Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Wide-Field, sanntidsavbildning av lokale og systemiske sårsignaler i Arabidopsis

Published: June 4, 2021 doi: 10.3791/62114
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 1,2
1Department of Biochemistry and Molecular Biology, Saitama University, 2Department of Botany, University of Wisconsin

Summary

Ekstracellulær glutamatutløst systemisk kalsiumsignalering er avgjørende for induksjon av planteforsvarsresponser på mekanisk såring og plantelevende angrep i planter. Denne artikkelen beskriver en metode for å visualisere den romlige og tidsmessige dynamikken i begge disse faktorene ved hjelp av Arabidopsis thaliana planter som uttrykker kalsium- og glutamatfølsomme fluorescerende biosensorer.

Abstract

Planter reagerer på mekaniske påkjenninger som sår og plantelevende ved å indusere forsvarsresponser både i de skadede og i de distale uskadede delene. Ved såring av et blad oppstår en økning i cytosolisk kalsiumionkonsentrasjon (Ca2 + signal) på sårstedet. Dette signalet overføres raskt til uskadede blader, hvor forsvarsresponser aktiveres. Vår nylige forskning viste at glutamat som lekker fra de sårede cellene i bladet inn i apoplasten rundt dem, fungerer som et sårsignal. Dette glutamatet aktiverer glutamatreseptorlignende Ca2+ gjennomtrengelige kanaler, noe som deretter fører til langdistanse Ca2 + signalutbredelse i hele anlegget. De romlige og tidsmessige egenskapene til disse hendelsene kan fanges opp med sanntidsavbildning av levende planter som uttrykker genetisk kodede fluorescerende biosensorer. Her introduserer vi en planteomfattende bildemetode i sanntid for å overvåke dynamikken i både Ca2+ -signalene og endringer i apoplastisk glutamat som oppstår som respons på sår. Denne tilnærmingen bruker et bredfelts fluorescensmikroskop og transgene Arabidopsis-planter som uttrykker Green Fluorescent Protein (GFP)-baserte Ca2+ og glutamatbiosensorer. I tillegg presenterer vi metodikk for enkelt å fremkalle sårindusert, glutamatutløst rask og langdistanse Ca2+ signalutbredelse. Denne protokollen kan også brukes på studier på andre plantespenninger for å bidra til å undersøke hvordan plantesystemisk signalering kan være involvert i deres signal- og responsnettverk.

Introduction

Planter kan ikke unnslippe biotiske påkjenninger, for eksempel insekter som fôrer på dem, så de har utviklet sofistikerte stresssensor- og signaltransduksjonssystemer for å oppdage og deretter beskytte seg mot utfordringer som plantelevende1. Ved sår eller plantelevende angrep starter planter raske forsvarsresponser, inkludert opphopning av fytohormonet jasmonsyre (JA) ikke bare på det sårede stedet, men også i uskadede distale organer2. Denne JA utløser deretter begge forsvarsresponser i det direkte skadede vevet og induserer fortrinnsrett forsvar i de uskadede delene av anlegget. I Arabidopsisble akkumuleringen av JA indusert av sår oppdaget i distale, intakte blader innen bare noen få minutter etter skade andre steder i anlegget, noe som tyder på at et raskt og langdistansesignal overføres fra det sårede bladet3. Flere kandidater, som Ca2+, reaktive oksygenarter (ROS) og elektriske signaler, har blitt foreslått å tjene som disse langdistanse sårsignalene i anlegg4,5.

Ca2+ er et av de mest allsidige og allestedsnærværende andre messenger-elementene i eukaryote organismer. I planter forårsaker larve tygge og mekanisk såring drastiske økninger i cytosoliske Ca2 + konsentrasjon ([Ca2 +]cyt) både i det sårede bladet og i viklet fjerne blader6,7. Dette systemiske Ca2+ -signalet mottas av intracellulære Ca2+-sensing proteiner, noe som fører til aktivering av nedstrøms forsvarssignalveier, inkludert JA biosyntese8,9. Til tross for mange slike rapporter som støtter viktigheten av Ca2 + -signaler i plantesårresponser, er informasjon om de romlige og tidsmessige egenskapene til Ca2 + -signaler forårsaket av sår begrenset.

Sanntidsavbildning ved hjelp av genetisk kodede Ca2+-indikatorer er et kraftig verktøy for å overvåke og kvantifisere romlig og tidsmessig dynamikk i Ca2+-signaler. Til dags dato er det utviklet versjoner av slike sensorer som muliggjør visualisering av Ca2 + -signaler på nivået av en enkelt celle, til vev, organer og til og med hele planter10. Den første genetisk kodede biosensoren for Ca2 + brukt i planter var bioluminescent protein aequorin avledet fra maneter Aequorea victoria11. Selv om dette chemiluminescent proteinet har blitt brukt til å oppdage Ca2 + endringer som svar på ulike belastninger i planter12,13,14,15,16,17,18, er det ikke godt egnet for sanntidsavbildning på grunn av det ekstremt lave luminescerende signalet det produserer. Förster Resonance Energy Transfer (FRET)-baserte Ca2+ indikatorer, for eksempel de gule kamelonene, har også blitt brukt til å undersøke dynamikken i en rekke Ca2+ signalhendelser i anlegg19,20,21,22,23,24. Disse sensorene er kompatible med bildemetoder og består oftest av Ca2+ bindende protein calmodulin (CaM) og et CaM-bindende peptid (M13) fra en myosinlyskjedekinase, alle smeltet sammen mellom to fluoroforproteiner, vanligvis et cyan fluorescerende protein (CFP) og en Gul fluorescerende proteinvariant (YFP)10. Ca2+ binding til CaM fremmer samspillet mellom CaM og M13 som fører til en konformasjonsendring av sensoren. Denne endringen fremmer energioverføring mellom CFP og YFP, noe som øker fluorescensintensiteten til YFP samtidig som fluorescensutslippet reduseres fra CFP. Overvåking av dette skiftet fra CFP til YFP fluorescens gir deretter et mål på økningen i Ca2 + nivå. I tillegg til disse FRET-sensorene er enkelt fluorescerende protein (FP)-baserte Ca2+ biosensorer, som GCaMP og R-GECO, også kompatible med planteavbildningsmetoder og er mye brukt til å studere [Ca2 +]cytendringer på grunn av deres høye følsomhet og brukervennlighet25,26,27,28,29,30. GCaMPs inneholder en enkelt sirkulær permutert (cp) GFP, igjen smeltet sammen til CaM og M13 peptid. Ca2+-avhengig interaksjon mellom CaM og M13 forårsaker en konformasjonsendring i sensoren som fremmer et skifte i protonasjonstilstanden til cpGFP, noe som forbedrer fluorescerende signal. Dermed, når Ca2 + nivåer stiger, øker cpGFP-signalet.

For å undersøke dynamikken i Ca2 + -signaler generert som svar på mekanisk såring eller plantelevende fôring, har vi brukt transgene Arabidopsis thaliana-planter som uttrykker en GCaMP-variant, GCaMP3 og et bredfelts fluorescensmikroskop6. Denne tilnærmingen har lyktes i å visualisere rask overføring av et langdistanse Ca2 + -signal fra sårstedet på et blad til hele planten. Dermed ble en økning i [Ca2 +]cyt umiddelbart oppdaget på sårstedet, men dette Ca2 + -signalet ble deretter forplantet til nabobladene gjennom vaskulaturen innen få minutter etter sår. Videre fant vi ut at overføringen av dette raske systemiske sårsignalet avskaffes i Arabidopsis planter med mutasjoner i to glutamatreseptorlignende gener, Glutamatreseptor som (GLR), GLR3.3 og GLR3.66. GLR-ene ser ut til å fungere som aminosyre inngjerdede Ca2 + kanaler involvert i forskjellige fysiologiske prosesser, inkludert sårrespons3, pollenrørvekst31, rotutvikling32, kaldrespons33og medfødt immunitet34. Til tross for denne godt forståtte, brede fysiologiske funksjonen til GLRs, er informasjon om deres funksjonelle egenskaper, for eksempel deres ligand spesifisitet, ion selectivity og subcellulær lokalisering, begrenset35. Nyere studier rapporterte imidlertid at GLR3.3 og GLR3.6 er lokalisert i henholdsvis phloem og xylem. PlanteglRs har likheter med ionotrope glutamatreseptorer (iGluRs)36 hos pattedyr, som aktiveres av aminosyrer, som glutamat, glycin og D-serin i pattedyrnervesystemet37. Faktisk viste vi at anvendelsen av 100 mM glutamat, men ikke andre aminosyrer, på sårstedet induserer et raskt, langdistanse Ca2 + signal i Arabidopsis, noe som indikerer at ekstracellulær glutamat sannsynligvis fungerer som et sårsignal i planter6. Dette svaret er avskaffet i glr3.3/glr3.6 mutant som antyder at glutamat kan virke gjennom en eller begge disse reseptorlignende kanalene, og faktisk ble AtGLR3.6 nylig vist seg å være inngjerdet av disse nivåene av glutamat38.

I planter, i tillegg til sin rolle som en strukturell aminosyre, har glutamat også blitt foreslått som en viktig utviklingsregulator39; Imidlertid er dens romlige og tidsmessige dynamikk dårlig forstått. Akkurat som for Ca2 +, flere genetisk kodede indikatorer for glutamat er utviklet for å overvåke dynamikken i denne aminosyren i levende celler40,41. iGluSnFR er en GFP-basert enkelt-FP glutamat biosensor sammensatt av cpGFP og et glutamatbindingsprotein (GltI) fra Escherichia coli42,43. Konformasjonsendringen av iGluSnFR, som induseres av glutamatbinding til GltI, resulterer i et forbedret GFP-fluorescensutslipp. For å undersøke om ekstracellulært glutamat fungerer som et signalmolekyl i plantesårrespons, koblet vi iGluSnFR-sekvensen med den grunnleggende chitinase signalpeptidsekresjonssekvensen (CHIB-iGluSnFR) for å lokalisere denne biosensoren i det apoplastiske rommet6. Denne tilnærmingen gjorde det mulig å avbilde eventuelle endringer i den apoplastiske glutamatkonsentrasjonen ([Glu]apo) ved hjelp av transgene Arabidopsis-planter som uttrykker denne sensoren. Vi oppdaget raske økninger i iGluSnFR-signalet på sårstedet. Disse dataene støtter ideen om at glutamat lekker ut av de skadede cellene / vevene til apoplasten ved såring og fungerer som et skadesignal som aktiverer GLR-ene og fører til langdistanse Ca2 + -signalet i plante6.

Her beskriver vi en planteomfattende sanntidsavbildningsmetode ved hjelp av genetisk kodede biosensorer for å overvåke og analysere dynamikken i langdistanse Ca2 + og ekstracellulære glutamatsignaler som svar påsåring 6. Tilgjengeligheten av bredfelts fluorescensmikroskopi og transgene planter som uttrykker genetisk kodede biosensorer gir en kraftig, men likevel lett implementert tilnærming for å oppdage raskt overførte langdistansesignaler, for eksempel Ca2 + bølger.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Forberedelse av plantemateriale

  1. I en 1,5 ml mikrotube steriliserer overflaten frøene til Arabidopsis thaliana (Col-0 tiltredelse) som uttrykker enten GCaMP3 eller CHIB-iGluSnFR ved å riste med 20% (v / v) NaClO i 3 minutter og vask deretter 5 ganger med sterilt destillert vann.
    MERK: De transgene linjene til Arabidopsis som uttrykker GCaMP3 eller CHIB-iGluSnFR har blitt beskrevet tidligere6.
  2. I en steril hette, så 13 overflatesteriliserte frø på en 10 cm firkantet plast Petri-tallerken fylt med 30 ml sterile (autoklavede) Murashige og Skoog (MS) medium [1x MS salter, 1% (w / v) sukrose, 0,01% (w / v) myoinositol, 0,05% (w / v) MES og 0,5% (w / v) gellan tyggegummi; pH 5.7 justert med 1N KOH]. Sett på lokket og pakk det inn med kirurgisk tape.
  3. Etter inkubasjon i mørket ved 4 °C i 2 dager, plasser platene horisontalt ved 22 °C i et vekstkammer under kontinuerlig lys (90-100 μmol m-2 s-1) i ca. 2 uker før bruk. Etter 2 uker teller antall Arabidopsis blader fra eldste til yngste44 (Figur 1). Sårresponser beveger seg fortrinnsvis fra det skadede bladet (n) til blader nummerert n ± 3 og n ± 56.
    MERK: I denne protokollen åpnes Petri-parabolen for avbildning av sår- og glutamateffektene under et fluorescensmikroskop. Derfor bør etterfølgende trinn i dette eksperimentet utføres under temperatur- og fuktighetskontrollerte romforhold. Dette er fordi Ca2+ signaler også fremkalles av endringer i disse miljøforholdene. Det er også kjent at det blå lyset, som slippes ut fra mikroskopet under opptak for eksitasjon av biosensorproteinets fluorescens, kan fremkalle en økning av cytosolisk Ca2 + konsentrasjon45, og derfor bør planten akklimatiseres til blålysbestrålingen i flere minutter før du begynner eksperimentet.

2. Kjemisk tilberedning

  1. Løs opp L-Glutamat i et flytende vekstmedium [1/2x MS-salter, 1% (m/v) sukrose og 0,05% (w/v) MES; pH 5.1 justert med 1N KOH] for å lage en 100 mM arbeidsløsning.
    MERK: Unngå bruk av salter av glutamat som natriumglutamat for å forhindre potensielle kationrelaterte effekter på Ca2+ dynamikk.

3. Mikroskopinnstilling og utføre sanntidsavbildning

  1. Slå på det motoriserte fluorescenssterokroskopet utstyrt med et 1x objektiv objektiv (NA = 0,156) og et sCMOS-kamera (figur 2) og konfigurer enhetsinnstillingene til å bestråle med et 470/40 nm eksitasjonslys og få et utslippslys som passerer gjennom et 535/50 nm filter.
    MERK: Ethvert GFP-sensitivt fluorescensmikroskop kan brukes til å oppdage GCaMP3- og iGluSnFR-signaler i sanntid, men en objektiv linse med lav effekt og et svært følsomt kamera med en bred sCMOS-brikke anbefales for å innhente signaler fra hele anlegget. Det lave effektmålet gjør det mulig å forestille seg et helt Arabidopsis-anleggs respons og bruk av et svært følsomt kamera tillater rask datainnsamling som trengs for å fange opp det raske tidsforløpet til den sårutløste Ca2 + -bølgen. For fluorescensmikroskopet som brukes i denne studien, er maksimumsverdiene for synsfeltet og temporal oppløsning henholdsvis 3 cm x 3 cm og 30 bilder per sekund (fps).
  2. Ta av lokket og legg fatet under objektivlinsen.
  3. Kontroller fluorescenssignalet fra anlegget og vent deretter i ca. 30 min i mørket til plantene er tilpasset de nye miljøforholdene. Dette tilpasningstrinnet er nødvendig fordi endringer i fuktighet fremkaller [Ca2+]cythøyde i planter som kan forstyrre eventuelle sårrelaterte hendelser.
  4. Juster fokus og forstørrelse for å se hele anlegget innen synsfeltet. I gjeldende protokoll ble det brukt en forstørrelse på 0,63x.
  5. Før du starter sanntidsavbildning, må du sette opp anskaffelsesparametrene for å oppdage fluorescenssignalene ved hjelp av mikroskopavbildningsprogramvare. Innstillingene for avbildning i gjeldende protokoll er: eksponerings- og intervalltider satt til henholdsvis 1,8 s og 2 s (dvs. 0,5 bps). Sett opptakstiden til 11 min.
  6. Bilde i 5 min før du starter eksperimentet for å akklimatisere anlegget til det blå lysbestrålingen fra mikroskopet, og start deretter innspillingen ved å klikke på Kjør nå, eller tilsvarende kommando i mikroskopprogramvaren som brukes. For å bestemme gjennomsnittlig fluorescens ved baseline, registrer minst 10 bilder (dvs. minst 20 s i gjeldende protokoll) før sår eller glutamatapplikasjon (se avsnitt 4).
    1. For sanntidsavbildning av sårinduserte[Ca. 2+]cyt- og [Glu]-apo-endringer, kutt petiolen eller den midterste delen av blad L1 med saks (Figur 3 og Figur 4).
    2. For sanntidsavbildning av glutamatutløste [Ca2+]cyt-endringer, kutt kanten (ca. 1 mm fra spissen) av blad 1 over hovedvenen med saks. Etter minst 20 min utvinningsperiode, påfør 10 μL 100 mM glutamat på bladets kuttede overflate (Figur 5).
      MERK: Denne forskjæringen var nødvendig for å gi glutamat tilgang til bladaplastikken for å utløse respons. I tillegg ble det funnet å være kritisk å bruke en dråpe destillert vann på den kuttede overflaten av blad L1 for å forhindre at prøvene tørket under utvinningen før du påførte glutamat.
  7. Etter å ha fullført 11 min-innspillingen, lagrer du dataene.

4. Dataanalyse

  1. For fluorescensintensitetsanalyse over tid, definer en interesseregion (ROI) på stedet der fluorescensintensiteten skal analyseres (figur 6 og figur 7). For hastighetsberegningen av Ca2+-bølgen definerer du 2 ROIer (ROI1 og ROI2) for analyse. I bildebehandlingsprogramvaren klikker du på Tidsmåling | Definere | Sirkel. Mål avstanden mellom AVKASTNING1 og avkastning2 ved å klikke på Merknader og Måling | Lengde | Enkel linje (figur 6).
  2. Mål de rå fluorescensverdiene (F) i hver avkastning over tid ved å klikke på Mål. Eksporter rådata til en regnearkprogramvare for å konvertere fluorescenssignalet til tall på hvert tidspunkt ved å klikke på Alle til Excel | Eksporter.
  3. Bestem referanseverdien for baseline, som er definert som F0, ved å beregne gjennomsnittet av F over de første 10 rammene (dvs. før behandling) i de registrerte dataene.
  4. Normaliser F-dataene (ved å beregne ΔF/F) ved hjelp av ligningen ΔF/F = (F−F0)/F0, der ΔF er den tidsavhengige endringen i fluorescens.
  5. For Ca2+ bølgehastighetsbølgeanalyse definerer du et betydelig signalstigningspunkt over de forhåndsstimmede verdiene som representerer deteksjon av en Ca2+ økning i hver avkastning (t1 og t2) ved hjelp av kriteriet for en økning til 2× standardavviket (2x SD) som beregnes fra F0-dataene ved hjelp av statistisk programvare. 95% av F0-dataene faller innenfor 2x SD fra gjennomsnittet, noe som indikerer at en økning i signal over dette nivået ved en tilfeldighet er ≤5%. Beregn tidsforskjellen for Ca2+-økningen mellom ROI1 og ROI2 [t2- t1 tidsforsinkelse (Δt)] og mål avstanden mellom ROI1 og ROI2, og bestem deretter hastighetene til enca. 2+ bølge.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Signalutbredelse av [Ca2+]cyt og [Glu]apo som svar på sår er presentert i figur 3, figur 4, film S1og film S2. Kutting av bladbladets petiole 1 i planter som uttrykker GCaMP3 (ved 0 s) førte til en betydelig økning i [Ca2+]cyt som raskt ble indusert lokalt gjennom vaskulaturen (ved 40 s) (Figur 3 og Film S1). Deretter ble signalet raskt forplantet til nærliggende blader (blad 3 og 6) i løpet av få minutter (ved 80 s) (Figur 3 og Movie S1).

Ved kutting av blad 1 i planter som uttrykker CHIB-iGluSnFR, ble det observert en rask [Glu]apo-økning rundt kuttområdet (ved 2 s). Dette signalet ble forplantet gjennom vaskulaturen lokalt i løpet av få minutter (ved 160 s), men ble ikke observert i systemiske blader (Figur 4 og Movie S2).

For sanntidsavbildning av Ca2+ signalutbredelse utløst av påføring av glutamat, ble kanten (ca. 1 mm fra spissen) av blad 1 i planter som uttrykker GCaMP3 kuttet som vist i figur 5A og Film S3. Kutting av kanten av blad 1 forårsaket en lokal [Ca2 +]cyt økning (ved 40 s), men dette signalet forsvant i løpet av få minutter (ved 124 s). Etter å ha ventet i ca. 10 minutter på at anlegget skulle komme seg, ble 10 μL 100 mM glutamat påført den kuttede overflaten av blad 1, noe som førte til en rask, betydelig økning av [Ca2+]cyt lokalt (ved 56 s) og signalutbredelse til distale blader (ved 104 s) (Figur 5B og Film S4).

For å måle endringene i [Ca2+]cyt indusert ved såring i det systemiske bladet, ble to ROIer (ROI1 og ROI2) satt i baseområdet og spissen av blad 6 i planter som uttrykker GCaMP3 som vist i figur 6A. Tidsforløpendringen av GCaMP3-signalintensiteten i ROI1 og ROI2 ved kutting av petiole av blad 1 ble målt (Figur 6B). En signifikant økning av[Ca. 2+]cyt ved ROI1 ble oppdaget tidligere enn for ROI2 (figur 6B). [Ca2+] cyt nådde ca. 100 s etter såring, varte i over 10 minutter og viste to faser (figur 6B).

For å bestemme hastigheten på Ca2+-bølgen ved mekanisk såring ble tidspunktet for et betydelig signal stigning over de pre-stimulerte verdiene i ROI1 og ROI2 bestemt (tidsforsinkelse; se avsnitt 4) (Figur 6C). Fordi avstanden mellom ROI1 og ROI2 var 2,7 mm i dette tilfellet (figur 6A), ble Ca2+ signalhastighet i blad 6 beregnet som 0,15 mm/s. For å måle [Glu]apo-endringene som svar på den mekaniske skaden, ble ROI1 satt i nærheten av skjærestedet til bladet merket som L1 som vist i figur 7A. [Lim] apo signatur på ROI1 har vist en enkelt topp på ca 100 s ved såring (Figur 7B).

Figure 1
Figur 1: Nummerering av Arabidopsis rosettblader. Arabidopsis blader er nummerert fra eldste til yngste (venstre panel). Et skjematisk diagram over bladenes posisjon er angitt i høyre panel. L: blad, C: cotyledons. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Et fluorescensmikroskop som ble brukt i denne studien. [Ca2+]cyt og [Glu]apodynamikk ble avbildet med et vidfelt fluorescens stereomikroskop. R: Fjernkontroll, O: 1x objektiv, C: sCMOS-kamera, T: Trinocular vipperør, S: Stage, P: Plantemateriale. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Sårindusert langdistanse Ca2+ signaloverføring. Kutting av petiole (hvit pil, 0 s) blad 1 (L1) i plante som uttrykker GCaMP3 utløste en lokal [Ca2 +]cyt økning (rød pil, 40 s) som ble overført til systemiske blader [blad 3 (L3) og blad 6 (L6)] (oransje piler, 80 s). Skalastang, 5 mm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: Sårutløst [Glu]-høyde. Kutting av bladet 1 (L1) (hvit pil, 0 s) i planter som uttrykker CHIB-iGluSnFR forårsaket en rask høyde på [Glu]apo (rød pil, 80 s) som forplantet seg gjennom vaskulaturen (oransje pil, 160 s). Skalastang, 2 mm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 5
Figur 5: Glutamatutløst langdistanse Ca2+ signaloverføring. (A) Skjære kanten (ca. 1 mm fra spissen) av blad 1 (L1) i planter som uttrykker GCaMP3 (hvit pil, 0 s) forårsaket en [Ca2 +]cyt økning (rød pil, 40 s). (B) Påføring av 100 mM glutamat til skjæreflaten på L1 (hvit pil, 0 s) forårsaket en lokal [Ca2+]cyt økning (rød pil, 56 s) som raskt forplantet seg til distale blader [f.eks. blad 3 (L3), blad 4 (L4) og blad 6 (L6)] (oransje piler, 104 s). Skalastenger, 5 mm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 6
Figur 6: [Ca2+]cytsignatur i systemiske blader som svar på mekanisk såring. (A) Et utvidet bilde av blad 6 (L6) i planter som uttrykker GCaMP3, er vist i figur 3. ROI1 (blå sirkel) og ROI2 (rosa sirkel) ble satt på henholdsvis base- og spissområdet. Hvit pil indikerer kuttstedet til blad 1s petiole (L1). I dette tilfellet var avstanden mellom ROI1 og ROI2 2,7 mm. (B) Kvantifisering av [Ca2+]cytsignaturer i ROI1 og ROI2. Endringer i fluorescensintensitet ble analysert ved hjelp av bildebehandlingsprogramvare. (C) En utvidet sporing av data i (B) mellom 0 og 80 s. Deteksjonspunkter for en Ca2+ økning i ROI1 og ROI2 ble definert som henholdsvis t1 og t2, ved hjelp av som et kriterium en økning til 2x standardavviket for prestimuleringsverdiene (2x SD, prikket linje). Verdien t2 - t1 ble definert som tidsforsinkelse (Δt) i gjeldende protokoll. Svart pil angir klippetiden. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 7
Figur 7: [Glu]apo signatur som svar på mekanisk såring. (A) Et utvidet bilde av blad 1 (L1) i planter som uttrykker CHIB-iGluSnFR er vist i figur 4. ROI1 ble satt i nærheten av kuttstedet. Hvit pil angir det kuttede området. (B) Mengden [Glu]apo-signatur i ROI1 overvåkes ved hjelp av bildebehandlingsprogramvare. Svart pil angir klippetiden. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Film S1: Langdistanse Ca2+ overføring etter mekanisk såring. Mekanisk såring ved petiole av blad 1 (L1) forårsaket en [Ca2 +]cyt økning overført til distale blader [f.eks. blad 3 (L3) og blad 6 (L6)]. Klikk her for å laste ned denne filmen.

Film S2: Høyde over de apoplastiske glutamatnivåene som svar på kutting. Mekanisk såring av bladet 1 (L1) forårsaket en umiddelbar økning i [Glu]apo. Klikk her for å laste ned denne filmen.

Film S3: Høyde over [Ca2+]cytnivåer som svar på kutting. Mekanisk såring i kanten av blad 1 (L1) forårsaket en umiddelbar, lokal [Ca2+]cythøyde. Klikk her for å laste ned denne filmen.

Film S4: Påføring av glutamat utløser systemisk [Ca2+]cyt øker. Påføring av 100 mM glutamat utløste Ca2+ overføring til systemiske blader [f.eks. blad 3 (L3), blad 4 (L4) og blad 6 (L6)]. Klikk her for å laste ned denne filmen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Systemisk signalering er viktig for planter å reagere på lokaliserte eksterne miljøstimuli og deretter opprettholde sin homeostase på et helt plantenivå. Selv om de ikke er utstyrt med et avansert nervesystem som dyr, bruker de rask kommunikasjon både i og mellom organer basert på faktorer som mobile elektriske (og muligens hydrauliske) signaler og forplantningsbølger av ROS og Ca2 + 46,47. Protokollen beskrevet ovenfor tillater planteomfattende sanntidsavbildning av aktiviteten til dette signalsystemet gjennom overvåking av dynamikken i Ca2+ og apoplastisk glutamat som svar på sår. Denne metoden gir et robust verktøy for å forstå raske og langdistansesignaler i planter som kombinerer høy romlig oppløsning og brukervennlighet. Denne protokollen gir også potensial til å gi ny fysiologisk innsikt i de molekylære mekanismene som ligger til grunn for fjernsårsignalering gjennom for eksempel bruk av mutanter som er defekte i putative elementer i det raske signalsystemet eller utforskning av effektene av farmakologiske reagenser som Ca2+ kanalblokkere (f.eks. LaCl3) eller hemmere av andre potensielt viktige signalaktiviteter6.

En viktig fordel med den beskrevne biosensoravbildningsmetoden er bruk av enkelt-FP biosensorer med høyt fluorescerende utbytte, noe som i stor grad forenkler både nødvendig utstyr for å gjøre disse målingene og deres i plantabruk. Dermed er fluorescensbaserte genetisk kodede indikatorer delt inn i to klasser: 1) intensitetsbaserte enkelt-FP biosensorer og 2) ratiometriske FRET-baserte biosensorer10. Selv om ratiometriske FRET-baserte sensorer er kvantitativt nøyaktige, gir intensitetsbaserte Ca2+-indikatorer, inkludert GCaMP3 og iGluSnFR som brukes her, både høyere tidsoppløsning og brukervennlighet på grunn av deres generelt lysere Ca2+-responsive signal og deres enklere mikroskopkrav10. For eksempel ble den rød-fluorescerende proteinbaserte enkelt-FP Ca2 + -indikatoren R-GECO1 rapportert å vise en mye større signalendring som svar på ekstracellulær ATP og planteforsvarets elicitors flg22 og chitin, sammenlignet med den forholdsmetriske YC3.6 biosensor27. For analyse av ratiometriske FRET-baserte sensorer er det også nødvendig å bruke et spesialisert mikroskop med flere filtre for å samle inn data ved to bølgelengder, mens enkelt-FP-baserte biosensorer krever at enheten samler inn dataene ved bare en bølgelengde, en evne som finnes i alle standard fluorescensmikroskop10. Det er imidlertid viktig å merke seg at det er noen ulemper ved å bruke single-FP biosensorer. Disse intensitetsbaserte enkelt-FP biosensorene er ikke foretrukket for kvantifisering av absolutte konsentrasjonsendringer eller for langsiktig avbildning over mange timer eller dager. Denne begrensningen skyldes at i tillegg til for eksempel Ca2+-nivå for GCaMP3, antas signalintensiteten fra disse enkelt-FP-biosensorene å bli påvirket av andre faktorer som sensoruttrykksnivå eller parametere som cellulær pH som kan endres over tid.

Til dags dato er mange nye varianter av disse genetisk kodede indikatorene konstruert for å forbedre signal-til-støy-forholdet, dynamisk område, kinetikk og sensorstabilitet. Etter at For eksempel Nakai et al.26 utviklet den første GCaMP, har ulike etterfølgende varianter, for eksempel GECOene, blitt generert av en kombinasjon av mutagenese og forsiktig karakterisering48,49,50. Det dynamiske spekteret av G-GECO (Green-GECO) ble rapportert å være omtrent to ganger større enn GCaMP328. Videre førte erstatningen med forskjellige fluorescerende proteiner i disse indikatorene til generering av GECO-varianter med forskjellige utslippsspektra, for eksempel B-GECO (Blue-GECO) og R-GECO (Red-GECO), som muliggjør bruk av disse indikatorene sammen med andre GFP spektralvarianter i flerfargede bildebehandlingsapplikasjoner28. På samme måte har GCaMP fortsatt å bli utviklet og forbedret med en rekke sensorer forbedret for responshastighet og amplitude av signal som nå er tilgjengelig50. For overvåking av glutamatdynamikk, annet enn iGluSnFR, en serie FRET-baserte glutamatbiosensorer, har FLuorescent Indicator Proteins for Glutamate (FLIPE) blitt utviklet40. FLIPE består av CFP og YFP som er koblet via glutamatbindende protein ybeJ tatt fra E. coli. Ved glutamatbinding til ybeJ observeres en glutamatkonsentrasjonsavhengig reduksjon av FRET-effektivitet. Derfor, for både Ca2 + og glutamat er det flere enkelt-FP- og ratiometriske sensorer tilgjengelig. Forskere bør vurdere riktig biosensor for å oppdage signaldynamikk avhengig av eksperimentell design og krav til målefaktorer som høyt signal: støy (enkelt-FP-sensorer) kontra et behov for svært nøyaktig kvantifisering (der FRET-sensorer utmerker seg).

Den brede, enkelt-FP-avbildningsmetoden som er beskrevet her for såring, bør også være nyttig når den brukes på andre stresssystemiske signalprosesser. Til tross for tilstedeværelsen av mange rapporter som antyder en avgjørende rolle for langdistanse Ca2 + signalering i ulike stressresponser, for eksempel plantelevende angrep6,51,52, salt20og tørke53, har bare noen få studier gitt den romlige informasjonen relatert til raske langdistanse Ca2 + signaler indusert av disse stressresponsene6,7,20,52. Bruken av et bredfelts fluorescensmikroskop i denne protokollen tillater også sanntidsobservasjon av mobil signaldynamikk, ikke bare i blad-til-blad-kommunikasjon, men også root-to-shoot kommunikasjon som nylig vist38. Selv om vi har fokusert på protokoller for Arabidopsis, gir denne planteomfattende sanntidsavbildningsmetoden også et robust verktøy for å forstå de romlige og tidsmessige egenskapene til systemiske Ca2 + -signalering i både biotiske og abiotiske stressresponser i andre plantearter som tobakk30.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingen interessekonflikter.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av tilskudd fra Japan Society for the Promotion of Science (17H05007 og 18H05491) til MT, National Science Foundation (IOS1557899 og MCB2016177) og National Aeronautics and Space Administration (NNX14AT25G og 80NSSC19K0126) til SG.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Arabidopsis expressing GCaMP3 Saitama University
Arabidopsis expressing CHIB-iGluSnFR Saitama University
GraphPad Prism 7 GraphPad Software
L-Glutamate FUJIFILM Wako 072-00501 Dissolved in a liquid growth medium [1/2x MS salts, 1% (w/v) sucrose, and 0.05% (w/v) MES; pH 5.1 adjusted with 1N KOH].
Microsoft Excel Microsoft Corporation
Murashige and Skoog (MS) medium FUJIFILM Wako 392-00591 composition: 1x MS salts, 1% (w/v) sucrose, 0.01% (w/v) myoinositol, 0.05% (w/v) MES, and 0.5% (w/v) gellan gum; pH 5.7 adjusted with 1N KOH.
Nikon SMZ25 stereomicroscope Nikon
NIS-Elements AR analysis Nikon
1x objective lens (P2-SHR PLAN APO) Nikon
sCMOS camera (ORCA-Flash4.0 V2) Hamamatsu Photonics C11440-22CU
Square plastic Petri dish Simport D210-16

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wu, J., Baldwin, I. T. Herbivory-induced signalling in plants: perception and action. Plant, Cell & Environment. 32 (9), 1161-1174 (2009).
  2. Howe, G. A., Major, I. T., Koo, A. J. Modularity in Jasmonate Signaling for Multistress Resilience. Annual Review of Plant Biology. 69 (1), 387-415 (2018).
  3. Mousavi, S. A. R., Chauvin, A., Pascaud, F., Kellenberger, S., Farmer, E. E. GLUTAMATE RECEPTOR-LIKE genes mediate leaf-to-leaf wound signalling. Nature. 500 (7463), 422-426 (2013).
  4. Gilroy, S., et al. Electric Signals: Key Mediators of Rapid Systemic Signaling in Plants. Plant Physiology. 171 (3), 1606-1615 (2016).
  5. Choi, W. -G., Hilleary, R., Swanson, S. J., Kim, S. -H., Gilroy, S. Rapid, long-distance electrical and calcium signaling in plants. Annual Review of Plant Biology. 67 (1), 287-307 (2016).
  6. Toyota, M., et al. Glutamate triggers long-distance, calcium-based plant defense signaling. Science. 361 (6407), 1112-1115 (2018).
  7. Nguyen, C. T., Kurenda, A., Stolz, S., Chételat, A., Farmer, E. E. Identification of cell populations necessary for leaf-to-leaf electrical signaling in a wounded plant. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (40), 10178-10183 (2018).
  8. Lecourieux, D., Ranjeva, R., Pugin, A. Calcium in plant defence-signalling pathways. New Phytologist. 171 (2), 249-269 (2006).
  9. Farmer, E. E., Gao, Y. -Q., Lenzoni, G., Wolfender, J. -L., Wu, Q. Wound- and mechanostimulated electrical signals control hormone responses. New Phytologist. 227 (4), 1037-1050 (2020).
  10. Palmer, A. E., Qin, Y., Park, J. G., McCombs, J. E. Design and application of genetically encoded biosensors. Trends in Biotechnology. 29 (3), 144-152 (2011).
  11. Ridgway, E. B., Ashley, C. C. Calcium transients in single muscle fibers. Biochemical and Biophysical Research Communications. 29 (2), 229-234 (1967).
  12. Kiegle, E., Moore, C. A., Haseloff, J., Tester, M. A., Knight, M. R. Cell-type-specific calcium responses to drought, salt and cold in the Arabidopsis root. The Plant Journal. 23 (2), 267-278 (2000).
  13. Zhu, X., Feng, Y., Liang, G., Liu, N., Zhu, J. -K. Aequorin-based luminescence imaging reveals stimulus- and tissue-specific Ca2+ dynamics in Arabidopsis plants. Molecular Plant. 6 (2), 444-455 (2013).
  14. Kwaaitaal, M., Huisman, R., Maintz, J., Reinstädler, A., Panstruga, R. Ionotropic glutamate receptor (iGluR)-like channels mediate MAMP-induced calcium influx in Arabidopsis thaliana. Biochemical Journal. 440 (3), 355-373 (2011).
  15. Vatsa, P., et al. Involvement of putative glutamate receptors in plant defence signaling and NO production. Biochimie. 93 (12), 2095-2101 (2011).
  16. Toyota, M., Furuichi, T., Sokabe, M., Tatsumi, H. Analyses of a gravistimulation-specific Ca2+ signature in Arabidopsis using parabolic flights. Plant Physiology. 163 (2), 543-554 (2013).
  17. Toyota, M. Hypergravity stimulation induces changes in intracellular calcium concentration in Arabidopsis seedlings. Advances in Space Research. 39, 1190-1197 (2007).
  18. Stephan, A. B., Kunz, H. -H., Yang, E., Schroeder, J. I. Rapid hyperosmotic-induced Ca2+ responses in Arabidopsis thaliana exhibit sensory potentiation and involvement of plastidial KEA transporters. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (35), 5242-5249 (2016).
  19. Nagai, T., Yamada, S., Tominaga, T., Ichikawa, M., Miyawaki, A. Expanded dynamic range of fluorescent indicators for Ca2+ by circularly permuted yellow fluorescent proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (29), 10554-10559 (2004).
  20. Choi, W. -G., Toyota, M., Kim, S. -H., Hilleary, R., Gilroy, S. Salt stress-induced Ca2+ waves are associated with rapid, long-distance root-to-shoot signaling in plants. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (17), 6497-6502 (2014).
  21. Evans, M. J., Choi, W. -G., Gilroy, S., Morris, R. J. A ROS-assisted calcium wave dependent on the AtRBOHD NADPH oxidase and TPC1 cation channel propagates the systemic response to salt stress. Plant Physiology. 171 (3), 1771-1784 (2016).
  22. Hilleary, R., et al. Tonoplast-localized Ca2+ pumps regulate Ca2+ signals during pattern-triggered immunity in Arabidopsis thaliana. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (31), 18849-18857 (2020).
  23. Lenglet, A., et al. Control of basal jasmonate signalling and defence through modulation of intracellular cation flux capacity. New Phytologist. 216 (4), 1161-1169 (2017).
  24. Choi, W. -G., Swanson, S. J., Gilroy, S. High-resolution imaging of Ca2+, redox status, ROS and pH using GFP biosensors. The Plant Journal. 70 (1), 118-128 (2012).
  25. Nagai, T., Sawano, A., Park, E. S., Miyawaki, A. Circularly permuted green fluorescent proteins engineered to sense Ca2. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (6), 3197-3202 (2001).
  26. Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. A high signal-to-noise Ca2+ probe composed of a single green fluorescent protein. Nature Biotechnology. 19 (2), 137-141 (2001).
  27. Keinath, N. F., et al. Live cell imaging with R-GECO1 sheds light on flg22- and Chitin-induced transient [Ca2+]cyt patterns in Arabidopsis. Molecular Plant. 8 (8), 1188-1200 (2015).
  28. Zhao, Y., et al. An expanded palette of genetically encoded Ca2+ indicators. Science. 333 (6051), 1888-1891 (2011).
  29. Vincent, T. R., et al. Real-time in vivo recording of Arabidopsis calcium signals during insect feeding using a fluorescent biosensor. JoVE. (126), e56142 (2017).
  30. DeFalco, T. A., et al. Using GCaMP3 to study Ca2+ signaling in nicotiana species. Plant and Cell Physiology. 58 (7), 1173-1184 (2017).
  31. Michard, E., et al. Glutamate receptor-like genes form Ca2+ channels in pollen tubes and are regulated by Pistil D-Serine. Science. 332 (6028), 434-437 (2011).
  32. Singh, S. K., Chien, C. -T., Chang, I. -F. The Arabidopsis glutamate receptor-like gene GLR3.6 controls root development by repressing the Kip-related protein gene KRP4. Journal of Experimental Botany. 67 (6), 1853-1869 (2016).
  33. Li, H., et al. Tomato GLR3.3 and GLR3.5 mediate cold acclimation-induced chilling tolerance by regulating apoplastic H2O2 production and redox homeostasis. Plant, Cell & Environment. 42 (12), 3326-3339 (2019).
  34. Li, F., et al. Glutamate receptor-like channel3.3 is involved in mediating glutathione-triggered cytosolic calcium transients, transcriptional changes, and innate immunity responses in Arabidopsis. Plant Physiology. 162 (3), 1497-1509 (2013).
  35. Wudick, M. M., Michard, E., Oliveira Nunes, C., Feijó, J. A. Comparing plant and animal glutamate receptors: common traits but different fates. Journal of Experimental Botany. 69 (17), 4151-4163 (2018).
  36. De Bortoli, S., Teardo, E., Szabò, I., Morosinotto, T., Alboresi, A. Evolutionary insight into the ionotropic glutamate receptor superfamily of photosynthetic organisms. Biophysical Chemistry. 218, 14-26 (2016).
  37. Janovjak, H., Sandoz, G., Isacoff, E. Y. A modern ionotropic glutamate receptor with a K+ selectivity signature sequence. Nature Communications. 2 (1), 232 (2011).
  38. Shao, Q., Gao, Q., Lhamo, D., Zhang, H., Luan, S. Two glutamate- and pH-regulated Ca2+ channels are required for systemic wound signaling in Arabidopsis. Science Signaling. 13 (640), (2020).
  39. Forde, B. G., Lea, P. J. Glutamate in plants: metabolism, regulation, and signalling. Journal of Experimental Botany. 58 (9), 2339-2358 (2007).
  40. Okumoto, S., et al. Detection of glutamate release from neurons by genetically encoded surface-displayed FRET nanosensors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (24), 8740-8745 (2005).
  41. Hires, S. A., Zhu, Y., Tsien, R. Y. Optical measurement of synaptic glutamate spillover and reuptake by linker optimized glutamate-sensitive fluorescent reporters. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (11), 4411-4416 (2008).
  42. Marvin, J. S., et al. An optimized fluorescent probe for visualizing glutamate neurotransmission. Nature Methods. 10 (2), 162-170 (2013).
  43. Marvin, J. S., et al. Stability, affinity, and chromatic variants of the glutamate sensor iGluSnFR. Nature Methods. 15 (11), 936-939 (2018).
  44. Farmer, E., Mousavi, S. A. R., Lenglet, A. Leaf numbering for experiments on long distance signalling in Arabidopsis. Protocol Exchange: Preprint server. , (2013).
  45. Harada, A., Shimazaki, K. -i Phototropins and blue light-dependent calcium signaling in higher plants. Photochemistry and Photobiology. 83 (1), 102-111 (2007).
  46. Huber, A. E., Bauerle, T. L. Long-distance plant signaling pathways in response to multiple stressors: the gap in knowledge. Journal of Experimental Botany. 67 (7), 2063-2079 (2016).
  47. Choi, W. -G., et al. Orchestrating rapid long-distance signaling in plants with Ca2+, ROS and electrical signals. The Plant Journal. 90 (4), 698-707 (2017).
  48. Tallini, Y. N., et al. Imaging cellular signals in the heart in vivo: cardiac expression of the high-signal Ca2+ indicator GCaMP2. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (12), 4753-4758 (2006).
  49. Tian, L., et al. Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators. Nature Methods. 6 (12), 875-881 (2009).
  50. Chen, T. -W., et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).
  51. Vincent, T. R., et al. Interplay of plasma membrane and vacuolar ion channels, together with BAK1, elicits rapid cytosolic calcium elevations in Arabidopsis during aphid feeding. The Plant Cell. 29 (6), 1460-1479 (2017).
  52. Meena, M. K., et al. The Ca2+ channel CNGC19 regulates Arabidopsis defense against spodoptera herbivory. The Plant Cell. 31 (7), 1539-1562 (2019).
  53. Cheong, Y. H., et al. CBL1, a calcium sensor that differentially regulates salt, drought, and cold responses in arabidopsis. The Plant Cell. 15 (8), 1833-1845 (2003).

Tags

Biologi utgave 172 kalsium GCaMP3 genetisk kodede fluorescerende biosensorer glutamat iGluSnFR fjernsignal såring
Wide-Field, sanntidsavbildning av lokale og systemiske sårsignaler i <em>Arabidopsis</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Uemura, T., Wang, J., Aratani, Y.,… More

Uemura, T., Wang, J., Aratani, Y., Gilroy, S., Toyota, M. Wide-Field, Real-Time Imaging of Local and Systemic Wound Signals in Arabidopsis. J. Vis. Exp. (172), e62114, doi:10.3791/62114 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter