Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Sarcomere Afkortning af pluripotente stamcelle-afledte kardiomyocytter ved hjælp af fluorescerende-tagged Sarcomere proteiner.

Published: March 3, 2021 doi: 10.3791/62129
Automatic Translation
*1, *1, 1,2, 3,4, 4, 4, 1, 1
1Division of Regenerative Medicine, Center for Molecular Medicine, Jichi Medical University, 2Department of Pediatrics, Jichi Medical University, 3Institute of Global Innovation Research, Tokyo University of Agriculture and Technology, 4Department of Precision Mechanics, Faculty of Science and Engineering, Chuo University
* These authors contributed equally

Summary

Denne metode kan bruges til at undersøge sarkomforkortelser ved hjælp af pluripotente stamcelleafledte kardiomyocytter med fluorescerende-mærkede sarkomproteiner.

Abstract

Pluripotente stamcelleafledte kardiomyocytter (PSC-CMs) kan fremstilles af både embryonale og inducerede pluripotente stamceller (ES/iPS). Disse celler giver lovende kilder til hjertesygdom modellering. For kardiomyopatier er sarkomere afkortning en af de standard fysiologiske vurderinger, der bruges sammen med voksne kardiomyocytter til at undersøge deres sygdomsphoenotyper. De tilgængelige metoder er imidlertid ikke egnede til at vurdere PSC-CMs' kontraktilitet, da disse celler har underudviklede sarkomenter, der er usynlige under fasekontrastmikroskopi. For at løse dette problem og udføre sarkomforkortelse med PSC-CMs blev der anvendt fluorescerende tagged sarkomproteiner og fluorescerende live-imaging. Tynde Z-linjer og en M-line opholde sig i begge ender og i midten af en sarkom, henholdsvis. Z-line proteiner — α-Actinin (ACTN2), Telethonin (TCAP) og actin-associeret LIM-protein (PDLIM3) — og et M-line protein — Myomesin-2 (Myom2) — blev mærket med fluorescerende proteiner. Disse mærkede proteiner kan udtrykkes fra endogene alleler som knock-ins eller fra adeno-associerede vira (AAV'er). Her introducerer vi metoderne til at differentiere mus og menneskelige pluripotente stamceller til kardiomyocytter, til at producere AAV'er og til at udføre og analysere live-imaging. Vi beskriver også metoderne til fremstilling af polydimethylsiloxan (PDMS) frimærker til en mønstret kultur af PSC-CMs, som letter analysen af sarkomere afkortning med fluorescerende-mærkede proteiner. For at vurdere sarkomforkortelse blev time-lapse-billeder af de bankende celler optaget med en høj framerate (50-100 billeder i sekundet) under elektrisk stimulering (0,5-1 Hz). For at analysere sarkomlængden i løbet af cellesammentrækning blev de optagede time-lapse-billeder udsat for SarcOptiM, en plug-in til ImageJ / Fiji. Vores strategi giver en enkel platform til undersøgelse af hjertesygdomme fænotyper i PSC-CMs.

Introduction

Hjerte-kar-sygdomme er den hyppigste årsag til dødelighed på verdensplan1 og kardiomyopati udgør den tredje årsag til hjerte-relaterede dødsfald2. Kardiomyopati er en kollektiv gruppe af sygdomme, der påvirker hjertemusklerne. Den seneste udvikling af inducerede pluripotente stamceller (iPS) og den rettet differentiering af iPS-celler mod kardiomyocytter (PSC-CMs) har åbnet døren for at studere kardiomyocytter med patientgenom som en in vitro-model af kardiomyopati. Disse celler kan bruges til at forstå patofysiologien af hjertesygdomme, til at belyse deres molekylære mekanismer og til at teste forskellige terapeutiske kandidater3. Der er en enorm interesse, således patient-afledte iPS celler er blevet genereret (f.eks hypertrofisk kardiomyopati [HCM]4,5, arytmogenic højre ventrikulær kardiomyopati [ARVC]6, udvidede kardiomyopati [DCM]7, og mitokondrie-relaterede kardiomyopatier8,9). Fordi et af kendetegnene ved kardiomyopati er dysfunktion og forstyrrelse af sarkomenter, er der brug for et gyldigt værktøj, der ensartet måler sarkomfunktion.

Sarkomere afkortning er den mest anvendte teknik til at vurdere sarkomfunktion og kontraktiliteten af voksne kardiomyocytter afledt af dyremodeller og mennesker. For at udføre sarkomforkortende, er veludviklede sarkomere, der er synlige under fasekontrast, påkrævet. PSC-CMs dyrkede imidlertid in vitro-display underudviklede og uorganiserede sarkomenter og kan derfor ikke bruges til korrekt at måle sarkomforkortelser10. Denne vanskelighed ved at foretage en korrekt vurdering af PSC-CMs ' kontraktilitet hindrer deres brug som platform til vurdering af hjertefunktioner in vitro. For indirekte at vurdere PSC-CMs-kontraktilitet er der anvendt mikroskopi af atomkraft, mikro-post-arrays, mikroskopi og impedansmålinger til måling af virkningerne af den bevægelse, som disse celler udøver på deres omgivelser11,12,13. Mere sofistikerede og mindre invasive videomikroskopioptagelser af faktisk cellulær bevægelse (f.eks. SI8000 fra SONY) kan bruges til alternativt at vurdere deres kontraktilitet, men denne metode måler ikke direkte sarkomere bevægelse eller kraftgenerering kinetik14.

For direkte at måle sarkom bevægelse i PSC-CMs, nye tilgange, såsom fluorescerende-tagging til sarkomere protein, er ved at opstå. For eksempel bruges Lifeact til at mærke filamentous actin (F-actin) til at måle sarkom bevægelse15,16. Genetisk modificerede iPS-celler er en anden mulighed for tagging af sarkomproteiner (f.eks. α-actinin [ACTN2] og Myomesin-2 [MYOM2]) med fluorescerende protein17,18,19.

I dette papir beskriver vi, hvordan man udfører time-lapse imaging til måling af sarkomforkortelser ved hjælp af Myom2-TagRFP (musefosterstamceller [ES] og ACTN2-mCherry (humane iPS-celler). Vi viser også, at en mønstret kultur letter sarkomere tilpasning. Derudover beskriver vi en alternativ metode til sarkommærkning ved hjælp af adeno-associerede vira (AAV'er), som i vid udstrækning kan anvendes på patientafledte iPS-celler.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Differentiering af pluripotente stamceller fra mus

  1. Vedligeholdelse af ES-museceller
    1. Vedligeholdelsesmedium: Bland 50 mL føtalt kvægserum (FBS), 5 mL L-alanin-L-glutamin, 5 mL ikke-essentiel aminosyre (NEAA), 5 mL 100 mM natriumpyrililat og 909 μl 55 mM 2-Mercaptoethanol med 450 mL Glasgow Minimum Essential Medium (GMEM). Suppl leukæmihæmmende faktor (LIF), CHIR-99021 og PD0325901 ved en endelig koncentration på henholdsvis 1000 U/mL, 1 μM og 3 μM. Steriliser mediet gennem et 0,22 μm filter.
    2. FBS medium: Bland 55 mL FBS, 5,5 mL L-alanin-L-glutamin, 5,5 mL natrium pyruvat og 5,5 mL NEAA til 500 mL Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM) høj glukose. Filtrat mediet gennem et 0,22 μm filter til sterilisering.
    3. Kultur SMM18 mus ES celler, hvor TagRFP blev slået ind i Myom2 locus på en gelatine 6 cm parabol i vedligeholdelse medium som tidligere beskrevet18. Passage hver 2-3 dage.
  2. Forberedelse af serumfri differentiering (SFD) medium
    1. Basal SFD: Bland 250 ml skinkes F-12, 750 ml Iskoves modificerede dulbeccos medium (IMDM), 10 ml B27-tillæg minus vitamin A, 5 ml N2-tillæg, 10 ml L-alanin-L-glutamin, 5 ml 10% kvægserumalbumin i fosfatbufferet saltvand (PBS) og 10 ml penicillin og streptomycin (10.000 U/mL). Filter gennem 0,22 μm si for at sterilisere.
    2. Ascorbinsyre opløses ved 5 mg/mL i destilleret vand, og der filtreres gennem 0,22 μm si for at sterilisere.
    3. 13 μL 1-Thioglycerol fortyndes til 1 mL IMDM. Heri henvises til denne fortyndede 1-Thioglycerol som MTG.
    4. Der tilsættes 10 μL ascorbinsyre (5 mg/mL) og 3 μL MTG til 1 mL basal SFD på brugsdagen. Heri henvises til denne blanding som komplet SFD.
  3. Dag 0, embryoid krop (EB) dannelse til differentiering
    1. Høst SMM18 mus ES celler med en rekombinant trypsin-lignende protease (rTrypsin) og tælle cellerne.
    2. Centrifuge 5 x 105 celler ved 300 x g i 3 min i 4 °C, opsuges i 10 mL komplet SFD og frø i en 10 cm petriskål. Cellerne dyrkes ved 37 °C og 5% CO2 i 50 timer.
  4. Differentiering dag 2
    1. Der tilsættes Activin A, humant vaskulært endotelvækstfaktor (hVEGF) og knoglemorfogenetisk protein 4 (BMP4) for at fuldføre SFD ved en endelig koncentration på henholdsvis 5 ng/mL, 5 ng/mL og 1,9 ng/mL.
      BEMÆRK: BMP4-koncentrationerne kan variere afhængigt af partiet BMP4. Test flere koncentrationer i et mindre forsøg, før du bruger et nyt parti, og bestem den bedste koncentration til hjertedifferentiering.
    2. Elben overføres fra en petriskål til et 15 mL rør og centrifuge ved 50-100 x g i 3 min ved 4 °C.
    3. I mellemtiden tilsættes det medium, der er forberedt i trin 1.4.1, til petriskålen for at beskytte, at de resterende EBs er tørre.
    4. Aspirere supernatanten fra 15 ml røret, opbrug eBs med mediet i petriskålen, og overfør EB-opløsningen tilbage til skålen. Derefter dyrkes EL'erne ved 37 °C og 5% CO2 i 46 timer.
  5. Differentiering dag 4
    1. Gelatine en 10 cm vævskulturbehandlet skål med 5 til 10 ml 0,1% gelatine i mindst 5 minutter. Aspirat gelatine lige før såning celler.
    2. Forbered medium: Bland grundlæggende fibroblast vækstfaktor (bFGF), FGF10, og hVEGF at fuldføre SFD ved 5 ng / mL, 25 ng / mL, og 5 ng / mL endelige koncentrationer, hhv. For en 10 cm skål, forbered 10 mL.
    3. Overfør celler fra petriskålen til et 15 mL rør. Tilsæt 5 mL PBS til petriskålen, vask flere gange, og overfør til 15-mL røret for at samle de resterende celler. Centrifuge ved 50-100 x g, 4 °C, 3 min.
    4. Aspirat supernatant, tilsæt 1 mL rTrypsin, og inkuber ved 37 °C i 3 min.
    5. Vortex kort at adskille EP'er, tilføje 9 mL af 10% FBS medium, vortex igen, og tælle cellerne.
    6. Centrifuge 1,5 x 107 celler ved 300 x g, 4 °C i 3 min, opsuges med de medier, der er forberedt i trin 1.4.2, og frø i gelatineiseret skål. Inkuber ved 37 °C og 5% CO2 i 2 dage.
      BEMÆRK: Ved dag 7 eller 8 kan der observeres omfattende tæsk af PSC-CMs.
  6. Lægemiddelvalg ved differentieringsdage 7 og 9: Refeed medierne med puromycin (2 μg/ml ved den endelige koncentration) for at eliminere ikke-kardiomyocytter på dag 7 og 9 af differentiering.
    BEMÆRK: Forældrelinjen af SMM18 er syNP4 mus ES celler, husly NCX1 promotor-drevet puromycin-resistente gen20.
  7. Dag 10, replate til fremtidige eksperimenter
    1. Coat en glasbundet kulturplade eller en 35 mm billedskål, der indeholder en polymerovertræk med 0,1% gelatine. For at forbedre modningen skal retterne belægges med laminin-511 E8-fragment (LN511-E8) ved 1 μg/cm2 i 30-60 minutter ved stuetemperatur18. Til kultur PSC-CMs i specifikke mønstre af interesse, henvises til trin 4 og 5 for at forberede polydimethylsiloxan (PDMS) frimærker.
    2. For at høste SMM18 PSC-CMs vaskes skålen to gange med PBS, påføres 1 mL rTrypsin og inkuberes 3 min ved 37 °C.
    3. Indsaml celler i 9 mL på 10% FBS-mellem, afbryd og tæl cellerne. Plade cellerne på 50.000-100.000 celler i en brønd af en 24-brønds plade eller 250.000-500.000 celler i en 35 mm billeddannelse parabol.
    4. Centrifuge et tilstrækkeligt antal celler (300 x g, 3 min) og genbruge cellerne med komplet SFD suppleret med FBS (endelig koncentration ved 10%).
    5. Inkuber natten over og ændre kulturmediet for at fuldføre SFD med puromycin.
    6. Fra dag 14 skal du ændre kulturmediet to til tre gange om ugen med komplet SFD indtil dag 21-28, hvor Myom2-RFP bliver fremtrædende. For AAV-baseret transduktion af fluorescerende-mærkede sarkomproteiner henvises til trin 3.

2. Differentiering af humane pluripotente stamceller

  1. Udarbejdelse af differentieringsmedier
    1. RPMI+B27-Ins: Bland 500 mL RPMI 1640 medium, 10 mL B27 minus insulin og 5,25 mL L-alanin-L-glutamin.
    2. RPMI+B27+Ins: Bland 500 mL RPMI, 10 mL B27-tillæg og 5,25 mL L-alanin-L-glutamin.
  2. Vedligeholdelse af menneskelige iPS-celler
    1. Passage menneskelige iPS celler to gange om ugen med AK02N på LN511-E8 efter tidligere offentliggjort metode med nogle ændringer21.
    2. Høst celler med en 3 min behandling af rTrypsin og indsamle i 10% FBS medium. Tæl celler og centrifuge ved 300 x g i 3 min ved 4 °C. Frø 75.000-125.000 celler i en brønd på 6 brøndplade med 2 mL AK02N suppleret med LN511-E8 og Y27632 ved den endelige koncentration på henholdsvis 0,5 μg/mL (0,1 μg/cm2)og 10 μM.
    3. Inkuber ved 37 °C og 5% CO2 og udskift mediet den følgende dag med 2 mL AK02N uden tilsætning. Skift medie hver anden til tre dage og passage hver tredje til fire dage.
  3. Dag -4: replate før differentiering
    1. Coat en 6 godt plade med 0,5 μg/cm2 af LN511-E8 fortyndet i PBS. Derefter inkuberes i mindst 30 minutter ved 37 °C og 5% CO2 eller 1 time ved stuetemperatur. Aspirat belægning løsning lige før såning celler.
    2. Høst menneskelige iPS-celler med rTrypsin og tæl celler som i trin 2.2.2.
    3. Centrifuge 1,25 x 105 celler til en brønd med en 6-brønds plade ved 300 x g i 3 min ved 4 °C og genbruges i 2 mL AK02N-tillæg ln511-E8 (endelig koncentration 0,5 μg/mL eller 0,1 μg/cm2) og Y27632 (endelig koncentration 10 μM) pr. brønd.
    4. Aspiratbelægningsopløsning, frø, der er genbrugte celler i den belagte plade, og inkuber ved 37 °C og 5% CO2.
  4. Dage -3 og -1: Udskift medium med 2 mL AK02N.
  5. Dag 0: Udskift medium med 2 mL RPMI+B27-Ins suppleret med CHIR99021 (endelig koncentration 6 μM) pr. brønd for at starte differentiering.
  6. Dag 2: Udskift medium med 2 mL RPMI+B27-Ins med WntC59 (endelig koncentration 2 μM) pr. brønd.
  7. Dag 4: Udskift medium med 2 mL RPMI+B27-Ins pr. brønd.
  8. Dag 7 og dag 9: Udskift medium med 2 ml RPMI+B27+Ins med puromycin (endelig koncentration 10 μg/mL) pr. brønd til selektivt dyrkning PSC-CMs.
    BEMÆRK: ACTN2-mCherry linje, der anvendes i denne undersøgelse, har en kassette af interne ribosomal indrejse site (IRES), puromycin-resistente gen indsat til 3′-uoversatte region (UTR) af TNNT2 locus, og mCherry erstatte stop codon af ACTN2. For at rense kardiomyocyt uden knock-in henvises til trin 3 og 4.
  9. Dag 10: Replate til fremtidige eksperimenter
    1. Coat en 35 mm billeddannelse parabol med en polymer coverlip med 0,5-1 μg/cm2 af LN511-E8 fortyndet i 0,1% Gelatine. Inkuber 2-4 timer ved stuetemperatur for langsigtet levedygtighed. Til kultur PSC-CMs i ønskede mønstre, henvises til trin 4 og 5 for at forberede PDMS frimærker.
    2. For at høste menneskelige PSC-CMs vaskes skålen to gange med PBS, påføres 1 mL rTrypsin pr. brønd og inkuberes 3 min ved 37 °C.
    3. Indsaml celler i 4 mL på 10% FBS-mellem, afbryd og tæl cellerne. Plade 250.000-500.000 celler pr. 35 mm billedskål.
    4. Centrifuge et tilstrækkeligt antal celler ved 300 x g i 3 min ved 4 °C, opsuget med RPMI+B27+Ins med puromycin (10 μg/mL) og plade på den belagte 35 mm billedskål.
    5. Inkuber natten over. Næste morgen skal kulturmediet udskiftes med RPMI+B27+Ins med puromycin (10 μg/mL).
    6. Fra dag 14 skal du skifte kulturmedium 2-3 gange om ugen med RPMI+B27+Ins indtil dag 21-28 til billedbehandling. For AAV-baseret transduktion af fluorescerende-mærkede sarkomproteiner henvises til trin 3.

3. Fluorescerende mærkning af sarkomenter ved hjælp af adeno-associerede vira

  1. Forberedelse før AAV-produktion
    1. Vedligehold HEK293T celler i DMEM suppleret med FBS (endelig koncentration 10%) på en 10 cm vævskultur plade. Passage celler tre gange om ugen.
    2. Polyethylenimin (PEI) fremstilles ved 1 mg/mL. Bland 50 mg polyethylenimine MAX 40000 og 40 mL ultrapure vand. Juster pH til 7,0 ved hjælp af 1 N NaOH. Derefter laves det endelige volumen til 50 mL med ultrapure vand og filtrere gennem en 0,22 μm si.
    3. Forbered en shuttle vektor med en sarkom mærkning gen (f.eks TCAP eller PDLIM3 smeltet med en grøn fluorescerende protein [GFP]), drevet af en kardiomyocyt-specifik promotor, såsom hjerte troponin T (cTNT)22.
      BEMÆRK: I dette tilfælde brugte vi monomerisk forbedret GFP med mutationer af V163A, S202T, L221V23.
  2. Dag 0, passage HEK celler
    1. Når cellerne når sammenløb, passage 2,0 x 107 HEK293T celler til en 15 cm vævskultur plade med 20 mL DMEM med 10% FBS.
  3. Dag 1, oversættelse
    1. 13,5 μg af rumfærgevektoren blandes, 26 μg pHelper (vektorkodning E2A, E4 og VA af adenovirus), 16,5 μg pRC6 (en vektorkodning AAV2 Rep og AAV6 Cap gener) og 1 mL DMEM uden natrium pyruvat (DMEM-Pyr).
    2. 224 μL PEI (1 mg/mL, tilberedt i trin 3.1.2) og 776 μL DMEM-Pyr.
    3. Plasmidopløsningen og PEI-opløsningen blandes og inkuberes ved stuetemperatur i 30 min.
    4. Plasmid/PEI-opløsningen til HEK293T-cellerne, der er forberedt i trin 3.2.
  4. Dag 2, medium forandring
    1. Ved 24 timer efter transinfektion, skift medium til DMEM-Pyr. Kulturceller indtil høst AAV på dag 7. AAV vil blive frigivet i kulturmedierne.
  5. Dag 7, AAV-kollektion, koncentration og buffererstatning ved hjælp af minimalrensningsmetode 24
    1. Inkuber en centrifugal ultrafiltreringsenhed (100 k molekylær vægtafskæring [MWCO]) med 5 mL på 1% BSA i PBS ved stuetemperatur i 15 minutter. Derefter centrifugeres ultrafiltreringsenheden ved 500 x g i 2 min. og aspirat både filtrerede og resterende opløsninger.
    2. Overfør medium fra den 15 cm skål, der producerede AAV, til et nyt 50 mL konisk rør og centrifuge (500 x g, 5 min). Supernatanten filtreres gennem en 0,45 μm sprøjtesien for at fjerne cellerester og anvende affjedring på ultrafiltreringsenheden.
    3. Centrifuge ved 2000 x g i 90 min eller indtil koncentration af dyrknings supernatanten 0,5 til 1 mL.
    4. Aspirat filtrat og anvende 15 mL PBS til ultrafiltration enhed.
    5. Centrifugering gentages, indtil koncentratet bliver 0,5-1 mL.
    6. Gentag 3.5.4 og 3.5.5.
    7. Koncentreret AAV overføres til et nyt 1,5 mL rør, og der opbevares ved 4 °C eller -20 °C.
      BEMÆRK: AAV kan bruges i P1-faciliteter, men følger lokale regler og forskrifter. AAV kan også produceres ved hjælp af konventionelle metoder.
  6. Beregning af AAV-titer
    1. 5 μL AAV, 195 μL DMEM-Pyr og 10 U benzonase blandes og inkuberes ved 37 °C i 1 time.
    2. Der tilsættes 200 μL proteinase K buffer (0,02 M Tris HCl og 1% SDS) og 5 μL proteinase K (20 mg/mL) og inkuberes ved 37 °C i 1 time.
    3. Der tilberedes forsigtigt 400 μL af en 25:24:1 Phenol/chloroform/isoamylalkoholopløsning, vortex i 1 min. og centrifuge ved 20.000 x g i 1 min.
    4. 200 μL af den vandige fase overføres til et nyt 1,5 mL rør, som vil give ca. halvdelen af de oprindelige AAV-genomer.
    5. Der tilsættes 1 μL Glykogen (20 mg/mL) til 20 μL på 3 M CH3COONa (pH 5.2) og vortex. Der tilsættes 250 μL 2-Propanol til 100 μL 100% ethanol og vortex igen.
    6. Inkuber ved -80 °C i 15 min. Derefter centrifuge ved 20.000 x g i 30 min ved 4 °C.
    7. Aspirat supernatant og tilsæt 70% ethanol til røret. Derefter centrifugeres ved 20.000 x g, 4 °C i 5 min.
    8. Aspirat supernatant og lufttørre, indtil pellet bliver klar.
    9. Der tilsættes 200 μL tris-ethylendiaminetetraeddikesyre (TE; pH 8.0) for at løse AAV-genomerne. Fortynd derefter prøven 100 gange med TE.
    10. Der fremstilles en standard med pAAV-CMV-Vector ved 6,5 ng/μL med TE for at opnå 109 vektorgenomer (vg)/ μL. Lav derefter en serie af 10-fold fortynding fra 104 til 108 med TE.
    11. 1 μL prøve-DNA (eller standarderne), 0,4 μL primere (5 μM), 3,6 μL destilleret vand og 5 μL SYBR Grøn masterblanding blandes. Primere, der ligger på ITR, er 5'-GGAACCTAGTGATGGAGTT-3 'og 5′-CGGCCTCAGTGAGCGA-3′.
    12. Udfør PCR i realtid med følgende betingelse: Indledende denaturering ved 95 °C i 60 s, 40 cyklusser denaturering ved 95 °C for 15 s og udglødning og udvidelse ved 60 °C i 30 s efterfulgt af smeltekurve.
    13. Baseret på standarderne og Ct-værdierne giver en PCR-maskine i realtid kopiantallet af vektorgenom i 1 μL af en prøve. Den oprindelige AAV-titer beregnes ved hjælp af følgende ligning: et kopinummer fra PCR i realtid (vg/μL) x 8 x 103 x 2, hvori 8 x 103 som fortyndingsfaktor under AAV-genomisolation og 2 som forskelsfaktor for AAV (enkelt streng) og plasmid (dobbeltstreng).
  7. Transduktion til PSC-CMs
    1. Tæl PSC-CMs i en ekstra brønd eller ekstra skål.
    2. Fortyndes AAV'er (1 x 104 til 1 x 106 vg/celle) for at udgøre 50 μL med PBS. Anvend AAV'er ved multipliciteten af infektion (MOI) på 1 x 104 til 1 x 106 vg/celle på PSC-CMs og kultur PSC-CMs i 3 dage med AAV i de tilsvarende differentieringsmedier til mus og menneskelige PSC-CMs, og skift derefter medier til kulturmedie uden AAV.
    3. Brug PSC-CMs til live-celle billeddannelse efter 7 dage eller mere efter transduktion.

4. [Valgfri] AAV-baseret rensning af PSC-CMs

  1. Forberedelse af AAV
    1. Forbered AAV som beskrevet i trin 3 ved hjælp af en shuttle vektor udtrykke blasticidin-resistente gen under kontrol af cTNT promotor.
  2. Transduktion til differentiering af iPS-celler
    1. Differentiere menneskelige iPS-celler i 4 dage efter den protokol, der er beskrevet i trin 2, og tælle antallet af celler i en ekstra brønd.
    2. Når du har skiftet medie på dag 4, skal du anvende AAV'er på MOI på 1 x10 5 vg/cell på at differentiere PSC'er i RPMI+B27-Ins-medier.
    3. På dag 7 skal du opdatere mediet med RPMI+B27+Ins og tilføje 2,5-10 μg/mL blasticidin.
    4. På dag 10 er PSC-CMs klar til at blive ompladet.

5. Udarbejdelse af PDMS-frimærker

  1. Anordningens mønster på 200 μm strimler sammen med 10-25 μm riller mellem strimlerne ved hjælp af en computerstøttet design (CAD) tegnesoftware.
  2. Tegn mønsteret af enheder på en kromfotomaske belagt med AZP1350 ved hjælp af UV-lys fra et maskless litografiværktøj.
  3. Udvikle mønsteret på fotomasken i en række positive fotoresist udvikler (f.eks chrom etchant) og skyl med DI vand.
  4. Dehydrer en siliciumskiver på en kogeplade ved 120 °C i 15 min.
  5. Lad waferen køle af til stuetemperatur og spin-coat en negativ fotoresist SU-8 3010 for at gøre en højde på 10-20 μm med 1500 rpm i 30 s ved hjælp af en spin-coater.
  6. Blød bage wafer i to trin på en kogeplade i henhold til producentens protokol.
  7. Når waferen er afkølet til stuetemperatur, skal du lægge waferen på masken aligner.
  8. Brug en maske aligner til at justere masken på wafer og udsætte wafer til UV-lys.
  9. Udfør den efter eksponering bages til wafer i to trin på en kogeplade i henhold til producentens protokol.
  10. Udvikle wafer i en serie af SU-8 udvikler og 2-Propanol, derefter tørre wafer med en nitrogen strøm.
  11. Overfør wafer i en petriskål af en passende størrelse.
  12. Bland PDMS elastomer og dets hærdningsmiddel i et forhold 10:1 w/w og hæld blandingen i petriskålen.
  13. Afgas PDMS i en ekssikkator, indtil alle luftbobler forsvinder, og hærder derefter PDMS på kogepladen ved 80 °C i 2 timer.
  14. Skræl det hærdede PDMS af masterformen ved hjælp af en pincet, og skær derefter delen ud med designet til at være et PDMS-stempel.
    BEMÆRK: Formen kan være firkantet, men en ottekantet form overfører mønsteret bedre ved kanten.

6. Mønstret kultur af pluripotente stamcelle-afledte kardiomyocytter

  1. Fjern støv fra overfladen af PDMS-frimærker ved hjælp af reparerebånd.
  2. Nedsænk frimærkerne i 70% ethanol for at sterilisere. Derefter blæse ethanol fra overfladen af frimærker ved hjælp af en luft duster.
  3. Påfør 5-10 μL på 0,5 wt% 2-methacryloyloxyethylphosphorylcholin (MPC) polymer/ethanol på overfladen af PDMS-frimærker.
    BEMÆRK: Ujævn fordeling af MPC polymer kan forårsage et forstyrret mønster.
  4. Inkuber 10-30 min indtil MPC polymer er helt tørret.
  5. Stemplerne sættes i kontakt med overtræksplader på en glasbundet dyrkningsplade eller en billedskål på 35 mm med polymerovertræk og sættes en vægt (f.eks. et AAA-batteri) på stemplet i 10 min.
  6. Fjern vægten og frimærkerne. Bekræft derefter, at mønsteret er blevet overført under mikroskop.
    BEMÆRK: Stemplede tallerkener/tallerkener kan opbevares op til 1 uge ved stuetemperatur.
  7. Vask de stemplede brønde/tallerkener med PBS to gange.
  8. LN511-E8 fortyndes med PBS ved 2-4 μg/mL, og skålen belægges med LN511-E8 ved 0,5-1 μg/cm2. For humane PSC-CMs fortyndes LN511-E8 med 0,1% gelatineopløsning i stedet for PBS. Derefter inkuberes i mindst 1 time (optimalt mere end 4 timer).
  9. Pladeceller som beskrevet i tidligere afsnit.

7. Time-lapse billeddannelse af sarkomenter under fluorescerende mikroskop

  1. Tænd og tilslut mikroskopet, den tilknyttede computer og også alle de nødvendige eksterne enheder.
  2. Hvis du vil udføre time-lapse-billedbehandling, skal du tage time-lapse-billeder med den højeste forstørrelse (100X objektiv linse med olieudstøj).
  3. Vælg betingelser for live-billedbehandling. Hvis du vil have gode repræsentative data, skal du prøve at tilpasse dig den højeste billedhastighed (minimum 20 ms eller 50 billeder i sekundet anbefales). Sæt lukkeren åben og anvende en nødvendig binning (4 X 4) og en afgrøde af erhvervelsen område for at opnå de korteste intervaller mellem billeder i løbet af time-lapse imaging.
    BEMÆRK: Indstillingen kan variere afhængigt af mikroskopernes konfigurationer. Kameraet skal være meget følsomt og er i stand til at overføre dataene til den tilsluttede pc hurtigt nok. Til dette formål brugte vi ORCA flash med Kamera-link. Vi har testet en roterende konfokal mikroskopi og har erhvervet billeder med 400 billeder i sekundet.
    1. [Valgfrit] Hvis slåhastigheden af cellerne er lav, fremkalder cellerne ved elektrisk feltstimulation.
  4. Køre time-lapse-posten
    1. Sørg for, at de afbildede felter forbliver i fokus under optagelsen af time-lapse-billedet.
    2. Gem time-lapse-billederne i en passende mappe.

8. Analyse af time-lapse billedbehandling ved hjælp af SarcOptiM, en ImageJ / Fiji plugin

  1. Indlæs en række time-lapse-billeder i ImageJ. I Olympus VSI-format skal du åbne filer via OlympusViewer-plug-in'en.
  2. Juster billedets lysstyrke og kontrast for at observere sarkommønsteret tydeligt (Billede | Juster | Lysstyrke/kontrast).
  3. Åbn SarcOptiM ved at klikke på Menuen Flere værktøjer (>>) og vælge SarcOptiM.
  4. Kalibrer programmet ved at trykke på knappen Ctrl + Skift + P og 1 μm på værktøjslinjen og følge instruktionerne i dialogboksene.
  5. Tegn en streg over sarkomens område, der skal bruges til at måle sarkomforkorteningen.
  6. Start sarkomere afkortningsanalyse ved at trykke på SingleCell (AVI) på værktøjslinjen. Repræsentative data er vist i figur 1 og figur 2.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Måling af sarkomforkortelse ved hjælp af knock-in PSC-CMs reporter linjer. Sarcomere-mærket PSC-CMs blev brugt til at måle sarkomere afkortning. Linjerne udtrykker Myom2-RFP og ACTN2-mCherry fra endogene loci. TagRFP blev indsat i Myom2, kodning M-proteiner, der lokaliserer til M-line, mens mCherry blev slået-in til ACTN2, kodning α-Actinin, som lokaliserer til Z-linje18,25. Time-lapse billeder blev opnået og brugt til at bestemme sarkomere afkortning som præsenteret i figur 1 og 2 og Movie 1-3.

For at overvinde den uorganiserede sarkom af PSC-CMs, specifikke PDMS frimærker blev brugt til at kultur PSC-CMs i stribe mønster. Denne mønstrede kultur fremmede en langstrakt celleform og et mere organiseret sarkommønster sammenlignet med celler, der dyrkes i det ikke-mønsterområde(Figur 2B og 2C). Med denne fordel promoverede den mønstrede kultur bedre sammentrækning af cellerne og gav en glat sarkomlængdeprofil som vist i Film 2 og 3 og Figur 2D.

Fluorescerende mærkning af Z-line protein ved hjælp af AAV-vektorer. For at visualisere Z-linjen af PSC-CMs uden at generere knock-in iPS-celler blev fluorescerende mærkede Z-line proteiner udtrykt ved hjælp af AAV-transduktion. To af de små Z-linjeproteiner, Telethonin (TCAP) og Actin-associeret LIM-protein (PDLIM3) med GFP, blev mærket og emballeret ved hjælp af AAV6-kapslen (Figur 3A). Da PSC-CMs blev differentieret og renset, blev AAV'er omsat til PSC-CMs(Figur 3B). De transducerede PSC-CMs udtrykte sarkomiske GFP-signaler langs PSC-CMs allerede tre dage efter transduktion(Figur 3C og 3D). Transduktion af AAV ved en MOI på 105 vg/celle er typisk tilstrækkelig til at visualisere fluorescerende tagged sarkomproteiner, og en højere titer kan forårsage ikke-specifik lokalisering af GFP til cytoplasma, selvom det øger den samlede GFP-intensitet.

Rensning af PSC-CMs ved hjælp af AAV-vektorer. Nuværende metoder er afhængige af lægemiddeludvælgelseskassetten, der allerede er på genomet af PSC-CMs, enten transgen eller knock-in linje. Det er dog arbejdskrævende at producere en sådan linje fra patient-afledte iPS-celler. Da AAV-vektorer har vist sig at drive ekspressionen af fluorescerende-mærkede Z-line proteiner uden behov for knock-in, forsøgte vi at etablere rensningsmetoden uden knock-in så godt (Figur 4). Med henblik herpå blev der konstrueret en ny AAV-vektor, som koder eksplosionsresistent gen under kontrol af cTNT-promotor (Figur 4A). AAV (MOI på 105 vg/cell) blev transduceret til at differentiere menneskelige iPS-celler på dag 4. Derefter blev celler behandlet med 2,5-10 μg/mL blasticidin (behov for at titrere for hver cellelinje) mellem dag 7 og 9(Figur 4B). På dag 14 var renheden af PSC-CMs mere end 90%(Figur 4C).

Figure 1
Figur 1: Sarkomere afkortning af musens PSC-CMs afledt af celllinjen Myom2-TagRFP. A. Det er ikke så lidt. Tidslinjen for PSC-CM-differentiering af mus. B. Repræsentative billeder til sarkomforkortning i forskellige tidspunkter med måleområder som angivet med gule bjælker. Skalastang = 10 μm. C. Sarcomere længdeprofil under sammentrækning af kardiomyocytter, der blev stimuleret med elektricitet ved 1 Hz. Frameraten var 50 billeder i sekundet. Pixelstørrelsen var 0,26 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: Repræsentative data, der viser sarkomere afkortning af de menneskelige PSC-CMs, der stammer fra ACTN2-mCherry-cellelinjen i ikke-mønstret og mønstret kultur. A. Det er ikke så lidt. Tidslinjen for menneskelig PSC-CM differentiering. B. og C. Kardiomyocytter dyrket i ikke-mønstrede kulturer viser uorganiserede sarkom mønstre (B), mens mønstrede kulturer fremme en god tilpasning af sarkom (C). Måling af områder præsenteret af gule bjælker. D. Det er mig. Tilsvarende sarkomlængdeprofiler opnået under cellesammentrækning fremkaldt af elektrisk stimulering ved 0,5 Hz og en 100 billeder pr. sekund billedhastighed. Pixelstørrelse = 0,26 μm, skalalinje = 10 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: PSC-CMs for mus efter AAV-transduktion i 3 dage. A. Det er ikke så lidt. Skematisk vektorkort over AAV til sarkomet mærkning. Et sarkomprotein (gen af interesse, GOI) er knyttet til GFP med en Gly-Gly-Gly-Ser linker (L) og udtrykt under kontrol af hjertetroponin T (cTNT) promotor. B. Tidslinjen for musens PSC-CM differentiering og AAV transduktion. C. og D. Repræsentative billeder, der viser klar sarkomal lokalisering og den tilsvarende sarkomlængdeprofil for TCAP-GFP (C) og PDLIM3-GFP (D) efter 3 dages transduktion til PSC-CMs genereret fra Myom2-TagRFP-cellelinjen. Skalastang = 10 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4:Blasticidin Rensning af menneskelige PSC-CMs uden knock-in. 
A. Det er ikke så lidt. Skematisk vektorkort over AAV, hvor en blasticidin-resistens genkassette (BSR) indsættes nedstrøms til cTNT-promotor. B. Tidslinjen for menneskelig psc-CMs differentiering, transduktion, og blasticidin udvælgelse. C. Repræsentative data, der viser procentdelen af cTNT + celler i humane PSC-CMs (transduceret 105 vg/celle AAV6 på dag 4 og derefter behandlet med 2,5 μg/mL blasticidin på dag 7 og 9). Klik her for at se en større version af dette tal.

Film 1: Fluorescerende time-lapse video af musen PSC-CMs genereret fra Myom2-TagRFP cellelinje. RFP-signaler viste et sarkommønster efter PSC-CM-kultur i 28 dage. Cellerne viste slå synkront, når stimuleret med elektricitet på 1 Hz. Den time-lapse billeder blev erhvervet hver 20 ms med en 100X linse. Skalastang = 5 μm. Klik her for at downloade denne film.

Film 2: Fluorescerende time-lapse video af den menneskelige PSC-CMs med ACTN2-mCherry dyrket på en ikke-mønstret kultur parabol. PSC-CMs udtrykke ACTN2-mCherry på en ikke-mønstret kultur parabol ikke kun viste uorganisering af sarkom, men også præsenteret en vinkende sammentrækning, som det er vanskeligt at bestemme sarkom afkortning. Cellerne blev stimuleret med elektricitet på 0,5 Hz og billeder erhvervet hver 10 ms med en 100X linse. Skalastang = 10 μm. Klik her for at downloade denne film.

Film 3: Fluorescerende time-lapse video af den menneskelige PSC-CMs med ACTN2-mCherry dyrket på en mønstret kultur parabol. Den mønstrede kultur fremmet tilpasning af sarkom og tvang cellerne til en stang form. Denne metode gjorde det lettere at bestemme sarkomforkortelse i PSC-CMs. Videoen blev opnået ved at stimulere cellerne med elektricitet på 0,5 Hz. Frameraten var 100 billeder i sekundet. Skalastang = 10 μm. Klik her for at downloade denne film.

Supplerende CAD-filer. CAD-filer til oprettelse af frimærker med strimler på 200 μm bredde og riller på 10 μm (Stamp_200x10.dxf), 25 μm (Stamp_200x25.dxf) og 50 μm (Stamp_200x50.dxf). Klik her for at hente denne fil.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

PSC-CMs har et stort potentiale til at blive brugt som en in vitro platform til model hjertesygdom og til at teste virkningerne af narkotika. Ikke desto mindre skal der først etableres en nøjagtig og ensartet metode til vurdering af PSC-CMs-funktioner. De fleste af funktionelle tests arbejder med PSC-CMs, f.eks elektrofysiologi, calcium forbigående, og stofskifte26, og en af de første patient-afledte PSC-CM undersøgelser handlede om lang-QT syndrom27. Men kontraktilitet, en af de vigtigste funktioner i en kardiomyocyt, er stadig vanskeligt at vurdere. Med voksne kardiomyocytter er sarkomere afkortning meget udbredt. På grund af den underudviklede og uorganiserede sarkom af PSC-CMs fungerer standardmetoden til sarkomere afkortning derimod ikke med disse celler. Derfor har vi fremlagt en alternativ metode til undersøgelse af sarkomforkortelser i PSC-CMs ved hjælp af fluorescerende-mærkede sarkomproteiner. Som påvist kan proteiner, der er lokaliseret til M-linjen (MYOM2) eller Z-line (ACTN2, TCAP og PDLIM3), fusioneret med fluorescerende proteiner, anvendes til denne tilgang. Vi har også vist, at fluorescerende-mærkede proteiner kan udtrykkes fra endogene loci eller AAV'er. AAV'er giver større fleksibilitet til at udtrykke fluorescerende mærkede proteiner end endogene loci, da AAV'er kan anvendes på enhver form for patientafledte PSC-CMs. I modsætning hertil kan ekspresproteiner fra endogene loci have en mindre effekt på sarkomere funktion, da ekspressionsniveauet af generne er stramt reguleret og også kan bruges til overvågning af modningen af PSC-CMs18.

Selv om Myom2-TagRFP, ACTN2-mCherry, og Lifeact alle blev brugt til at undersøge sarkom afkortning16,18,19, er det stadig uklart, om disse proteiner forstyrrer sarkom funktion. For nylig blev Lifeact rapporteret at forstyrre actin organisation og cellulær morfologi28. Det er også vigtigt at bemærke, at fusionsmønstre (dvs. GFP-fusionsstedet på N-sigt eller C-sigt for målprotein) også påvirker sarkomfunktionen29. Derfor, før de anvendes bredt, er det vigtigt at foretage en grundig vurdering af, om fluorescerende-mærkede sarkomproteiner forstyrrer sarkomfunktionen, og om proteinproteininteraktioner forekommer i sarkomenter in vitro, in vivoog/eller hos voksne kardiomyocytter. Dette repertoire af fluorescerende-mærkede sarkomproteiner giver et godt udgangspunkt for fremtidige proteintekniske muligheder (dvs. afkortning af sarkomproteinerne til kun lokaliseringssignaler). Valg af proteiner til tag er en anden nøgle til succes. Vi har mærket en anden Z-line protein med GFP, men dette protein vises kun en cytoplasmisk fordeling i stedet for at lokalisere til sarkomere. For live-imaging kan proteinstabilitet også spille en rolle, da signalniveauet for eksempel vil være lavere, hvis et mærket protein er ustabilt. Lysstofrørets fotostabilitet er også vigtig, da ustabile proteinsignaler let slukkes under billeddannelse.

For at undersøge PSC-CMs' kontraktilitet ved hjælp af andre metoder end beskrevet kan indirekte målinger af kraft genereret af PSC-CMs (f.eks. mikro-post arrays, trækkraftkraftmikroskopi) eller bevægelse (f.eks. bevægelsesdetektering i høj opløsning ved hjælp af SI8000)11,12,13,14 anvendes. Vores metode kan kombineres med disse metoder eller med farvebaserede handlingspotentiale / calcium forbigående målinger. Den kombinatoriske tilgang kan give yderligere oplysninger om, hvordan en sygdom forårsager dysfunktion i patient-afledte PSC-CMs.

En af udfordringerne i sarkomforkortelse i PSC-CMs er at finde en god sarkom, der bevæger sig lineært, ellers kan cellerne let komme ud af linjen for sarkom påvisning af SarcOptiM og forårsage ustabile sarkomforkortende resultater. Her demonstrerer vi, at brug af en mønstret kultur genereret med PDMS-frimærker kan give en mere stabil og lineær sarkombevægelse. En mønstret kultur er også kendt for at understøtte modningen af PSC-CMs16, hvilket er vigtigt for sarkomfunktion.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

H.U. har indgivet et patent relateret til dette manuskript.

Acknowledgments

Vi vil gerne anerkende alle laboratoriemedlemmer i Afdelingen for Regenerativ Medicin ved Jichi Medical University for den nyttige diskussion og teknisk bistand. Denne undersøgelse blev støttet af tilskud fra Japan Agency for Medical Research and Development (AMED; JP18bm0704012 og JP20bm0804018), Japan Society for the Promotion of Science (JSPS; JP19KK0219), og den japanske Circulation Society (Grant for Basic Research) til H.U.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1-Thioglycerol Sigma-Aldrich M6145-25
2-Mercaptoethanol (55mM) Thermo Fisher Scientific 21985-023
2-methacryloyloxyethyl phosphorylcholine (MPC) polymer, NOF Corp. LIPIDURE-CM5206
2-Propanol Fujifilm wako 166-04836
35-mm imaging dish with a polymer coverslip (µ-Dish 35 mm, high) ibidi 81156
AAVproR Helper Free System (AAV6)
(vectors; pHelper, pRC6, pAAV-CMV-Vector)		 Takara 6651
ACTN2-mCherry (AR12, AR21) hiPSCs N.A. We inserted IRES-puromycin resistant casette to 3' UTR of TNNT2 locus and mCherry around the stop codon of ACTN2 in 610B1 hiPSC line, following a method describe elsewhere (Anzai, Methods Mol Biol, in press)
B-27 Supplement (50X), serum free Thermo Fisher Scientific 17504-044
B-27 Supplement, minus insulin Thermo Fisher Scientific A18956-01
B27 supplement (50X), minus Vitamin A Thermo Fisher Scientific 12587-010
Benzonase (25 U/µL) Merck Millipore 70746
Blasticidin S Hydrochloride Fujifilm wako 029-18701
BMP-4, Human, Recombinant, R&D Systems, Inc. 314-BP-010
Bovine Serum Albumin Sigma-Aldrich A4503-100g
C59, Wnt Antagonist (WntC59) abcam ab142216
CAD drawing software, Robert McNeel and Associates, WA, USA Rhinoceros 6.0
Centrifugal ultrafiltration unit (100k MWCO), Vivaspin-20 Sartorius VS2042
CHIR99021 Cayman 13122
Chromium etchant Nihon Kagaku Sangyo Co., Ltd., Japan N14B
Chromium mask coated with AZP1350 Clean Surface Technology Co., Japan CBL2506Bu-AZP
Dr. GenTLE Precipitation Carrier (20mg/mL Glycogen, 3 M Sodium Acetate (pH 5.2)) Takara 9094
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) - high glucose Sigma-Aldrich D6429-500
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) - high glucose, without sodium pyruvate Sigma-Aldrich D5796
Ethanol (99.5) Fujifilm wako 057-00456
Fetal Bovine Serum Moregate 59301104
FGF-10, Human, Recombinant, R&D Systems, Inc. 345-FG-025
Fibroblast Growth Factor(basic), human, recombinant Fujifilm wako 060-04543
Gelatin from porcine skin powder Sigma-Aldrich G1890-100g
Glasgow Minimum Essential Medium (GMEM) Sigma-Aldrich G5154-500
GLASS BOTTOM culture plates MatTek P24G-1.5-13-F/H
Ham’s F-12 Thermo Fisher Scientific 11765-062
Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) Thermo Fisher Scientific 12440-061
L-alanine-L-glutamine (GlutaMAX Supplement, 200mM) Thermo Fisher Scientific 35050-061
L(+)-Ascorbic Acid Sodium Salt Fujifilm wako 196-01252
Laminin-511 E8 fragment (LN511-E8, iMatrix-511) Nippi 892012
Mask aligner Union Optical Co., Ltd., Japan PEM-800
Maskless lithography tool NanoSystem Solutions, Inc., Japan D-Light DL-1000
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) Thermo Fisher Scientific 11140-050
Millex-HV Syringe Filter Unit, 0.45 µm, PVDF (0.45-µm filter) Merck Millipore SLHVR33RS
Myom2-RFP (SMM18) N.A. Developed in our previous paper (Chanthra, Sci Rep, 2020)
N-2 Supplement (100X) Thermo Fisher Scientific 17502-048
ORCA-Flash4.0 V3 digital CMOS camera Hamamatsu C13440-20CU
PD0325901 Stemgent 04-0006-10
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) Thermo Fisher Scientific 15140-122
Petri dish Sansei medical co. Ltd 01-004
Phenol/Chloroform/Isoamyl alcohol (25:24:1) Nippon Gene 311-90151
Polydimethylsiloxane (PDMS) elastomer Dow Corning Corp., MI, USA SILPOT 184
polyethylenimine MAX (MW. 40,000) Polyscience 24765-1
Positive photoresist developer Tokyo Ohka Kogyo Co., Ltd., Japan NMD-3
PowerUp SYBR Green Master Mix Thermo Fisher Scientific A25742
Proteinase K Takara 9034
Puromycin Dihydrochloride Fujifilm wako 166-23153
Recombinant Human/Mouse/Rat Activin A Protein R&D Systems, Inc. 338-AC-050
Recombinant trypsin-like protease (rTrypsin; TrypLE express) Thermo Fisher Scientific 12604-039
RPMI1640 Medium Thermo Fisher Scientific 11875-119
Silicon wafer Matsuzaki Seisakusyo Co., Ltd., Japan N.A.
Sodium Pyruvate (100 mM) Thermo Fisher Scientific 11360-070
Spin-coater Mikasa Co., Ltd., Japan MS-A100
Spininng confocal microscopy Oxford Instruments Andor Dragonfly Spinning Disk System
StemSure LIF, Mouse, recombinant, Solution (10^6U) Fujifilm wako 195-16053
SU-8 3010 Kayaku Advanced Materials, Inc., MA, USA SU-8 3010
SU-8 developer Kayaku Advanced Materials, Inc., MA, USA SU-8 developer
Tris-EDTA Nippon Gene 314-90021
Vascular Endothelial Growth Factor-A165(VEGF), Human, recombinant Fujifilm wako 226-01781

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Mensah, G. A., Roth, G. A., Fuster, V. The Global Burden of Cardiovascular Diseases and Risk Factors. Journal of the American College of Cardiology. 74 (20), 2529-2532 (2019).
  2. Wexler, R. K., Elton, T., Pleister, A., Feldman, D. Cardiomyopathy: an overview. American Family Physician. 79 (9), 778-784 (2009).
  3. Parrotta, E. I., Lucchino, V., Scaramuzzino, L., Scalise, S., Cuda, G. Modeling Cardiac Disease Mechanisms Using Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes: Progress, Promises and Challenges. International Journal of Molecular Sciences. , 30 (2020).
  4. Carvajal-Vergara, X., et al. Patient-specific induced pluripotent stem-cell-derived models of LEOPARD syndrome. Nature. 465 (7299), 808-812 (2010).
  5. Lan, F., et al. Abnormal calcium handling properties underlie familial hypertrophic cardiomyopathy pathology in patient-specific induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 12 (1), 101-113 (2013).
  6. Kim, C., et al. Studying arrhythmogenic right ventricular dysplasia with patient-specific iPSCs. Nature. 494 (7435), 105-110 (2013).
  7. Gramlich, M., et al. Antisense-mediated exon skipping: a therapeutic strategy for titin-based dilated cardiomyopathy. EMBO Molecular Medicine. 7 (5), 562-576 (2015).
  8. Wang, G., et al. Modeling the mitochondrial cardiomyopathy of Barth syndrome with induced pluripotent stem cell and heart-on-chip technologies. Nature Medicine. 20 (6), 616-623 (2014).
  9. Li, S., et al. Mitochondrial Dysfunctions Contribute to Hypertrophic Cardiomyopathy in Patient iPSC-Derived Cardiomyocytes with MT-RNR2 Mutation. Stem Cell Reports. 10 (3), 808-821 (2018).
  10. Cho, G. -S., et al. Neonatal Transplantation Confers Maturation of PSC-Derived Cardiomyocytes Conducive to Modeling Cardiomyopathy. Cell Reports. 18 (2), 571-582 (2017).
  11. Yang, X., et al. Tri-iodo-l-thyronine promotes the maturation of human cardiomyocytes-derived from induced pluripotent stem cells. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 72, 296-304 (2014).
  12. Ribeiro, A. J. S., et al. Multi-Imaging Method to Assay the Contractile Mechanical Output of Micropatterned Human iPSC-Derived Cardiac Myocytes. Circulation Research. 120 (10), 1572-1583 (2017).
  13. Sewanan, L. R., Campbell, S. G. Modelling sarcomeric cardiomyopathies with human cardiomyocytes derived from induced pluripotent stem cells. The Journal of Physiology. 598 (14), 2909-2922 (2020).
  14. Kopljar, I., et al. Chronic drug-induced effects on contractile motion properties and cardiac biomarkers in human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. British Journal of Pharmacology. 174 (21), 3766-3779 (2017).
  15. Riedl, J., et al. Lifeact: a versatile marker to visualize F-actin. Nature Methods. 5 (7), 605-607 (2008).
  16. Ribeiro, A. J. S., et al. Contractility of single cardiomyocytes differentiated from pluripotent stem cells depends on physiological shape and substrate stiffness. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (41), 12705-12710 (2015).
  17. Roberts, B., et al. Fluorescent Gene Tagging of Transcriptionally Silent Genes in hiPSCs. Stem Cell Reports. 12 (5), 1145-1158 (2019).
  18. Chanthra, N., et al. A Novel Fluorescent Reporter System Identifies Laminin-511/521 as Potent Regulators of Cardiomyocyte Maturation. Scientific Reports. 10 (1), 4249 (2020).
  19. Ribeiro, M. C., et al. A cardiomyocyte show of force: A fluorescent alpha-actinin reporter line sheds light on human cardiomyocyte contractility versus substrate stiffness. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 141, 54-64 (2020).
  20. Yamanaka, S., Zahanich, I., Wersto, R. P., Boheler, K. R. Enhanced Proliferation of Monolayer Cultures of Embryonic Stem (ES) Cell-Derived Cardiomyocytes Following Acute Loss of Retinoblastoma. PLoS ONE. 3 (12), 3896 (2008).
  21. Miyazaki, T., Isobe, T., Nakatsuji, N., Suemori, H. Efficient Adhesion Culture of Human Pluripotent Stem Cells Using Laminin Fragments in an Uncoated Manner. Scientific Reports. 7 (1), 41165 (2017).
  22. Prasad, K. -M. R., Xu, Y., Yang, Z., Acton, S. T., French, B. A. Robust cardiomyocyte-specific gene expression following systemic injection of AAV: in vivo gene delivery follows a Poisson distribution. Gene Therapy. 18 (1), 43-52 (2011).
  23. Arakawa, H., et al. Protein evolution by hypermutation and selection in the B cell line DT40. Nucleic Acids Research. 36 (1), e1 (2007).
  24. Konno, A., Hirai, H. Efficient whole brain transduction by systemic infusion of minimally purified AAV-PHP.eB. Journal of Neuroscience Methods. 346, 108914 (2020).
  25. Anzai, T., et al. Generation of Efficient Knock-in Mouse and Human Pluripotent Stem Cells Using CRISPR-Cas9. Methods of Molecular Biology. Yoshida, Y., et al. , (2020).
  26. Ahmed, R. E., Anzai, T., Chanthra, N., Uosaki, H. A Brief Review of Current Maturation Methods for Human Induced Pluripotent Stem Cells-Derived Cardiomyocytes. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 178 (2020).
  27. Moretti, A., et al. Patient-specific induced pluripotent stem-cell models for long-QT syndrome. The New England Journal of Medicine. 363 (15), 1397-1409 (2010).
  28. Flores, L. R., Keeling, M. C., Zhang, X., Sliogeryte, K., Gavara, N. Lifeact-GFP alters F-actin organization, cellular morphology and biophysical behaviour. Scientific Reports. 9 (1), 3241 (2019).
  29. Sparrow, A. J., et al. Measurement of Myofilament-Localized Calcium Dynamics in Adult Cardiomyocytes and the Effect of Hypertrophic Cardiomyopathy Mutations. Circulation Research. 124 (8), 1228-1239 (2019).

Tags

Medicin Pluripotente stamcelle kardiomyocyt sarkomere afkortning levende billeddannelse fluorescerende-tagged sarkom proteiner microcontact udskrivning
Sarcomere Afkortning af pluripotente stamcelle-afledte kardiomyocytter ved hjælp af fluorescerende-tagged Sarcomere proteiner.
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ahmed, R. E., Chanthra, N., Anzai,… More

Ahmed, R. E., Chanthra, N., Anzai, T., Koiwai, K., Murakami, T., Suzuki, H., Hanazono, Y., Uosaki, H. Sarcomere Shortening of Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes using Fluorescent-Tagged Sarcomere Proteins.. J. Vis. Exp. (169), e62129, doi:10.3791/62129 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter