavbildning av glutamatutlöstacytförändringar [Ca2+] skär du kanten (ca 1 mm från spetsen) på blad 1 över huvud venen med sax. Efter minst 20 minuters återhämtningsperiod, applicera 10 μL 100 mM glutamat på bladets skurna yta (figur 5).
      OBS: Denna förskärning var nödvändig för att tillåta glutamat tillgång till blad apoplast för att utlösa svar. Dessutom konstaterades det att det var viktigt att applicera en droppe destillerat vatten på bladens snittyta L1 för att förhindra att proverna tosade under återhämtningen innan glutamat applicerades.
  7. När du har avslutat 11 minuters inspelning sparar du data.

4. Dataanalys

  1. För fluorescensintensitetsanalys över tid, definiera en region av intresse (ROI) på den plats där fluorescensintensitet ska analyseras (figur 6 och figur 7). För hastighetsberäkningen av Ca2+-vågen definierar du 2 ROI (ROI1 och ROI2) för analys. Klicka på Time Measurement-| i bildframställningsprogrammet. Definiera | Cirkel. Mät avståndet mellan ROI1 och ROI2 genom att klicka på Anteckningar och | Längd | Enkel linje (figur 6).
  2. Mät de råa fluorescensvärdena (F) i varje ROI över tid genom att klicka på Mått. Exportera rådata till ett kalkylbladsprogram för att konvertera fluorescenssignalen till tal vid varje tidpunkt genom att klicka på Alla till Excel | Exportera.
  3. Bestäm utgångsvärdet för fluorescens, som definieras som F0, genom att beräkna medelvärdet av F över de första 10 bildrutorna (dvs. före behandlingen) i de registrerade data.
  4. Normalisera F-data (genom att beräkna ΔF/F) med hjälp av ekvationen ΔF/F = (F−F0)/F0, där ΔF är den tidsberoende förändringen i fluorescens.
  5. För Ca2+ våghastighetsvåganalys, definiera en signifikant signalökningspunkt ovanför de förstimulerade värdena som representerar detektion av en Ca2 + ökning av varje ROI (t1 och t2) med hjälp av kriteriet om en ökning till 2× standardavvikelsen (2x SD) som beräknas från F0-data med hjälp av statistisk programvara. 95% av F0-data faller inom 2x SD från medelvärdet, vilket indikerar att en ökning av signalen över denna nivå av en slump är ≤5%. Beräkna tidsskillnaden för Ca2+ -ökningen mellan ROI1 och ROI2 [t2- t1 tidsfördröjning (Δt)] och mät avståndet mellan ROI1 och ROI2 och bestäm sedan hastigheterna för en Ca2 + våg.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Signalspridning av [Ca2+]cyt och [Glu]apo som svar på sårning presenteras i figur 3, figur 4, film S1och film S2. Styckning av bladbladets petiole 1 i växter som uttrycker GCaMP3 (vid 0 s) ledde till en betydande ökning av [Ca2 +]cyt som snabbt inducerades lokalt genom vaskulaturen (vid 40-talet) (Figur 3 och Movie S1). Därefter spreds signalen snabbt till närliggande löv (blad 3 och 6) inom några minuter (på 80-talet) (Figur 3 och Movie S1).

Vid skärning av blad 1 i växter som uttrycker CHIB-iGluSnFR observerades en snabb [Glu]apoökning runt den skurna regionen (vid 2 s). Denna signal spreds genom vaskulaturen lokalt inom några minuter (vid 160-talet) men observerades inte i systemiska löv (Figur 4 och Movie S2).

För realtidsavbildning av Ca2 + signalutbredning som utlöses av applicering av glutamat, skars kanten (cirka 1 mm från spetsen) av blad 1 i växter som uttrycker GCaMP3 enligt figur 5A och film S3. Att skära kanten av blad 1 orsakade en lokal [Ca2 +]cytökning (vid 40 s) men denna signal försvann inom några minuter (vid 124 s). Efter att ha väntat i cirka 10 minuter på att växten skulle återhämta sig applicerades 10 μL 100 mM glutamat på bladens skurna yta 1, vilket orsakade en snabb, betydande ökning av [Ca2+]cyt lokalt (vid 56 s) och signalspridning till distala löv (vid 104 s) (Figur 5B och Movie S4).

För att mäta förändringarna i [Ca2+] cyt sominducerats genom sårning i det systemiska bladet fastställdes två roi(ROI1 och ROI2) i basregionen och spetsen av blad 6 i växter som uttrycker GCaMP3 enligt figur 6A. Tidskursändringen av GCaMP3-signalintensiteten i ROI1 och ROI2 vid skärning av bladens petiole 1 mättes (figur 6B). En betydande ökning av [Ca2+]cyt vid ROI1 upptäcktes tidigare än roi2(figur 6B). [Ca2+] cyt nådde en topp på cirka 100 s efter sårskada, varade i över 10 minuter och uppvisade två faser (figur 6B).

För att bestämma hastigheterna för Ca2+-vågen vid mekanisk sårning fastställdes tidspunkten för en signifikant signalökning över de förstimulerade värdena i ROI1 och ROI2 (tidsfördröjning; se avsnitt 4) (figur 6C). Eftersom avståndet mellan ROI1 och ROI2 var 2,7 mm i detta fall (figur 6A), beräknades Ca2 + signalhastigheten i blad 6 som 0,15 mm/s. För att mäta [Glu]apo-förändringarna som svar på de mekaniska skadorna fastställdes ROI1 i närheten av skärplatsen för bladet märkt som L1 enligt figur 7A. - Jag är ledsen för det här. apo-signaturen vid ROI1 har uppvisat en enda topp på cirka 100 s vid sårning (Figur 7B).

Figure 1
Figur 1: Numrering av Arabidopsis rosettblad. Arabidopsis löv är numrerade från äldsta till yngsta (vänster panel). Ett schematiskt diagram över bladens position visas i den högra panelen. L: blad, C: cotyledons. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Figure 2
Figur 2:Ett fluorescensmikroskop somanvänds i denna studie. R: Fjärrkontroll, O: 1x objektiv, C: sCMOS-kamera, T: Trinocular tilting tube, S: Stage, P: Växtmaterial. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Figure 3
Figur 3:Sårinducerad långdistanssignalöverföring ca2+. Att skära petiole (vit pil, 0 s) blad 1 (L1) i växt som uttrycker GCaMP3 utlöste en lokal [Ca2 +]cytökning (röd pil, 40 s) som överfördes till systemiska löv [blad 3 (L3) och blad 6 (L6)] (orange pilar, 80 s). Skalstreck, 5 mm. Klicka här för att se en större version av den här figuren.

Figure 4
Figur 4:Sårutlöst [Glu]apohöjd. Att skära bladet 1 (L1) (vit pil, 0 s) i växter som uttrycker CHIB-iGluSnFR orsakade en snabb höjning av [Glu]apo (röd pil, 80 s) som spred sig genom vaskulaturen (orange pil, 160 s). Skalstreck, 2 mm. Klicka här för att se en större version av den här figuren.

Figure 5
Bild 5:Glutamatutlöst långdistans ca2+ signalöverföring. (A) Att skära kanten (ca 1 mm från spetsen) av blad 1 (L1) iväxter som uttrycker GCaMP3 (vit pil, 0 s) orsakade encytökning (röd pil, 40 s). (B) Applicering av 100 mM glutamat på den skurna ytan av L1 (vit pil, 0 s) orsakade en lokal [Ca2 +]cytökning (röd pil, 56 s) som snabbt spred sig till distala löv [t.ex. blad 3 (L3), blad 4 (L4) och blad 6 (L6)] (orange pilar, 104 s). Skalstänger, 5 mm. Klicka här för att se en större version av den här figuren.

Figure 6
Figur 6:[Ca2+]cytsignatur i systemiska blad som svar på mekanisk sårning. (A) En utökad bild av blad 6 (L6) i växter som uttrycker GCaMP3 visas i figur 3. ROI1 (blå cirkel) och ROI2 (rosa cirkel) sattes vid bas- respektive spetsområdet. Vit pil indikerar den skurna platsen för blad 1:s petiole (L1). I detta fall var avståndet mellan ROI1 och ROI2 2,7 mm. (B) Kvantifiering av [Ca2+]cytsignaturer i ROI1 och ROI2. Fluorescens intensitet ändringar analyserades med hjälp av bildframställning programvara. C)Ett utökat spår av data i B mellan 0 och 80 s. Detektionspunkter för en Ca2+ ökning av ROI1 och ROI2 definierades som t1 respektive t2,med hjälp av som kriterium en ökning till 2x standardavvikelsen för prestimuleringsvärdena (2x SD, prickad linje). Värdet t 2 - t1 definierades som tidsfördröjning (Δt) i det aktuella protokollet. Svart pil anger klipptiden. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Figure 7
Figur 7:[Glu]apo-signatur som svar på mekanisk sårning. (A) En utökad bild av blad 1 (L1) i växter som uttrycker CHIB-iGluSnFR visas i figur 4. ROI1 sattes i närheten av den avskurna platsen. Vit pil anger den klippta regionen. (B) Kvantifieringen av [Glu]aposignatur i ROI1 övervakas med hjälp av bildåtergivningsprogram. Svart pil anger klipptiden. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Film S1: Långdistans Ca2+ transmission efter mekanisk sårning. Mekanisk sårning vid bladblad 1 (L1) orsakade encytökning [Ca2+] som överförts till distala blad [t.ex. blad 3 (L3) och blad 6 (L6)]. Klicka här för att ladda ner den här filmen.

Film S2: Höjning av apoplastiska glutamatnivåer som svar på skärning. Mekanisk sårning av bladet 1 (L1) orsakade en omedelbar ökning av [Glu]apo. Klicka här för att ladda ner den här filmen.

Film S3: Höjd av [Ca2+]cytnivåer som svar på skärning. Mekanisk sårning vid kanten av blad 1 (L1) orsakade en omedelbar, lokal [Ca2+]cythöjd. Klicka här för att ladda ner den här filmen.

Film S4: Applicering av glutamat utlöser systemisk [Ca2 +]cyt ökar. Applicering av 100 mM glutamat utlöste Ca2 + överföring till systemiska blad [t.ex. blad 3 (L3), blad 4 (L4) och blad 6 (L6)]. Klicka här för att ladda ner den här filmen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Systemisk signalering är viktigt för växter att reagera på lokaliserade externa miljöstimulanser och sedan behålla sin homeostas på en hel anläggningsnivå. Även om de inte är utrustade med ett avancerat nervsystem som djur, använder de snabb kommunikation både inom och mellan organ baserat på faktorer som mobila elektriska (och eventuellt hydrauliska) signaler och förökningsvågor av ROS och Ca2 + 46,47. Protokollet som beskrivs ovan tillåter växtomfattande, realtidsavbildning av aktiviteten i detta signalsystem genom övervakning avdynamiken i Ca 2 + och apoplastiskt glutamat som svar på sårning. Denna metod ger ett robust verktyg för att förstå snabba och långdistanssignaler i växter som kombinerar hög spatiotemporal upplösning och användarvänlighet. Detta protokoll erbjuder också potential att ge nya fysiologiska insikter om de molekylära mekanismer som ligger till grund för långdistanssårsignalering genom att t.ex. använda mutanter som är defekta i förmodade element i det snabba signalsystemet eller utforskning av effekterna av farmakologiska reagenser som Ca2+ kanalblockerare (t.ex. LaCl3) eller hämmare av andra potentiellt viktiga signalaktiviteter6.

En viktig fördel med den biosensoravbildningsmetod som beskrivs är användningen av en FP-biosensorer med högt fluorescerande utbyte, vilket avsevärt förenklar både den utrustning som krävs för att göra dessa mätningar och deras användning av planta. Fluorescensbaserade genetiskt kodade indikatorer är således indelade i två klasser: 1) intensitetsbaserade en-FP-biosensorer och 2) ratiometriska FRET-baserade biosensorer10. Även om ratiometric FRET-baserade sensorer är kvantitativt exakta, ger intensitetsbaserade Ca2 + -indikatorer, inklusive GCaMP3 och iGluSnFR som används här, både högre temporal upplösning och användarvänlighet på grund av deras generellt ljusare Ca2 + -responsivasignal och deras enklare mikroskopkrav10. Till exempel rapporterades den rödfluorescerande proteinbaserade single-FP Ca2 + indikator R-GECO1 visa en mycket större signalförändring som svar på extracellulär ATP och växtförsvarets elicitors flg22 och chitin, jämfört med den ratiometric YC3.6 biosensor27. För analys av ratiometric FRET-baserade sensorer är det också nödvändigt att använda ett specialiserat mikroskop med flera filter för att samla in data vid två våglängder, medan en FP-baserade biosensorer kräver att enheten samlar in data vid endast en våglängd, en kapacitet som finns i alla standard fluorescensmikroskop10. Det är dock viktigt att notera att det finns vissa nackdelar med att använda en-FP-biosensorer. Dessa intensitetsbaserade, en-FP biosensorer är inte att föredra för kvantifiering av absoluta koncentrationsförändringar eller för långsiktig avbildning under många timmar eller dagar. Denna begränsning beror på att förutom t.ex. Ca2+ nivå för GCaMP3, signalintensiteten från dessa en-FP biosensorer tros påverkas av andra faktorer såsom sensoruttrycksnivå eller parametrar såsom cellulära pH som kan ändras med tiden.

Hittills har många nya varianter av dessa genetiskt kodade indikatorer konstruerats för att förbättra signal-till-brusförhållandet, dynamiskt omfång, kinetik och sensorstabilitet. Till exempel, efter nakai et al.26 utvecklat den första GCaMP, har olika på varandra följande varianter, såsom GECOs genererats av en kombination av mutagenes och noggrann karakterisering48,49,50. Det dynamiska intervallet för G-GECO (Green-GECO) rapporterades vara ungefär tvåfaldigt större än GCaMP328. Dessutom ledde ersättningen med olika fluorescerande proteiner i dessa indikatorer till generering av GECO-varianter med olika utsläppsspektra, såsom B-GECO (Blue-GECO) och R-GECO (Red-GECO), vilket möjliggör användning av dessa indikatorer tillsammans med andra GFP-spektralvarianter i multifärgsavbildningstillämpningar28. På samma sätt har GCaMP fortsatt att utvecklas och förbättras med en serie sensorer förbättrade för responshastighet och amplitud av signal som nu är tillgänglig50. För övervakning av glutamatdynamik, förutom iGluSnFR, har en serie FRET-baserade glutamatbiosensorer, FLuorescent Indicator Proteins for Glutamate (FLIPE) utvecklats40. FLIPE består av CFP och YFP som är kopplade via glutamatbindande proteinet ybeJ taget från E. coli. Vid glutamatbindning till ybeJ observeras en glutamatkoncentrationsberoende minskning av FRET-effektiviteten. Därför, för både Ca2 + och glutamat finns det flera single-FP och ratiometric sensorer tillgängliga. Forskare bör överväga lämplig biosensor för att upptäcka signaldynamik beroende på experimentell design och krav på mätfaktorer som hög signal:brus (en-FP-sensorer) jämfört med ett behov av mycket exakt kvantifiering (där FRET-sensorer utmärker sig).

Den breda, en-FP-bildframställningsmetod som beskrivs här för sårning bör också vara användbar när den tillämpas på andra stresssystemiska signalprocesser. Trots närvaron av många rapporter som tyder på en avgörande roll av långdistans Ca2 + signalering i olika stress svar, såsom växtätare attack6,51,52,salt20, och torka53, har endast ett fåtal studier gett spatiotemporal information relaterade till snabba långdistans Ca2 + signaler framkallas av dessa stress svar6,7,20,52. Användningen av ett bredfälts fluorescensmikroskop i detta protokoll möjliggör också realtidsobservation av mobil signaldynamik inte bara i kommunikation från blad till blad utan också root-to-shoot-kommunikation som nyligenvisades 38. Även om vi har fokuserat på protokoll för Arabidopsis, ger denna växtomfattande realtidsavbildningsmetod också ett robust verktyg för att förstå de rumsliga och tidsmässiga egenskaperna hos systemisk Ca2 + signalering i både biotiska och abiotiska stressreaktioner hos andra växtarter somtobak 30.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har inga intressekonflikter.

Acknowledgments

Detta arbete stöddes av bidrag från Japan Society for the Promotion of Science (17H05007 och 18H05491) till MT, National Science Foundation (IOS1557899 och MCB2016177) och National Aeronautics and Space Administration (NNX14AT25G och 80NSSC19K0126) till SG.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Arabidopsis expressing GCaMP3 Saitama University
Arabidopsis expressing CHIB-iGluSnFR Saitama University
GraphPad Prism 7 GraphPad Software
L-Glutamate FUJIFILM Wako 072-00501 Dissolved in a liquid growth medium [1/2x MS salts, 1% (w/v) sucrose, and 0.05% (w/v) MES; pH 5.1 adjusted with 1N KOH].
Microsoft Excel Microsoft Corporation
Murashige and Skoog (MS) medium FUJIFILM Wako 392-00591 composition: 1x MS salts, 1% (w/v) sucrose, 0.01% (w/v) myoinositol, 0.05% (w/v) MES, and 0.5% (w/v) gellan gum; pH 5.7 adjusted with 1N KOH.
Nikon SMZ25 stereomicroscope Nikon
NIS-Elements AR analysis Nikon
1x objective lens (P2-SHR PLAN APO) Nikon
sCMOS camera (ORCA-Flash4.0 V2) Hamamatsu Photonics C11440-22CU
Square plastic Petri dish Simport D210-16

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wu, J., Baldwin, I. T. Herbivory-induced signalling in plants: perception and action. Plant, Cell & Environment. 32 (9), 1161-1174 (2009).
  2. Howe, G. A., Major, I. T., Koo, A. J. Modularity in Jasmonate Signaling for Multistress Resilience. Annual Review of Plant Biology. 69 (1), 387-415 (2018).
  3. Mousavi, S. A. R., Chauvin, A., Pascaud, F., Kellenberger, S., Farmer, E. E. GLUTAMATE RECEPTOR-LIKE genes mediate leaf-to-leaf wound signalling. Nature. 500 (7463), 422-426 (2013).
  4. Gilroy, S., et al. Electric Signals: Key Mediators of Rapid Systemic Signaling in Plants. Plant Physiology. 171 (3), 1606-1615 (2016).
  5. Choi, W. -G., Hilleary, R., Swanson, S. J., Kim, S. -H., Gilroy, S. Rapid, long-distance electrical and calcium signaling in plants. Annual Review of Plant Biology. 67 (1), 287-307 (2016).
  6. Toyota, M., et al. Glutamate triggers long-distance, calcium-based plant defense signaling. Science. 361 (6407), 1112-1115 (2018).
  7. Nguyen, C. T., Kurenda, A., Stolz, S., Chételat, A., Farmer, E. E. Identification of cell populations necessary for leaf-to-leaf electrical signaling in a wounded plant. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (40), 10178-10183 (2018).
  8. Lecourieux, D., Ranjeva, R., Pugin, A. Calcium in plant defence-signalling pathways. New Phytologist. 171 (2), 249-269 (2006).
  9. Farmer, E. E., Gao, Y. -Q., Lenzoni, G., Wolfender, J. -L., Wu, Q. Wound- and mechanostimulated electrical signals control hormone responses. New Phytologist. 227 (4), 1037-1050 (2020).
  10. Palmer, A. E., Qin, Y., Park, J. G., McCombs, J. E. Design and application of genetically encoded biosensors. Trends in Biotechnology. 29 (3), 144-152 (2011).
  11. Ridgway, E. B., Ashley, C. C. Calcium transients in single muscle fibers. Biochemical and Biophysical Research Communications. 29 (2), 229-234 (1967).
  12. Kiegle, E., Moore, C. A., Haseloff, J., Tester, M. A., Knight, M. R. Cell-type-specific calcium responses to drought, salt and cold in the Arabidopsis root. The Plant Journal. 23 (2), 267-278 (2000).
  13. Zhu, X., Feng, Y., Liang, G., Liu, N., Zhu, J. -K. Aequorin-based luminescence imaging reveals stimulus- and tissue-specific Ca2+ dynamics in Arabidopsis plants. Molecular Plant. 6 (2), 444-455 (2013).
  14. Kwaaitaal, M., Huisman, R., Maintz, J., Reinstädler, A., Panstruga, R. Ionotropic glutamate receptor (iGluR)-like channels mediate MAMP-induced calcium influx in Arabidopsis thaliana. Biochemical Journal. 440 (3), 355-373 (2011).
  15. Vatsa, P., et al. Involvement of putative glutamate receptors in plant defence signaling and NO production. Biochimie. 93 (12), 2095-2101 (2011).
  16. Toyota, M., Furuichi, T., Sokabe, M., Tatsumi, H. Analyses of a gravistimulation-specific Ca2+ signature in Arabidopsis using parabolic flights. Plant Physiology. 163 (2), 543-554 (2013).
  17. Toyota, M. Hypergravity stimulation induces changes in intracellular calcium concentration in Arabidopsis seedlings. Advances in Space Research. 39, 1190-1197 (2007).
  18. Stephan, A. B., Kunz, H. -H., Yang, E., Schroeder, J. I. Rapid hyperosmotic-induced Ca2+ responses in Arabidopsis thaliana exhibit sensory potentiation and involvement of plastidial KEA transporters. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (35), 5242-5249 (2016).
  19. Nagai, T., Yamada, S., Tominaga, T., Ichikawa, M., Miyawaki, A. Expanded dynamic range of fluorescent indicators for Ca2+ by circularly permuted yellow fluorescent proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (29), 10554-10559 (2004).
  20. Choi, W. -G., Toyota, M., Kim, S. -H., Hilleary, R., Gilroy, S. Salt stress-induced Ca2+ waves are associated with rapid, long-distance root-to-shoot signaling in plants. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (17), 6497-6502 (2014).
  21. Evans, M. J., Choi, W. -G., Gilroy, S., Morris, R. J. A ROS-assisted calcium wave dependent on the AtRBOHD NADPH oxidase and TPC1 cation channel propagates the systemic response to salt stress. Plant Physiology. 171 (3), 1771-1784 (2016).
  22. Hilleary, R., et al. Tonoplast-localized Ca2+ pumps regulate Ca2+ signals during pattern-triggered immunity in Arabidopsis thaliana. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (31), 18849-18857 (2020).
  23. Lenglet, A., et al. Control of basal jasmonate signalling and defence through modulation of intracellular cation flux capacity. New Phytologist. 216 (4), 1161-1169 (2017).
  24. Choi, W. -G., Swanson, S. J., Gilroy, S. High-resolution imaging of Ca2+, redox status, ROS and pH using GFP biosensors. The Plant Journal. 70 (1), 118-128 (2012).
  25. Nagai, T., Sawano, A., Park, E. S., Miyawaki, A. Circularly permuted green fluorescent proteins engineered to sense Ca2. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (6), 3197-3202 (2001).
  26. Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. A high signal-to-noise Ca2+ probe composed of a single green fluorescent protein. Nature Biotechnology. 19 (2), 137-141 (2001).
  27. Keinath, N. F., et al. Live cell imaging with R-GECO1 sheds light on flg22- and Chitin-induced transient [Ca2+]cyt patterns in Arabidopsis. Molecular Plant. 8 (8), 1188-1200 (2015).
  28. Zhao, Y., et al. An expanded palette of genetically encoded Ca2+ indicators. Science. 333 (6051), 1888-1891 (2011).
  29. Vincent, T. R., et al. Real-time in vivo recording of Arabidopsis calcium signals during insect feeding using a fluorescent biosensor. JoVE. (126), e56142 (2017).
  30. DeFalco, T. A., et al. Using GCaMP3 to study Ca2+ signaling in nicotiana species. Plant and Cell Physiology. 58 (7), 1173-1184 (2017).
  31. Michard, E., et al. Glutamate receptor-like genes form Ca2+ channels in pollen tubes and are regulated by Pistil D-Serine. Science. 332 (6028), 434-437 (2011).
  32. Singh, S. K., Chien, C. -T., Chang, I. -F. The Arabidopsis glutamate receptor-like gene GLR3.6 controls root development by repressing the Kip-related protein gene KRP4. Journal of Experimental Botany. 67 (6), 1853-1869 (2016).
  33. Li, H., et al. Tomato GLR3.3 and GLR3.5 mediate cold acclimation-induced chilling tolerance by regulating apoplastic H2O2 production and redox homeostasis. Plant, Cell & Environment. 42 (12), 3326-3339 (2019).
  34. Li, F., et al. Glutamate receptor-like channel3.3 is involved in mediating glutathione-triggered cytosolic calcium transients, transcriptional changes, and innate immunity responses in Arabidopsis. Plant Physiology. 162 (3), 1497-1509 (2013).
  35. Wudick, M. M., Michard, E., Oliveira Nunes, C., Feijó, J. A. Comparing plant and animal glutamate receptors: common traits but different fates. Journal of Experimental Botany. 69 (17), 4151-4163 (2018).
  36. De Bortoli, S., Teardo, E., Szabò, I., Morosinotto, T., Alboresi, A. Evolutionary insight into the ionotropic glutamate receptor superfamily of photosynthetic organisms. Biophysical Chemistry. 218, 14-26 (2016).
  37. Janovjak, H., Sandoz, G., Isacoff, E. Y. A modern ionotropic glutamate receptor with a K+ selectivity signature sequence. Nature Communications. 2 (1), 232 (2011).
  38. Shao, Q., Gao, Q., Lhamo, D., Zhang, H., Luan, S. Two glutamate- and pH-regulated Ca2+ channels are required for systemic wound signaling in Arabidopsis. Science Signaling. 13 (640), (2020).
  39. Forde, B. G., Lea, P. J. Glutamate in plants: metabolism, regulation, and signalling. Journal of Experimental Botany. 58 (9), 2339-2358 (2007).
  40. Okumoto, S., et al. Detection of glutamate release from neurons by genetically encoded surface-displayed FRET nanosensors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (24), 8740-8745 (2005).
  41. Hires, S. A., Zhu, Y., Tsien, R. Y. Optical measurement of synaptic glutamate spillover and reuptake by linker optimized glutamate-sensitive fluorescent reporters. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (11), 4411-4416 (2008).
  42. Marvin, J. S., et al. An optimized fluorescent probe for visualizing glutamate neurotransmission. Nature Methods. 10 (2), 162-170 (2013).
  43. Marvin, J. S., et al. Stability, affinity, and chromatic variants of the glutamate sensor iGluSnFR. Nature Methods. 15 (11), 936-939 (2018).
  44. Farmer, E., Mousavi, S. A. R., Lenglet, A. Leaf numbering for experiments on long distance signalling in Arabidopsis. Protocol Exchange: Preprint server. , (2013).
  45. Harada, A., Shimazaki, K. -i Phototropins and blue light-dependent calcium signaling in higher plants. Photochemistry and Photobiology. 83 (1), 102-111 (2007).
  46. Huber, A. E., Bauerle, T. L. Long-distance plant signaling pathways in response to multiple stressors: the gap in knowledge. Journal of Experimental Botany. 67 (7), 2063-2079 (2016).
  47. Choi, W. -G., et al. Orchestrating rapid long-distance signaling in plants with Ca2+, ROS and electrical signals. The Plant Journal. 90 (4), 698-707 (2017).
  48. Tallini, Y. N., et al. Imaging cellular signals in the heart in vivo: cardiac expression of the high-signal Ca2+ indicator GCaMP2. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (12), 4753-4758 (2006).
  49. Tian, L., et al. Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators. Nature Methods. 6 (12), 875-881 (2009).
  50. Chen, T. -W., et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).
  51. Vincent, T. R., et al. Interplay of plasma membrane and vacuolar ion channels, together with BAK1, elicits rapid cytosolic calcium elevations in Arabidopsis during aphid feeding. The Plant Cell. 29 (6), 1460-1479 (2017).
  52. Meena, M. K., et al. The Ca2+ channel CNGC19 regulates Arabidopsis defense against spodoptera herbivory. The Plant Cell. 31 (7), 1539-1562 (2019).
  53. Cheong, Y. H., et al. CBL1, a calcium sensor that differentially regulates salt, drought, and cold responses in arabidopsis. The Plant Cell. 15 (8), 1833-1845 (2003).

Tags

Biologi Utgåva 172 kalcium GCaMP3 genetiskt kodade fluorescerande biosensorer glutamat iGluSnFR långdistanssignal sår
Wide-Field, Realtidsavbildning av lokala och systemiska sårsignaler i <em>Arabidopsis</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Uemura, T., Wang, J., Aratani, Y.,… More

Uemura, T., Wang, J., Aratani, Y., Gilroy, S., Toyota, M. Wide-Field, Real-Time Imaging of Local and Systemic Wound Signals in Arabidopsis. J. Vis. Exp. (172), e62114, doi:10.3791/62114 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter