Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Саркомерное укорочение кардиомиоцитов, полученных из плюрипотентных стволовых клеток, с использованием флуоресцентно-помеченных саркомерных белков.

Published: March 3, 2021 doi: 10.3791/62129
Automatic Translation
*1, *1, 1,2, 3,4, 4, 4, 1, 1
1Division of Regenerative Medicine, Center for Molecular Medicine, Jichi Medical University, 2Department of Pediatrics, Jichi Medical University, 3Institute of Global Innovation Research, Tokyo University of Agriculture and Technology, 4Department of Precision Mechanics, Faculty of Science and Engineering, Chuo University
* These authors contributed equally

Summary

Этот метод может быть использован для исследования укорочения саркомера с использованием плюрипотентных кардиомиоцитов, полученных из стволовых клеток, с флуоресцентными белками саркомера.

Abstract

Плюрипотентные кардиомиоциты, полученные из стволовых клеток (PSC-CMs), могут быть получены как из эмбриональных, так и из индуцированных плюрипотентных стволовых (ES / iPS) клеток. Эти клетки являются перспективными источниками для моделирования сердечных заболеваний. Для кардиомиопатий укорочение саркомера является одной из стандартных физиологических оценок, которые используются со взрослыми кардиомиоцитами для изучения фенотипов их заболевания. Однако имеющиеся методы не подходят для оценки сократимости PSC-CMs, так как эти клетки имеют недостаточно развитые саркомеры, которые невидимы при фазово-контрастной микроскопии. Для решения этой проблемы и выполнения укорочения саркомера с помощью PSC-CMs использовались флуоресцентные помеченные белки саркомера и флуоресцентная живая визуализация. Тонкие Z-линии и М-линия находятся на обоих концах и в центре саркомера соответственно. Белки Z-линии — α-актинин (ACTN2), телетонин (TCAP) и актин-ассоциированный белок LIM (PDLIM3) — и один белок M-линии — Myomesin-2 (Myom2) — были помечены флуоресцентными белками. Эти помеченные белки могут быть экспрессированы из эндогенных аллелей в виде нокаутов или из аденоассоциированных вирусов (AAV). Здесь мы представляем методы дифференцировки плюрипотентных стволовых клеток мыши и человека к кардиомиоцитам, для производства AAV, а также для выполнения и анализа живой визуализации. Описаны также методы получения полидиметилсилоксановых (PDMS) штампов для узорчатой культуры PSC-CMs, что облегчает анализ укорочения саркомера флуоресцентно-помеченными белками. Для оценки укорочения саркомера были записаны покадровые изображения бьющихся клеток с высокой частотой кадров (50-100 кадров в секунду) при электрической стимуляции (0,5-1 Гц). Для анализа длины саркомера в ходе сокращения клеток записанные покадровые изображения были подвергнуты SarcOptiM, плагину для ImageJ / Fiji. Наша стратегия предоставляет простую платформу для исследования фенотипов сердечных заболеваний в PSC-CMs.

Introduction

Сердечно-сосудистые заболевания являются основной причиной смертности во всем мире1, а кардиомиопатия представляет собой третью причину смертности, связанной с сердцем2. Кардиомиопатия – это коллективная группа заболеваний, поражающих сердечную мышцу. Последние разработки индуцированных плюрипотентных стволовых (iPS) клеток и направленная дифференцировка iPS-клеток в сторону кардиомиоцитов (PSC-CMs) открыли двери для изучения кардиомиоцитов с геномом пациента в качестве модели кардиомиопатии in vitro. Эти клетки могут быть использованы для понимания патофизиологии сердечных заболеваний, для выяснения их молекулярных механизмов и для тестирования различных терапевтических кандидатов3. Существует огромный интерес, таким образом, были сгенерированы iPS-клетки, полученные от пациента (например, гипертрофическая кардиомиопатия [HCM]4,5,аритмогенная кардиомиопатия правого желудочка [ARVC]6,дилатационная кардиомиопатия [DCM]7и кардиомиопатии, связанные с митохондриями,8,9). Поскольку одной из характеристик кардиомиопатии является дисфункция и нарушение саркомер, необходим действительный инструмент, который равномерно измеряет функцию саркомера.

Укорочение саркомера является наиболее широко используемым методом оценки функции саркомера и сократимости взрослых кардиомиоцитов, полученных от животных моделей и людей. Для выполнения укорочения саркомера требуются хорошо развитые саркомы, которые видны при фазово-контрастном. Однако PSC-CMs, культивируемые in vitro, демонстрируют недоразвитые и дезорганизованные саркомеры и, следовательно, не могут быть использованы для правильного измерения укорочения саркомера10. Эта трудность правильной оценки сократимости PSC-CMs препятствует их использованию в качестве платформы для оценки сердечных функций in vitro. Для косвенной оценки сократимости PSC-CMs использовались атомно-силовая микроскопия, микропостойные массивы, микроскопия силы тяги и измерения импеданса для измерения влияния движения, оказываемого этими клетками на их окружение11,12,13. Более сложные и менее инвазивные видеомикроскопические записи фактического клеточного движения (например, SI8000 от SONY) могут быть использованы для альтернативной оценки их сократимости, однако этот метод не измеряет непосредственно саркомерное движение или кинетику генерации силы14.

Для непосредственного измерения движения саркомера в PSC-CMs появляются новые подходы, такие как флуоресцентная маркировка белка саркомера. Например, Lifeact используется для маркировки нитевидных актинов (F-актина) для измерения саркомерного движения15,16. Генетически модифицированные iPS-клетки являются еще одним вариантом маркировки саркомерных белков (например, α-актинина [ACTN2] и миомезина-2 [MYOM2]) флуоресцентным белком17,18,19.

В этой статье мы описываем, как выполнить покадровую визуализацию для измерения укорочения саркомера с использованием Myom2-TagRFP (эмбриональные стволовые клетки мыши [ES]) и ACTN2-mCherry (человеческие iPS-клетки). Мы также показываем, что узорчатая культура облегчает выравнивание саркомера. Кроме того, мы описываем альтернативный метод маркировки саркомера с использованием аденоациациированных вирусов (AAV), который может быть широко применен к iPS-клеткам, полученным от пациента.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Дифференцировка плюрипотентных стволовых клеток мышей

  1. Обслуживание ES ячеек мыши
    1. Поддерживающая среда: Смешайте 50 мл фетальной бычий сыворотки (FBS), 5 мл L-аланин-L-глутамина, 5 мл незамененной аминокислоты (NEAA), 5 мл 100 мМ пирувата натрия и 909 мкл 55 мМ 2-меркаптоэтанола с 450 мл минимальной незаменимой среды Глазго (GMEM). Дополняйте фактор ингибирования лейкемии (LIF), CHIR-99021 и PD0325901 в конечной концентрации 1000 Ед/мл, 1 мкМ и 3 мкМ соответственно. Стерилизуйте среду через фильтр 0,22 мкм.
    2. Среда FBS: смешайте 55 мл FBS, 5,5 мл L-аланина-L-глутамина, 5,5 мл пирувата натрия и 5,5 мл NEAA до 500 мл высокой глюкозы Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM). Фильтруйте среду через фильтр 0,22 мкм для стерилизации.
    3. Культура SMM18 мыши ES клеток, в которых TagRFP был выбит в локус Myom2 на желатинизированной 6 см посуде в поддерживающей среде, как описаноранее 18. Прохождение каждые 2-3 дня.
  2. Получение безывороточной дифференцировочной среды (SFD)
    1. Базальный SFD: смешайте 250 мл F-12 Хамса, 750 мл модифицированной среды Dulbecco (IMDM), 10 мл добавки B27 без витамина A, 5 мл добавки N2, 10 мл L-аланина-L-глутамина, 5 мл 10% бычих сывороточных альбуминов в фосфатно-буферном физиологическом растворе (PBS) и 10 мл пенициллина и стрептомицина (10 000 ЕД / мл). Фильтровать через ситечко 0,22 мкм для стерилизации.
    2. Растворить аскорбиновую кислоту в 5 мг/мл в дистиллированной воде и процедить через ситечко 0,22 мкм для стерилизации.
    3. Развести 13 мкл 1-тиоглицерина до 1 мл ИМДМ. Здесь относятся к этому разбавленный 1-тиоглицерин как MTG.
    4. Добавьте 10 мкл аскорбиновой кислоты (5 мг/мл) и 3 мкл МТГ к 1 мл базального СФД в день использования. В данном описании эта смесь называется полным SFD.
  3. День 0, формирование эмбриоидного тела (EB) для дифференцировки
    1. Соберите ES-клетки SMM18 мыши с рекомбинантной трипсин-подобной протеазой (rTrypsin) и подсчитайте клетки.
    2. Центрифуга 5 х 105 клеток при 300 х г в течение 3 мин при 4 °C, повторно суспендировать в 10 мл полного SFD и посеять в 10-сантиметровую чашку Петри. Культивьяйте клетки при 37 °C и 5% CO2 в течение 50 ч.
  4. Дифференциация день 2
    1. Добавьте активин А, фактор роста эндотелия сосудов человека (hVEGF) и костный морфогенетический белок 4 (BMP4) для полного SFD в конечной концентрации 5 нг / мл, 5 нг / мл и 1,9 нг / мл соответственно.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Концентрации БМП4 могут различаться в зависимости от партии БМП4. Протестируйте несколько концентраций в небольшом исследовании перед использованием новой партии и определите лучшую концентрацию для сердечной дифференцировки.
    2. Переложите ЭБ из чашки Петри в трубку 15 мл и центрифугу при 50-100 х г в течение 3 мин при 4 °C.
    3. Тем временем добавьте среду, приготовленную на этапе 1.4.1, в чашку Петри, чтобы защитить оставшиеся ЭБ, будучи сухими.
    4. Аспирировать супернатант из трубки 15 мл, повторно суспендировать ЭБ со средой в чашке Петри и перенести раствор EB обратно в чашку. Затем культивируют ЭБ при 37 °C и 5% CO2 в течение 46 ч.
  5. Дифференциация день 4
    1. Желатинизируйте 10 см тканевую культуру блюда с 5-10 мл 0,1% желатина в течение не менее 5 минут. Аспират желатина непосредственно перед посевом клеток.
    2. Приготовление среды: Смешайте основной фактор роста фибробластов (bFGF), FGF10 и hVEGF для получения конечных концентраций SFD при 5 нг/мл, 25 нг/мл и 5 нг/мл соответственно. Для блюда 10 см приготовить 10 мл.
    3. Перенесите клетки из чашки Петри в трубку 15 мл. Добавьте 5 мл PBS в чашку Петри, вымойте несколько раз и переложите в 15-мл трубку, чтобы собрать оставшиеся клетки. Центрифуга при 50-100 х г, 4 °C, 3 мин.
    4. Аспират супернатант, добавляют 1 мл rTrypsin и инкубируют при 37 °C в течение 3 мин.
    5. Вихрь ненадолго, чтобы диссоциировать ЭБ, добавить 9 мл 10% среды FBS, снова вихрь и подсчитать клетки.
    6. Центрифуга 1,5 х 107 клеток при 300 х г, 4 °С в течение 3 мин, повторно суспендируют со средой, приготовленной на этапе 1.4.2, и высевают в желатинизированную посуду. Инкубировать при 37 °C и 5% CO2 в течение 2 дней.
      ПРИМЕЧАНИЕ: К 7 или 8 дню можно наблюдать обширное биение PSC-CMs.
  6. Подбор препарата на 7 и 9 день дифференцировки: Повторное заполнение среды пуромицином (2 мкг/мл в конечной концентрации) для устранения некримиоцитов на 7 и 9 день дифференцировки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Родительской линией SMM18 является syNP4 мышиные ES-клетки, в удерживающие промоторный ген NCX1, устойчивый к пуромицину20.
  7. День 10, перекладывать для будущих экспериментов
    1. Покрыть стеклянную культурную пластину или 35-миллиметровую тарелку для визуализации, содержащую полимерный покровный лист, 0,1% желатина. Для усиления созревания покрываем посуду фрагментом ламинина-511 Е8 (LN511-E8) по 1 мкг/см2 в течение 30-60 мин при комнатной температуре18. Для культивирования PSC-CMs по конкретным шаблонам, представляющим интерес, пожалуйста, обратитесь к шагам 4 и 5 для приготовления штампов полидиметилсилоксана (PDMS).
    2. Чтобы собрать урожай SMM18 PSC-CMs, дважды вымойте посуду PBS, нанесите 1 мл rTrypsin и инкубировать 3 мин при 37 °C.
    3. Соберите клетки в 9 мл 10% среды FBS, приостановите и подсчитайте клетки. Размещайте ячейки на 50 000-100 000 клеток в одной скважине из 24-скважинной пластины или 250 000-500 000 клеток в 35-миллиметровой тарелке для визуализации.
    4. Центрифугируют достаточное количество клеток (300 х г, 3 мин) и повторно суспендируют клетки полным СФД, дополненным ФБС (конечная концентрация в 10%).
    5. Инкубируют на ночь и меняют культурную среду до полного СФД с пуромицином.
    6. С 14-го дня меняйте культурную среду два-три раза в неделю с полным СФД до 21-28 дня, когда Myom2-RFP становится заметным. Для трансдукции на основе AAV флуоресцентных помеченных саркомерных белков, пожалуйста, обратитесь к Шагу 3.

2. Дифференцировка плюрипотентных стволовых клеток человека

  1. Подготовка дифференцированных сред
    1. RPMI+B27-Ins: смешайте 500 мл среды RPMI 1640, 10 мл B27 минус инсулин и 5,25 мл L-аланина-L-глутамина.
    2. RPMI+B27+Ins: смешайте 500 мл RPMI, 10 мл добавки B27 и 5,25 мл L-аланина-L-глутамина.
  2. Поддержание iPS-клеток человека
    1. Прохождение человеческих iPS-клеток два раза в неделю с AK02N на LN511-E8 по ранее опубликованному методу с некоторыми модификациями21.
    2. Соберите клетки с помощью 3-минутной обработки rTrypsin и соберите в 10% среду FBS. Подсчитайте ячейки и центрифугу при 300 х г в течение 3 мин при 4 °C. Посеять 75 000-125 000 клеток в одной скважине из 6 пластин с 2 мл AK02N, дополненных LN511-E8 и Y27632 в конечной концентрации0,5 мкг/мл (0,1 мкг/см2) и 10 мкМ соответственно.
    3. Инкубировать при 37 °C и 5% CO2 и заменить среду на следующий день 2 мл AK02N без каких-либо добавок. Меняйте носитель каждые два-три дня и проходите каждые три-четыре дня.
  3. День -4: перекладывание перед дифференциацией
    1. Покрыть 6-скважинную пластину 0,5 мкг/см2 LN511-E8, разбавленной в PBS. Затем инкубируют в течение не менее 30 мин при 37°С и 5% СО2 или 1 ч при комнатной температуре. Раствор для покрытия аспирата непосредственно перед посевом клеток.
    2. Соберите человеческие iPS-клетки с помощью rTrypsin и подсчитайте клетки, как на шаге 2.2.2.
    3. Центрифуга 1,25 х 105 ячеек для скважины из 6-й пластины при 300 х г в течение 3 мин при 4 °С и повторное суспендование в 2 мл АК02Н с добавлением LN511-E8 (конечная концентрация 0,5 мкг/мл или 0,1 мкг/см2) и Y27632 (конечная концентрация 10 мкМ) на скважину.
    4. Аспиратное покрытие раствора, семена повторно суспендируют клетки в покрытую пластину и инкубируют при 37 °C и 5% CO2.
  4. Дни -3 и -1: заменить средний на 2 мл АК02Н.
  5. День 0: Замените среду 2 мл RPMI+B27-Ins, дополненными CHIR99021 (конечная концентрация 6 мкМ) на скважину, чтобы начать дифференциацию.
  6. День 2: Заменить среду 2 мл RPMI+B27-Ins на WntC59 (конечная концентрация 2 мкМ) на скважину.
  7. День 4: Замените среду 2 мл RPMI+B27-Ins на скважину.
  8. День 7 и день 9: заменить среду 2 мл RPMI+B27+Ins на пуромицин (конечная концентрация 10 мкг/мл) на скважину для селективного культивирования PSC-CMs.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Линия ACTN2-mCherry, используемая в этом исследовании, имеет кассету внутреннего рибосомального входа (IRES), пуромицин-резистентный ген, вставленный в 3'-нетранслированную область (UTR) локуса TNNT2, и mCherry, заменяющий стоп-кодон ACTN2. Чтобы очистить кардиомиоциты без стука, пожалуйста, обратитесь к шагам 3 и 4.
  9. День 10: перекладывать для будущих экспериментов
    1. Покрыть 35-миллиметровую тарелку для визуализации полимерным чехловым слипом с 0,5-1 мкг/см2 LN511-E8, разведенным в 0,1% желатина. Инкубировать 2-4 ч при комнатной температуре для длительной жизнеспособности. Чтобы культивировать PSC-CMs по желаемым образцам, обратитесь к шагам 4 и 5 для подготовки штампов PDMS.
    2. Чтобы собрать у человека PSC-CMs, дважды вымойте посуду PBS, нанесите 1 мл rTrypsin на скважину и инкубировать 3 мин при 37 °C.
    3. Соберите клетки в 4 мл 10% среды FBS, приостановите и подсчитайте клетки. Пластина 250 000-500 000 клеток на 35 мм тарелку для визуализации.
    4. Центрифугируют достаточное количество клеток при 300 х г в течение 3 мин при 4 °C, повторно суспендируют RPMI+B27+Ins с пуромицином (10 мкг/мл) и пластину на покрытой 35 мм пластине для визуализации.
    5. Инкубировать на ночь. На следующее утро замените питательную среду rpmI+B27+Ins на пуромицин (10 мкг/мл).
    6. С 14-го дня меняйте культурную среду 2-3 раза в неделю с RPMI+B27+Ins до 21-28 дня для визуализации. Для трансдукции на основе AAV флуоресцентных помеченных саркомерных белков, пожалуйста, обратитесь к Шагу 3.

3. Флуоресцентная маркировка саркомер с использованием аденоациациированных вирусов

  1. Подготовка перед производством ААВ
    1. Поддерживать клетки HEK293T в DMEM с добавлением FBS (конечная концентрация 10%) на 10 см тканевой культурной пластине. Прохождение клеток три раза в неделю.
    2. Готовят полиэтиленимин (PEI) в 1 мг/мл. Смешать 50 мг полиэтиленимина MAX 40000 и 40 мл сверхчистой воды. Отрегулируйте pH до 7,0 с помощью 1 N NaOH. Затем сделайте конечный объем до 50 мл сверхчистой водой и процедите через сетчатый фильтр 0,22 мкм.
    3. Подготовьте челночный вектор с геном маркировки саркомера (например, TCAP или PDLIM3, слитым с зеленым флуоресцентным белком [GFP]), управляемым кардиомиоцит-специфическим промотором, таким как сердечный тропонин T (cTNT)22.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для этого случая мы использовали мономерный усиленный GFP с мутациями V163A, S202T, L221V23.
  2. День 0, прохождение HEK клеток
    1. Когда клетки достигают слияния, проходя 2,0 х 107 клеток HEK293T в 15 см тканевую культурную пластину с 20 мл DMEM с 10% FBS.
  3. День 1, трансфекция
    1. Смешайте 13,5 мкг челночного вектора, 26 мкг pHelper (вектор, кодирующий E2A, E4 и VA аденовируса), 16,5 мкг pRC6 (вектор, кодирующий гены AAV2 Rep и AAV6 Cap) и 1 мл DMEM без пирувата натрия (DMEM-Pyr).
    2. Смешайте 224 мкл PEI (1 мг/мл, приготовленный на этапе 3.1.2) и 776 мкл DMEM-Pyr.
    3. Смешайте и инкубируют плазмидный раствор и раствор ПЭИ при комнатной температуре в течение 30 мин.
    4. Добавьте раствор плазмиды/PEI к клеткам HEK293T, приготовленным на этапе 3.2.
  4. День 2, среднее изменение
    1. Через 24 ч после трансфекции меняют среду на DMEM-Pyr. Культивирование клеток до сбора AAV на 7 день. AAV будет выпущен в культурные среды.
  5. День 7, Сбор, концентрация и замена буфера AAV с использованием метода минимальной очистки24
    1. Инкубировать центробежную ультрафильтрационную установку (100k molecular weight cut-off [MWCO]) с 5 мл 1% BSA в PBS при комнатной температуре в течение 15 мин. Затем центрифугируют установку ультрафильтрации при 500 х г в течение 2 мин и аспирируют как отфильтрованные, так и оставшиеся растворы.
    2. Перенесите среду с 15-сантиметровой тарелки, на которую был изготовлен AAV, на новую коническую трубку и центрифугу 50 мл (500 x g, 5 мин). Отфильтруйте супернатант через сетчатый фильтр 0,45 мкм для удаления остатков клеток и нанесите суспензию на установку ультрафильтрации.
    3. Центрифугу при 2000 х г в течение 90 мин или до концентрирования культуры супернатанта 0,5 - 1 мл.
    4. Аспирировать фильтрат и нанести 15 мл PBS на ультрафильтрационную установку.
    5. Центрифугирование повторяют до тех пор, пока концентрат не станет 0,5-1 мл.
    6. Повторите 3.5.4 и 3.5.5.
    7. Переложите концентрированный AAV в новую трубку 1,5 мл и храните при 4 °C или -20 °C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: AAV можно использовать на объектах P1, но следовать местным правилам и положениям. AAV также может быть получен обычными методами.
  6. Расчет титра AAV
    1. Смешайте 5 мкл AAV, 195 мкл DMEM-Pyr и 10 ЕД бензоназы и инкубировать при 37 °C в течение 1 ч.
    2. Добавьте 200 мкл буфера протеиназы K (0,02 M Tris HCl и 1% SDS) и 5 мкл протеиназы K (20 мг/мл) и инкубируют при 37 °C в течение 1 ч.
    3. Тщательно приготовьте 400 мкл раствора фенола/хлороформа/изоамилового спирта 25:24:1, вихрь в течение 1 мин и центрифугу при 20 000 х г в течение 1 мин.
    4. Перенесите 200 мкл водной фазы в новую трубку 1,5 мл, которая даст примерно половину исходных геномов AAV.
    5. Добавьте 1 мкл гликогена (20 мг/мл) к 20 мкл 3 M CH3COONa (рН 5,2) и вихря. Добавьте 250 мкл 2-пропанола к 100 мкл 100% этанола и снова вихрь.
    6. Инкубировать при -80 °C в течение 15 мин. Затем центрифугу при 20 000 х г в течение 30 мин при 4 °C.
    7. Аспирировать супернатант и добавить 70% этанола в пробирку. Затем центрифугу при 20 000 х г, 4 °C в течение 5 мин.
    8. Аспирировать супернатант и сушить на воздухе до тех пор, пока гранула не станет прозрачной.
    9. Добавьте 200 мкл трис-этилендиаминтетрауксусной кислоты (TE; рН 8,0) для разрешения геномов AAV. Затем разбавьте образец в 100 раз ТЕ.
    10. Подготовьте стандарт с pAAV-CMV-Vector при 6,5 нг/мкл с TE для получения 109 векторных геномов (vg)/мкл. Затем делают серию 10-кратного разведения от 104 до 108 с ТЭ.
    11. Смешайте 1 мкл образца ДНК (или эталонов), 0,4 мкл праймеров (5 мкМ), 3,6 мкл дистиллированной воды и 5 мкл мастер-микса SYBR Green. Грунтовки, расположенные на ITR, 5′-GGAACCCCTAGTGATGGAGTT-3′ и 5′-CGGCCTCAGTGAGCGA-3′.
    12. Выполняйте ПЦР в режиме реального времени со следующим условием: начальная денатура при 95 °C в течение 60 с, 40 циклов денатурирования при 95 °C в течение 15 с, а также отжиг и удлинение при 60 °C в течение 30 с последующей кривой плавления.
    13. Основываясь на стандартах и значениях Ct, аппарат ПЦР в режиме реального времени обеспечивает число копий векторного генома в 1 мкл образца. Рассчитайте исходный титр AAV, используя следующее уравнение: число копий, предоставляемое ПЦР в реальном времени (vg/μL) x 8 x 103 x 2, где 8 x 103 в качестве разбавляемого фактора во время выделения генома AAV и 2 в качестве разностного фактора AAV (одноцепочечный) и плазмиды (двухцепочечный).
  7. Трансдукция в PSC-CMs
    1. Считайте PSC-CMs в дополнительном колодце или дополнительном блюде.
    2. Разбавьте AAV (1 x 104 до 1 x 106 vg/ячейка) до 50 мкл с PBS. Применяют AAV при кратности инфекции (MOI) от 1 х 10 4 до1 х 106 vg/клетка к PSC-CMs и культивируют PSC-CMs в течение 3 дней с AAV в соответствующих дифференцированных средах для мыши и человека PSC-CMs, затем меняют среду на культуральную среду без AAV.
    3. Используйте PSC-CMs для визуализации живых клеток через 7 дней или более после трансдукции.

4. [Опционально] Очистка PSC-CMs на основе AAV

  1. Подготовка ААВ
    1. Приготовьте AAV, как описано в Шаге 3, используя челночный вектор, экспрессирующий бластицидин-резистентный ген под контролем промотора cTNT.
  2. Трансдукция к дифференцированным iPS-клеткам
    1. Дифференцируйте человеческие iPS-клетки в течение 4 дней в соответствии с протоколом, описанным в шаге 2, и подсчитайте количество клеток в дополнительном колодец.
    2. После изменения среды на 4-й день примените AAVs в MOI 1 x 105 vg/ячейку для дифференцирования PSC в средах RPMI+B27-Ins.
    3. На 7-й день обновите среду RPMI+B27+Ins и добавьте 2,5-10 мкг/мл бластицидина.
    4. На 10-й день PSC-CMs готовы к перекладке.

5. Подготовка штампов PDMS

  1. Спроектируйте рисунок устройства из полос 200 мкм вместе с канавками 10-25 мкм между полосами с помощью программного обеспечения для рисования автоматизированного проектирования (CAD).
  2. Нарисуйте рисунок устройств на хромированной фотомаске, покрытой AZP1350, используя ультрафиолетовый свет инструмента литографии без маски.
  3. Разработайте рисунок на фотомаске в серии положительных фоторезистов (например, хромовый травилка) и промойте водой DI.
  4. Обезвоживать кремниевую пластину на конфорке при 120 °C в течение 15 мин.
  5. Дайте пластине остыть до комнатной температуры и отспилите негативное фоторезист СУ-8 3010, чтобы сделать высоту 10-20 мкм с 1500 об/мин в течение 30 с помощью спин-коатера.
  6. Мягко запекайте в два этапа на конфорке согласно протоколу производителя.
  7. После того, как пластина остынет до комнатной температуры, загрузите пластину на выравниватель маски.
  8. Используйте выравнивание маски, чтобы выровнять маску на пластине и подвергнуть пластину воздействию ультрафиолетового излучения.
  9. Проведите постэкспозиционное выпекание к пластине в два этапа на конфорке согласно протоколу производителя.
  10. Разрабатываем пластину в серии СУ-8 разработчика и 2-Пропанола, затем сушим пластину струей азота.
  11. Переложите в чашку Петри подходящего размера.
  12. Смешайте эластомер PDMS и его отверждающее средство в соотношении 10:1 w/w и перелейте смесь в чашку Петри.
  13. Дегазируйте PDMS в адсорбаторе до тех пор, пока все пузырьки воздуха не исчезнут, затем отвержите PDMS на конфорке при 80 °C в течение 2 ч.
  14. Отклейте отвержденный PDMS от основной формы с помощью пинцетка, затем вырежьте часть с конструкцией, чтобы она была штампом PDMS.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Форма может быть квадратной, однако восьмиугольная форма лучше передает узор по краю.

6. Узорчатая культура кардиомиоцитов, полученных из плюрипотентных стволовых клеток

  1. Удалите пыль с поверхности штампов PDMS с помощью починочной ленты.
  2. Погрузьте штампы в 70% этанол для стерилизации. Затем выдуйте этанол с поверхности штампов с помощью воздушного пылесосы.
  3. Нанесите 5-10 мкл 0,5 мас.% 2-метанрилоксиэтилфосфорилхолин (MPC) полимера/этанола на поверхность марок PDMS.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Неравномерное распределение полимера MPC может привести к нарушению рисунка.
  4. Инкубировать 10-30 мин до полного высыхания полимера MPC.
  5. Поместите штампы в контакт с крышками пластины для культивовки со стеклянным дном или 35-миллиметровой тарелки для визуализации с полимерным чехловым слипом и наденьте вес (например, батарею ААА) на штамп в течение 10 минут.
  6. Снимите вес и штампы. Затем подтвердите, что рисунок был передан под микроскопом.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Штампованные тарелки/посуда могут храниться до 1 недели при комнатной температуре.
  7. Дважды вымойте штампованные колодцы/посуду PBS.
  8. Разбавить LN511-E8 PBS при 2-4 мкг/мл и покрыть блюдо LN511-E8 при 0,5-1мкг/см2. Для человека PSC-CMs разбавьте LN511-E8 0,1% раствором желатина вместо PBS. Затем инкубируют не менее 1 ч (оптимально, более 4 ч).
  9. Пластинчатые ячейки, как описано в предыдущих разделах.

7. Покадровая визуализация саркомер под флуоресцентным микроскопом

  1. Включите и подключите микроскоп, связанный компьютер, а также все необходимые периферийные устройства.
  2. Для выполнения покадровой съемки захватывайте покадровые изображения с наибольшим увеличением (объектив 100X с масляным выступом).
  3. Выберите условия визуализации в реальном времени. Чтобы получить хорошие репрезентативные данные, попробуйте настроиться на самую высокую частоту кадров (рекомендуется минимум 20 мс или 50 кадров в секунду). Установите затвор открытым и примените необходимое биннинг (4 X 4) и обрезку области сбора для достижения кратчайших интервалов между изображениями во время покадрового изображения.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Настройка может варьироваться в зависимости от конфигурации микроскопов. Камера должна быть высокочувствительной и способна передавать данные на подключенный ПК достаточно быстро. Для этого мы использовали вспышку ORCA с Camera-link. Мы протестировали вращающуюся конфокальную микроскопию и получили изображения со скоростью 400 кадров в секунду.
    1. [Необязательно] Если скорость биения клеток низкая, вызвате клетки стимуляцией электрического поля.
  4. Запуск покадровой записи
    1. Убедитесь, что изображенные поля остаются в фокусе во время записи покадрового изображения.
    2. Сохраните покадровые изображения в соответствующую папку.

8. Анализ покадровой съемки с помощью плагина ImageJ/Fiji SarcOptiM

  1. Загрузите серию покадровых изображений в ImageJ. Для формата Olympus VSI открывайте файлы с помощью плагина OlympusViewer.
  2. Отрегулируйте яркость и контрастность изображения, чтобы четко наблюдать саркомерную картину (Image | Отрегулируйте | Яркость/Контрастность).
  3. Откройте SarcOptiM, щелкнув меню Дополнительные инструменты (>>) и выбрав SarcOptiM.
  4. Откалибруйте программу, нажав Ctrl + Shift + P и кнопку 1 мкм на панели инструментов и следуя инструкциям диалоговых окон.
  5. Провести линию через область саркомера, которая будет использоваться для измерения укорочения саркомера.
  6. Начните анализ сокращения саркомера, нажав SingleCell (AVI) на панели инструментов. Репрезентативные данные показаны на рисунках 1 и 2.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Измерение укорочения саркомера с помощью выбивающихся репортерных линий PSC-CMs. Меченые саркомером PSC-CMs использовались для измерения укорочения саркомера. Линии выражают Myom2-RFP и ACTN2-mCherry из эндогенных локусов. TagRFP был вставлен в Myom2,кодируя M-белки, которые локализуются на M-линии, в то время как mCherry был введен в ACTN2,кодируя α-актинин, который локализуется на Z-линии18,25. Покадровые изображения были получены и использованы для определения укорочения саркомера, как показано на рисунках 1 и 2 и в фильме 1-3.

Чтобы преодолеть неорганизованный саркомер PSC-CMs, специальные штампы PDMS были использованы для культивировании PSC-CMs в полосатом рисунке. Эта узорчатая культура способствовала вытянутой форме клеток и более организованному саркомеру по сравнению с клетками, культивируемыми в необразообразнойобласти (рисунки 2B и 2C). Благодаря этому преимуществу узорчатая культура способствовала лучшему сокращению клеток и обеспечивала гладкий профиль длины саркомера, как показано в фильмах 2 и 3 и на рисунке 2D.

Флуоресцентная маркировка белка Z-line с использованием векторов AAV. Чтобы визуализировать Z-линию PSC-CMs без генерации iPS-клеток, флуоресцентно-помеченные белки Z-line были экспрессированы с использованием трансдукции AAV. Два небольших белка Z-линии, телетонин (TCAP) и актин-ассоциированный LIM-белок (PDLIM3) с GFP, были помечены и упакованы с использованием капсида AAV6(рисунок 3A). После того, как PSC-CMs были дифференцированы и очищены, AAV были трансдуцированы в PSC-CMs(рисунок 3B). Трансдуцированные PSC-CMs выражали саркомерические сигналы GFP вдоль PSC-CMs уже через три дня после трансдукции(рисунки 3C и 3D). Как правило, трансдукция AAV при MOI 105 vg/клетка достаточна для визуализации флуоресцентно-помеченных саркомерных белков, и более высокий титр может вызвать неспецифическую локализацию GFP в цитоплазме, хотя это увеличивает общую интенсивность GFP.

Очистка PSC-КМ с использованием векторов AAV. Современные методы основаны на кассете выбора лекарств, которая уже находится в геноме PSC-CMs, либо трансгенной, либо в линии нокдауна. Тем не менее, производство такой линии из iPS-клеток, полученных от пациента, является трудоемким. Поскольку было продемонстрировано, что векторы AAV управляют экспрессией флуоресцентно-меченых белков Z-line без необходимости нокдауна, мы стремились установить метод очистки без нок-ина(рисунок 4). С этой целью был построен новый вектор AAV, кодирующий бластицидин-резистентный ген под контролем промотора cTNT(рисунок 4A). AAV (MOI 105 vg/cell) трансдуцировался к дифференцированным iPS-клеткам человека на 4-й день. Затем клетки обрабатывали 2,5-10 мкг/мл бластицидина (необходимо титровать для каждой клеточной линии) между 7 и 9 днями(рисунок 4B). На 14 день чистота PSC-CMs составляла более 90%(Рисунок 4С).

Figure 1
Рисунок 1:Саркомерное укорочение мышиных PSC-CMs, полученных из клеточной линии Myom2-TagRFP. А. Временная шкала для дифференциации PSC-CM мыши. В. Репрезентативные изображения для укорочения саркомера в разных временных точках с областями измерения, обозначенными желтыми полосами. Шкала шкалы = 10 мкм. С. Профиль длины саркомера при сокращении кардиомиоцитов, которое стимулировалось электричеством при 1 Гц. Частота кадров составляла 50 кадров в секунду. Размер пикселя составил 0,26 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 2
Рисунок 2:Репрезентативные данные, показывающие укорочение саркомера человеческих PSC-CMs, полученных из клеточной линии ACTN2-mCherry в нешарном и узорчатом культивировании. А. Временная шкала дифференциации PSC-CM человека. В. Кардиомиоциты, культивируемые в немодных культурах, демонстрируют дезорганизованные саркомерные паттерны (B), в то время как узорчатые культуры способствуют хорошему выравниванию саркомера (C). Измерение областей представлено желтыми полосами. Д. Соответствующие саркомерные профили длины, полученные при сокращении ячейки, индуцируются электрической стимуляцией при частоте кадров 0,5 Гц и частоте кадров 100 кадров в секунду. Размер пикселя = 0,26 мкм, шкала = 10 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 3
Рисунок 3:Мышиные PSC-CMs после трансдукции AAV в течение 3 дней. А. Схематическая векторная карта AAV для маркировки саркомера. Саркомерный белок (ген, представляющий интерес, GOI) связан с GFP с линкером Gly-Gly-Gly-Ser (L) и экспрессируется под контролем промотора сердечного тропонина T (cTNT). В. Временная шкала для дифференциации PSC-CM мыши и трансдукции AAV. С. и Д. Репрезентативные изображения, показывающие четкую локализацию саркомера и соответствующий профиль длины саркомера TCAP-GFP (C) и PDLIM3-GFP (D) после 3 дней трансдукции в PSC-CMs, генерируемые клеточной линией Myom2-TagRFP. Шкала шкалы = 10 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 4
Рисунок 4:Очистка бластицидина человеческими PSC-CMs без подделки. 
А. Схематическая векторная карта AAV, в которой кассета гена бластицидин-резистентности (BSR) вставляется вниз по потоку к промотору cTNT. В. Временная шкала дифференциации, трансдукции и селекции бластицидина у человека. С. Репрезентативные данные, показывающие процентное содержание клеток cTNT + в PSC-CMs человека (трансдуцированные10 5 vg/cell AAV6 на 4-й день, затем обработанные 2,5 мкг/мл бластицидином в дни 7 и 9). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Фильм 1: Флуоресцентное покадровое видео мыши PSC-CMs, сгенерированное из клеточной линии Myom2-TagRFP. Сигналы RFP показали саркомерную картину после культуры PSC-CM в течение 28 дней. Клетки показали синхронное биение при стимуляции электричеством при 1 Гц. Покадровые снимки были получены каждые 20 мс с помощью объектива 100X. Шкала бар = 5 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот фильм.

Фильм 2: Флуоресцентное покадровое видео человеческих PSC-CMs с ACTN2-mCherry, культивируемых на блюде без шаблона. PSC-CMs, экспрессирующие ACTN2-mCherry на блюде без узорчатой культуры, не только показали дезорганизацию саркомера, но и представляли собой колебание сокращения, для которого трудно определить укорочение саркомера. Клетки стимулировали электричеством при 0,5 Гц и получали изображения каждые 10 мс с помощью объектива 100X. Шкала шкалы = 10 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот фильм.

Фильм 3: Флуоресцентное покадровое видео человеческих PSC-CMs с ACTN2-mCherry, культивируемых на узорчатом блюде культуры. Узорчатая культура способствовала выравниванию саркомера и заставляла клетки формировать форму стержня. Этот метод позволил легче определить укорочение саркомера в PSC-КМ. Видео было получено путем стимуляции ячеек электричеством на частоте 0,5 Гц. Частота кадров составляла 100 кадров в секунду. Шкала шкалы = 10 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот фильм.

Дополнительные файлы САПР. CAD файлы для создания штампов с полосами шириной 200 мкм и канавками 10 мкм (Stamp_200x10.dxf), 25 мкм (Stamp_200x25.dxf) и 50 мкм (Stamp_200x50.dxf). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

PSC-CMs имеют большой потенциал для использования в качестве платформы in vitro для моделирования сердечных заболеваний и тестирования эффектов лекарств. Тем не менее, сначала необходимо разработать точный, унифицированный метод оценки функций PSC-CMs. Большинство функциональных тестов работают с PSC-CM, например, электрофизиология, переходный кальций и метаболизм26,и одно из первых исследований PSC-CM, полученных от пациента, было посвящено синдрому длинного QT27. Однако сократимость, одну из важнейших функций кардиомиоцита, все еще трудно оценить. При взрослых кардиомиоцитах широко применяется укорочение саркомера. Напротив, из-за недостаточно развитого и дезорганизованного саркомера PSC-CMs стандартный метод укорочения саркомера не работает с этими клетками. Поэтому мы представили альтернативный метод изучения укорочения саркомера в PSC-CMs с использованием флуоресцентно-помеченных саркомерных белков. Как было показано, для этого подхода могут быть использованы белки, локализованные на M-линии (MYOM2) или Z-линии (ACTN2, TCAP и PDLIM3), слитые с флуоресцентными белками. Мы также показали, что флуоресцентно-помеченные белки могут быть экспрессированы из эндогенных локусов или AAVs. AAV обеспечивают большую гибкость для экспрессии флуоресцентных помеченных белков, чем эндогенные локусы, поскольку AAV могут быть применены к любому типу PSC-CMs, полученных от пациента. Напротив, экспрессия белков из эндогенных локусов может оказывать меньшее влияние на функцию саркомера, поскольку уровень экспрессии генов жестко регулируется и также может быть использован для мониторинга созревания PSC-CMs18.

Несмотря на то, что Myom2-TagRFP, ACTN2-mCherry и Lifeact использовались для изучения саркомера, укорочения16,18,19,до сих пор неясно, влияют ли эти белки на функцию саркомера. Недавно сообщалось, что Lifeact нарушает организацию актина и клеточную морфологию28. Также важно отметить, что паттерны слияния (т.е. сайт слияния GFP на N-члене или С-члене белка-мишени) также влияют на функцию саркомера29. Поэтому, прежде чем широко использоваться, важно тщательно оценить, влияют ли флуоресцентные помеченные белки саркомера на функцию саркомера и происходят ли белково-белковые взаимодействия в саркомерах in vitro, in vivoи / или во взрослых кардиомиоцитах. Этот репертуар флуоресцентных саркомерных белков обеспечивает хорошую отправную точку для будущих вариантов белковой инженерии (т. Е. Сокращение белков саркомера до только сигналов локализации). Выбор белков для пометки является еще одним ключом к успеху. Мы пометили другой белок Z-линии GFP, однако этот белок демонстрировал только цитоплазматическое распределение, а не локализовался в саркомере. Для живой визуализации стабильность белка также может играть роль, так как, например, если помеченный белок нестабилен, уровень сигнала будет ниже. Фотостабильность флуоресцентного белка также важна, так как нестабильные белковые сигналы будут легко гасять во время визуализации.

Для изучения сократимости PSC-КМ с использованием методов, отличных от описанных, могут быть использованы косвенные измерения силы, генерируемой PSC-CMs (например, микропостойные массивы, микроскопия тяговой силы) или движения (например, обнаружение движения с высоким разрешением с использованием SI8000)11,12,13,14. Наш метод может быть объединен с этими методами или с измерениями потенциала действия на основе красителя / преходящего кальция. Комбинаторный подход может предоставить дополнительную информацию о том, как заболевание вызывает дисфункцию в PSC-CMs, полученных от пациента.

Одна из проблем при укорочению саркомера в PSC-CMs заключается в том, чтобы найти хороший саркомер, который движется линейно, в противном случае клетки могут легко сойти с линии для обнаружения саркомера SarcOptiM и вызвать нестабильные результаты укорочения саркомера. Здесь мы демонстрируем, что использование узорчатой культуры, сгенерированной с помощью штампов PDMS, может обеспечить более стабильное и линейное саркомерное движение. Также известно, что узорчатая культура поддерживает созревание PSC-CMs16,что важно для функции саркомера.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

H.U. подал патент, связанный с этой рукописью.

Acknowledgments

Мы хотели бы поблагодарить всех членов лаборатории в отделе регенеративной медицины Медицинского университета Джичи за полезную дискуссию и техническую помощь. Это исследование было поддержано грантами Японского агентства медицинских исследований и разработок (AMED; JP18bm0704012 и JP20bm0804018), Японское общество содействия развитию науки (JSPS; JP19KK0219) и Японское общество циркуляции (грант на фундаментальные исследования) для H.U.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1-Thioglycerol Sigma-Aldrich M6145-25
2-Mercaptoethanol (55mM) Thermo Fisher Scientific 21985-023
2-methacryloyloxyethyl phosphorylcholine (MPC) polymer, NOF Corp. LIPIDURE-CM5206
2-Propanol Fujifilm wako 166-04836
35-mm imaging dish with a polymer coverslip (µ-Dish 35 mm, high) ibidi 81156
AAVproR Helper Free System (AAV6)
(vectors; pHelper, pRC6, pAAV-CMV-Vector)		 Takara 6651
ACTN2-mCherry (AR12, AR21) hiPSCs N.A. We inserted IRES-puromycin resistant casette to 3' UTR of TNNT2 locus and mCherry around the stop codon of ACTN2 in 610B1 hiPSC line, following a method describe elsewhere (Anzai, Methods Mol Biol, in press)
B-27 Supplement (50X), serum free Thermo Fisher Scientific 17504-044
B-27 Supplement, minus insulin Thermo Fisher Scientific A18956-01
B27 supplement (50X), minus Vitamin A Thermo Fisher Scientific 12587-010
Benzonase (25 U/µL) Merck Millipore 70746
Blasticidin S Hydrochloride Fujifilm wako 029-18701
BMP-4, Human, Recombinant, R&D Systems, Inc. 314-BP-010
Bovine Serum Albumin Sigma-Aldrich A4503-100g
C59, Wnt Antagonist (WntC59) abcam ab142216
CAD drawing software, Robert McNeel and Associates, WA, USA Rhinoceros 6.0
Centrifugal ultrafiltration unit (100k MWCO), Vivaspin-20 Sartorius VS2042
CHIR99021 Cayman 13122
Chromium etchant Nihon Kagaku Sangyo Co., Ltd., Japan N14B
Chromium mask coated with AZP1350 Clean Surface Technology Co., Japan CBL2506Bu-AZP
Dr. GenTLE Precipitation Carrier (20mg/mL Glycogen, 3 M Sodium Acetate (pH 5.2)) Takara 9094
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) - high glucose Sigma-Aldrich D6429-500
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) - high glucose, without sodium pyruvate Sigma-Aldrich D5796
Ethanol (99.5) Fujifilm wako 057-00456
Fetal Bovine Serum Moregate 59301104
FGF-10, Human, Recombinant, R&D Systems, Inc. 345-FG-025
Fibroblast Growth Factor(basic), human, recombinant Fujifilm wako 060-04543
Gelatin from porcine skin powder Sigma-Aldrich G1890-100g
Glasgow Minimum Essential Medium (GMEM) Sigma-Aldrich G5154-500
GLASS BOTTOM culture plates MatTek P24G-1.5-13-F/H
Ham’s F-12 Thermo Fisher Scientific 11765-062
Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) Thermo Fisher Scientific 12440-061
L-alanine-L-glutamine (GlutaMAX Supplement, 200mM) Thermo Fisher Scientific 35050-061
L(+)-Ascorbic Acid Sodium Salt Fujifilm wako 196-01252
Laminin-511 E8 fragment (LN511-E8, iMatrix-511) Nippi 892012
Mask aligner Union Optical Co., Ltd., Japan PEM-800
Maskless lithography tool NanoSystem Solutions, Inc., Japan D-Light DL-1000
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) Thermo Fisher Scientific 11140-050
Millex-HV Syringe Filter Unit, 0.45 µm, PVDF (0.45-µm filter) Merck Millipore SLHVR33RS
Myom2-RFP (SMM18) N.A. Developed in our previous paper (Chanthra, Sci Rep, 2020)
N-2 Supplement (100X) Thermo Fisher Scientific 17502-048
ORCA-Flash4.0 V3 digital CMOS camera Hamamatsu C13440-20CU
PD0325901 Stemgent 04-0006-10
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) Thermo Fisher Scientific 15140-122
Petri dish Sansei medical co. Ltd 01-004
Phenol/Chloroform/Isoamyl alcohol (25:24:1) Nippon Gene 311-90151
Polydimethylsiloxane (PDMS) elastomer Dow Corning Corp., MI, USA SILPOT 184
polyethylenimine MAX (MW. 40,000) Polyscience 24765-1
Positive photoresist developer Tokyo Ohka Kogyo Co., Ltd., Japan NMD-3
PowerUp SYBR Green Master Mix Thermo Fisher Scientific A25742
Proteinase K Takara 9034
Puromycin Dihydrochloride Fujifilm wako 166-23153
Recombinant Human/Mouse/Rat Activin A Protein R&D Systems, Inc. 338-AC-050
Recombinant trypsin-like protease (rTrypsin; TrypLE express) Thermo Fisher Scientific 12604-039
RPMI1640 Medium Thermo Fisher Scientific 11875-119
Silicon wafer Matsuzaki Seisakusyo Co., Ltd., Japan N.A.
Sodium Pyruvate (100 mM) Thermo Fisher Scientific 11360-070
Spin-coater Mikasa Co., Ltd., Japan MS-A100
Spininng confocal microscopy Oxford Instruments Andor Dragonfly Spinning Disk System
StemSure LIF, Mouse, recombinant, Solution (10^6U) Fujifilm wako 195-16053
SU-8 3010 Kayaku Advanced Materials, Inc., MA, USA SU-8 3010
SU-8 developer Kayaku Advanced Materials, Inc., MA, USA SU-8 developer
Tris-EDTA Nippon Gene 314-90021
Vascular Endothelial Growth Factor-A165(VEGF), Human, recombinant Fujifilm wako 226-01781

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Mensah, G. A., Roth, G. A., Fuster, V. The Global Burden of Cardiovascular Diseases and Risk Factors. Journal of the American College of Cardiology. 74 (20), 2529-2532 (2019).
  2. Wexler, R. K., Elton, T., Pleister, A., Feldman, D. Cardiomyopathy: an overview. American Family Physician. 79 (9), 778-784 (2009).
  3. Parrotta, E. I., Lucchino, V., Scaramuzzino, L., Scalise, S., Cuda, G. Modeling Cardiac Disease Mechanisms Using Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes: Progress, Promises and Challenges. International Journal of Molecular Sciences. , 30 (2020).
  4. Carvajal-Vergara, X., et al. Patient-specific induced pluripotent stem-cell-derived models of LEOPARD syndrome. Nature. 465 (7299), 808-812 (2010).
  5. Lan, F., et al. Abnormal calcium handling properties underlie familial hypertrophic cardiomyopathy pathology in patient-specific induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 12 (1), 101-113 (2013).
  6. Kim, C., et al. Studying arrhythmogenic right ventricular dysplasia with patient-specific iPSCs. Nature. 494 (7435), 105-110 (2013).
  7. Gramlich, M., et al. Antisense-mediated exon skipping: a therapeutic strategy for titin-based dilated cardiomyopathy. EMBO Molecular Medicine. 7 (5), 562-576 (2015).
  8. Wang, G., et al. Modeling the mitochondrial cardiomyopathy of Barth syndrome with induced pluripotent stem cell and heart-on-chip technologies. Nature Medicine. 20 (6), 616-623 (2014).
  9. Li, S., et al. Mitochondrial Dysfunctions Contribute to Hypertrophic Cardiomyopathy in Patient iPSC-Derived Cardiomyocytes with MT-RNR2 Mutation. Stem Cell Reports. 10 (3), 808-821 (2018).
  10. Cho, G. -S., et al. Neonatal Transplantation Confers Maturation of PSC-Derived Cardiomyocytes Conducive to Modeling Cardiomyopathy. Cell Reports. 18 (2), 571-582 (2017).
  11. Yang, X., et al. Tri-iodo-l-thyronine promotes the maturation of human cardiomyocytes-derived from induced pluripotent stem cells. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 72, 296-304 (2014).
  12. Ribeiro, A. J. S., et al. Multi-Imaging Method to Assay the Contractile Mechanical Output of Micropatterned Human iPSC-Derived Cardiac Myocytes. Circulation Research. 120 (10), 1572-1583 (2017).
  13. Sewanan, L. R., Campbell, S. G. Modelling sarcomeric cardiomyopathies with human cardiomyocytes derived from induced pluripotent stem cells. The Journal of Physiology. 598 (14), 2909-2922 (2020).
  14. Kopljar, I., et al. Chronic drug-induced effects on contractile motion properties and cardiac biomarkers in human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. British Journal of Pharmacology. 174 (21), 3766-3779 (2017).
  15. Riedl, J., et al. Lifeact: a versatile marker to visualize F-actin. Nature Methods. 5 (7), 605-607 (2008).
  16. Ribeiro, A. J. S., et al. Contractility of single cardiomyocytes differentiated from pluripotent stem cells depends on physiological shape and substrate stiffness. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (41), 12705-12710 (2015).
  17. Roberts, B., et al. Fluorescent Gene Tagging of Transcriptionally Silent Genes in hiPSCs. Stem Cell Reports. 12 (5), 1145-1158 (2019).
  18. Chanthra, N., et al. A Novel Fluorescent Reporter System Identifies Laminin-511/521 as Potent Regulators of Cardiomyocyte Maturation. Scientific Reports. 10 (1), 4249 (2020).
  19. Ribeiro, M. C., et al. A cardiomyocyte show of force: A fluorescent alpha-actinin reporter line sheds light on human cardiomyocyte contractility versus substrate stiffness. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 141, 54-64 (2020).
  20. Yamanaka, S., Zahanich, I., Wersto, R. P., Boheler, K. R. Enhanced Proliferation of Monolayer Cultures of Embryonic Stem (ES) Cell-Derived Cardiomyocytes Following Acute Loss of Retinoblastoma. PLoS ONE. 3 (12), 3896 (2008).
  21. Miyazaki, T., Isobe, T., Nakatsuji, N., Suemori, H. Efficient Adhesion Culture of Human Pluripotent Stem Cells Using Laminin Fragments in an Uncoated Manner. Scientific Reports. 7 (1), 41165 (2017).
  22. Prasad, K. -M. R., Xu, Y., Yang, Z., Acton, S. T., French, B. A. Robust cardiomyocyte-specific gene expression following systemic injection of AAV: in vivo gene delivery follows a Poisson distribution. Gene Therapy. 18 (1), 43-52 (2011).
  23. Arakawa, H., et al. Protein evolution by hypermutation and selection in the B cell line DT40. Nucleic Acids Research. 36 (1), e1 (2007).
  24. Konno, A., Hirai, H. Efficient whole brain transduction by systemic infusion of minimally purified AAV-PHP.eB. Journal of Neuroscience Methods. 346, 108914 (2020).
  25. Anzai, T., et al. Generation of Efficient Knock-in Mouse and Human Pluripotent Stem Cells Using CRISPR-Cas9. Methods of Molecular Biology. Yoshida, Y., et al. , (2020).
  26. Ahmed, R. E., Anzai, T., Chanthra, N., Uosaki, H. A Brief Review of Current Maturation Methods for Human Induced Pluripotent Stem Cells-Derived Cardiomyocytes. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 178 (2020).
  27. Moretti, A., et al. Patient-specific induced pluripotent stem-cell models for long-QT syndrome. The New England Journal of Medicine. 363 (15), 1397-1409 (2010).
  28. Flores, L. R., Keeling, M. C., Zhang, X., Sliogeryte, K., Gavara, N. Lifeact-GFP alters F-actin organization, cellular morphology and biophysical behaviour. Scientific Reports. 9 (1), 3241 (2019).
  29. Sparrow, A. J., et al. Measurement of Myofilament-Localized Calcium Dynamics in Adult Cardiomyocytes and the Effect of Hypertrophic Cardiomyopathy Mutations. Circulation Research. 124 (8), 1228-1239 (2019).

Tags

Медицина Выпуск 169 Плюрипотентные стволовые клетки кардиомиоциты укорочение саркомера живая визуализация флуоресцентные белки саркомера микроконтактная печать
Саркомерное укорочение кардиомиоцитов, полученных из плюрипотентных стволовых клеток, с использованием флуоресцентно-помеченных саркомерных белков.
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ahmed, R. E., Chanthra, N., Anzai,… More

Ahmed, R. E., Chanthra, N., Anzai, T., Koiwai, K., Murakami, T., Suzuki, H., Hanazono, Y., Uosaki, H. Sarcomere Shortening of Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes using Fluorescent-Tagged Sarcomere Proteins.. J. Vis. Exp. (169), e62129, doi:10.3791/62129 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter