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Biology

Imagens em campo amplo e em tempo real de sinais de feridas locais e sistêmicas em Arabidopsis

Published: June 4, 2021 doi: 10.3791/62114
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 1,2
1Department of Biochemistry and Molecular Biology, Saitama University, 2Department of Botany, University of Wisconsin

Summary

A sinalização sistêmica de cálcio acionada por glutamato extracelular é fundamental para a indução de respostas de defesa vegetal a ferimentos mecânicos e ataque herbívoro em plantas. Este artigo descreve um método para visualizar a dinâmica espacial e temporal de ambos os fatores usando plantas arabidopsis thaliana expressando biosensores fluorescentes sensíveis ao cálcio e glutamato.

Abstract

As plantas respondem a tensões mecânicas, como ferimentos e herbívoros, induzindo respostas de defesa tanto nas partes danificadas quanto nas partes distais não danificadas. Após o ferimento de uma folha, ocorre um aumento na concentração de íons de cálcio citosos (sinal ca2+) no local da ferida. Este sinal é rapidamente transmitido para folhas não danificadas, onde as respostas de defesa são ativadas. Nossa pesquisa recente revelou que o glutamato vazando das células feridas da folha para o apoplasto ao seu redor serve como um sinal de ferimento. Este glutamato ativa os canais permeáveis ca2+ semelhantes ao receptor de glutamato, o que leva à propagação de sinal Ca2+ de longa distância em toda a planta. As características espaciais e temporais desses eventos podem ser capturadas com imagens em tempo real de plantas vivas expressando biosensores fluorescentes geneticamente codificados. Aqui introduzimos um método de imagem em tempo real em toda a planta para monitorar a dinâmica dos sinais ca2+ e mudanças no glutamato apoplástico que ocorrem em resposta ao ferimento. Esta abordagem usa um microscópio de fluorescência de campo largo e plantas de Arabidopsis transgênicas expressando Ca2+ à base de Proteína Fluorescente Verde (GFP) e biosensores de glutamato. Além disso, apresentamos metodologia para facilmente provocar a propagação de sinal Ca2+ induzida por feridas e glutamato. Este protocolo também pode ser aplicado a estudos sobre outras estações vegetais para ajudar a investigar como a sinalização sistêmica da planta pode estar envolvida em suas redes de sinalização e resposta.

Introduction

As plantas não podem escapar de estresses bióticos, por exemplo, insetos que se alimentam deles, por isso desenvolveram sofisticados sistemas de sensoriamento de estresse e transdução de sinais para detectar e, em seguida, proteger-se de desafios como herbívoro1. Ao ferir ou atacar herbívoros, as plantas iniciam respostas rápidas de defesa, incluindo o acúmulo do ácido jasmônico fitohormônio (JA) não apenas no local ferido, mas também em órgãos distais não danificados2. Este JA então ambos desencadeiam respostas de defesa nos tecidos diretamente danificados e induz preventivamente defesas nas partes não danificadas da planta. Em Arabidopsis, o acúmulo de JA induzido pelo ferimento foi detectado em folhas distais e intactas em apenas alguns minutos de danos em outros lugares da planta sugerindo que um sinal rápido e de longa distância está sendo transmitido da folha3ferida . Vários candidatos, como ca2+,espécies reativas de oxigênio (ROS) e sinais elétricos, foram propostos para servir como esses sinais de ferida de longa distância nas plantas4,5.

Ca2+ é um dos mais versáteis e onipresentes segundo elementos mensageiros em organismos eucarióticos. Nas plantas, a mastigação de lagartas e o ferimento mecânico causam aumentos drásticos na concentração citosolic Ca2+ ([Ca2+]cyt) tanto na folha ferida quanto em folhas distantes desenroladas6,7. Este sinal sistêmico Ca2+ é recebido por proteínas de sensoriamento intracelular Ca2+,que levam à ativação de vias de sinalização de defesa a jusante, incluindo a biossíntese JA8,9. Apesar de inúmeros desses relatos que sustentam a importância dos sinais de Ca2+ nas respostas de feridas vegetais, as informações sobre as características espaciais e temporais dos sinais Ca2+ induzidos pelo ferimento são limitadas.

A imagem em tempo real usando indicadores Ca2+ geneticamente codificados é uma ferramenta poderosa para monitorar e quantificar a dinâmica espacial e temporal dos sinais Ca2+. Até o momento, foram desenvolvidas versões desses sensores que permitem a visualização de sinais ca2+ ao nível de uma única célula, para tecidos, órgãos e até plantas inteiras10. O primeiro biosensor geneticamente codificado para Ca2+ usado em plantas foi a proteína bioluminescente aequorin derivada da água-viva Aequorea victoria11. Embora esta proteína quemiluminescente tenha sido usada para detectar alterações de Ca2+ em resposta a várias tensões nas plantas12,13,14,15,16,17,18, não é adequada para imagens em tempo real devido ao sinal extremamente baixo luminescente que produz. Os indicadores Ca2+ baseados em Förster Resonance Energy Transfer (FRET), como os cameleons Amarelos, também foram usados com sucesso para investigar a dinâmica de uma gama de eventos de sinalização Ca2+ nas usinas19,20,21,22,23,24. Estes sensores são compatíveis com abordagens de imagem e, mais comumente, são compostos pela proteína de ligação Ca2+ calmodulin (CaM) e um peptídeo de ligação de CaM (M13) de uma quinase da cadeia de luz da miosina, tudo fundido entre duas proteínas fluorforas, geralmente uma Proteína Fluorescente Cyan (CFP) e uma variante de Proteína Fluorescente Amarela (YFP)10. A ligação Ca2+ ao CaM promove a interação entre CaM e M13 levando a uma mudança conformacional do sensor. Essa mudança promove a transferência de energia entre o PCP e o YFP, o que aumenta a intensidade da fluorescência do YFP, diminuindo a emissão de fluorescência do PCP. O monitoramento dessa mudança de CFP para fluorescência YFP fornece então uma medida do aumento do nível Ca2+. Além desses sensores FRET, biosensores ca2+ baseados em proteína única (FP) como GCaMP e R-GECO, também são compatíveis com abordagens de imagem vegetal e são amplamente utilizados para estudar as alteraçõesde citos [Ca2+] devido à sua alta sensibilidade e facilidade de uso25,26,27,28,29,30. Os GCaMPs contêm um único GFP circularmente permutado (cp), novamente fundido ao CaM e ao peptídeo M13. A interação dependente de Ca2+entre CaM e M13 provoca uma mudança conformacional no sensor que promove uma mudança no estado de protonação do cpGFP, aumentando seu sinal fluorescente. Assim, à medida que os níveis de Ca2+ aumentam, o sinal cpGFP aumenta.

Para investigar a dinâmica dos sinais ca2+ gerados em resposta a ferimentos mecânicos ou alimentação herbívora, utilizamos plantas transgênicas arabidopsis thaliana expressando uma variante GCaMP, GCaMP3, e um microscópio de fluorescência de campo largo6. Esta abordagem conseguiu visualizar a transmissão rápida de um sinal Ca2+ de longa distância do local da ferida em uma folha para toda a planta. Assim, um aumento nocite [Ca2+] foi imediatamente detectado no local da ferida, mas este sinal Ca2+ foi então propagado para as folhas vizinhas através da vasculatura poucos minutos após o ferimento. Além disso, descobrimos que a transmissão desse sinal de ferida sistêmica rápida é abolida em plantas arabidopsis com mutações em dois genes semelhantes a receptores de glutamato, Glutamato Receptor Like (GLR), GLR3.3 e GLR3.66. Os GLRs parecem funcionar como canais de aminoácidos fechados Ca2+ envolvidos em diversos processos fisiológicos, incluindo resposta à ferida3,crescimento do tubo de pólen31,desenvolvimento raiz32,resposta fria33e imunidade inata34. Apesar dessa função fisiológica bem compreendida e ampla das GLRs, as informações sobre suas propriedades funcionais, como sua especificidade de ligante, seletividade de íons e localização subcelular, são limitadas35. No entanto, estudos recentes relataram que GLR3.3 e GLR3.6 estão localizados nos phloem e xilem, respectivamente. As GLRs vegetais têm semelhanças com receptores de glutamato ionotrópicos (iGluRs)36 em mamíferos, que são ativados por aminoácidos, como glutamato, glicina e D-serina no sistema nervoso mamífero37. De fato, demonstramos que a aplicação de glutamato de 100 mM, mas não outros aminoácidos, no local da ferida induz um sinal ca2+ rápido e de longa distância em Arabidopsis,indicando que o glutamato extracelular provavelmente age como sinal de ferida nas plantas6. Esta resposta é abolida no mutante glr3.3/glr3.6 sugerindo que o glutamato pode estar agindo através de um ou ambos esses canais semelhantes a receptores e, de fato, o AtGLR3.6 foi recentemente mostrado como fechado por esses níveis de glutamato38.

Nas plantas, além de seu papel como aminoácido estrutural, o glutamato também foi proposto como um importante regulador de desenvolvimento39; no entanto, sua dinâmica espacial e temporal são mal compreendidas. Assim como no Ca2+, vários indicadores geneticamente codificados para glutamato foram desenvolvidos para monitorar a dinâmica deste aminoácido em células vivas40,41. IGluSnFR é um biosensor de glutamato uni FP baseado em GFP composto por cpGFP e uma proteína de ligação de glutamato (GLT) da Escherichia coli42,43. A mudança conformacional do iGluSnFR, que é induzido pela ligação de glutamato ao GLI, resulta em uma emissão de fluorescência GFP aprimorada. Para investigar se o glutamato extracelular age como uma molécula de sinalização na resposta à ferida vegetal, conectamos a sequência iGluSnFR com a sequência básica de secreção de peptídeo de sinal de chitinase (CHIB-iGluSnFR) para localizar esse biosensor no espaço apoplásico6. Esta abordagem permitiu a imagem de quaisquer alterações na concentração de glutamato apoplástico ([Glu]apo) usando plantas de Arabidopsis transgênicas expressando este sensor. Detectamos aumentos rápidos no sinal iGluSnFR no local do ferimento. Esses dados apoiam a ideia de que o glutamato vaza das células/tecidos danificados para o apoplasto ao ferimento e age como um sinal de dano ativando as GLRs e levando ao sinal Ca2+ de longa distância nas plantas6.

Aqui, descrevemos um método de imagem em tempo real em toda a planta usando biosensores geneticamente codificados para monitorar e analisar a dinâmica dos sinais de glutamato Ca2+ de longa distância e extracelulares em resposta ao ferimento6. A disponibilidade de microscopia de fluorescência de campo amplo e plantas transgênicas expressando biosensores geneticamente codificados fornece uma abordagem poderosa, mas facilmente implementada para detectar sinais de longa distância rapidamente transmitidos, como ondas ca2+.

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Protocol

1. Preparação do material vegetal

  1. Em um microtubo de 1,5 mL, a superfície esteriliza as sementes de Arabidopsis thaliana (adesão Col-0) expressando gCaMP3 ou CHIB-iGluSnFR tremendo com 20% (v/v) NaClO por 3 min e depois lave 5 vezes com água destilada estéril.
    NOTA: As linhas transgênicas de Arabidopsis expressando GCaMP3 ou CHIB-iGluSnFR foram descritas anteriormente6.
  2. Em um capô estéril, semeear 13 sementes esterilizadas pela superfície em uma placa de Petri de plástico quadrado de 10 cm, preenchida com 30 mL estéril (autoclaved) Murashige e Skoog (MS) médio [1x sais MS, 1% (p/v) sacarose, 0,01% (w/v) mioinositol, 0,05% (w/v) MES e 0,5% (w/v) goma gellan; pH 5,7 ajustado com 1N KOH]. Substitua a tampa e enrole com fita cirúrgica.
  3. Após a incubação no escuro a 4 °C por 2 dias, coloque as placas horizontalmente a 22 °C em uma câmara de crescimento sob luz contínua (90-100 μmol m-2 s-1) durante aproximadamente 2 semanas antes do uso. Após 2 semanas, conte o número de folhas arabidopsis do mais velho para o caçula44 (Figura 1). As respostas da ferida se movem preferencialmente da folha danificada (n) para as folhas numeradas n ± 3 e n ± 56.
    NOTA: Neste protocolo, a placa de Petri será aberta para a imagem dos efeitos da ferida e glutamato sob um microscópio de fluorescência. Portanto, as etapas subsequentes deste experimento devem ser conduzidas sob condições de ambiente controladas pela temperatura e umidade. Isso porque os sinais ca2+ também são provocados por mudanças nessas condições ambientais. Também é sabido que a luz azul, emitida do microscópio durante o registro para excitação da fluorescência da proteína biosensor, pode provocar um aumento da concentração citosolica Ca2+ 45 e, portanto, a planta deve ser aclimatada à irradiação da luz azul por vários minutos antes de iniciar o experimento.

2. Preparação química

  1. Dissolver L-Glutamato em um meio de crescimento líquido [sais de 1/2x MS, 1% (w/v) sacarose e 0,05% (w/v) MES; pH 5.1 ajustado com 1N KOH] para fazer uma solução de trabalho de 100 mM.
    NOTA: Evite o uso de sais de glutamato, como glutamato de sódio, para evitar potenciais efeitos relacionados à cação na dinâmica ca2+.

3. Configuração do microscópio e condução de imagens em tempo real

  1. Ligue o estereóquio de fluorescência motorizada equipado com uma lente objetiva de 1x (NA = 0,156) e uma câmera sCMOS(Figura 2) e configure as configurações do dispositivo para irradiar com uma luz de excitação de 470/40 nm e adquirir uma luz de emissão passando por um filtro de 535/50 nm.
    NOTA: Qualquer microscópio de fluorescência sensível ao GFP pode ser usado para detectar sinais GCaMP3 e iGluSnFR em tempo real, mas uma lente objetiva de baixa potência e uma câmera altamente sensível com um chip sCMOS largo são recomendados para adquirir sinais de toda a planta. O objetivo de baixa potência permite a imagem de toda a resposta de uma planta arabidopsis e o uso de uma câmera altamente sensível permite a rápida aquisição de dados necessários para capturar o curso de tempo rápido da onda Ca2+ acionada pela ferida. Para o microscópio de fluorescência utilizado neste estudo, os valores máximos do campo de visão e resolução temporal são de 3 cm x 3 cm e 30 quadros por segundo (fps), respectivamente.
  2. Retire a tampa e coloque o prato sob a lente objetiva.
  3. Verifique o sinal de fluorescência da planta e, em seguida, aguarde aproximadamente 30 minutos no escuro até que as plantas sejam adaptadas às novas condições ambientais. Esta etapa de adaptação é necessária porquemudanças na umidade provocam a elevaçãode citos em plantas que podem interferir em qualquer evento relacionado à ferida.
  4. Ajuste o foco e a ampliação para ver toda a planta no campo de visão. No protocolo atual, foi utilizada uma ampliação de 0,63x.
  5. Antes de iniciar a imagem em tempo real, configure os parâmetros de aquisição para detectar os sinais de fluorescência usando software de imagem de microscópio. As configurações para imagem no protocolo atual são: tempo de exposição e intervalo definidos para 1,8 s e 2 s (ou seja, 0,5 fps), respectivamente. Defina o tempo de gravação para 11 min.
  6. Imagem por 5 minutos antes de iniciar o experimento para aclimatar a planta à irradiação de luz azul do microscópio, em seguida, começar a gravar clicando em Run Now, ou o comando equivalente no software de microscópio que está sendo usado. Para determinar a fluorescência média da linha de base, grave pelo menos 10 quadros (ou seja, pelo menos 20 s no protocolo atual) antes de ferir ou apresentar aplicação de glutamato (ver Seção 4).
    1. Para imagens em tempo real decite induzido por ferida [Ca2+] e [Glu]apo alterações, corte a petiole ou a região média da folha L1 com tesoura(Figura 3 e Figura 4).
    2. Para imagens em tempo real de alterações decite de glutamato [Ca2+],corte a borda (aproximadamente 1 mm da ponta) da folha 1 através da veia principal com a tesoura. Após pelo menos 20 min de período de recuperação, aplique 10 μL de glutamato de 100 mM na superfície cortada da folha(Figura 5).
      NOTA: Este pré-corte foi necessário para permitir o acesso de glutamato ao apoplast da folha, a fim de desencadear respostas. Além disso, a aplicação de uma gota de água destilada na superfície cortada da folha L1 foi considerada fundamental para evitar que as amostras se desselicissem durante a recuperação antes da aplicação do glutamato.
  7. Depois de terminar a gravação de 11 minutos, salve os dados.

4. Análise de dados

  1. Para análise da intensidade da fluorescência ao longo do tempo, defina uma região de interesse (ROI) no local onde a intensidade da fluorescência deve ser analisada(Figura 6 e Figura 7). Para o cálculo de velocidade da onda Ca2+, defina 2 ROIs (ROI1 e ROI2) para análise. No software de imagem, clique em | de Medição de Tempo Defina | Círculo. Meça a distância entre ROI1 e ROI2 clicando em Anotações e | | de comprimento Linha Simples (Figura 6).
  2. Meça os valores de fluorescência bruta (F) em cada ROI ao longo do tempo clicando em Measure. Exporte dados brutos para um software de planilha para converter o sinal de fluorescência em números em cada ponto de tempo clicando em All to Excel | Exportação.
  3. Determine o valor da fluorescência da linha de base, que é definido como F0, calculando a média de F sobre os primeiros 10 quadros (ou seja, antes do tratamento) nos dados registrados.
  4. Normalize os dados F (calculando ΔF/F) usando a equação ΔF/F = (F−F0)/F0, onde ΔF é a mudança dependente do tempo na fluorescência.
  5. Para a análise de ondas de velocidade de onda Ca2+, defina um ponto de elevação significativo do sinal acima dos valores pré-estimulados como representando a detecção de um aumento de Ca2+ em cada ROI (t1 e t2) usando o critério de elevação para 2× o desvio padrão (2x SD) que é calculado a partir dos dados F0 usando software estatístico. 95% dos dados do F0 estão dentro de 2x SD da média, indicando que um aumento do sinal acima desse nível por acaso é ≤5%. Calcule a diferença de tempo do aumento de Ca2+ entre ROI1 e ROI2 [t2- t1 time-lag (Δt)] e meça a distância entre ROI1 e ROI2, então determine as velocidades de qualquer onda Ca2+.

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Representative Results

A propagação de sinais de [Ca2+]cyt e [Glu]apo em resposta ao ferimento é apresentada na Figura 3, Figura 4, Filme S1e Filme S2. Cortar a petiola da folha 1 em plantas expressando GCaMP3 (em 0 s) levou a um aumento significativo nocite [Ca2+] que foi rapidamente induzido localmente através da vasculatura (aos 40 s) (Figura 3 e Filme S1). Posteriormente, o sinal foi rapidamente propagado para folhas vizinhas (folha 3 e 6) em poucos minutos (aos 80 s) (Figura 3 e Filme S1).

Ao cortar a folha 1 em plantas expressando CHIB-iGluSnFR, observou-se um rápido aumento deapo [Glu] em torno da região de corte (em 2 s). Este sinal foi propagado através da vasculatura localmente em poucos minutos (aos 160 s), mas não foi observado em folhas sistêmicas(Figura 4 e Filme S2).

Para a imagem em tempo real da propagação de sinal Ca2+ desencadeada pela aplicação de glutamato, a borda (aproximadamente 1 mm da ponta) da folha 1 em plantas expressando GCaMP3 foi cortada como mostrado na Figura 5A e no Filme S3. Cortar a borda da folha 1 causou um aumento decite local [Ca2+] (em 40 s), mas este sinal desapareceu em poucos minutos (em 124 s). Depois de esperar aproximadamente 10 minutos para a planta se recuperar, 10 μL de glutamato de 100 mM foi aplicado na superfície cortada da folha 1, o que causou um rápido e significativo aumento decit [Ca2+] localmente (aos 56 s) e propagação de sinal para folhas distais (a 104 s) (Figura 5B e Filme S4).

Para medir as mudanças nocite [Ca2+] induzido pelo ferimento na folha sistêmica, dois ROIs (ROI1 e ROI2) foram definidos na região base e ponta da folha 6 em plantas expressando GCaMP3 como mostrado na Figura 6A. A mudança de curso de tempo da intensidade do sinal GCaMP3 no ROI1 e ROI2 ao cortar a petiola da folha 1 foi medida(Figura 6B). Um aumento significativo docit [Ca2+] no ROI1 foi detectado anteriormente ao do ROI2 (Figura 6B). [Ca2+] cyt atingiu aproximadamente 100 s após o ferimento, durou mais de 10 minutos, e exibiu duas fases(Figura 6B).

Para determinar as velocidades da onda Ca2+ sobre o ferimento mecânico, o ponto de tempo de um aumento significativo de sinal acima dos valores pré-estimulados no ROI1 e ROI2 foi determinado (time-lag; ver Seção 4) (Figura 6C). Como a distância entre ROI1 e ROI2 foi de 2,7 mm neste caso (Figura 6A), a velocidade do sinal Ca2+ na folha 6 foi calculada como 0,15 mm/s. Para medir as alterações [glu]apo em resposta ao dano mecânico, o ROI1 foi definido nas proximidades do local de corte da folha marcado como L1 como mostrado na Figura 7A. [Glu] apo assinatura no ROI1 exibiu um único pico em aproximadamente 100 s após o ferimento(Figura 7B).

Figure 1
Figura 1: Numeração de folhas de roseta arabidopsis. As folhas arabidopsis são numeradas do mais antigo ao mais jovem (painel esquerdo). Um diagrama esquemático da posição das folhas é indicado no painel direito. L: folha, C: cotilledons. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: Um microscópio de fluorescência usado neste estudo. [Ca2+]cyt e [Glu]apo dynamics foram imagens com um estereóscópio de fluorescência de campo largo. R: Controlador remoto, O: 1x lente objetiva, C: câmera sCMOS, T: Tubo de inclinação trinocular, S: Estágio, P: Material vegetal. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: Transmissão de sinal Ca2+ induzida por feridas. O corte da petiola (seta branca, 0 s) da folha 1 (L1) na planta expressando GCaMP3 desencadeou um aumento decito local [Ca2+] (seta vermelha, 40 s) que foi transmitido para folhas sistêmicas [folha 3 (L3) e folha 6 (L6)] (setas laranjas, 80 s). Barra de escala, 5 mm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4: Elevação deapo acionada pela ferida [Glu]. Cortar a folha 1 (L1) (seta branca, 0 s) em plantas expressando CHIB-iGluSnFR causou uma rápida elevação de [Glu]apo (seta vermelha, 80 s) que se propagava através da vasculatura (seta laranja, 160 s). Barra de escala, 2 mm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 5
Figura 5: Transmissão de sinal Ca2+ acionada por glutamato. (A) Cortar a borda (aproximadamente 1 mm da ponta) da folha 1 (L1) em plantas expressas GCaMP3 (seta branca, 0 s) causou um aumentode cite [Ca2+] (seta vermelha, 40 s). (B) A aplicação de glutamato de 100 mM à superfície cortada de L1 (seta branca, 0 s) causou um aumento decite local [Ca2+] (seta vermelha, 56 s) que rapidamente se propum a folhas distais [por exemplo, folha 3 (L3), folha 4 (L4) e folha 6 (L6)] (setas laranjas, 104 s). Barras de escala, 5 mm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 6
Figura 6: [Ca2+] assinaturade cito em folhas sistêmicas em resposta ao ferimento mecânico. (A) Uma imagem expandida da folha 6 (L6) em plantas expressas GCaMP3 é mostrada na Figura 3. ROI1 (círculo azul) e ROI2 (círculo rosa) foram definidos na região de base e ponta, respectivamente. A seta branca indica o local de corte da petiole da folha 1 (L1). Neste caso, a distância entre ROI1 e ROI2 foi de 2,7 mm. (B) Quantificação de assinaturasde cite [Ca2+] em ROI1 e ROI2. Alterações na intensidade da fluorescência foram analisadas por meio de software de imagem. (C) Um traço expandido de dados em (B) entre 0 e 80 s. Os pontos de detecção de um aumento de Ca2+ no ROI1 e ROI2 foram definidos como t1 e t2, respectivamente,utilizando como critério um aumento para 2x o desvio padrão dos valores de pré-estimulação (2x SD, linha pontilhada). O valor de t2 - t1 foi definido como time-lag (Δt) no protocolo atual. A seta preta indica o tempo de corte. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 7
Figura 7: [Glu] assinaturaapo em resposta ao ferimento mecânico. (A) Uma imagem expandida da folha 1 (L1) em plantas expressas CHIB-iGluSnFR é mostrada na Figura 4. O ROI1 foi montado nas proximidades do local do corte. A seta branca indica a região do corte. (B) A quantitação da assinatura de [Glu]apo no ROI1 é monitorada usando software de imagem. A seta preta indica o tempo de corte. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Filme S1: Transmissão Ca2+ de longa distância após ferimentos mecânicos. O ferimento mecânico na petiola da folha 1 (L1) causou um aumentode cite [Ca2+] transmitido para folhas distais [por exemplo, folha 3 (L3) e folha 6 (L6)]. Clique aqui para baixar este filme.

Filme S2: Elevação dos níveis de glutamato apoplástico em resposta ao corte. O ferimento mecânico da folha 1 (L1) causou um aumento imediato noapo[Glu] . Clique aqui para baixar este filme.

Filme S3: Elevação dosníveis decite [Ca2+]em resposta ao corte. O ferimento mecânico na borda da folha 1 (L1) causou uma elevação decite local e imediata [Ca2+]. Clique aqui para baixar este filme.

Filme S4: Aplicação de glutamato desencadeia aumentos sistêmicos [Ca2+]cyt. A aplicação de glutamato de 100 mM acionou a transmissão Ca2+ para folhas sistêmicas [por exemplo, folha 3 (L3), folha 4 (L4) e folha 6 (L6)]. Clique aqui para baixar este filme.

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Discussion

A sinalização sistêmica é importante para que as plantas respondam a estímulos ambientais externos localizados e, em seguida, mantenham sua homeostase em todo o nível da planta. Embora não estejam equipados com um sistema nervoso avançado como animais, eles empregam comunicação rápida dentro e entre órgãos com base em fatores como sinais elétricos móveis (e possivelmente hidráulicos) e ondas propagadoras de ROS e Ca2+ 46,47. O protocolo descrito acima permite imagens em tempo real da atividade deste sistema de sinalização através do monitoramento da dinâmica do Ca2+ e glutamato apoplástico em resposta ao ferimento. Este método fornece uma ferramenta robusta para entender sinais rápidos e de longa distância em plantas que combinam alta resolução espacial e facilidade de uso. Este protocolo também oferece o potencial de fornecer novas percepções fisiológicas sobre os mecanismos moleculares subjacentes à sinalização de feridas de longa distância através, por exemplo, usando mutantes que são defeituosos em elementos putativos do sistema de sinalização rápida ou exploração dos efeitos de reagentes farmacológicos como bloqueadores de canais Ca2+(por exemplo, LaCl3) ou inibidores de outras atividades de sinalização potencialmente chave6.

Uma vantagem importante do método de imagem biosensor descrito é o uso de biosensores de FP único com alto rendimento fluorescente, simplificando muito tanto os equipamentos necessários para fazer essas medições quanto seu uso em planta. Assim, os indicadores geneticamente codificados baseados em fluorescência são divididos em duas classes: 1) biosensores de FP único baseados em intensidade e 2) biosensores baseados em FRET10. Embora os sensores baseados em FRET ratiométricos sejam indicadores Ca2+ quantitativos, baseados em intensidade, incluindo o GCaMP3 e o iGluSnFR usados aqui, fornecem resolução temporal mais alta e facilidade de uso devido ao seu sinal responsivo Ca2+geralmente mais brilhante e seus requisitos de microscópio mais simples10. Por exemplo, oindicador R-GECO1 baseado em proteína vermelha-fluorescente R-GECO1 mostrou uma mudança de sinal muito maior em resposta ao ATP extracelular e aos elicitors de defesa vegetal flg22 e chitin, quando comparado com a razãométrica YC3.6 biosensor27. Para análise de sensores baseados em FRET ratiométricos, também é necessário usar um microscópio especializado com múltiplos filtros para coletar dados em dois comprimentos de onda, enquanto biosensores baseados em FP único exigem que o dispositivo colete os dados em apenas um comprimento de onda, uma capacidade encontrada em todos os microscópios de fluorescência padrão10. No entanto, é importante notar que existem algumas desvantagens do uso de biosensores de FP único. Esses biosensores de fp único baseados em intensidade não são preferidos para quantificar mudanças absolutas de concentração ou para imagens de longo prazo durante muitas horas ou dias. Essa limitação ocorre porque, além do nível de Ca2+ para GCaMP3, a intensidade do sinal desses biosensores de FP único é considerada afetada por outros fatores, como o nível de expressão do sensor ou parâmetros como pH celular que podem mudar com o tempo.

Até o momento, muitas novas variantes desses indicadores geneticamente codificados foram projetadas para melhorar a relação sinal/ruído, alcance dinâmico, cinética e estabilidade do sensor. Por exemplo, depois que Nakai et al.26 desenvolveram o primeiro GCaMP, várias variantes sucessivas, como os GECOs foram geradas por uma combinação de mutagênese e caracterização cuidadosa48,49,50. A gama dinâmica de G-GECO (Green-GECO) foi relatada como aproximadamente duas vezes maior que a de GCaMP328. Além disso, a substituição por diferentes proteínas fluorescentes nesses indicadores levou à geração de variantes GECO com diferentes espectros de emissões, como B-GECO (Blue-GECO) e R-GECO (Red-GECO), o que permite o uso desses indicadores ao lado de outras variantes espectrais de GFP em aplicações de imagem multicoloridas28. Da mesma forma, o GCaMP continuou a ser desenvolvido e melhorado com uma série de sensores aprimorados para velocidade de resposta e amplitude de sinal agora disponível50. Para monitorar a dinâmica do glutamato, além do iGluSnFR, uma série de biosensores de glutamato à base de FRET, foram desenvolvidos40. FLIPE é composto por CFP e YFP que estão ligados através da proteína de ligação de glutamato ybeJ retirada de E. coli. Após a ligação do glutamato ao ybeJ, observa-se uma diminuição dependente da concentração de glutamato da eficiência do FRET. Portanto, tanto para ca2+ quanto para glutamato há múltiplos sensores de fp único e razão disponível. Os pesquisadores devem considerar o biosensor apropriado para detectar a dinâmica do sinal dependendo do design experimental e requisitos para fatores de medição, como alto sinal:ruído (sensores de FP único) versus a necessidade de quantitação altamente precisa (onde os sensores FRET se destacam).

O método de imagem de campo largo, de um único FP descrito aqui para ferimentos, também deve ser útil quando aplicado a outros processos de sinalização sistêmica de estresse. Apesar da presença de inúmeros relatos que sugerem um papel crucial da sinalização Ca2+ de longa distância em várias respostas ao estresse, como o ataque herbívoro6,51,52,sal20e seca53, apenas alguns estudos forneceram as informações espacials relacionadas aos sinais rápidos de longa distância Ca2+ induzidos por essas respostas de estresse6,7,20,52. O uso de um microscópio de fluorescência de campo largo neste protocolo também permite a observação em tempo real da dinâmica do sinal móvel não apenas na comunicação folha a folha, mas também na comunicação raiz-a-tiro como mostrado recentemente38. Embora tenhamos focado em protocolos para arabidopsis,este método de imagem em tempo real de toda a planta também fornece uma ferramenta robusta para entender as características espaciais e temporais da sinalização sistêmica Ca2+ tanto em respostas ao estresse biótico quanto abiótico em outras espécies vegetais, como o tabaco30.

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Disclosures

Os autores não têm conflitos de interesse.

Acknowledgments

Este trabalho foi apoiado por bolsas da Sociedade Japonesa para a Promoção da Ciência (17H05007 e 18H05491) para MT, da Fundação Nacional de Ciência (IOS1557899 e MCB2016177) e da Administração Nacional de Aeronáutica e Espaço (NNX14AT25G e 80NSSC19K0126) para a SG.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Arabidopsis expressing GCaMP3 Saitama University
Arabidopsis expressing CHIB-iGluSnFR Saitama University
GraphPad Prism 7 GraphPad Software
L-Glutamate FUJIFILM Wako 072-00501 Dissolved in a liquid growth medium [1/2x MS salts, 1% (w/v) sucrose, and 0.05% (w/v) MES; pH 5.1 adjusted with 1N KOH].
Microsoft Excel Microsoft Corporation
Murashige and Skoog (MS) medium FUJIFILM Wako 392-00591 composition: 1x MS salts, 1% (w/v) sucrose, 0.01% (w/v) myoinositol, 0.05% (w/v) MES, and 0.5% (w/v) gellan gum; pH 5.7 adjusted with 1N KOH.
Nikon SMZ25 stereomicroscope Nikon
NIS-Elements AR analysis Nikon
1x objective lens (P2-SHR PLAN APO) Nikon
sCMOS camera (ORCA-Flash4.0 V2) Hamamatsu Photonics C11440-22CU
Square plastic Petri dish Simport D210-16

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Biologia Questão 172 cálcio GCaMP3 biosensores fluorescentes geneticamente codificados glutamato iGluSnFR sinal de longa distância ferida
Imagens em campo amplo e em tempo real de sinais de feridas locais e sistêmicas em <em>Arabidopsis</em>
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Uemura, T., Wang, J., Aratani, Y.,… More

Uemura, T., Wang, J., Aratani, Y., Gilroy, S., Toyota, M. Wide-Field, Real-Time Imaging of Local and Systemic Wound Signals in Arabidopsis. J. Vis. Exp. (172), e62114, doi:10.3791/62114 (2021).

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