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Biology

Imaging in tempo reale a ampio campo dei segnali di ferita locali e sistemici in Arabidopsis

Published: June 4, 2021 doi: 10.3791/62114
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 1,2
1Department of Biochemistry and Molecular Biology, Saitama University, 2Department of Botany, University of Wisconsin

Summary

La segnalazione sistemica del calcio extracellulare innescata dal glutammato è fondamentale per l'induzione delle risposte della difesa delle piante al mento meccanico e all'attacco di erbivoro nelle piante. Questo articolo descrive un metodo per visualizzare la dinamica spaziale e temporale di entrambi questi fattori utilizzando piante di thaliana arabidopsis che esprimono biosensori fluorescenti sensibili al calcio e al glutammato.

Abstract

Gli impianti rispondono a sollecitazioni meccaniche come ferite ed erbivori inducendo risposte di difesa sia nelle parti danneggiate che in quelle non danneggiate. Al momento del mento di una foglia, si verifica un aumento della concentrazione citosolica di ioni di calcio (segnale Ca2 +) nel sito della ferita. Questo segnale viene rapidamente trasmesso a foglie non danneggiate, dove vengono attivate le risposte della difesa. La nostra recente ricerca ha rivelato che il glutammato che fuorie' dalle cellule ferite della foglia nell'apoplasto che li circonda serve come segnale di ferita. Questo glutammato attiva canali permeabili Ca2+ simili al recettore del glutammato, che quindi porta alla propagazione del segnale Ca2+ a lunga distanza in tutta la pianta. Le caratteristiche spaziali e temporali di questi eventi possono essere catturate con l'imaging in tempo reale di piante viventi che esprimono biosensori fluorescenti geneticamente codificati. Qui introduciamo un metodo di imaging in tempo reale a livello vegetale per monitorare la dinamica dei segnali Ca2 + e i cambiamenti nel glutammato apoplastico che si verificano in risposta al mento. Questo approccio utilizza un microscopio a fluorescenza a campo ampio e piante transgeniche di Arabidopsis che esprimono biosensori Ca2+ a base di proteina fluorescente verde (GFP) e biosensori glutammati. Inoltre, presentiamo una metodologia per suscitare facilmente la propagazione del segnale Ca2+ indotta da ferite, innescata dal glutammato e rapida e a lunga distanza. Questo protocollo può anche essere applicato a studi su altre sollecitazioni dell'impianto per aiutare a studiare come la segnalazione sistemica degli impianti potrebbe essere coinvolta nelle loro reti di segnalazione e risposta.

Introduction

Le piante non possono sfuggire agli stress biotici, ad esempio gli insetti che si nutrono di loro, quindi hanno sviluppato sofisticati sistemi di rilevamento dello stress e trasduzione del segnale per rilevare e quindi proteggersi da sfide come l'erbivoro1. Al momento del mento o dell'attacco di erbivoro, le piante avviano risposte rapide di difesa tra cui l'accumulo dell'acido jasmonico fitoormone (JA) non solo nel sito ferito ma anche negli organi distale non danneggiati2. Questo JA quindi innesca risposte di difesa nei tessuti direttamente danneggiati e induce preemptive difese nelle parti non danneggiate della pianta. In Arabidopsis, l'accumulo di JA indotto dal mento è stato rilevato in foglie distale e intatte entro pochi minuti dai danni altrove nella pianta suggerendo che un segnale rapido e a lunga distanza viene trasmesso dalla fogliaferita 3. Diversi candidati, come Ca2+,specie reattive dell'ossigeno (ROS) e segnali elettrici, sono stati proposti per servire come questi segnali di ferita a lunga distanza nellepiante 4,5.

Ca2+ è uno dei secondi elementi messaggeri più versatili e onnipresenti negli organismi eucarioti. Nelle piante, la masticazione del bruco e il mento meccanico causano drastici aumenti della concentrazione citosolica di Ca2 + ([Ca2+]cyt) sia nella foglia ferita che nelle foglie lontane non liche6,7. Questo segnale ca2+ sistemico viene ricevuto dalle proteine intracellulari ca2+,che portano all'attivazione di vie di segnalazione della difesa a valle, tra cui biosintesi JA8,9. Nonostante numerosi rapporti di questo tipo supportano l'importanza dei segnali Ca2+ nelle risposte delle ferite delle piante, le informazioni sulle caratteristiche spaziali e temporali dei segnali Ca2+ indotti dal ferimento sono limitate.

L'imaging in tempo reale utilizzando indicatori Ca2+ geneticamente codificati è un potente strumento per monitorare e quantificare la dinamica spaziale e temporale dei segnali Ca2+. Ad oggi, sono state sviluppate versioni di tali sensori che consentono la visualizzazione di segnali Ca2 + a livello di una singola cellula, a tessuti, organi e persino piante intere10. Il primo biosensore geneticamente codificato per Ca2+ utilizzato nelle piante è stata l'aequorina proteica bioluminescente derivata dalla medusa Aequorea victoria11. Sebbene questa proteina chemiluminescente sia stata utilizzata per rilevare cambiamenti Ca2+ in risposta a varie sollecitazioni nelle piante12,13,14,15,16,17,18, non è adatta per l'imaging in tempo reale a causa del segnale luminescente estremamente basso che produce. Gli indicatori Ca2+ basati su Förster Resonance Energy Transfer (FRET), come i camelioni gialli, sono stati utilizzati con successo anche per indagare la dinamica di una serie di eventidi segnalazione Ca 2 + negliimpianti 19,20,21,22,23,24. Questi sensori sono compatibili con gli approcci di imaging e più comunemente sono composti dalla calmodulina proteica legante Ca2+ (CaM) e da un peptide legante CaM (M13) da una chinasi della catena leggera della miosina, tutti fusi tra due proteine fluorofori, generalmente una proteina fluorescente ciano (CFP) e una variante della proteina fluorescente gialla (YFP)10. L'associazione Ca2+ a CaM favorisce l'interazione tra CaM e M13 portando a un cambiamento conformazionale del sensore. Questo cambiamento promuove il trasferimento di energia tra la PCP e l'YFP, il che aumenta l'intensità di fluorescenza dell'YFP riducendo al contempo le emissioni di fluorescenza della PCP. Il monitoraggio di questo passaggio dalla PCP alla fluorescenza YFP fornisce quindi una misura dell'aumento del livello Ca2+. Oltre a questi sensori FRET, i biosensori Ca2+ a base di proteine fluorescenti singole (FP), come GCaMP e R-GECO, sono anche compatibili con gli approcci di imaging vegetale e sono ampiamente utilizzati per studiare [Ca2+]cambiamenti del cito a causa della loro elevata sensibilità e facilità d'uso25,26,27,28,29,30. I GCAMP contengono un singolo GFP permutato circolare (cp), nuovamente fuso a CaM e al peptide M13. L'interazione dipendente da Ca2+tra CaM e M13 provoca un cambiamento conformazionale nel sensore che promuove uno spostamento dello stato di protonazione del cpGFP, migliorando il suo segnale fluorescente. Pertanto, conl'aumento dei livelli di Ca 2+, il segnale cpGFP aumenta.

Per indagare la dinamica dei segnali Ca2+ generati in risposta a ferite meccaniche o alimentazione di erbivori, abbiamo utilizzato piante transgeniche arabidopsis thaliana che esprimono una variante GCaMP, GCaMP3, e un microscopio a fluorescenza a campolargo 6. Questo approccio è riuscito a visualizzare la trasmissione rapida di un segnale Ca2+ a lunga distanza dal sito della ferita su una foglia a tutta la pianta. Pertanto, un aumento del cito [Ca2+]è stato immediatamente rilevato nel sito della ferita, ma questo segnale Ca2 + è stato poi propagato alle foglie vicine attraverso la vascucolatura entro pochi minuti dal mento. Inoltre, abbiamo scoperto che la trasmissione di questo rapido segnale di ferita sistemica è abolita nelle piante arabidopsis con mutazioni in due geni simili al recettore del glutammato, Glutammato Recettore Like (GLR), GLR3.3 e GLR3.66. I GLR sembrano funzionare come canali Ca2+ recintati da amminoacidi coinvolti in diversi processi fisiologici, tra cui rispostaalle ferite 3,crescita del tubo di polline31,sviluppo delle radici32,risposta alfreddo 33e immunità innata34. Nonostante questa ben compresa, ampia funzione fisiologica dei GLR, le informazioni sulle loro proprietà funzionali, come la loro specificità ligando, la selettività ioniche e la localizzazione subcellulare, sonolimitate 35. Tuttavia, studi recenti hanno riferito che GLR3.3 e GLR3.6 sono localizzati rispettivamente nel phloem e nello xilema. I GLR vegetali hanno somiglianze con i recettori del glutammato ionotropico (iGluRs)36 nei mammiferi, che vengono attivati dagli amminoacidi, come glutammato, glicina e D-serina nel sistema nervoso dei mammiferi37. Infatti, abbiamo dimostrato che l'applicazione di glutammato di 100 mM, ma non di altri amminoacidi, nel sito della ferita induce un segnale Ca2 + rapido e a lunga distanza in Arabidopsis, indicando che il glutammato extracellulare agisce probabilmente come un segnale di ferita nelle piante6. Questa risposta è abolita nel mutante glr3.3/glr3.6 suggerendo che il glutammato possa agire attraverso uno o entrambi questi canali simili a recettori e, in effetti, AtGLR3.6 è stato recentemente dimostrato essere gated da questi livelli di glutammato38.

Nelle piante, oltre al suo ruolo di amminoacido strutturale, il glutammato è stato proposto anche come regolatore chiave dello sviluppo39; tuttavia, le sue dinamiche spaziali e temporali sono poco comprese. Proprio come per Ca2+,sono stati sviluppati diversi indicatori geneticamente codificati per il glutammato per monitorare la dinamica di questo amminoacido nelle celluleviventi 40,41. iGluSnFR è un biosensore glutammato single-FP basato su GFP composto da cpGFP e una proteina legante il glutammato (GltI) di Escherichia coli42,43. Il cambiamento conformazionale di iGluSnFR, indotto dal legame del glutammato con GltI, si traduce in una maggiore emissione di fluorescenza GFP. Per indagare se il glutammato extracellulare agisce come una molecola di segnalazione nella risposta della ferita vegetale, abbiamo collegato la sequenza iGluSnFR con la sequenza di secrezione peptidica del segnale chitinasio di base (CHIB-iGluSnFR) per localizzare questo biosensore nello spazio apoplastico6. Questo approccio ha permesso di imaging di eventuali cambiamenti nella concentrazione di glutammato apoplastico ([Glu]apo) utilizzando piante transgeniche di Arabidopsis che esprimono questo sensore. Abbiamo rilevato rapidi aumenti del segnale iGluSnFR nel sito di wounding. Questi dati supportano l'idea che il glutammato fuoriesi dalle cellule / tessuti danneggiati all'apoplasto al momento del mento e agisce come un segnale di danno attivando i GLR e portando al segnale Ca2 + a lunga distanza nelle piante6.

Qui, descriviamo un metodo di imaging in tempo reale a livello vegetale utilizzando biosensori geneticamente codificati per monitorare e analizzare la dinamica dei segnali ca2+ a lunga distanza e glutammato extracellulare in risposta almento 6. La disponibilità di microscopia a fluorescenza a campo largo e piante transgeniche che esprimono biosensori geneticamente codificati fornisce un approccio potente ma facilmente implementato per rilevare segnali a lunga distanza trasmessi rapidamente, come le onde Ca2+.

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Protocol

1. Preparazione del materiale vegetale

  1. In un microtubo da 1,5 mL, sterilizzare in superficie i semi della pianta arabidopsis thaliana (adesione Col-0) esprimendo GCaMP3 o CHIB-iGluSnFR tremando con il 20% (v/v) NaClO per 3 minuti e quindi lavare 5 volte con acqua distillata sterile.
    NOTA: Le linee transgeniche di Arabidopsis che esprimono GCaMP3 o CHIB-iGluSnFR sono state descritte in precedenza6.
  2. In un cappuccio sterile, seminare 13 semi sterilizzati in superficie su una piastra di Petri di plastica quadrata di 10 cm riempita con 30 mL sterile (autoclavato) Murashige e Skoog (MS) medium [1x SALI MS, 1% (w/v) saccarosio, 0,01% (w/v) mioinositolo, 0,05% (w/v) MES e 0,5% (w/v) gomma gellan; pH 5,7 regolato con 1N KOH]. Sostituire il coperchio e avvolgere con nastro chirurgico.
  3. Dopo l'incubazione al buio a 4 °C per 2 giorni, posizionare le piastre orizzontalmente a 22 °C in una camera di crescita sotto luce continua (90-100 μmol m-2 s-1)per circa 2 settimane prima dell'uso. Dopo 2 settimane, conta il numero di foglie di Arabidopsis dal più vecchio al più giovane44 (Figura 1). Le risposte alle ferite si spostano preferenzialmente dalla foglia danneggiata (n) alle foglie numerate n ± 3 e n ± 56.
    NOTA: In questo protocollo, la piastra di Petri sarà aperta per l'imaging degli effetti della ferita e del glutammato al microscopio a fluorescenza. Pertanto, le fasi successive di questo esperimento devono essere condotte in condizioni di ambiente controllate da temperatura e umidità. Questo perché i segnali Ca2+ sono anche provocati da cambiamenti in queste condizioni ambientali. È anche noto che la luce blu, emessa dal microscopio durante la registrazione per l'eccitazione della fluorescenza della proteina biosensore, può provocare un aumento della concentrazione citosolica di Ca2 + 45 e quindi la pianta deve essere acclimatata all'irradiazione della luce blu per diversi minuti prima di iniziare l'esperimento.

2. Preparazione chimica

  1. Sciogliere L-glutammato in un mezzo di crescita liquido [1/2x MS sali, 1% (w/v) saccarosio e 0,05% (w/v) MES; pH 5.1 regolato con 1N KOH] per fare una soluzione di lavoro da 100 mM.
    NOTA: Evitare l'uso di sali di glutammato come il glutammato di sodio per prevenire potenziali effetti correlati al catione sulla dinamica Ca2+.

3. Impostazione del microscopio e conduzione di immagini in tempo reale

  1. Accendere lo stereomicroscopio a fluorescenza motorizzata dotato di un obiettivo 1x (NA = 0,156) e di una fotocamera sCMOS (Figura 2) e configurare le impostazioni del dispositivo per irradiare con una luce di eccitazione di 470/40 nm e acquisire una luce di emissione che passa attraverso un filtro da 535/50 nm.
    NOTA: Qualsiasi microscopio a fluorescenza sensibile alla GFP può essere utilizzato per rilevare segnali GCaMP3 e iGluSnFR in tempo reale, ma si consiglia un obiettivo a bassa potenza e una fotocamera altamente sensibile con un ampio chip sCMOS per acquisire segnali dall'intero impianto. L'obiettivo a bassa potenza consente di imaging della risposta di un intero impianto arabidopsis e l'uso di una telecamera altamente sensibile consente la rapida acquisizione dei dati necessaria per catturare il rapido decorso del tempo dell'onda Ca2 + innescata dalla ferita. Per il microscopio a fluorescenza utilizzato in questo studio, i valori massimi del campo visivo e della risoluzione temporale sono rispettivamente di 3 cm x 3 cm e 30 fotogrammi al secondo (fps).
  2. Rimuovere il coperchio e posizionare il piatto sotto l'obiettivo.
  3. Controllare il segnale di fluorescenza dalla pianta e quindi attendere circa 30 minuti al buio fino a quando le piante non vengono adattate alle nuove condizioni ambientali. Questo passaggio di adattamento è necessario perché i cambiamenti nell'umidità provocano [Ca2+]elevazione del cito nelle piante che possono interferire con qualsiasi evento correlato alla ferita.
  4. Regolare la messa a fuoco e l'ingrandimento per vedere l'intera pianta nel campo visivo. Nel protocollo corrente è stato utilizzato un ingrandimento 0,63x.
  5. Prima di iniziare l'imaging in tempo reale, impostare i parametri di acquisizione per rilevare i segnali di fluorescenza utilizzando il software di imaging al microscopio. Le impostazioni per l'imaging nel protocollo corrente sono: tempi di esposizione e intervallo impostati rispettivamente su 1,8 s e 2 s (cioè 0,5 fps). Impostare il tempo di registrazione su 11 min.
  6. Immagine per 5 minuti prima di iniziare l'esperimento per acclimatare la pianta all'irradiazione della luce blu dal microscopio,quindi iniziare a registrare facendo clic su Run Now o sul comando equivalente nel software del microscopio utilizzato. Per determinare la fluorescenza media di base, registrare almeno 10 fotogrammi (cioè almeno 20 s nel protocollo corrente) prima di ferire o applicazione di glutammato (vedere sezione 4).
    1. Per l'imaging in tempo reale delcito indotto dalla ferita [Ca2+] e [Glu]apo cambia, tagliare il picciolo o la regione centrale della foglia L1 con le forbici(Figura 3 e Figura 4).
    2. Per l'imaging in tempo reale dei cambi dicit innescati dal glutammato [Ca2+], tagliare il bordo (circa 1 mm dalla punta) della foglia 1 attraverso la vena principale con le forbici. Dopo almeno 20 minuti di recupero, applicare 10 μL di glutammato da 100 mM sulla superficie tagliata della foglia (Figura 5).
      NOTA: Questo pre-taglio era necessario per consentire l'accesso del glutammato all'apoplasto fogliare al fine di innescare risposte. Inoltre, l'applicazione di una goccia di acqua distillata sulla superficie tagliata della foglia L1 è stata trovata fondamentale per evitare che i campioni si desiccano durante il recupero prima di applicare il glutammato.
  7. Dopo aver terminato la registrazione di 11 minuti, salvare i dati.

4. Analisi dei dati

  1. Per l'analisi dell'intensità della fluorescenza nel tempo, definire una regione di interesse (ROI) nel luogo in cui deve essere analizzata l'intensità della fluorescenza(Figura 6 e Figura 7). Per il calcolo della velocità dell'onda Ca2+, definire 2 ROI (ROI1 e ROI2) per l'analisi. Nel software di imaging, fare clic su Misurazione del tempo | Definisci | Cerchio. Misurare la distanza tra ROI1 e ROI2 facendo clic su Annotazioni e misure | Lunghezza | Linea semplice (figura 6).
  2. Misurare i valori di fluorescenza grezza (F) in ogni ROI nel tempo facendo clic su Misura. Esportare i dati grezzi in un software per fogli di calcolo per convertire il segnale di fluorescenza in numeri in ogni momento facendo clic su Tutti in Excel | Esportazione.
  3. Determinare il valore di fluorescenza di base, definito come F0, calcolando la media di F sui primi 10 fotogrammi (cioè prima del trattamento) nei dati registrati.
  4. Normalizzare i dati F (calcolando ΔF/F) usando l'equazione ΔF/F = (F−F0)/F0, dove ΔF è la variazione di fluorescenza dipendente dal tempo.
  5. Per l'analisi dell'onda di velocità d'onda Ca2+, definire un significativo punto di aumento del segnale al di sopra dei valori pre-stimolati comerappresentazione del rilevamento di un aumento ca 2+ in ogni ROI (t1 e t2) usando il criterio di un aumento a 2× la deviazione standard (2x SD) che viene calcolata dai dati F0 utilizzando software statistico. Il 95% dei dati F0 rientra in 2x SD dalla media, indicando che un aumento del segnale al di sopra di questo livello per caso è ≤5%. Calcolare la differenza di tempo dell'aumento ca2+ tra ROI1 e ROI2 [t2- t1 time-lag (Δt)] e misurare la distanza tra ROI1 e ROI2, quindi determinare le velocità di qualsiasi onda Ca2+.

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Representative Results

La propagazione del segnale di [Ca2+]cyt e [Glu]apo in risposta al collare è presentata nella Figura 3, Figura 4, Filmato S1e Filmato S2. Il taglio del picciolo della foglia 1 nelle piante che esprimono GCaMP3 (a 0 s) ha portato a un aumento significativo delcit [Ca2+] che è stato rapidamente indotto localmente attraverso la vascucolatura (a 40 s)(Figura 3 e Film S1). Successivamente, il segnale è stato rapidamente propagato alle foglie vicine (foglia 3 e 6) in pochi minuti (a 80 s)(Figura 3 e Film S1).

Al taglio della foglia 1 nelle piante che esprimono CHIB-iGluSnFR, è stato osservato un rapidoaumento dell'apo [Glu] intorno alla regione di taglio (a 2 s). Questo segnale è stato propagato attraverso la vascucolatura localmente in pochi minuti (a 160 s) ma non è stato osservato nelle foglie sistemiche(Figura 4 e Filmato S2).

Per l'imaging in tempo reale della propagazione del segnale Ca2+ innescata dall'applicazione del glutammato, il bordo (a circa 1 mm dalla punta) della foglia 1 nelle piante che esprimono GCaMP3 è stato tagliato come mostrato nella figura 5A e film S3. Il taglio del bordo della foglia 1 ha causato un aumento delcit locale [Ca2+] (a 40 s) ma questo segnale è scomparso in pochi minuti (a 124 s). Dopo aver atteso circa 10 minuti per il recupero della pianta, 10 μL di glutammato di 100 mM sono stati applicati alla superficie tagliata della foglia 1, che ha causato un rapido e significativo aumento del cit [Ca2+]localmente (a 56 s) e la propagazione del segnale alle foglie distale (a 104 s)(Figura 5B e Movie S4).

Per misurare le variazioni delcit [Ca2+] indotto dal mento nella foglia sistemica, due ROI (ROI1 e ROI2) sono state fissate nella regione di base e nella punta della foglia 6 nelle piante che esprimono GCaMP3 come mostrato nella figura 6A. È stato misurato il cambio di rotta del tempo dell'intensità del segnale GCaMP3 in ROI1 e ROI2 al taglio del picceolo della foglia 1(Figura 6B). Un aumento significativo del cit [Ca2+]al ROI1 è stato rilevato prima di quello del ROI2 (Figura 6B). [Ca2+] il cito ha raggiunto il picco di circa 100 s dopo il mento, è durato oltre 10 minuti ed ha mostrato due fasi(Figura 6B).

Per determinare le velocità dell'onda Ca2+ al momento del mento meccanico, è stato determinato il punto di tempo di un segnale significativo al di sopra dei valori pre-stimolati in ROI1 e ROI2 (time-lag; vedi Sezione 4) (Figura 6C). Poiché in questo caso la distanza tra ROI1 e ROI2 era di 2,7 mm(Figura 6A),la velocità del segnale Ca2+ nella foglia 6 è stata calcolata come 0,15 mm/s. Per misurare i cambiamentidell'apo [Glu] in risposta al danno meccanico, ROI1 è stato impostato in prossimità del sito di taglio della foglia contrassegnato come L1 come mostrato nella figura 7A. [Glu] la firma apo al ROI1 ha mostrato un singolo picco a circa 100 s al momento del mento (Figura 7B).

Figure 1
Figura 1: Numerazione delle foglie di rosetta arabidopsis. Le foglie di arabidopsis sono numerate dal più vecchio al più giovane (pannello sinistro). Un diagramma schematico della posizione delle foglie è indicato nel pannello di destra. L: foglia, C: cotyledons. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2: Un microscopio afluorescenza utilizzato in questo studio. [Ca2+]cit e [Glu]apo dynamics sono stati imageati con uno stereomicroscopio a fluorescenza a campo largo. R: Telecomando, O: obiettivo 1x, C: fotocamera sCMOS, T: tubo basculante trinoculare, S: Stadio, P: Materiale vegetale. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3: Trasmissione del segnale Ca 2+ a lunga distanzaindotta dalla ferita. Il taglio del picciolo (freccia bianca, 0 s) della foglia 1 (L1) in pianta che esprime GCaMP3 ha innescato un aumento delcito locale [Ca2+] (freccia rossa, 40 s) che è stato trasmesso alle foglie sistemiche [foglia 3 (L3) e foglia 6 (L6)] (frecce arancioni, 80 s). Barra di scala, 5 mm.

Figure 4
Figura 4: Elevazione dell'apo innescatadalla ferita [Glu]. Il taglio della foglia 1 (L1) (freccia bianca, 0 s) nelle piante che esprimono CHIB-iGluSnFR ha causato una rapida elevazionedell'apo [Glu] (freccia rossa, 80 s) che si è propagato attraverso la vascucolatura (freccia arancione, 160 s). Barra di scala, 2 mm.

Figure 5
Figura 5: Trasmissione del segnaleCa 2+ a lunga distanzainnescata dal glutammato. (A) Tagliare il bordo (a circa 1 mm dalla punta) della foglia 1 (L1) nelle piante che esprimono GCaMP3 (freccia bianca, 0 s) ha causato un aumento delcit [Ca2+] (freccia rossa, 40 s). (B) L'applicazione di glutammato di 100 mM sulla superficie tagliata di L1 (freccia bianca, 0 s) ha causato un aumento delcito [Ca2+] locale (freccia rossa, 56 s) che si è rapidamente propagato alle foglie distali [ad esempio, foglia 3 (L3), foglia 4 (L4) e foglia 6 (L6)] (frecce arancioni, 104 s). Barre di scala, 5 mm.

Figure 6
Figura 6: [Ca2+]firma del cito nelle foglie sistemiche in risposta al mento meccanico. (A) Un'immagine ampliata della foglia 6 (L6) negli impianti che esprimono GCaMP3 è mostrata nella figura 3. ROI1 (cerchio blu) e ROI2 (cerchio rosa) sono stati impostati rispettivamente nella regione di base e punta. La freccia bianca indica il sito di taglio del picciolo della foglia 1 (L1). In questo caso, la distanza tra ROI1 e ROI2 era di 2,7 mm (B) Quantificazione delle firmedi cit [Ca2+] in ROI1 e ROI2. I cambiamenti di intensità della fluorescenza sono stati analizzati utilizzando il software di imaging. (C) Una traccia estesa di dati in (B) compresa tra 0 e 80 s. I punti di rilevamento di un aumento ca2+ del ROI1 e del ROI2 sono stati definiti rispettivamente come t1 e t2, utilizzando come criterio un aumento a 2 volte la deviazione standard dei valori di prestimulazione (2x SD, linea tratteggiata). Il valore di t2 - t1 è stato definito come time-lag (Δt) nel protocollo corrente. La freccia nera indica il tempo di taglio. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 7
Figura 7: Firmadell'apo [Glu] in risposta al collare meccanico. (A) Un'immagine ampliata della foglia 1 (L1) negli impianti che esprimono CHIB-iGluSnFR è mostrata nella figura 4. ROI1 è stato impostato nelle vicinanze del sito di taglio. La freccia bianca indica l'area di taglio. (B) La quantificazione della firmaapo [Glu] nel ROI1 viene monitorata utilizzando un software di imaging. La freccia nera indica il tempo di taglio. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Filmato S1: Trasmissione Ca2+ a lunga distanza dopo un mento meccanico. Il mento meccanico al picciolo della foglia 1 (L1) ha causato un aumento delcito [Ca2+] trasmesso alle foglie distale [ad esempio, foglia 3 (L3) e foglia 6 (L6)]. Clicca qui per scaricare questo film.

Filmato S2: Elevazione dei livelli di glutammato apoplastico in risposta al taglio. Il collare meccanico della foglia 1 (L1) ha causato un aumento immediatodell'apo[Glu]. Clicca qui per scaricare questo film.

Filmato S3: Elevazione dei livelli dicit [Ca2+] in risposta al taglio. Il mento meccanico sul bordo della foglia 1 (L1) ha causato un'immediata elevazione delcit locale [Ca2+]. Clicca qui per scaricare questo film.

Filmato S4: L'applicazione dei trigger glutammati sistemici [Ca2+]cyt aumenta. L'applicazione del glutammato da 100 mM ha innescato la trasmissione Ca2+ alle foglie sistemiche [ad esempio, foglia 3 (L3), foglia 4 (L4) e foglia 6 (L6)]. Clicca qui per scaricare questo film.

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Discussion

La segnalazione sistemica è importante per le piante per rispondere agli stimoli ambientali esterni localizzati e quindi per mantenere la loro omeostasi a un intero livello di impianto. Sebbene non siano dotati di un sistema nervoso avanzato come gli animali, impiegano una comunicazione rapida sia all'interno che tra gli organi sulla base di fattori come segnali elettrici mobili (ed eventualmente idraulici) e onde di propagazione di ROS e Ca2 +46,47. Il protocollo sopra descritto consente l'imaging in tempo reale a livello vegetale dell'attività di questo sistema di segnalazione attraverso il monitoraggio della dinamica di Ca2+ e glutammato apoplastico in risposta al mento. Questo metodo fornisce uno strumento robusto per comprendere segnali rapidi e a lunga distanza nelle piante che combinano un'elevata risoluzione spaziotemporale e facilità d'uso. Questo protocollo offre anche il potenziale per fornire nuove intuizioni fisiologiche sui meccanismi molecolari alla base della segnalazione delle ferite a lunga distanza attraverso, ad esempio, l'uso di mutanti difettosi elementi putativi del sistema di segnalazione rapida o l'esplorazione degli effetti di reagenti farmacologici come i bloccanti del canale Ca2 + (ad esempio, LaCl3)o gli inibitori di altre attività di segnalazionepotenzialmente chiave 6. 

Un importante vantaggio del metodo di imaging biosensore descritto è l'uso di biosensori a singolo FP ad alta resa fluorescente, semplificando notevolmente sia le apparecchiature necessarie per effettuare queste misurazioni che il loro uso in planta. Pertanto, gli indicatori geneticamente codificati basati sulla fluorescenza sono divisi in due classi: 1) biosensori single-FP basati sull'intensità e 2) biosensori ratiometrici basati su FRET10. Sebbene i sensori basati su FRET ratiometrici siano indicatori Ca2+ basati sull'intensità quantitativamente accurati, inclusi i GCaMP3 e iGluSnFR utilizzati qui, forniscono sia una risoluzione temporale più elevata che una facilità d'uso grazie al loro segnale ca2+generalmente più luminoso e ai loro requisiti di microscopiopiù semplici 10. Ad esempio, è stato segnalato chel'indicatore R-GECO1 R-GECO1 a base di proteine a base di proteine fluorescenti rosse ha mostrato un cambiamento di segnale molto maggiore in risposta all'ATP extracellulare e agli elicitori di difesa delle piante flg22 e chitina, rispetto al biosensore ratiometrico YC3.627. Per l'analisi di sensori ratiometrici basati su FRET, è anche necessario utilizzare un microscopio specializzato con più filtri per raccogliere dati a due lunghezze d'onda, mentre i biosensori basati su FP singolo richiedono al dispositivo di raccogliere i dati a una sola lunghezza d'onda, una capacità che si trova in tutti i microscopi a fluorescenza standard10. Tuttavia, è importante notare che ci sono alcuni svantaggi dell'utilizzo di biosensori single-FP. Questi biosensori single-FP basati sull'intensità non sono preferiti per quantificare i cambiamenti di concentrazione assoluta o per l'imaging a lungo termine per molte ore o giorni. Questa limitazione è perché oltre, ad esempio, al livello Ca2+ per GCaMP3, si ritiene che l'intensità del segnale da questi biosensori single-FP sia influenzata da altri fattori come il livello di espressione del sensore o parametri come il pH cellulare che possono cambiare nel tempo.

Ad oggi, molte nuove varianti di questi indicatori geneticamente codificati sono state progettate per migliorare il rapporto segnale/rumore, la gamma dinamica, la cinetica e la stabilità del sensore. Ad esempio, dopo che Nakai et al. La gamma dinamica di G-GECO (Green-GECO) è stata segnalata per essere circa due volte più grande di quella di GCaMP328. Inoltre, la sostituzione con diverse proteine fluorescenti in questi indicatori ha portato alla generazione di varianti GECO con diversi spettri di emissione, come B-GECO (Blue-GECO) e R-GECO (Red-GECO), che consente l'utilizzo di questi indicatori insieme ad altre varianti spettrali GFP in applicazioni di imaging multicolore28. Allo stesso modo, GCaMP ha continuato a essere sviluppato e migliorato con una serie di sensori potenziati per la velocità di risposta e l'ampiezza del segnale oradisponibili 50. Per il monitoraggio della dinamica del glutammato, diverso da iGluSnFR, una serie di biosensori glutammati a base di FRET, sono state sviluppate le proteine indicatori FLuorescent per glutammato (FLIPE)40. FLIPE è composto da CFP e YFP che sono collegati tramite la proteina legante il glutammato ybeJ presa da E. coli. Dopo il legame del glutammato con lo ybeJ, si osserva una diminuzione dell'efficienza FRET dipendente dalla concentrazione di glutammato. Pertanto, sia per Ca2+ che per il glutammato sono disponibili più sensori single-FP e ratiometrici. I ricercatori dovrebbero prendere in considerazione il biosensore appropriato per rilevare la dinamica del segnale a seconda della progettazione sperimentale e dei requisiti per fattori di misurazione come l'elevato segnale: rumore (sensori single-FP) rispetto alla necessità di una quantificazione altamente accurata (dove i sensori FRET eccellono).

Il metodo di imaging a campo largo e a singolo FP qui descritto per il mento dovrebbe essere utile anche se applicato ad altri processi di segnalazione sistemica a sollecitazione. Nonostante la presenza di numerosi rapporti che suggeriscono un ruolo cruciale della segnalazione Ca2+ a lunga distanza in varie risposte allo stress, come l'attacco di erbivoro6,51,52,sale 20e siccità53,solo pochi studi hanno fornito le informazioni spaziotemporali relative ai rapidi segnali Ca2 + a lunga distanza indotti da queste risposte allo stress6,7,20,52. L'uso di un microscopio a fluorescenza ad ampio campo in questo protocollo consente anche l'osservazione in tempo reale della dinamica del segnale mobile non solo nella comunicazione leaf-to-leaf ma anche nella comunicazione root-to-shoot come recentementemostrato 38. Sebbene ci siamo concentrati sui protocolli per arabidopsis,questo metodo di imaging in tempo reale a livello vegetale fornisce anche uno strumento robusto per comprendere le caratteristiche spaziali e temporali della segnalazione sistemica Ca2 + sia nelle risposte di stress biotico che abiotico in altre specie vegetali come il tabacco30.

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Disclosures

Gli autori non hanno conflitti di interesse.

Acknowledgments

Questo lavoro è stato supportato da sovvenzioni della Japan Society for the Promotion of Science (17H05007 e 18H05491) a MT, dalla National Science Foundation (IOS1557899 e MCB2016177) e dalla National Aeronautics and Space Administration (NNX14AT25G e 80NSSC19K0126) a SG.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Arabidopsis expressing GCaMP3 Saitama University
Arabidopsis expressing CHIB-iGluSnFR Saitama University
GraphPad Prism 7 GraphPad Software
L-Glutamate FUJIFILM Wako 072-00501 Dissolved in a liquid growth medium [1/2x MS salts, 1% (w/v) sucrose, and 0.05% (w/v) MES; pH 5.1 adjusted with 1N KOH].
Microsoft Excel Microsoft Corporation
Murashige and Skoog (MS) medium FUJIFILM Wako 392-00591 composition: 1x MS salts, 1% (w/v) sucrose, 0.01% (w/v) myoinositol, 0.05% (w/v) MES, and 0.5% (w/v) gellan gum; pH 5.7 adjusted with 1N KOH.
Nikon SMZ25 stereomicroscope Nikon
NIS-Elements AR analysis Nikon
1x objective lens (P2-SHR PLAN APO) Nikon
sCMOS camera (ORCA-Flash4.0 V2) Hamamatsu Photonics C11440-22CU
Square plastic Petri dish Simport D210-16

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Biologia Numero 172 calcio GCaMP3 biosensori fluorescenti geneticamente codificati glutammato iGluSnFR segnale a lunga distanza feritae
Imaging in tempo reale a ampio campo dei segnali di ferita locali e sistemici in <em>Arabidopsis</em>
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Uemura, T., Wang, J., Aratani, Y.,… More

Uemura, T., Wang, J., Aratani, Y., Gilroy, S., Toyota, M. Wide-Field, Real-Time Imaging of Local and Systemic Wound Signals in Arabidopsis. J. Vis. Exp. (172), e62114, doi:10.3791/62114 (2021).

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