Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

Weitfeld-Echtzeit-Bildgebung lokaler und systemischer Wundsignale bei Arabidopsis

doi: 10.3791/62114 Published: June 4, 2021

Summary

Extrazelluläre Glutamat-ausgelöste systemische Kalziumsignalisierung ist entscheidend für die Induktion von pflanzlichen Abwehrreaktionen auf mechanische Wunden und Pflanzenfresserangriffe in Pflanzen. Dieser Artikel beschreibt eine Methode, um die räumliche und zeitliche Dynamik dieser beiden Faktoren mit Arabidopsis thaliana-Pflanzen zu visualisieren, die kalzium- und glutamatempfindliche fluoreszierende Biosensoren exprimieren.

Abstract

Pflanzen reagieren auf mechanische Belastungen wie Verwundung und Pflanzenfresser, indem sie Abwehrreaktionen sowohl in den beschädigten als auch in den distalen unbeschädigten Teilen hervorrufen. Bei der Verwundung eines Blattes tritt an der Wundstelle ein Anstieg der zytosolischen Calciumionenkonzentration (Ca2+ Signal) auf. Dieses Signal wird schnell an unbeschädigte Blätter übertragen, wo Abwehrreaktionen aktiviert werden. Unsere jüngste Forschung ergab, dass Glutamat, das aus den verwundeten Zellen des Blattes in den Apoplasten um sie herum austritt, als Wundsignal dient. Dieses Glutamat aktiviert Glutamatrezeptor-ähnliche Ca2+ durchlässige Kanäle, was dann zu einer Fernausbreitung des Ca2+ Signals in der gesamten Pflanze führt. Die räumlichen und zeitlichen Eigenschaften dieser Ereignisse können mit Echtzeit-Bildgebung lebender Pflanzen erfasst werden, die genetisch kodierte fluoreszierende Biosensoren exprimieren. Hier stellen wir eine pflanzenweite Echtzeit-Bildgebungsmethode vor, um die Dynamik sowohl der Ca2+ Signale als auch Veränderungen des apoplastischen Glutamats, die als Reaktion auf Wunden auftreten, zu überwachen. Dieser Ansatz verwendet ein Weitfeld-Fluoreszenzmikroskop und transgene Arabidopsis-Pflanzen, die Green Fluorescent Protein (GFP)-basierte Ca2+ und Glutamat-Biosensoren exprimieren. Darüber hinaus stellen wir Methoden vor, um eine wundinduzierte, glutamatgesteuerte schnelle und ferngesteuerte Ca2+ Signalausbreitung leicht hervorzulösen. Dieses Protokoll kann auch auf Studien zu anderen Pflanzenstress angewendet werden, um zu untersuchen, wie die systemische Signalübertragung von Pflanzen an ihren Signal- und Reaktionsnetzwerken beteiligt sein könnte.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Pflanzen können biotischen Belastungen, z. B. Insekten, die sich von ihnen ernähren, nicht entkommen, daher haben sie ausgeklügelte Stresssensor- und Signaltransduktionssysteme entwickelt, um Herausforderungen wie Pflanzenfresser zu erkennen und sich dann vor ihnen zu schützen1. Bei Verwundung oder Pflanzenfresserangriff initiieren Pflanzen schnelle Abwehrreaktionen, einschließlich der Ansammlung des Phytohormons Jasmonsäure (JA) nicht nur an der verwundeten Stelle, sondern auch in unbeschädigten distalen Organen2. Dieses JA löst dann sowohl Abwehrreaktionen in den direkt geschädigten Geweben aus als auch präventiv Abwehrkräfte in den unbeschädigten Teilen der Pflanze. Bei Arabidopsiswurde die durch Wunden induzierte Ansammlung von JA in distalen, intakten Blättern innerhalb weniger Minuten nach Beschädigung an anderer Stelle in der Pflanze nachgewiesen, was darauf hindeutet, dass ein schnelles und fernweites Signal vom verwundeten Blatt3übertragen wird. Mehrere Kandidaten, wie Ca2+,reaktive Sauerstoffspezies (ROS) und elektrische Signale, wurden vorgeschlagen, um als diese Fernwundsignale in Pflanzen4,5zu dienen.

Ca2+ ist eines der vielseitigsten und allgegenwärtigsten zweiten Botenstoffe in eukaryotischen Organismen. Bei Pflanzen verursachen Raupenkauen und mechanische Verwundungen einen drastischen Anstieg der zytosolischen Ca2+ Konzentration ([Ca2+]Zyt) sowohl im verwundeten Blatt als auch in ungewickelten entfernten Blättern6,7. Dieses systemische Ca2+-Signal wird von intrazellulärenCa2+-Sensorproteinenempfangen, die zur Aktivierung nachgeschalteter Abwehrsignalwege, einschließlich ja-Biosynthese8,9führen. Trotz zahlreicher solcher Berichte, die die Bedeutung von Ca2+-Signalen für pflanzliche Wundreaktionen unterstützen, sind Informationen über die räumlichen und zeitlichen Eigenschaften von Ca2+-Signalen, die durch Verwundung induziert werden, begrenzt.

Die Echtzeitbildgebung mit genetisch kodierten Ca2+-Indikatoren ist ein leistungsfähiges Werkzeug zur Überwachung und Quantifizierung der räumlichen und zeitlichen Dynamik von Ca2+-Signalen. Bis heute wurden Versionen solcher Sensoren entwickelt, die die Visualisierung von Ca2+ Signalen auf der Ebene einer einzelnen Zelle, zu Geweben, Organen und sogar ganzen Pflanzen ermöglichen10. Der erste genetisch kodierte Biosensor für Ca2+, der in Pflanzen verwendet wurde, war das biolumineszierende Protein Aequorin, das aus der Qualle Aequorea victoria11gewonnen wurde. Obwohl dieses chemiluminineszierende Protein verwendet wurde, um Ca2+ Veränderungen als Reaktion auf verschiedene Spannungen in Pflanzen12,13,14,15,16,17,18zu erkennen, ist es aufgrund des extrem niedrigen Lumineszenzsignals, das es erzeugt, nicht gut für die Echtzeitbildgebung geeignet. Förster Resonance Energy Transfer (FRET)-basierte Ca2+ Indikatoren, wie die Gelben Kameleons, wurden auch erfolgreich verwendet, um die Dynamik einer Reihe von Ca2+ Signalereignissen in Pflanzen19,20,21,22,23,24zu untersuchen. Diese Sensoren sind mit bildgebenden Ansätzen kompatibel und bestehen am häufigsten aus dem Ca2+-bindenden Protein Calmodulin (CaM) und einem CaM-bindenden Peptid (M13) aus einer Myosin-Leichtkettenkinase, die alle zwischen zwei Fluorophorproteinen verschmolzen sind, im Allgemeinen einem Cyan Fluorescent Protein (CFP) und einer Yellow Fluorescent Protein Variante (YFP)10. Die Ca2+-Bindung an CaM fördert die Interaktion zwischen CaM und M13, was zu einer Konformationsänderung des Sensors führt. Diese Änderung fördert die Energieübertragung zwischen CFP und YFP, was die Fluoreszenzintensität des YFP erhöht und gleichzeitig die Fluoreszenzemission der CFP verringert. Die Überwachung dieser Verschiebung von CFP- zu YFP-Fluoreszenz liefert dann ein Maß für den Anstieg des Ca2+-Niveaus. Zusätzlich zu diesen FRET-Sensoren sind einzelne fluoreszierende Protein (FP)-basierte Ca2+ Biosensoren wie GCaMP und R-GECO auch mit pflanzlichen Bildgebungsansätzen kompatibel und werden aufgrund ihrer hohen Empfindlichkeit und Benutzerfreundlichkeit häufig zur Untersuchung von [Ca2+]-Zytänderungen verwendet25,26,27,28,29,30. GCaMPs enthalten ein einzelnes zirkulär permutiertes (cp) GFP, das wiederum mit CaM und dem M13-Peptid verschmolzen ist. Die Ca2+-abhängigeWechselwirkung zwischen CaM und M13 bewirkt eine Konformationsänderung im Sensor, die eine Verschiebung des Protonierungszustands des cpGFP fördert und sein fluoreszierendes Signal verstärkt. Wenn also die Ca2+-Pegel steigen, nimmt das cpGFP-Signal zu.

Um die Dynamik von Ca2+ Signalen zu untersuchen, die als Reaktion auf mechanische Verwundung oder Pflanzenfresserfütterung erzeugt werden, haben wir transgene Arabidopsis thaliana Pflanzen verwendet, die eine GCaMP-Variante, GCaMP3, und ein Weitfeld-Fluoreszenzmikroskop6exprimieren. Dieser Ansatz hat es geschafft, die schnelle Übertragung eines Ca 2+-Fernsignals von der Wundstelle aufeinem Blatt auf die gesamte Pflanze zu visualisieren. So wurde sofort ein Anstieg des[Ca2+]Zyts an der Wundstelle festgestellt, aber dieses Ca2+ Signal wurde dann innerhalb weniger Minuten nach der Verwundung durch das Gefäß durch die benachbarten Blätter verbreitet. Darüber hinaus fanden wir heraus, dass die Übertragung dieses schnellen systemischen Wundsignals in Arabidopsis-Pflanzen mit Mutationen in zwei Glutamatrezeptor-ähnlichen Genen, Glutamatrezeptor-like (GLR), GLR3.3 und GLR3.66, aufgehoben wird. Die GLRs scheinen als aminosäuregesteuerte Ca2+ Kanäle zu fungieren, die an verschiedenen physiologischen Prozessen beteiligt sind, einschließlich Wundantwort3,Pollenröhrenwachstum31,Wurzelentwicklung32,Kältereaktion33und angeborene Immunität34. Trotz dieser gut verstandenen, breiten physiologischen Funktion der GLRs sind Informationen über ihre funktionellen Eigenschaften, wie ihre Ligandenspezifität, Ionenselektivität und subzelluläre Lokalisation, begrenzt35. Neuere Studien berichteten jedoch, dass GLR3.3 und GLR3.6 im Phloem bzw. Xylem lokalisiert sind. Pflanzliche GLRs haben Ähnlichkeiten mit ionotropen Glutamatrezeptoren (iGluRs)36 bei Säugetieren, die durch Aminosäuren wie Glutamat, Glycin und D-Serin im Nervensystem von Säugetieren aktiviert werden37. Tatsächlich haben wir gezeigt, dass die Anwendung von 100 mM Glutamat, aber nicht anderer Aminosäuren, an der Wundstelle ein schnelles, fernförmiges Ca2+ Signal in Arabidopsisinduziert, was darauf hindeutet, dass extrazelluläres Glutamat wahrscheinlich als Wundsignal in Pflanzen wirkt6. Diese Reaktion wird in der glr3.3/glr3.6-Mutante aufgehoben, was darauf hindeutet, dass Glutamat durch einen oder beide dieser rezeptorähnlichen Kanäle wirken könnte, und tatsächlich wurde kürzlich gezeigt, dass AtGLR3.6 durch diese Glutamatspiegel38eingezäunt wird.

In Pflanzen wurde Glutamat neben seiner Rolle als strukturelle Aminosäure auch als wichtiger Entwicklungsregulator vorgeschlagen39; seine räumliche und zeitliche Dynamik ist jedoch wenig verstanden. Genau wie für Ca2+wurden mehrere genetisch kodierte Indikatoren für Glutamat entwickelt, um die Dynamik dieser Aminosäure in lebenden Zellen zu überwachen40,41. iGluSnFR ist ein GFP-basierter Single-FP-Glutamat-Biosensor, der aus cpGFP und einem Glutamat-bindenden Protein (GltI) aus Escherichia coli42,43besteht. Die Konformationsänderung von iGluSnFR, die durch Glutamatbindung an GltI induziert wird, führt zu einer verstärkten GFP-Fluoreszenzemission. Um zu untersuchen, ob extrazelluläres Glutamat als Signalmolekül in der pflanzlichen Wundantwort wirkt, haben wir die iGluSnFR-Sequenz mit der grundlegenden Chitinase-Signalpeptidsekretionssequenz (CHIB-iGluSnFR) verbunden, um diesen Biosensor im apoplastischen Raum zu lokalisieren6. Dieser Ansatz ermöglichte die Abbildung von Veränderungen der apoplastischen Glutamatkonzentration ([Glu]apo) mit transgenen Arabidopsis-Pflanzen, die diesen Sensor exprimieren. Wir haben einen schnellen Anstieg des iGluSnFR-Signals an der Wundstelle festgestellt. Diese Daten unterstützen die Idee, dass Glutamat bei der Verwundung aus den beschädigten Zellen / Geweben in den Apoplast austritt und als Schadenssignal wirkt, das die GLRs aktiviert und zum Fernsignal Ca2+ in Pflanzen6führt.

Hier beschreiben wir ein pflanzenweites Echtzeit-Bildgebungsverfahren mit genetisch kodierten Biosensoren zur Überwachung und Analyse der Dynamik von Fernsignalen von Ca2+ und extrazellulärem Glutamat als Reaktion auf Diebstwunden6. Die Verfügbarkeit von Weitfeld-Fluoreszenzmikroskopie und transgenen Pflanzen, die genetisch kodierte Biosensoren exprimieren, bietet einen leistungsstarken, aber leicht zu implementierenden Ansatz zur Erkennung schnell übertragener Fernsignale wie Ca2+ Wellen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. Pflanzenmaterialaufbereitung

  1. In einer 1,5 ml Mikroröhrchen sterilisieren Sie die Samen der Arabidopsis thaliana (Col-0 Accession) Pflanze, die entweder GCaMP3 oder CHIB-iGluSnFR exprimiert, indem Sie mit 20% (v / v) NaClO für 3 min schütteln und dann 5 mal mit sterilem destilliertem Wasser waschen.
    HINWEIS: Die transgenen Linien von Arabidopsis, die GCaMP3 oder CHIB-iGluSnFR exprimieren, wurden zuvor beschrieben6.
  2. Säen Sie in einer sterilen Haube 13 oberflächensterilisierte Samen auf einer 10 cm großen quadratischen Kunststoff-Petrischale, die mit 30 ml sterilem (autoklaviertem) Murashige und Skoog (MS) Medium gefüllt ist [1x MS-Salze, 1% (w/v) Saccharose, 0,01% (w/v) Myoinositol, 0,05% (w/v) MES und 0,5% (w/v) Gellangummi; pH 5,7 eingestellt mit 1N KOH]. Ersetzen Sie den Deckel und wickeln Sie ihn mit chirurgischem Klebeband ein.
  3. Nach der Inkubation im Dunkeln bei 4 °C für 2 Tage die Platten horizontal bei 22 °C in eine Wachstumskammer unter Dauerlicht (90-100 μmol m-2 s-1) für ca. 2 Wochen vor Gebrauch legen. Zählen Sie nach 2 Wochen die Anzahl der Arabidopsis-Blätter von den ältesten bis zu den jüngsten44 (Abbildung 1). Wundreaktionen bewegen sich vorzugsweise vom beschädigten Blatt (n) zu Blättern mit den Nummern n ± 3 und n ± 56.
    HINWEIS: In diesem Protokoll wird die Petrischale geöffnet, um die Wund- und Glutamateffekte unter einem Fluoreszenzmikroskop abbilden zu können. Daher sollten nachfolgende Schritte in diesem Experiment unter temperatur- und feuchtigkeitskontrollierten Raumbedingungen durchgeführt werden. Dies liegt daran, dass Ca2+ Signale auch durch Veränderungen dieser Umgebungsbedingungen ausgelöst werden. Es ist auch bekannt, dass das blaue Licht, das während der Aufzeichnung zur Anregung der Fluoreszenz des Biosensorproteins vom Mikroskop emittiert wird, eine Erhöhung der zytosolischen Ca2+ Konzentration45 hervorrufen kann und daher die Pflanze vor Beginn des Experiments einige Minuten an die Blaulichtbestrahlung gewöhnt werden sollte.

2. Chemische Zubereitung

  1. L-Glutamat in einem flüssigen Wachstumsmedium [1/2x MS-Salze, 1% (w/v) Saccharose und 0,05% (w/v) MES; pH 5,1 mit 1N KOH eingestellt] auflösen, um eine 100 mM Arbeitslösung herzustellen.
    HINWEIS: Vermeiden Sie die Verwendung von Glutamatsalzen wie Natriumglutamat, um mögliche kationenbedingte Auswirkungen auf die Ca2+ Dynamik zu verhindern.

3. Mikroskopeinstellung und Durchführung von Echtzeit-Bildgebung

  1. Schalten Sie das motorisierte Fluoreszenz-Stereomikroskop ein, das mit einem 1x Objektiv (NA = 0,156) und einer sCMOS-Kamera(Abbildung 2)ausgestattet ist, und konfigurieren Sie die Geräteeinstellungen so, dass es mit einem 470/40 nm Anregungslicht bestrahlt und ein Emissionslicht durch einen 535/50 nm Filter erhält.
    HINWEIS: Jedes GFP-empfindliche Fluoreszenzmikroskop kann verwendet werden, um GCaMP3- und iGluSnFR-Signale in Echtzeit zu detektieren, aber ein Objektiv mit geringem Stromverbrauch und eine hochempfindliche Kamera mit einem breiten sCMOS-Chip werden empfohlen, um Signale von der gesamten Anlage zu erfassen. Das Low-Power-Objektiv ermöglicht die Abbildung der Reaktion einer gesamten Arabidopsis-Anlage und die Verwendung einer hochempfindlichen Kamera ermöglicht die schnelle Datenerfassung, die erforderlich ist, um den schnellen Zeitverlauf der wundauslösenden Ca2+ Welle zu erfassen. Für das in dieser Studie verwendete Fluoreszenzmikroskop betragen die maximalen Werte des Sichtfeldes und der zeitlichen Auflösung 3 cm x 3 cm bzw. 30 Bilder pro Sekunde (fps).
  2. Entfernen Sie den Deckel und stellen Sie die Schüssel unter die Objektivlinse.
  3. Überprüfen Sie das Fluoreszenzsignal der Pflanze und warten Sie dann ca. 30 Min im Dunkeln, bis die Pflanzen an die neuen Umweltbedingungen angepasst sind. Dieser Anpassungsschritt ist erforderlich, da Feuchtigkeitsänderungen [Ca2+]zytenerhöhungen in Pflanzen hervorrufen, die alle wundbedingten Ereignisse stören können.
  4. Stellen Sie den Fokus und die Vergrößerung ein, um die gesamte Pflanze im Sichtfeld zu sehen. Im aktuellen Protokoll wurde eine 0,63-fache Vergrößerung verwendet.
  5. Bevor Sie mit der Echtzeit-Bildgebung beginnen, richten Sie die Erfassungsparameter ein, um die Fluoreszenzsignale mit einer Mikroskop-Bildgebungssoftware zu erkennen. Die Einstellungen für die Bildgebung im aktuellen Protokoll sind: Belichtungs- und Intervallzeiten auf 1,8 s bzw. 2 s (d. h. 0,5 fps) eingestellt. Stellen Sie die Aufnahmezeit auf 11 min ein.
  6. Bild für 5 Minuten vor Beginn des Experiments, um die Pflanze an die Blaulichtbestrahlung des Mikroskops zu gewöhnen, und starten Sie dann die Aufnahme, indem Sie auf Jetzt ausführenoder den entsprechenden Befehl in der verwendeten Mikroskopsoftware verwenden. Um die durchschnittliche Ausgangsfluoreszenz zu bestimmen, zeichnen Sie mindestens 10 Frames (d. h. mindestens 20 s im aktuellen Protokoll) auf, bevor Sie gewickelt oder Glutamat auftragen (siehe Abschnitt 4).
    1. Zur Echtzeit-Bildgebung von wundinduzierten [Ca2+]Zyt- und [Glu]Apo-Veränderungen schneiden Sie den Blattstiel oder den mittleren Bereich des Blattes L1 mit einer Schere ab (Abbildung 3 und Abbildung 4).
    2. Für die Echtzeit-Bildgebung von Glutamat-ausgelösten [Ca2+]Zytveränderungen schneiden Sie den Rand (ca. 1 mm von der Spitze entfernt) von Blatt 1 über die Hauptvene mit einer Schere. Nach mindestens 20 Minuten Erholungsphase 10 μL 100 mM Glutamat auf die Schnittfläche des Blattes auftragen (Abbildung 5).
      HINWEIS: Dieses Vorschneiden war notwendig, um Glutamat den Zugang zum Blattapoplasten zu ermöglichen, um Reaktionen auszulösen. Darüber hinaus erwies sich das Auftragen eines Tropfens destilliertem Wasser auf die Schnittoberfläche des Blattes L1 als kritisch, um zu verhindern, dass die Proben während der Erholung vor dem Auftragen von Glutamat austrocknen.
  7. Nachdem Sie die 11-minütige Aufzeichnung abgeschlossen haben, speichern Sie die Daten.

4. Datenanalyse

  1. Für die Analyse der Fluoreszenzintensität im Zeitverlauf definieren Sie einen Bereich von Interesse (ROI) an der Stelle, an der die Fluoreszenzintensität analysiert werden soll (Abbildung 6 und Abbildung 7). Definieren Sie für die Geschwindigkeitsberechnung der Ca2+ Welle 2 ROIs (ROI1 und ROI2) für die Analyse. Klicken Sie in der Bildgebungssoftware auf Zeitmessung | definieren | Kreis. Messen Sie den Abstand zwischen ROI1 und ROI2, indem Sie auf Anmerkungen und | Länge | Einfache Linie (Abbildung 6).
  2. Messen Sie die Rohfluoreszenzwerte (F) in jedem ROI im Laufe der Zeit, indem Sie auf Messenklicken. Exportieren Sie Rohdaten in eine Tabellenkalkulationssoftware, um das Fluoreszenzsignal zu jedem Zeitpunkt in Zahlen umzuwandeln, indem Sie auf All to Excel | Exportieren.
  3. Bestimmen Sie den Ausgangsfluoreszenzwert, der als F0definiert ist, indem Sie den Durchschnitt von F über die ersten 10 Frames (d. h. vor der Behandlung) in den aufgezeichneten Daten berechnen.
  4. Normalisieren Sie die F-Daten (durch Berechnung von ΔF/F) mit der Gleichung ΔF/F = (F−F0)/F0, wobei ΔF die zeitabhängige Änderung der Fluoreszenz ist.
  5. Definieren Sie für die Ca2+ Wellengeschwindigkeitswellenanalyse einen signifikanten Signalanstiegspunkt über den vorstimulierten Werten als Nachweis einer Ca2+ Erhöhung in jedem ROI (t1 und t2) unter Verwendung des Kriteriums eines Anstiegs auf 2× der Standardabweichung (2x SD), die aus den F0-Daten mit statistischer Software berechnet wird. 95% der F0-Daten liegen innerhalb von 2x SD vom Mittelwert, was darauf hindeutet, dass ein Anstieg des Signals über diesem Niveau zufällig ≤5% beträgt. Berechnen Sie die Zeitdifferenz der Ca2+ Erhöhung zwischen ROI1 und ROI2 [t2- t1 Time-Lag (Δt)] und messen Sie den Abstand zwischen ROI1 und ROI2, dann bestimmen Sie die Geschwindigkeiten jeder Ca2+ Welle.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Die Signalausbreitung von [Ca2+]cyt und [Glu]apo als Reaktion auf Wunden ist in Abbildung 3, Abbildung 4, Movie S1und Movie S2dargestellt. Das Schneiden des Blattstiels 1 in Pflanzen, die GCaMP3 (bei 0 s) exprimierten, führte zu einem signifikanten Anstieg des [Ca2+]Zyts, der schnell lokal durch das Gefäß (bei 40 s) induziert wurde (Abbildung 3 und Film S1). Anschließend wurde das Signal innerhalb weniger Minuten (bei 80 s) schnell auf benachbarte Blätter (Blatt 3 und 6) übertragen(Abbildung 3 und Film S1).

Beim Schneiden von Blatt 1 in Pflanzen, die CHIB-iGluSnFR exprimieren, wurde ein schneller [Glu]Apo-Anstieg um die Schnittregion (bei 2 s) beobachtet. Dieses Signal wurde innerhalb weniger Minuten (bei 160 s) lokal durch das Gefäß übertragen, aber in systemischen Blättern nicht beobachtet (Abbildung 4 und Film S2).

Für die Echtzeit-Bildgebung der Ca 2+-Signalausbreitung, die durch die Anwendung von Glutamat ausgelöst wird, wurde der Rand (ca. 1 mm von der Spitze entfernt) von Blatt 1 in Pflanzen, die GCaMP3 exprimieren, wie in Abbildung 5A und Film S3gezeigt geschnitten. Das Schneiden der Kante von Blatt 1 verursachte einen lokalen [Ca2+]Zytanstieg (bei 40 s), aber dieses Signal verschwand innerhalb weniger Minuten (bei 124 s). Nach etwa 10 Minuten Wartezeit bis zur Erholung der Pflanze wurden 10 μL 100 mM Glutamat auf die Schnittfläche von Blatt 1 aufgetragen, was lokal (bei 56 s) zu einem schnellen, signifikanten Anstieg des [Ca2+]Cyt führte und eine Ausbreitung auf distale Blätter (bei 104 s) signalisierte(Abbildung 5B und Film S4).

Um die Veränderungen des [Ca2+]Zyts zu messen, die durch Eineundung im systemischen Blatt induziert werden, wurden zwei ROIs (ROI1 und ROI2) im Basisbereich und an der Blattspitze 6 in Pflanzen festgelegt, die GCaMP3 exprimieren, wie in Abbildung 6Agezeigt. Die zeitliche Verlaufsänderung der GCaMP3-Signalintensität in ROI1 und ROI2 beim Schneiden des Blattstiels von Blatt 1 wurde gemessen (Abbildung 6B). Ein signifikanter Anstieg des [Ca2+]Cyt bei ROI1 wurde früher als der roi2 festgestellt (Abbildung 6B). [Ca2+] Cyt erreichte nach der Verwundung einen Höhepunkt von etwa 100 s, dauerte über 10 Minuten und zeigte zwei Phasen (Abbildung 6B).

Zur Bestimmung der Geschwindigkeiten der Ca2+-Welle bei mechanischer Verwundung wurde der Zeitpunkt eines signifikanten Signalanstiegs über die vorstimulierten Werte in ROI1 und ROI2 bestimmt (Zeitverzögerung; siehe Abschnitt 4) (Abbildung 6C). Da der Abstand zwischen ROI1 und ROI2 in diesem Fall 2,7 mm betrug (Abbildung 6A), wurde die Ca2+ Signalgeschwindigkeit in Blatt 6 mit 0,15 mm/s berechnet. Um die[Glu]-Apo-Veränderungen als Reaktion auf die mechanische Beschädigung zu messen, wurde ROI1 in der Nähe der Schnittstelle des als L1 gekennzeichneten Blattes eingestellt, wie in Abbildung 7Agezeigt. [Glu] Die Apo-Signatur bei ROI1 hat einen einzigen Peak von etwa 100 s nach der Verwundung gezeigt (Abbildung 7B).

Figure 1
Abbildung 1: Nummerierung der Arabidopsis-Rosettenblätter. Arabidopsis Blätter sind von den ältesten bis zu den jüngsten nummeriert (linke Tafel). Ein schematisches Diagramm der Position der Blätter ist im rechten Feld angezeigt. L: Blatt, C: Keimblätter. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 2
Abbildung 2: Ein in dieser Studie verwendetes Fluoreszenzmikroskop. [Ca2+]Zyt- und [Glu]-Apodynamik wurden mit einem Weitfeld-Fluoreszenz-Stereomikroskop abgebildet. R: Fernbedienung, O: 1x Objektiv, C: sCMOS Kamera, T: Trinokular Kipprohr, S: Bühne, P: Pflanzenmaterial. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 3
Abbildung 3: Wundinduzierte Fernsignalübertragung Ca2+. Das Schneiden des Blattstiels (weißer Pfeil, 0 s) von Blatt 1 (L1) in pflanzenexpressierendem GCaMP3 löste eine lokale [Ca2+]Zytenzunahme (roter Pfeil, 40 s) aus, die auf systemische Blätter [Blatt 3 (L3) und Blatt 6 (L6)] übertragen wurde (orange Pfeile, 80 s). Maßstabsleiste, 5 mm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 4
Abbildung 4: Wundauslösende [Glu]Apo-Erhöhung. Das Schneiden des Blattes 1 (L1) (weißer Pfeil, 0 s) in Pflanzen, die CHIB-iGluSnFR exprimieren, verursachte eine schnelle Erhöhung von [Glu]apo (roter Pfeil, 80 s), die sich durch das Gefäßsystem ausbreitete (oranger Pfeil, 160 s). Maßstabsleiste, 2 mm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 5
Abbildung 5: Glutamat-ausgelöste Fernsignalübertragung Ca2+. (A) Schneiden der Kante (ca. 1 mm von der Spitze entfernt) von Blatt 1 (L1) in Pflanzen, die GCaMP3 (weißer Pfeil, 0 s) exprimieren, verursachte eine [Ca2+]Zyterhöhung (roter Pfeil, 40 s). (B) Die Anwendung von 100 mM Glutamat auf die Schnittfläche von L1 (weißer Pfeil, 0 s) verursachte eine lokale [Ca2+]Zytenzunahme (roter Pfeil, 56 s), die sich schnell auf distale Blätter [z. B. Blatt 3 (L3), Blatt 4 (L4) und Blatt 6 (L6)] ausbreitete (orange Pfeile, 104 s). Maßstabsbalken, 5 mm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 6
Abbildung 6: [Ca2+]Zytensignatur in systemischen Blättern als Reaktion auf mechanische Wunden. (A) Ein erweitertes Bild von Blatt 6 (L6) in Pflanzen, die GCaMP3 exprimieren, ist in Abbildung 3dargestellt. ROI1 (blauer Kreis) und ROI2 (rosa Kreis) wurden an der Basis bzw. im Spitzenbereich festgelegt. Weißer Pfeil zeigt die Schnittstelle des Blattstiels 1 (L1) an. In diesem Fall betrug der Abstand zwischen ROI1 und ROI2 2,7 mm. (B) Quantifizierung der [Ca2+]Zytsignaturen in ROI1 und ROI2. Fluoreszenzintensitätsänderungen wurden mit Hilfe einer Bildgebungssoftware analysiert. (C) Eine erweiterte Spur von Daten in (B) zwischen 0 s und 80 s. Detektionspunkte einer Ca2+ Erhöhung des ROI1 und ROI2 wurden als t1 bzw.t2definiert, wobei als Kriterium ein Anstieg auf das 2-fache der Standardabweichung der Vorstimulationswerte (2x SD, gestrichelte Linie) herangezogen wurde. Der Wert von t2 - t1 wurde im aktuellen Protokoll als Time-Lag (Δt) definiert. Schwarzer Pfeil zeigt die Schnittzeit an. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 7
Abbildung 7: [Glu]apo-Signatur als Reaktion auf mechanische Wunden. (A) Ein erweitertes Bild von Blatt 1 (L1) in Pflanzen, die CHIB-iGluSnFR exprimieren, ist in Abbildung 4 dargestellt. ROI1 wurde in der Nähe der Cut-Site eingestellt. Der weiße Pfeil zeigt den Schnittbereich an. (B) Die Quantifizierung der [Glu]Apo-Signatur im ROI1 wird mit Hilfe einer Bildgebungssoftware überwacht. Schwarzer Pfeil zeigt die Schnittzeit an. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Film S1: Fernübertragung Ca2+ nach mechanischer Verwundung. Mechanische Wunden am Blattstiel von Blatt 1 (L1) verursachten einen [Ca2+]Zytanstieg, der auf distale Blätter übertragen wurde [z. B. Blatt 3 (L3) und Blatt 6 (L6)]. Bitte klicken Sie hier, um diesen Film herunterzuladen.

Film S2: Erhöhung des apoplastischen Glutamatspiegels als Reaktion auf das Schneiden. Mechanische Verwundung des Blattes 1 (L1) verursachte eine sofortige Zunahme von [Glu]apoBitte klicken Sie hier, um diesen Film herunterzuladen.

Film S3: Erhöhung der [Ca2+]Zytpegel als Reaktion auf das Schneiden. Mechanische Verwundungen am Rand von Blatt 1 (L1) verursachten eine sofortige, lokale [Ca2+]Zytenerhöhung. Bitte klicken Sie hier, um diesen Film herunterzuladen.

Film S4: Anwendung von Glutamat löst systemische [Ca2+]Zyterhöhungen aus. Die Anwendung von 100 mM Glutamat löste eineCa2+-Übertragung auf systemische Blätter aus [z. B. Blatt 3 (L3), Blatt 4 (L4) und Blatt 6 (L6)]. Bitte klicken Sie hier, um diesen Film herunterzuladen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Systemische Signalisierung ist wichtig für Pflanzen, um auf lokalisierte äußere Umweltreize zu reagieren und dann ihre Homöostase auf einer ganzen Pflanzenebene zu erhalten. Obwohl sie nicht wie Tiere mit einem fortgeschrittenen Nervensystem ausgestattet sind, verwenden sie eine schnelle Kommunikation sowohl innerhalb als auch zwischen Organen, basierend auf Faktoren wie mobilen elektrischen (und möglicherweise hydraulischen) Signalen und sich ausbreitenden Wellen von ROS und Ca2 + 46,47. Das oben beschriebene Protokoll ermöglicht eine pflanzenweite Echtzeit-Bildgebung der Aktivität dieses Signalsystems durch Überwachung der Dynamik von Ca2+ und apoplastischem Glutamat als Reaktion auf Wunden. Diese Methode bietet ein robustes Werkzeug zum Verständnis von schnellen und Fernsignalen in Anlagen, die eine hohe räumlich-zeitliche Auflösung und Benutzerfreundlichkeit kombinieren. Dieses Protokoll bietet auch das Potenzial, neue physiologische Einblicke in die molekularen Mechanismen zu liefern, die der Wundsignalisierung über große Entfernungen zugrunde liegen, z. B. durch die Verwendung von Mutanten, die in mutmaßlichen Elementen des schnellen Signalsystems defekt sind, oder die Erforschung der Wirkungen pharmakologischer Reagenzien wie Ca2+ Kanalblocker (z. B. LaCl3) oder Inhibitoren anderer potenziell wichtiger Signalaktivitäten6.

Ein wichtiger Vorteil der beschriebenen Biosensor-Bildgebungsmethode ist die Verwendung von Single-FP-Biosensoren mit hoher Fluoreszenzausbeute, die sowohl die für diese Messungen erforderliche Ausrüstung als auch deren Einsatz in planta erheblich vereinfachen. So werden fluoreszenzbasierte genetisch kodierte Indikatoren in zwei Klassen eingeteilt: 1) intensitätsbasierte Single-FP-Biosensoren und 2) ratiometrische FRET-basierte Biosensoren10. Obwohl ratiometrische FRET-basierte Sensoren quantitativ genau sind, bieten intensitätsbasierte Ca2+ Indikatoren, einschließlich der hier verwendeten GCaMP3 und iGluSnFR, aufgrund ihres allgemein helleren Ca2+-reaktionsfähigen Signals und ihrer einfacheren Mikroskopanforderungen sowohl eine höhere zeitliche Auflösung als auch eine höhere Benutzerfreundlichkeit10. Zum Beispiel wurde berichtet, dass der rot fluoreszierende proteinbasierte Single-FP Ca2+ Indikator R-GECO1 im Vergleich zum ratiometrischen YC3.6-Biosensor27eine viel größere Signaländerung als Reaktion auf extrazelluläres ATP und die pflanzlichen Abwehrelfentscheider flg22 und Chitin zeigt. Für die Analyse ratiometrischer FRET-basierter Sensoren ist es auch notwendig, ein spezialisiertes Mikroskop mit mehreren Filtern zu verwenden, um Daten bei zwei Wellenlängen zu sammeln, während Single-FP-basierte Biosensoren erfordern, dass das Gerät die Daten nur bei einer Wellenlänge sammelt, eine Fähigkeit, die in allen Standard-Fluoreszenzmikroskopen10zu finden ist. Es ist jedoch wichtig zu beachten, dass die Verwendung von Single-FP-Biosensoren einige Nachteile mit sich hat. Diese intensitätsbasierten Single-FP-Biosensoren werden nicht zur Quantifizierung absoluter Konzentrationsänderungen oder zur Langzeitbildgebung über viele Stunden oder Tage bevorzugt. Diese Einschränkung liegt daran, dass zusätzlich zu z. B. dem Ca2+-Pegel für GCaMP3 die Signalintensität dieser Single-FP-Biosensoren von anderen Faktoren wie dem Sensorexpressionsniveau oder Parametern wie dem zellulären pH-Wert beeinflusst wird, die sich im Laufe der Zeit ändern können.

Bis heute wurden viele neue Varianten dieser genetisch kodierten Indikatoren entwickelt, um das Signal-Rausch-Verhältnis, den Dynamikbereich, die Kinetik und die Sensorstabilität zu verbessern. Zum Beispiel, nachdem Nakai et al.26 das erste GCaMP entwickelt haben, wurden verschiedene aufeinanderfolgende Varianten, wie die GECOs, durch eine Kombination aus Mutagenese und sorgfältiger Charakterisierung48,49,50erzeugt. Der Dynamikbereich von G-GECO (Green-GECO) war berichten zufolge etwa doppelt so groß wie der von GCaMP328. Darüber hinaus führte der Ersatz durch verschiedene fluoreszierende Proteine in diesen Indikatoren zur Generierung von GECO-Varianten mit unterschiedlichen Emissionsspektren, wie B-GECO (Blue-GECO) und R-GECO (Red-GECO), was den Einsatz dieser Indikatoren neben anderen GFP-Spektralvarianten in mehrfarbigen Bildgebungsanwendungen ermöglicht28. In ähnlicher Weise wurde GCaMP weiterentwickelt und verbessert, wobei eine Reihe von Sensoren für die Reaktionsgeschwindigkeit und amplitude des Signals verbessert wurden, die jetzt verfügbar sind50. Zur Überwachung der Glutamatdynamik wurden neben iGluSnFR, einer Reihe von FRET-basierten Glutamat-Biosensoren, den FLuorescent Indicator Proteins for Glutamat (FLIPE)entwickelt 40. FLIPE besteht aus CFP und YFP, die über das Glutamat-bindende Protein ybeJ aus E. colimiteinander verbunden sind. Bei der Bindung von Glutamat an YbeJ wird eine glutamatkonzentrationsabhängige Abnahme der FRET-Effizienz beobachtet. Daher stehen sowohl für Ca2+ als auch für Glutamat mehrere Single-FP- und ratiometrische Sensoren zur Verfügung. Forscher sollten den geeigneten Biosensor in Betracht ziehen, um die Signaldynamik abhängig vom experimentellen Design und den Anforderungen an Messfaktoren wie hohes Signal: Rauschen (Single-FP-Sensoren) im Vergleich zu einem Bedarf an hochgenauer Quantifizierung (wo FRET-Sensoren sich auszeichnen) zu erkennen.

Das hier beschriebene Weitfeld-Single-FP-Bildgebungsverfahren für die Verwundung sollte auch bei der Anwendung auf andere stresssystemische Signalprozesse nützlich sein. Trotz des Vorhandenseins zahlreicher Berichte, die auf eine entscheidende Rolle der Fernsignalisierung von Ca2+ bei verschiedenen Stressreaktionen hindeuten, wie z. B. Pflanzenfresserangriff6,51,52, Salz20und Dürre53, haben nur wenige Studien die raumzeitlichen Informationen in Bezug auf schnelle Fernsignale von Ca2 + geliefert,die durch diese Stressreaktionen induziert werden6,7,20,52. Die Verwendung eines Weitfeld-Fluoreszenzmikroskops in diesem Protokoll ermöglicht auch die Echtzeitbeobachtung der mobilen Signaldynamik nicht nur in der Blatt-zu-Blatt-Kommunikation, sondern auch in der Root-to-Shoot-Kommunikation, wie kürzlich gezeigt38. Obwohl wir uns auf Protokolle für Arabidopsiskonzentriert haben, bietet diese pflanzenweite Echtzeit-Bildgebungsmethode auch ein robustes Werkzeug, um die räumlichen und zeitlichen Eigenschaften der systemischen Ca2+ Signalisierung sowohl bei biotischen als auch bei abiotischen Stressreaktionen bei anderen Pflanzenarten wie Tabak30zu verstehen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte.

Acknowledgments

Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse der Japan Society for the Promotion of Science (17H05007 und 18H05491) an MT, der National Science Foundation (IOS1557899 und MCB2016177) und der National Aeronautics and Space Administration (NNX14AT25G und 80NSSC19K0126) an SG unterstützt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Arabidopsis expressing GCaMP3 Saitama University
Arabidopsis expressing CHIB-iGluSnFR Saitama University
GraphPad Prism 7 GraphPad Software
L-Glutamate FUJIFILM Wako 072-00501 Dissolved in a liquid growth medium [1/2x MS salts, 1% (w/v) sucrose, and 0.05% (w/v) MES; pH 5.1 adjusted with 1N KOH].
Microsoft Excel Microsoft Corporation
Murashige and Skoog (MS) medium FUJIFILM Wako 392-00591 composition: 1x MS salts, 1% (w/v) sucrose, 0.01% (w/v) myoinositol, 0.05% (w/v) MES, and 0.5% (w/v) gellan gum; pH 5.7 adjusted with 1N KOH.
Nikon SMZ25 stereomicroscope Nikon
NIS-Elements AR analysis Nikon
1x objective lens (P2-SHR PLAN APO) Nikon
sCMOS camera (ORCA-Flash4.0 V2) Hamamatsu Photonics C11440-22CU
Square plastic Petri dish Simport D210-16

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wu, J., Baldwin, I. T. Herbivory-induced signalling in plants: perception and action. Plant, Cell & Environment. 32, (9), 1161-1174 (2009).
  2. Howe, G. A., Major, I. T., Koo, A. J. Modularity in Jasmonate Signaling for Multistress Resilience. Annual Review of Plant Biology. 69, (1), 387-415 (2018).
  3. Mousavi, S. A. R., Chauvin, A., Pascaud, F., Kellenberger, S., Farmer, E. E. GLUTAMATE RECEPTOR-LIKE genes mediate leaf-to-leaf wound signalling. Nature. 500, (7463), 422-426 (2013).
  4. Gilroy, S., et al. Electric Signals: Key Mediators of Rapid Systemic Signaling in Plants. Plant Physiology. 171, (3), 1606-1615 (2016).
  5. Choi, W. -G., Hilleary, R., Swanson, S. J., Kim, S. -H., Gilroy, S. Rapid, long-distance electrical and calcium signaling in plants. Annual Review of Plant Biology. 67, (1), 287-307 (2016).
  6. Toyota, M., et al. Glutamate triggers long-distance, calcium-based plant defense signaling. Science. 361, (6407), 1112-1115 (2018).
  7. Nguyen, C. T., Kurenda, A., Stolz, S., Chételat, A., Farmer, E. E. Identification of cell populations necessary for leaf-to-leaf electrical signaling in a wounded plant. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115, (40), 10178-10183 (2018).
  8. Lecourieux, D., Ranjeva, R., Pugin, A. Calcium in plant defence-signalling pathways. New Phytologist. 171, (2), 249-269 (2006).
  9. Farmer, E. E., Gao, Y. -Q., Lenzoni, G., Wolfender, J. -L., Wu, Q. Wound- and mechanostimulated electrical signals control hormone responses. New Phytologist. 227, (4), 1037-1050 (2020).
  10. Palmer, A. E., Qin, Y., Park, J. G., McCombs, J. E. Design and application of genetically encoded biosensors. Trends in Biotechnology. 29, (3), 144-152 (2011).
  11. Ridgway, E. B., Ashley, C. C. Calcium transients in single muscle fibers. Biochemical and Biophysical Research Communications. 29, (2), 229-234 (1967).
  12. Kiegle, E., Moore, C. A., Haseloff, J., Tester, M. A., Knight, M. R. Cell-type-specific calcium responses to drought, salt and cold in the Arabidopsis root. The Plant Journal. 23, (2), 267-278 (2000).
  13. Zhu, X., Feng, Y., Liang, G., Liu, N., Zhu, J. -K. Aequorin-based luminescence imaging reveals stimulus- and tissue-specific Ca2+ dynamics in Arabidopsis plants. Molecular Plant. 6, (2), 444-455 (2013).
  14. Kwaaitaal, M., Huisman, R., Maintz, J., Reinstädler, A., Panstruga, R. Ionotropic glutamate receptor (iGluR)-like channels mediate MAMP-induced calcium influx in Arabidopsis thaliana. Biochemical Journal. 440, (3), 355-373 (2011).
  15. Vatsa, P., et al. Involvement of putative glutamate receptors in plant defence signaling and NO production. Biochimie. 93, (12), 2095-2101 (2011).
  16. Toyota, M., Furuichi, T., Sokabe, M., Tatsumi, H. Analyses of a gravistimulation-specific Ca2+ signature in Arabidopsis using parabolic flights. Plant Physiology. 163, (2), 543-554 (2013).
  17. Toyota, M. Hypergravity stimulation induces changes in intracellular calcium concentration in Arabidopsis seedlings. Advances in Space Research. 39, 1190-1197 (2007).
  18. Stephan, A. B., Kunz, H. -H., Yang, E., Schroeder, J. I. Rapid hyperosmotic-induced Ca2+ responses in Arabidopsis thaliana exhibit sensory potentiation and involvement of plastidial KEA transporters. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113, (35), 5242-5249 (2016).
  19. Nagai, T., Yamada, S., Tominaga, T., Ichikawa, M., Miyawaki, A. Expanded dynamic range of fluorescent indicators for Ca2+ by circularly permuted yellow fluorescent proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, (29), 10554-10559 (2004).
  20. Choi, W. -G., Toyota, M., Kim, S. -H., Hilleary, R., Gilroy, S. Salt stress-induced Ca2+ waves are associated with rapid, long-distance root-to-shoot signaling in plants. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, (17), 6497-6502 (2014).
  21. Evans, M. J., Choi, W. -G., Gilroy, S., Morris, R. J. A ROS-assisted calcium wave dependent on the AtRBOHD NADPH oxidase and TPC1 cation channel propagates the systemic response to salt stress. Plant Physiology. 171, (3), 1771-1784 (2016).
  22. Hilleary, R., et al. Tonoplast-localized Ca2+ pumps regulate Ca2+ signals during pattern-triggered immunity in Arabidopsis thaliana. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117, (31), 18849-18857 (2020).
  23. Lenglet, A., et al. Control of basal jasmonate signalling and defence through modulation of intracellular cation flux capacity. New Phytologist. 216, (4), 1161-1169 (2017).
  24. Choi, W. -G., Swanson, S. J., Gilroy, S. High-resolution imaging of Ca2+, redox status, ROS and pH using GFP biosensors. The Plant Journal. 70, (1), 118-128 (2012).
  25. Nagai, T., Sawano, A., Park, E. S., Miyawaki, A. Circularly permuted green fluorescent proteins engineered to sense Ca2. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98, (6), 3197-3202 (2001).
  26. Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. A high signal-to-noise Ca2+ probe composed of a single green fluorescent protein. Nature Biotechnology. 19, (2), 137-141 (2001).
  27. Keinath, N. F., et al. Live cell imaging with R-GECO1 sheds light on flg22- and Chitin-induced transient [Ca2+]cyt patterns in Arabidopsis. Molecular Plant. 8, (8), 1188-1200 (2015).
  28. Zhao, Y., et al. An expanded palette of genetically encoded Ca2+ indicators. Science. 333, (6051), 1888-1891 (2011).
  29. Vincent, T. R., et al. Real-time in vivo recording of Arabidopsis calcium signals during insect feeding using a fluorescent biosensor. JoVE. (126), e56142 (2017).
  30. DeFalco, T. A., et al. Using GCaMP3 to study Ca2+ signaling in nicotiana species. Plant and Cell Physiology. 58, (7), 1173-1184 (2017).
  31. Michard, E., et al. Glutamate receptor-like genes form Ca2+ channels in pollen tubes and are regulated by Pistil D-Serine. Science. 332, (6028), 434-437 (2011).
  32. Singh, S. K., Chien, C. -T., Chang, I. -F. The Arabidopsis glutamate receptor-like gene GLR3.6 controls root development by repressing the Kip-related protein gene KRP4. Journal of Experimental Botany. 67, (6), 1853-1869 (2016).
  33. Li, H., et al. Tomato GLR3.3 and GLR3.5 mediate cold acclimation-induced chilling tolerance by regulating apoplastic H2O2 production and redox homeostasis. Plant, Cell & Environment. 42, (12), 3326-3339 (2019).
  34. Li, F., et al. Glutamate receptor-like channel3.3 is involved in mediating glutathione-triggered cytosolic calcium transients, transcriptional changes, and innate immunity responses in Arabidopsis. Plant Physiology. 162, (3), 1497-1509 (2013).
  35. Wudick, M. M., Michard, E., Oliveira Nunes, C., Feijó, J. A. Comparing plant and animal glutamate receptors: common traits but different fates. Journal of Experimental Botany. 69, (17), 4151-4163 (2018).
  36. De Bortoli, S., Teardo, E., Szabò, I., Morosinotto, T., Alboresi, A. Evolutionary insight into the ionotropic glutamate receptor superfamily of photosynthetic organisms. Biophysical Chemistry. 218, 14-26 (2016).
  37. Janovjak, H., Sandoz, G., Isacoff, E. Y. A modern ionotropic glutamate receptor with a K+ selectivity signature sequence. Nature Communications. 2, (1), 232 (2011).
  38. Shao, Q., Gao, Q., Lhamo, D., Zhang, H., Luan, S. Two glutamate- and pH-regulated Ca2+ channels are required for systemic wound signaling in Arabidopsis. Science Signaling. 13, (640), (2020).
  39. Forde, B. G., Lea, P. J. Glutamate in plants: metabolism, regulation, and signalling. Journal of Experimental Botany. 58, (9), 2339-2358 (2007).
  40. Okumoto, S., et al. Detection of glutamate release from neurons by genetically encoded surface-displayed FRET nanosensors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102, (24), 8740-8745 (2005).
  41. Hires, S. A., Zhu, Y., Tsien, R. Y. Optical measurement of synaptic glutamate spillover and reuptake by linker optimized glutamate-sensitive fluorescent reporters. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, (11), 4411-4416 (2008).
  42. Marvin, J. S., et al. An optimized fluorescent probe for visualizing glutamate neurotransmission. Nature Methods. 10, (2), 162-170 (2013).
  43. Marvin, J. S., et al. Stability, affinity, and chromatic variants of the glutamate sensor iGluSnFR. Nature Methods. 15, (11), 936-939 (2018).
  44. Farmer, E., Mousavi, S. A. R., Lenglet, A. Leaf numbering for experiments on long distance signalling in Arabidopsis. Protocol Exchange: Preprint server. (2013).
  45. Harada, A., Shimazaki, K. -i Phototropins and blue light-dependent calcium signaling in higher plants. Photochemistry and Photobiology. 83, (1), 102-111 (2007).
  46. Huber, A. E., Bauerle, T. L. Long-distance plant signaling pathways in response to multiple stressors: the gap in knowledge. Journal of Experimental Botany. 67, (7), 2063-2079 (2016).
  47. Choi, W. -G., et al. Orchestrating rapid long-distance signaling in plants with Ca2+, ROS and electrical signals. The Plant Journal. 90, (4), 698-707 (2017).
  48. Tallini, Y. N., et al. Imaging cellular signals in the heart in vivo: cardiac expression of the high-signal Ca2+ indicator GCaMP2. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103, (12), 4753-4758 (2006).
  49. Tian, L., et al. Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators. Nature Methods. 6, (12), 875-881 (2009).
  50. Chen, T. -W., et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499, (7458), 295-300 (2013).
  51. Vincent, T. R., et al. Interplay of plasma membrane and vacuolar ion channels, together with BAK1, elicits rapid cytosolic calcium elevations in Arabidopsis during aphid feeding. The Plant Cell. 29, (6), 1460-1479 (2017).
  52. Meena, M. K., et al. The Ca2+ channel CNGC19 regulates Arabidopsis defense against spodoptera herbivory. The Plant Cell. 31, (7), 1539-1562 (2019).
  53. Cheong, Y. H., et al. CBL1, a calcium sensor that differentially regulates salt, drought, and cold responses in arabidopsis. The Plant Cell. 15, (8), 1833-1845 (2003).
Weitfeld-Echtzeit-Bildgebung lokaler und systemischer Wundsignale bei <em>Arabidopsis</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Uemura, T., Wang, J., Aratani, Y., Gilroy, S., Toyota, M. Wide-Field, Real-Time Imaging of Local and Systemic Wound Signals in Arabidopsis. J. Vis. Exp. (172), e62114, doi:10.3791/62114 (2021).More

Uemura, T., Wang, J., Aratani, Y., Gilroy, S., Toyota, M. Wide-Field, Real-Time Imaging of Local and Systemic Wound Signals in Arabidopsis. J. Vis. Exp. (172), e62114, doi:10.3791/62114 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter