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Biology

Wide-Field, Imágenes en tiempo real de señales de heridas locales y sistémicas en Arabidopsis

Published: June 4, 2021 doi: 10.3791/62114
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 1,2
1Department of Biochemistry and Molecular Biology, Saitama University, 2Department of Botany, University of Wisconsin

Summary

Extracelular glutamato desencadenado por la señalización sistémica de calcio es fundamental para la inducción de las respuestas de defensa de las plantas a las heridas mecánicas y ataques de herbívoros en las plantas. Este artículo describe un método para visualizar la dinámica espacial y temporal de ambos estos factores usando las plantas del thaliana de Arabidopsis que expresan los biosensores fluorescentes calcio y glutamato-sensibles.

Abstract

Las plantas responden a tensiones mecánicas como heridas y herbívoros induciendo respuestas de defensa tanto en las partes dañadas como en las distales no dañadas. Sobre herir de una hoja, un aumento en la concentración cytosolic del ion del calcio (señal de Ca2+) ocurre en el sitio de la herida. Esta señal se transmite rápidamente a las hojas no dañadas, donde se activan las respuestas de defensa. Nuestra investigación reciente reveló que el glutamato que se escapa de las células heridas de la hoja en el apoplasto alrededor de ellos sirve como señal de la herida. Este glutamato activa los canales permeables de Ca2+ similares a los receptores de glutamato, lo que luego conduce a la propagación de señales de Ca2+ a larga distancia en toda la planta. Las características espaciales y temporales de estos eventos se pueden capturar con imágenes en tiempo real de plantas vivas que expresan biosensores fluorescentes codificados genéticamente. Aquí introducimos un método planta-ancho, en tiempo real de la proyección de imagen para supervisar la dinámica de las señales de Ca2+ y de los cambios en el glutamato apoplásico que ocurren en respuesta a herir. Este enfoque utiliza un microscopio de fluorescencia de campo amplio y plantas transgénicas de Arabidopsis que expresan proteína verde fluorescente (GFP)-basado en Ca2 + y biosensores de glutamato. Además, presentamos la metodología para provocar fácilmente herida-inducida, glutamato-accionado rápido y a larga distancia Ca2+ propagación de la señal. Este protocolo también se puede aplicar a estudios sobre otras tensiones de plantas para ayudar a investigar cómo la señalización sistémica de la planta podría estar involucrada en sus redes de señalización y respuesta.

Introduction

Las plantas no pueden escapar de las tensiones bióticas, por ejemplo, los insectos que se alimentan de ellas, por lo que han desarrollado sofisticados sistemas de detección de estrés y transducción de señales para detectar y luego protegerse de desafíos como la herbivoría1. Al herir o atacar a los herbívoros, las plantas inician respuestas de defensa rápidas, incluida la acumulación del ácido fitohormona jasmónico (JA) no sólo en el sitio herido, sino también en los órganos distales no dañados2. Este JA entonces ambos acciona respuestas de la defensa en los tejidos directamente dañados e induce preventivamente defensas en las partes no dañadas de la planta. En Arabidopsis,la acumulación de JA inducida por heridas se detectó en hojas distales e intactas a los pocos minutos del daño en otra parte de la planta, lo que sugiere que se está transmitiendo una señal rápida y a larga distancia desde la hoja herida3. Varios candidatos, tales como Ca2+,especies reactivas de oxígeno (ROS), y señales eléctricas, se han propuesto para servir como estas señales de heridas de larga distancia en las plantas4,5.

Ca2+ es uno de los elementos de segundo mensajero más versátiles y ubicuos en los organismos eucariotas. En las plantas, la masticación de orugas y las heridas mecánicas causan aumentos drásticos en la concentración citosólica de Ca2+ ([Ca2+]cyt)tanto en la hoja herida como en las hojas distantes desenrolladas6,7. Esta señal sistémica de Ca2+ es recibida por proteínas intracelulares de detección de Ca2+,que conducen a la activación de las vías de señalización de defensa aguas abajo, incluida la biosíntesis de JA8,9. A pesar de los informes numerosos tales que apoyan la importancia de las señales de Ca2+ en respuestas de la herida de la planta, la información sobre las características espaciales y temporales de las señales de Ca2+ inducidas por herir es limitada.

Las imágenes en tiempo real utilizando indicadores de Ca2+ codificados genéticamente son una herramienta poderosa para monitorear y cuantificar la dinámica espacial y temporal de las señales de Ca2+. Hasta la fecha, se han desarrollado versiones de dichos sensores que permiten la visualización de señales de Ca2+ a nivel de una sola célula, a tejidos, órganos e incluso plantas enteras10. El primer biosensor codificado genéticamente para Ca2+ utilizado en plantas fue la proteína bioluminiscente aequorina derivada de la medusa Aequorea victoria11. Aunque esta proteína quimioluminiscente se ha utilizado para detectar cambios de Ca2+ en respuesta a diversas tensiones en plantas12,13, 14,15, 16,17, 18,no es adecuada para imágenes en tiempo real debido a la señal luminiscente extremadamente baja que produce. Förster Resonance Energy Transfer (FRET)-basado en indicadores de Ca2 +, tales como los cameleons amarillos, también se han utilizado con éxito para investigar la dinámica de una gama de eventos de señalización de Ca2 + en las plantas19,20,21,22,23,24. Estos sensores son compatibles con los enfoques de imagen y más comúnmente están compuestos por la proteína de unión a Ca2+ calmodulina (CaM) y un péptido de unión a CaM (M13) de una quinasa de cadena ligera de miosina, todos fusionados entre dos proteínas fluoróforas, generalmente una proteína fluorescente cian (CFP) y una variante de proteína fluorescente amarilla (YFP)10. La unión de Ca2+ a CaM promueve la interacción entre CaM y M13, lo que lleva a un cambio conformacional del sensor. Este cambio promueve la transferencia de energía entre el CFP y el YFP, lo que aumenta la intensidad de fluorescencia del YFP al tiempo que disminuye la emisión de fluorescencia del CFP. El monitoreo de este cambio de CFP a fluorescencia YFP entonces proporciona una medida del aumento en el nivel de Ca2 +. Además de estos sensores FRET, los biosensores ca2+ basados en proteínas fluorescentes individuales (FP), como GCaMP y R-GECO, también son compatibles con los enfoques de imágenes de plantas y se utilizan ampliamente para estudiar los cambiosde ci cyt [Ca2+] debido a su alta sensibilidad y facilidad de uso25,26,27,28,29,30. GCaMPs contiene un solo circular permutated (cp) GFP, otra vez fusionado a CaM y el péptido M13. La interacción dependiente de Ca2+entre CaM y M13 provoca un cambio conformacional en el sensor que promueve un cambio en el estado de protonación del cpGFP, potenciando su señal fluorescente. Por lo tanto, a medida que aumentan los niveles de Ca2 +, la señal cpGFP aumenta.

Para investigar la dinámica de las señales de Ca2 + generadas en respuesta a heridas mecánicas o alimentación de herbívoros, hemos utilizado plantas transgénicas de Arabidopsis thaliana que expresan una variante de GCaMP, GCaMP3, y un microscopio de fluorescencia de campo ancho6. Este enfoque ha tenido éxito en la visualización de la transmisión rápida de una señal de Ca2 + de larga distancia desde el sitio de la herida en una hoja a toda la planta. Así, un aumento en [Ca2+]cyt fue detectado inmediatamente en el sitio de la herida pero esta señal de Ca2+ entonces fue propagada a las hojas vecinas a través de la vasculatura dentro de algunos minutos de herir. Además, encontramos que la transmisión de esta señal de herida sistémica rápida se suprime en plantas de Arabidopsis con mutaciones en dos genes similares a receptores de glutamato, Glutamato Receptor Like (GLR), GLR3.3, y GLR3.66. Los GLRs parecen funcionar como canales de Ca2+ bloqueados por aminoácidos involucrados en diversos procesos fisiológicos, incluyendo la respuesta de la herida3,el crecimiento del tubo de polen31,el desarrollo de la raíz32,la respuesta fría33y la inmunidad innata34. A pesar de esta función fisiológica amplia y bien entendida de los GLRs, la información sobre sus propiedades funcionales, como su especificidad de ligando, selectividad iónica y localización subcelular, es limitada35. Sin embargo, estudios recientes informaron que GLR3.3 y GLR3.6 están localizados en el floema y el xilema, respectivamente. Los GLRs de plantas tienen similitudes con los receptores ionotrópicos de glutamato (iGluRs)36 en mamíferos, que son activados por aminoácidos, como el glutamato, la glicina y la D-serina en el sistema nervioso de los mamíferos37. De hecho, demostramos que la aplicación de glutamato de 100 mM, pero no de otros aminoácidos, en el sitio de la herida induce una señal rápida y a larga distancia de Ca2+ en Arabidopsis,lo que indica que el glutamato extracelular probablemente actúa como una señal de herida en las plantas6. Esta respuesta se suprime en el mutante glr3.3/glr3.6sugiriendo que el glutamato puede estar actuando a través de uno o ambos de estos canales similares a receptores y, de hecho, AtGLR3.6 recientemente se demostró que está bloqueado por estos niveles de glutamato38.

En las plantas, además de su papel como aminoácido estructural, el glutamato también se ha propuesto como un regulador clave del desarrollo39; sin embargo, su dinámica espacial y temporal es poco conocida. Al igual que para el Ca2+,se han desarrollado varios indicadores genéticamente codificados para el glutamato para monitorizar la dinámica de este aminoácido en células vivas40,41. iGluSnFR es un biosensor de glutamato de fp único basado en GFP compuesto por cpGFP y una proteína de unión a glutamato (GltI) de Escherichia coli42,43. El cambio conformacional de iGluSnFR, que es inducido por la unión de glutamato a GltI, resulta en una emisión de fluorescencia GFP mejorada. Para investigar si el glutamato extracelular actúa como molécula de señalización en la respuesta de la herida de la planta, conectamos la secuencia de iGluSnFR con la secuencia básica de secreción de péptidos de señal quitinasa (CHIB-iGluSnFR) para localizar este biosensor en el espacio apóplásico6. Este acercamiento permitió la proyección de imagen de cualquier cambio en la concentración apoplástica del glutamato ([Glu]apo)usando las plantas transgénicas de Arabidopsis que expresaban este sensor. Detectamos aumentos rápidos en la señal del iGluSnFR en el sitio que hería. Estos datos apoyan la idea de que el glutamato se escapa de las células/tejidos dañados al apoplasto al herir y actúa como una señal de daño que activa los GLRs y conduce a la señal de Ca2+ de larga distancia en las plantas6.

Aquí, describimos un método de imágenes en tiempo real en toda la planta utilizando biosensores codificados genéticamente para monitorear y analizar la dinámica de ca2 + de larga distancia y señales de glutamato extracelular en respuesta a la herida6. La disponibilidad de microscopía de fluorescencia de campo amplio y plantas transgénicas que expresan biosensores codificados genéticamente proporciona un enfoque potente, pero fácil de implementar para detectar señales de larga distancia transmitidas rápidamente, como las ondas ca2 +.

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Protocol

1. Preparación de material vegetal

  1. En un microtubo de 1,5 mL, esterilizar en superficie las semillas de arabidopsis thaliana (col-0 accesión) planta que expresa ya sea GCaMP3 o CHIB-iGluSnFR agitando con 20% (v / v) NaClO durante 3 min y luego lavar 5 veces con agua destilada estéril.
    NOTA: Las líneas transgénicas de Arabidopsis que expresan GCaMP3 o CHIB-iGluSnFR han sido descritaspreviamente 6.
  2. En una capucha estéril, siembre 13 semillas esterilizadas en superficie en una placa de Petri de plástico cuadrada de 10 cm llena de 30 mL de murashige estéril (autoclave) y medio Skoog (MS) [1x sales ms, 1% (p/v) sacarosa, 0,01% (p/v) myoinositol, 0,05% (p/v) MES y 0,5% (p/v) goma gellan; pH 5,7 ajustado con 1N KOH]. Substituya la tapa y envuelva con cinta quirúrgica.
  3. Después de la incubación en la oscuridad a 4 °C durante 2 días, colocar las placas horizontalmente a 22 °C en una cámara de crecimiento bajo luz continua (90-100 μmol m-2 s-1) durante aproximadamente 2 semanas antes de su uso. Después de 2 semanas, cuente el número de hojas de Arabidopsis de mayor amenor 44 (Figura 1). Las respuestas de la herida se desplazan preferentemente de la hoja dañada (n) a las hojas numeradas n ± 3 y n ± 56.
    NOTA: En este protocolo, la placa de Petri se abrirá para obtener imágenes de los efectos de la herida y el glutamato bajo un microscopio de fluorescencia. Por lo tanto, los pasos posteriores de este experimento deben llevarse a cabo en condiciones ambiente controladas por temperatura y humedad. Esto se debe a que las señales de Ca2+ también son provocadas por cambios en estas condiciones ambientales. También se sabe que la luz azul, emitida por el microscopio durante el registro para la excitación de la fluorescencia de la proteína biosensor, puede provocar un aumento de la concentración citosólica de Ca2 + 45 y por lo tanto la planta debe aclimatarse a la irradiación de luz azul durante varios minutos antes de comenzar el experimento.

2. Preparación química

  1. Disuelva el L-glutamato en un medio de crecimiento líquido [1/2x sales ms, 1% (p/v) sacarosa y 0,05% (p/v) MES; pH 5,1 ajustado con 1N KOH] para hacer una solución de trabajo de 100 mM.
    NOTA: Evite el uso de sales de glutamato como el glutamato de sodio para prevenir posibles efectos relacionados con cationes sobre la dinámica de Ca2 +.

3. Ajuste del microscopio y realización de imágenes en tiempo real

  1. Encienda el estereomicroscopio de fluorescencia motorizado equipado con una lente objetivo 1x (NA = 0,156) y una cámara sCMOS (Figura 2) y configure los ajustes del dispositivo para irradiar con una luz de excitación de 470/40 nm y adquirir una luz de emisión que pase a través de un filtro de 535/50 nm.
    NOTA: Cualquier microscopio de fluorescencia sensible a GFP se puede utilizar para detectar señales GCaMP3 e iGluSnFR en tiempo real, pero se recomienda una lente objetivo de baja potencia y una cámara altamente sensible con un chip sCMOS ancho para adquirir señales de toda la planta. El objetivo de baja potencia permite la obtención de imágenes de la respuesta de toda una planta de Arabidopsis y el uso de una cámara altamente sensible permite la rápida adquisición de datos necesaria para capturar el rápido curso de tiempo de la onda de Ca2 + activada por heridas. Para el microscopio de fluorescencia utilizado en este estudio, los valores máximos del campo de visión y la resolución temporal son de 3 cm x 3 cm y 30 cuadros por segundo (fps), respectivamente.
  2. Retire la tapa y coloque el plato debajo de la lente objetivo.
  3. Compruebe la señal de fluorescencia de la planta y luego espere aproximadamente 30 minutos en la oscuridad hasta que las plantas se adapten a las nuevas condiciones ambientales. Este paso de adaptación es necesario porque los cambios en la humedad provocan [Ca2 +]elevación cyt en las plantas que pueden interferir con cualquier evento relacionado con la herida.
  4. Ajuste el enfoque y la ampliación para ver toda la planta en el campo de visión. En el protocolo actual, se utilizó un aumento de 0,63x.
  5. Antes de comenzar las imágenes en tiempo real, configure los parámetros de adquisición para detectar las señales de fluorescencia utilizando el software de imágenes de microscopio. Los ajustes para la proyección de imagen en el protocolo actual son: tiempos de la exposición y del intervalo fijados a 1.8 s y 2 s (es decir, 0.5 fps), respectivamente. Establezca el tiempo de grabación en 11 min.
  6. Imagen durante 5 minutos antes de comenzar el experimento para aclimatar la planta a la irradiación de luz azul del microscopio, luego comience a grabar haciendo clic en Ejecutar ahora,o el comando equivalente en el software de microscopio que se está utilizando. Para determinar la fluorescencia basal promedio, registre al menos 10 fotogramas (es decir, al menos 20 s en el protocolo actual) antes de la herida o la aplicación de glutamato (consulte la Sección 4).
    1. Para obtener imágenes en tiempo real de los cambiosde cyt y [Glu]apo inducidos por heridas [Ca2+],corte el pecíolo o la región media de la hoja L1 con tijeras (Figura 3 y Figura 4).
    2. Para obtener imágenes en tiempo real de los cambiosde cyt desencadenados por glutamato [Ca2+],corte el borde (aproximadamente 1 mm de la punta) de la hoja 1 a través de la vena principal con tijeras. Después de al menos un período de recuperación de 20 min, aplique 10 μL de glutamato de 100 mM a la superficie de corte de la hoja (Figura 5).
      NOTA: Este pre-corte fue necesario para permitir el acceso del glutamato al apoplasto de la hoja con el fin de desencadenar respuestas. Además, se encontró que la aplicación de una gota de agua destilada a la superficie de corte de la hoja L1 era crítica para evitar que las muestras se desecaran durante la recuperación antes de aplicar glutamato.
  7. Después de terminar la grabación de 11 minutos, guarde los datos.

4. Análisis de datos

  1. Para el análisis de la intensidad de fluorescencia a lo largo del tiempo, defina una región de interés (ROI) en el lugar donde se va a analizar la intensidad de fluorescencia (Figura 6 y Figura 7). Para el cálculo de la velocidad de la onda Ca2+, defina 2 ROI (ROI1 y ROI2) para el análisis. En el software de imágenes, haga clic en Medición de tiempo | Definir | Círculo. Mida la distancia entre ROI1 y ROI2 haciendo clic en Anotaciones y | Longitud | Línea simple (Figura 6).
  2. Mida los valores de fluorescencia sin procesar (F) en cada ROI a lo largo del tiempo haciendo clic en Medir. Exportar datos sin procesar a un software de hoja de cálculo para convertir la señal de fluorescencia en números en cada punto de tiempo haciendo clic en Todo a Excel | Exportar.
  3. Determine el valor de fluorescencia basal, que se define como F0,calculando el promedio de F durante los primeros 10 fotogramas (es decir, antes del tratamiento) en los datos registrados.
  4. Normalice los datos de F (calculando ΔF/F) usando la ecuación ΔF/F = (F−F0)/F0, donde ΔF es el cambio dependiente del tiempo en fluorescencia.
  5. Para el análisis de onda de velocidad de onda de Ca2+, defina un punto de ascenso de señal significativo por encima de los valores preestimulados como representación de la detección de un aumento de Ca2+ en cada ROI(t1 y t2)utilizando el criterio de un aumento a 2× la desviación estándar (2x SD) que se calcula a partir de los datos de F0 utilizando software estadístico. El 95% de los datos de F0 se encuentra dentro de 2x SD de la media, lo que indica que un aumento de la señal por encima de este nivel por casualidad es ≤5%. Calcule la diferencia de tiempo del aumento de Ca2+ entre ROI1 y ROI2 [t2- t1 time-lag (Δt)] y mida la distancia entre ROI1 y ROI2, luego determine las velocidades de cualquier onda de Ca2+.

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Representative Results

La propagación de la señal de [Ca2+]cyt y [Glu]apo en respuesta a la herida se presenta en la Figura 3, figura 4, película S1y película S2. El corte del pecíolo de la hoja 1 en plantas que expresan GCaMP3 (a 0 s) llevó a un aumento significativo de [Ca2+]cyt que fue rápidamente inducido localmente a través de la vasculatura (a los 40 s) (Figura 3 y Película S1). Posteriormente, la señal se propagó rápidamente a las hojas vecinas (hojas 3 y 6) en pocos minutos (a los 80 s) (Figura 3 y Película S1).

Al cortar la hoja 1 en plantas que expresan CHIB-iGluSnFR, se observó un rápido aumento de [Glu]apo alrededor de la región de corte (a 2 s). Esta señal se propagó a través de la vasculatura localmente en pocos minutos (a 160 s) pero no se observó en hojas sistémicas(Figura 4 y Película S2).

Para la obtención de imágenes en tiempo real de la propagación de la señal de Ca2+ desencadenada por la aplicación de glutamato, se cortó el borde (aproximadamente 1 mm de la punta) de la hoja 1 en plantas que expresan GCaMP3 como se muestra en la Figura 5A y la Película S3. Cortar el borde de la hoja 1 causó un aumento local decyt [Ca2+] (a 40 s) pero esta señal desapareció en pocos minutos (a 124 s). Después de esperar aproximadamente 10 min para que la planta se recuperara, se aplicaron 10 μL de glutamato de 100 mM a la superficie de corte de la hoja 1, lo que provocó un aumento rápido y significativo de [Ca2+]cyt localmente (a 56 s) y propagación de la señal a las hojas distales (a 104 s) (Figura 5B y Película S4).

Para medir los cambios en [Ca2+]cyt inducidos por heridas en la hoja sistémica, se establecieron dos ROIs (ROI1 y ROI2) en la región base y la punta de la hoja 6 en plantas que expresan GCaMP3 como se muestra en la Figura 6A. Se midió el cambio de curso de tiempo de la intensidad de la señal GCaMP3 en ROI1 y ROI2 al cortar el pecíolo de la hoja 1 (Figura 6B). Se detectó un aumento significativo de [Ca2+]cyt en ROI1 antes que el de ROI2 (Figura 6B). [Ca2+] cyt alcanzó un máximo de aproximadamente 100 s después de la herida, duró más de 10 min y exhibió dos fases(Figura 6B).

Para determinar las velocidades de la onda de Ca2+ tras la herida mecánica, se determinó el punto de tiempo de una señal significativa de aumento por encima de los valores preestimulados en ROI1 y ROI2 (time-lag; ver Sección 4) (Figura 6C). Debido a que la distancia entre ROI1 y ROI2 fue de 2,7 mm en este caso (Figura 6A), la velocidad de la señal de Ca2+ en la hoja 6 se calculó como 0,15 mm/s. Para medir loscambios de apo [Glu] en respuesta al daño mecánico, roi1 se estableció en las proximidades del sitio de corte de la hoja marcada como L1 como se muestra en la Figura 7A. [Glu] la firma apo en ROI1 ha exhibido un solo pico en aproximadamente 100 s al herir (Figura 7B).

Figure 1
Figura 1: Numeración de las hojas de roseta de Arabidopsis. Las hojas de Arabidopsis están numeradas de mayor a menor (panel izquierdo). Un diagrama esquemático de la posición de las hojas se indica en el panel derecho. L: hoja, C: cotilledones. Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.

Figure 2
Figura 2:Un microscopio de fluorescencia utilizado en este estudio. [Ca2+]cyt y [Glu]apo dinámica se fotociró con un estereomicroscopio de fluorescencia de campo amplio. R: Mando a distancia, O: lente objetivo 1x, C: cámara sCMOS, T: Tubo basculante trinocular, S: Etapa, P: Material vegetal. Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.

Figure 3
Figura 3:Transmisión de señal ca2+ de larga distancia inducida por heridas. El corte del pecíolo (flecha blanca, 0 s) de la hoja 1 (L1) en la planta que expresa GCaMP3 desencadenó un aumento local [Ca2+]cyt (flecha roja, 40 s) que se transmitió a las hojas sistémicas [hoja 3 (L3) y hoja 6 (L6)] (flechas naranjas, 80 s). Barra de escala, 5 mm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4:Elevaciónapo desencadenada por heridas [Glu]. El corte de la hoja 1 (L1) (flecha blanca, 0 s) en plantas que expresan CHIB-iGluSnFR causó una rápida elevación de [Glu]apo (flecha roja, 80 s) que se propagó a través de la vasculatura (flecha naranja, 160 s). Barra de escala, 2 mm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5:Transmisión deseñal de Ca2+ de larga distancia activada por glutamato. (A) Cortar el borde (aproximadamente 1 mm desde la punta) de la hoja 1 (L1) en plantas que expresan GCaMP3 (flecha blanca, 0 s) causó un aumento de [Ca2+]cyt (flecha roja, 40 s). (B)La aplicación de glutamato de 100 mM a la superficie de corte de L1 (flecha blanca, 0 s) causó un aumento local de[Ca 2+] cyt (flecha roja, 56 s) que se propagó rápidamente a las hojas distales [por ejemplo, hoja 3 (L3), hoja 4 (L4) y hoja 6 (L6)] (flechas naranjas, 104 s). Barras de escala, 5 mm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 6
Figura 6:[Ca2+] firmacyt en hojas sistémicas en respuesta a heridas mecánicas. (A)Una imagen expandida de la hoja 6 (L6) en plantas que expresan GCaMP3 se muestra en la Figura 3. Roi1 (círculo azul) y ROI2 (círculo rosa) se establecieron en la base y la región de la punta, respectivamente. La flecha blanca indica el sitio de corte del pecíolo de la hoja 1 (L1). En este caso, la distancia entre ROI1 y ROI2 fue de 2,7 mm.(B)Cuantificación de [Ca2+] firmascyt en ROI1 y ROI2. Los cambios de la intensidad de la fluorescencia eran analizados usando software de la proyección de imagen. (C) Un rastro ampliado de datos en (B) entre 0 s y 80 s. Los puntos de detección de un aumento de Ca2+ en ROI1 y ROI2 se definieron como t1 y t2,respectivamente, utilizando como criterio un aumento a 2x de la desviación estándar de los valores de prestimulación (2x SD, línea punteada). El valor de t2 - t1 se definió como time-lag (Δt) en el protocolo actual. La flecha negra indica el tiempo de corte. Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.

Figure 7
Figura 7:[Glu]apo firma en respuesta a heridas mecánicas. (A) En la Figura 4se muestra una imagen expandida de la hoja 1 (L1) en plantas que expresan CHIB-iGluSnFR. ROI1 se estableció en las inmediaciones del sitio de corte. La flecha blanca indica la región de corte. (B)La cuantificación de la firma [Glu]apo en ROI1 se supervisa utilizando software de imágenes. La flecha negra indica el tiempo de corte. Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.

Película S1: Transmisión ca2+ de larga distancia después de heridas mecánicas. La herida mecánica en el pecíolo de la hoja 1 (L1) causó un aumento delcyt [Ca2+] transmitido a las hojas distales [e.g., hoja 3 (L3) y hoja 6 (L6)]. Por favor, haga clic aquí para descargar esta película.

Película S2: Elevación de los niveles de glutamato apoplásico en respuesta al corte. La herida mecánica de la hoja 1 (L1) causó un aumento inmediato en [Glu]apo. Por favor, haga clic aquí para descargar esta película.

Película S3: Elevación de [Ca2+]niveles decyt en respuesta al corte. La herida mecánica en el borde de la hoja 1 (L1) causó una elevación inmediata, local delcyt [Ca2+]. Por favor, haga clic aquí para descargar esta película.

Película S4: La aplicación de glutamato desencadena sistémicos [Ca2+]cyt aumenta. La aplicación de glutamato de 100 mM desencadenó la transmisión de Ca2+ a hojas sistémicas [por ejemplo, hoja 3 (L3), hoja 4 (L4) y hoja 6 (L6)]. Por favor, haga clic aquí para descargar esta película.

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Discussion

La señalización sistémica es importante para que las plantas respondan a estímulos ambientales externos localizados y luego mantengan su homeostasis a nivel de toda la planta. Aunque no están equipados con un sistema nervioso avanzado como los animales, emplean una comunicación rápida tanto dentro como entre órganos basados en factores como las señales eléctricas móviles (y posiblemente hidráulicas) y las ondas de propagación de ROS y Ca2+46,47. El protocolo descrito anteriormente permite obtener imágenes en toda la planta y en tiempo real de la actividad de este sistema de señalización mediante el monitoreo de la dinámica de Ca2 + y glutamato apoplásico en respuesta a la herida. Este método proporciona una herramienta robusta para comprender señales rápidas y de larga distancia en plantas que combinan alta resolución espaciotemporal y facilidad de uso. Este protocolo también ofrece el potencial de proporcionar nuevos conocimientos fisiológicos sobre los mecanismos moleculares subyacentes a la señalización de heridas a larga distancia a través de, por ejemplo, el uso de mutantes que son defectuosos en los elementos putativos del sistema de señalización rápida o la exploración de los efectos de reactivos farmacológicos como los bloqueadores de canales de Ca2 + (por ejemplo, LaCl3)o inhibidores de otras actividades de señalización potencialmente clave6. 

Una ventaja importante del método de imágenes de biosensores descrito es el uso de biosensores de un solo FP con alto rendimiento fluorescente, simplificando en gran medida tanto el equipo necesario para realizar estas mediciones como su uso en planta. Por lo tanto, los indicadores codificados genéticamente basados en fluorescencia se dividen en dos clases: 1) biosensores de fp único basados en la intensidad y 2) biosensores ratiométricos basados en FRET10. Aunque los sensores basados en FRET ratiométricos son cuantitativamente precisos, los indicadores de Ca2+ basados en la intensidad, incluidos los GCaMP3 e iGluSnFR utilizados aquí, proporcionan una mayor resolución temporal y facilidad de uso debido a su señal de respuesta de Ca2+generalmente más brillante y sus requisitos de microscopio más simples10. Por ejemplo, se informó que el indicador R-GECO1 R-GECO1 basado en proteínas mono-fluorescentes de un solo FP Y2+ muestra un cambio de señal mucho mayor en respuesta al ATP extracelular y a los elicidores de defensa vegetal flg22 y quitina, en comparación con el biosensor ratiométrico YC3.627. Para el análisis de sensores ratiométricos basados en FRET, también es necesario utilizar un microscopio especializado con múltiples filtros para recopilar datos en dos longitudes de onda, mientras que los biosensores basados en FP único requieren que el dispositivo recopile los datos en una sola longitud de onda, una capacidad que se encuentra en todos los microscopios de fluorescencia estándar10. Sin embargo, es importante tener en cuenta que hay algunas desventajas de usar biosensores de un solo FP. Estos biosensores de fp único basados en la intensidad no son los preferidos para cuantificar los cambios absolutos de concentración o para obtener imágenes a largo plazo durante muchas horas o días. Esta limitación se debe a que, además de, por ejemplo, el nivel de Ca2+ para GCaMP3, se cree que la intensidad de la señal de estos biosensores de un solo FP se ve afectada por otros factores como el nivel de expresión del sensor o parámetros como el pH celular que pueden cambiar con el tiempo.

Hasta la fecha, muchas nuevas variantes de estos indicadores codificados genéticamente se han diseñado para mejorar la relación señal/ruido, el rango dinámico, la cinética y la estabilidad del sensor. Por ejemplo, después de que Nakai et al.26 desarrollaran el primer GCaMP, varias variantes sucesivas, como los GECOs, han sido generadas por una combinación de mutagénesis y caracterización cuidadosa48,49,50. Se informó de que el rango dinámico de G-GECO (Green-GECO) era aproximadamente dos veces mayor que el de GCaMP328. Además, la sustitución por diferentes proteínas fluorescentes en estos indicadores dio lugar a la generación de variantes de GECO con diferentes espectros de emisión, como B-GECO (Blue-GECO) y R-GECO (Red-GECO), lo que permite el uso de estos indicadores junto con otras variantes espectrales de GFP en aplicaciones de imagen multicolor28. Del mismo modo, GCaMP ha seguido desarrollándose y mejorando con una serie de sensores mejorados para la velocidad de respuesta y la amplitud de la señal que ahora están disponibles50. Para el monitoreo de la dinámica del glutamato, distintos de iGluSnFR, se han desarrollado una serie de biosensores de glutamato basados en FRET, se han desarrollado las proteínas indicadoras FLuorescent para glutamato (FLIPE)40. FLIPE se compone de CFP y YFP que se unen a través de la proteína de unión al glutamato ybeJ tomada de E. coli. Sobre el glutamato que ata a ybeJ, una disminución dependiente de la concentración del glutamato de la eficacia del traste se observa. Por lo tanto, tanto para Ca2+ como para glutamato hay múltiples sensores de un solo FP y ratiométricos disponibles. Los investigadores deben considerar el biosensor apropiado para detectar la dinámica de la señal en función del diseño experimental y los requisitos para los factores de medición, como la señal alta: ruido (sensores de un solo FP) frente a la necesidad de una cuantificación de alta precisión (donde sobresalen los sensores FRET).

El método de la proyección de imagen del ancho-campo, solo-FP descrito aquí para herir debe también ser útil cuando está aplicado a otros procesos sistémicos de la señalización de la tensión. A pesar de la presencia de numerosos informes que sugieren un papel crucial de la señalización de Ca2 + a larga distancia en diversas respuestas de estrés, como el ataque de herbívoros6,51,52,sal20y la sequía53,solo unos pocos estudios han proporcionado la información espaciotemporal relacionada con las señales rápidas de Ca2 + de larga distancia inducidas por estas respuestas deestrés 6,7,20,52. El uso de un microscopio de fluorescencia de campo amplio en este protocolo también permite la observación en tiempo real de la dinámica de la señal móvil no sólo en la comunicación hoja a hoja, sino también en la comunicación de raíz a brote, como se ha demostrado recientemente38. Aunque nos hemos centrado en los protocolos para Arabidopsis,este método de imágenes en tiempo real para toda la planta también proporciona una herramienta robusta para comprender las características espaciales y temporales de la señalización sistémica de Ca2 + en las respuestas de estrés biótico y abiótico en otras especies de plantas como el tabaco30.

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Disclosures

Los autores no tienen ningún conflicto de intereses.

Acknowledgments

Este trabajo fue apoyado por subvenciones de la Sociedad Japonesa para la Promoción de la Ciencia (17H05007 y 18H05491) a MT, la Fundación Nacional de Ciencias (IOS1557899 y MCB2016177) y la Administración Nacional de Aeronáutica y del Espacio (NNX14AT25G y 80NSSC19K0126) a SG.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Arabidopsis expressing GCaMP3 Saitama University
Arabidopsis expressing CHIB-iGluSnFR Saitama University
GraphPad Prism 7 GraphPad Software
L-Glutamate FUJIFILM Wako 072-00501 Dissolved in a liquid growth medium [1/2x MS salts, 1% (w/v) sucrose, and 0.05% (w/v) MES; pH 5.1 adjusted with 1N KOH].
Microsoft Excel Microsoft Corporation
Murashige and Skoog (MS) medium FUJIFILM Wako 392-00591 composition: 1x MS salts, 1% (w/v) sucrose, 0.01% (w/v) myoinositol, 0.05% (w/v) MES, and 0.5% (w/v) gellan gum; pH 5.7 adjusted with 1N KOH.
Nikon SMZ25 stereomicroscope Nikon
NIS-Elements AR analysis Nikon
1x objective lens (P2-SHR PLAN APO) Nikon
sCMOS camera (ORCA-Flash4.0 V2) Hamamatsu Photonics C11440-22CU
Square plastic Petri dish Simport D210-16

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Biología Número 172 calcio GCaMP3 biosensores fluorescentes genéticamente codificados glutamato iGluSnFR señal de larga distancia heridas
Wide-Field, Imágenes en tiempo real de señales de heridas locales y sistémicas en <em>Arabidopsis</em>
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Uemura, T., Wang, J., Aratani, Y.,… More

Uemura, T., Wang, J., Aratani, Y., Gilroy, S., Toyota, M. Wide-Field, Real-Time Imaging of Local and Systemic Wound Signals in Arabidopsis. J. Vis. Exp. (172), e62114, doi:10.3791/62114 (2021).

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