Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Brug af GAL4-UAS System for Funktionel Genetik i Anopheles gambiae

Published: April 15, 2021 doi: 10.3791/62131
Automatic Translation
1, 1, 1,2,3, 1, 1, 1, 1
1Department of Vector Biology, Liverpool School of Tropical Medicine, 2IMBB FORTH, 3Department of Biology, University of Crete

Summary

Det tværpolitiske GAL4-UAS-system er et alsidigt værktøj til modifikation af genekspression på en kontrolleret spatiotemporal måde, som muliggør funktionel genetisk analyse i Anopheles gambiae. De procedurer, der er beskrevet for brug af dette system, er en semi-standardiseret kloningsstrategi, sexing og screening af pupper til fluorescerende proteinmarkører og embryofiksering.

Abstract

Det tværpolitiske GAL4-UAS-system er et alsidigt og kraftfuldt værktøj til funktionel genetisk analyse. Essensen af systemet er at krydse transgene 'driver' linjer, der udtrykker gær transskription faktor GAL4 på en vævsspecifik måde, med transgene 'responder' linjer bærer en kandidat gen / RNA interferens konstruktion, hvis udtryk er kontrolleret af Upstream Aktivering Sekvenser (UAS), der binder GAL4. I det efterfølgende afkom udtrykkes gen- eller lyddæmpningskonstruktionen således på en foreskrevet spatiotemporal måde, hvilket gør det muligt at analysere de resulterende fænotyper og udlede genfunktion. Det binære system muliggør fleksibilitet i eksperimentelle tilgange til at screene fænotyper genereret af transgene udtryk i flere vævsspecifikke mønstre, selv om alvorlige fitness omkostninger er induceret. Vi har tilpasset dette system til Anopheles gambiae, den vigtigste malaria vektor i Afrika.

I denne artikel leverer vi nogle af de fælles procedurer, der anvendes under GAL4-UAS-analyse. Vi beskriver an. gambiae GAL4-UAS linjer, der allerede er genereret, samt kloning af nye responder konstruktioner til upregulation og RNAi knockdown. Vi specificerer en trinvis vejledning til sexing af myg pupper til at etablere genetiske kors, der også omfatter screening afkom til at følge arv af fluorescerende genmarkører, der mærker føreren og responder indsættelser. Vi præsenterer også en protokol for rydning af an gambiae embryoner for at studere embryonal udvikling. Endelig introducerer vi potentielle tilpasninger af metoden til at generere driverlinjer gennem CRISPR/Cas9-indsættelse af GAL4 nedstrøms af målgener.

Introduction

Det tværpolitiske GAL4-UAS-system er arbejdshesten for funktionel karakterisering af gener i insektmodelorganismen Drosophila melanogaster1,2,3. For at bruge GAL4-UAS-systemet krydses transgene førerlinjer, der udtrykker gærtransskriptionsfaktoren GAL4 under kontrol af en lovgivningsmæssig sekvens, med responderlinjer, der bærer et interessegen eller RNA-interferens (RNAi) konstruktion kontrolleret af en Upstream Activation Sequence (UAS), der er anerkendt af GAL4. Afkommet af dette kors udtrykker transgene af interesse i en spatiotemporal mønster dikteret af promotor kontrollerende GAL4 udtryk (figur 1). Fænotyper, der vises af afkom af driver-responder kors kan vurderes at belyse funktionen af kandidat gener. Selvom D. melanogaster er blevet brugt til at undersøge gener fra andre organismer4,5,6,7, er GAL4-UAS-systemet nu blevet tilpasset til brug i insekter af medicinsk og landbrugsmæssig betydning for at give direkte analyse af interessearter 8,9,10,11,12,13,14.

I den afrikanske malaria myg, Anopheles gambiae, GAL4-UAS-systemet blev først testet af celle linje co-transfection9. Flere konstruktioner blev analyseret for effektivitet i forskellige parvis kombinationer og fandt, at 14 tandemly gentagne UAS suppleret med en lille kunstig intron (UAS-14i) viste det bredeste udvalg af aktiveringspotentiale, når de anvendes med et panel af GAL4 drivere. For at demonstrere in vivo-funktionalitet blev disse konstruktioner derefter brugt til at skabe to separate transgene An. gambiae linjer af PiggyBac transformation8: en førerlinje, der transporterer GAL4 drevet af en midgutspecifik promotor, og en responderlinje, der indeholder både luciferase og forbedrede gule fluorescerende protein (eYFP) gener under regulering af UAS-sekvenser. Tarmspecifik luciferaseaktivitet og fluorescens i afkommet indikerede, at systemet var effektivt i Anopheles. Siden da er der blevet oprettet driverlinjer, der udtrykker transgener i andet væv, der er vigtigt for vektorkapacitet og insekticidresistens, herunder oenocytter15 og hæmocytter16, og i et tæt på allestedsnærværende mønster10. Talrige UAS linjer er også blevet genereret til analyse gener menes at være involveret i stofskiftet og beslaglæggelse medieret insekticidresistens, cuticular kulbrinte syntese og fluorescerende tag forskellige celle-og vævstyper (tabel 1). For responder linjer, site-rettet integration af transgene er nu udført af ΦC31 katalyseret rekombination kassette udveksling17,18 at fastsætte den genomiske sammenhæng af UAS regulerede gener. På denne måde normaliseres transgene udtryk med hensyn til genomisk indsættelsessted, hvilket giver mulighed for en mere præcis sammenligning af de fænotypiske virkninger af forskellige kandidatgener.

De responder linjer skabt til dato er designet til enten at udtrykke transgene enten på forhøjede niveauer eller til at reducere genekspression gennem RNA interferens (RNAi). Normalt cDNA kloner er smeltet til UAS sekvens til at generere egnede udtryk plasmider, men fuld genomiske sekvenser er også muligt under forudsætning af, at de ikke er for store til kloning. For at generere lyddæmpningskonstruktioner har vi brugt tre forskellige metoder til at opnå egnede tandem omvendte sekvenser, der danner hårnål dsRNA, der stimulerer RNAi. Disse har inkluderet fusion PCR, asymmetrisk PCR og kommerciel syntese af hårnål konstruktioner. Fælles for hver metode er inkluderingen af en intronsekvens mellem de omvendte sekvenser for at give kloningsstabilitet. Responder plasmider, hvori et gen af interesse / RNAi konstruktion kan indsættes er blevet udviklet15. Disse plasmider bærer også de krævede ΦC31 attB-steder til RMCE (beskrevet i Adolfi, der ledsager JoVE-papir, der beskriver RCME-teknikken i detaljer). Protokoller, der dækker de vigtige trin, der kræves, når du vælger sekvensen til indsættelse i en af disse plasmider til overekspression, er inkluderet i dette manuskript. Derudover er to protokoller for RNAi hårnål konstruere skabelse beskrevet og illustreret.

Når du opretter nye linjer, er identifikation af sjældne transgene individer afgørende at opdrætte fra at etablere og opretholde transgene kolonier. Vigtigst for GAL4-UAS-systemet er det nødvendigt at skelne mellem responder- og førerlinjerne for at etablere kryds og identificere individuelle afkom, der bærer begge transgener. Dette opnås ved at bruge forskellige dominerende valgbare markørgener knyttet til driveren og responderkassetter. Oftest er disse fluorescerende markørgener, der klart kan skelnes ved hjælp af optiske filtre (f.eks. eYFP, eCFP, dsRed). Det er vigtigt, at markører udtrykkes i et kendt og pålideligt spatiotemporalt mønster, da dette gør identifikation af abnormiteter og forurening lettere. Fluorescerende markør genekspression er rutinemæssigt reguleret af den syntetiske 3xP3 promotor, som forårsager øje og ventrale ganglier specifikke udtryk i alle faser af An. gambiae udvikling19. Fluorescerende markører kontrolleret af 3xP3 er inkluderet i alle transformation plasmider beskrevet i denne artikel. En protokol, der beskriver de almindelige metoder, der anvendes til at screene fluorescerende An. gambiae pupae GAL4-UAS linjer er inkluderet her.

Et af nøgleelementerne i GAL4-UAS-systemet er nødvendigheden af at krydse de differentierede driver- og responderlinjer. For at gøre dette skal mandlige og kvindelige fra hver linje adskilles før parring. Voksne er let skelnes ved synet, men for at etablere genetiske kors er det fornuftigt at adskille kønnene før voksen fremkomst for at sikre, at parring ikke har fundet sted. Den generelle størrelse forskel mellem mandlige og kvindelige An. gambiae pupper er for variabel til at være en effektiv og pålidelig metode til kønsbestemmelse20. I stedet giver klare morfologiske forskelle i de ydre kønsorganer et pålideligt grundlag for sexing i An. gambiae. I denne artikel beskriver vi en pålidelig metode til sexing An. gambiae pupper til at oprette passende kors.

Figure 1
Figur 1 - Diagrammatisk repræsentation af processen for anvendelse af det todelte GAL4-UAS-system i Anopheles gambiae. (A) De vigtigste komponenter i en eksempelvektor (pSL-attB-UAS14-gyp[3xp3-eYFP]) er afbildet med detaljer om de tilgængelige begrænsningssteder (EcoRI, NheI, XhoI og NcoI) inden for de flere kloningssteder, der er egnede til brug til at indsætte hårnålkonstruktions- eller kodningssekvensen for interessegen. Dockinglinjens struktur er også afbildet. (B) Overgangstrinnet illustreres med angivelse af mænds brug fra førerlinjen (med GAL4-driver af en initiativtager af interesse og eCFP drevet af 3xP3-promotoren) og kvinder fra responderlinjen (med interessegen eller hårnålkonstruktionen kontrolleret af en UAS-promotor og en eYFP-markør, der kontrolleres af 3xP3-promotoren). (C) En diagrammatisk gengivelse af GAL4-kørselsekspression af det interessegen, der er af interesse for korsets afkom i B, og en liste over nogle af de typiske fænotyper, der vurderes. Forkortelser: Multiple Cloning Site (MCS), Recombinase medieret kassetteudveksling (RMCE), Upstream Activator Sequence (UAS), forbedret gult fluorescerende protein (eYFP), forbedret cyan fluorescerende protein (eCFP). Klik her for at se en større version af dette tal.

Det er brugen af kryds, der giver gal4-UAS-systemets todelte karakter, som har klare fordele i forhold til mere lineære tilgange. F.eks. kan mange flere kombinationer af fører- og reaktionslinjer vurderes, end det ville være muligt, hvis der skulle genereres og opretholdes en ny transgen linje for hver promotor/genkombination. Endnu vigtigere, det giver mulighed for analyse af gener, der producerer dødelige eller sterile fænotyper, når deres udtryk er forstyrret, som er vanskelige at skabe / vedligeholde i et lineært system. Sådanne dødelige fænotyper kan manifestere sig på alle udviklingsstadier, afhængigt af genfunktionen og spatiotemporal ekspression, men observeres oftest under embryonal udvikling. Visualisering myg embryo udvikling kræver clearing af uigennemsigtig chorion, som frakker æggene. Følgende metoder beskrevet i Trpiš (1970)21 og Kaiser et al. (2014)22 beskriver vi de protokoller, vi bruger til at rette embryoner, samtidig med at vi opretholder strukturel integritet og blegning for at rydde den enkercheion, der tillader mikroskopisk visualisering og billeddannelse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Design og konstruktion af UAS konstruktioner

  1. Design og samling af vektorer til kandidatgenudtryk
    1. Bestem den rækkefølge, der skal bruges til kandidatgensregulering.
      1. Sekvens cDNA / gDNA fra stammen af interesse og sammenligne det med den offentliggjorte sekvens for at kontrollere sin identitet og identificere potentielle SNPs og begrænsning steder for diagnostisk fordøje.
      2. Sørg for, at den fremadgående primer, der anvendes til genforstærkning, dækker den oprindelige Kozak-sekvens, og start codon, hvor det er relevant. En primer med ~ 10 bp bindende opstrøms af starten codon vil omfatte Kozak sekvens.
      3. Medtag stop codon i fragmentet forstærket fra den omvendte primer i de fleste tilfælde. Brug 3' afslutningssekvenser, der er angivet i de beskrevne plasmidvektorer, eller forstærkes fra genomiske sekvenser af kandidatgenomiske sekvenser.
      4. Bestil kommercielle sekvenser med specifik codon bias, hvis det ønskes.
    2. Brug standardundercloningprocedurer til at indsætte genkassetter i UAS-plasmidvektorer, f.eks. pSL-attB-UAS14-gyp[3xP3-eYFP]15 (figur 1) til både upregulation og RNAi-konstruktioner.
    3. Producere transgene myg skabt ved hjælp af ΦC31 rekombination medieret kassette udveksling10,17,18,23.
  2. Oprettelse af RNAi hårnål konstruktioner: enkelt trin forstærkning ved hjælp af asymmetrisk PCR15,24
    1. Uddrag genomisk DNA (gDNA) fra voksne kvindelige An. gambiae bærer den ønskede kandidat gen ved hjælp af Livak metode25.
      1. Design den forreste primer til at binde til mål exon på 5 'af det ønskede fragment rettet mod den nærliggende intron. Design 3'-enden af en brogrunder, så den binder sig til enden af den foregående exon for at forstærke intronen. 5' endeen supplerer et lille fragment af mål exon umiddelbart efter intronen.
    2. Kør en asymmetrisk PCR-reaktion, som er beskrevet i Xiao (2006)24 (figur 2).
    3. Klon det rensede PCR-produkt til en passende vektor, der bærer UAS-promotoren (f.eks. pSL-attB-UAS14-gyp[3xP3-eYFP]15).
      BEMÆRK: Enzymer på det mange kloningssted, der er egnede til pSL-attB-UAS14-gyp[3xP3-eYFP] kloning15, og de næste nødvendige trin er angivet i figur 1. Enkelt enzym fordøje er afgørende, da kun én begrænsning site er tilsat. Afphosphorylation af plasmid vil forbedre kloning effektivitet.
  3. Konstruktion af RNAi hårnål konstruktioner: Fusion PCR af cDNA og gDNA15
    1. Uddrag genomisk DNA (gDNA) fra voksne kvindelige An. gambiae bærer den ønskede kandidat gen ved hjælp af Livak metode25.
      1. Medtag gDNA i en PCR-reaktion for at forstærke målområdet for exon- og intronsekvenserne sammen (figur 2).
      2. Design 3'-enden af den forreste primer, så den binder sig til den omvendte måludseelsessekvens for at forstærke mod målintronsekvensen og 5'-enden for at bære et begrænsningssted for at lette kloning.
      3. Design omvendt primer (1) til at binde sig til 5 'ende af intron og 5 'ende udhæng bærer de første baser af den forreste sekvens af den nærliggende exon. Dette udhæng bruges i fusions-PCR.
      4. Rense det ønskede reaktionsprodukt.
    2. Uddrag RNA, fjern DNA ved hjælp af DNase's og forbered cDNA fra voksne kvindelige An. gambiae bærer den ønskede kandidat gen efter producentens protokoller.
    3. Brug cDNA i en PCR-reaktion til kun at forstærke eksonens målområde (figur 2).
      1. Design fremad primer (2), således at 3 'ende binder i 3 'slutningen af den komplementære mål exon sekvens og 5 'ende af primeren bærer en begrænsning site til brug i kloning.
        BEMÆRK: Den forreste primer fra 1.3.1.2 kan bruges igen i denne anden reaktion. Dette vil dog betyde, at et enkelt enzym fordøje er afgørende. Ved hjælp af en anden fremad primer med en anden begrænsning site vil tillade dobbelt fordøje, som kan øge kloning effektivitet.
      2. Design omvendt primer (2) - 3 'ende binder sig til 5 'ende af den nærliggende exon forstærke målet exon. 5' ende binder sig til 3 'enden af introns fremad streng. Dette udhæng bruges i fusions-PCR.
      3. Rense det ønskede reaktionsprodukt.
    4. Medtag produkterne fra trin 1.3.1 og 1.3.2 som skabeloner til en fusions-PCR-reaktion ved hjælp af standardkoncentrationer med Fremad-primere 1 og 2. Rense det ønskede produkt.
    5. Fordøje det rensede produkt til at generere udhæng til kloning. Klon til en passende vektor nedstrøms af UAS promotor. Passende enzymer til kloning af pSL-attB-UAS14-gyp[3xP3-eYFP]15 og de næste trin, der kræves, er angivet i figur 1.

Figure 2
Figur 2 - Diagrammatisk repræsentation af oprettelsen af RNAi-konstruktioner til indsættelse i pSL-attB-UAS14-gyp[3xP3-eYFP] ved to metoder: (A) Enkelttrins asymmetrisk PCR (tilpasset fra Xiao. Y H et al. (2006) og (B) multi-trins fusion PCR. Klik her for at se en større version af dette tal.

2. An. gambiae pupae screening

  1. Indsamling af pupper til mikroskopisk karakterisering
    BEMÆRK: I løbet af disse protokoller henviser vand til destilleret vand suppleret med 0,01% damsalt.
    1. Bageste An. gambiae myg ved hjælp af standard protokoller (f.eks MR426) til pupal fase.
      FORSIGTIG: Pas på ikke at skade pupper under hele denne proces.
    2. Saml pupper på en klar flad skål egnet til brug med et stereomikroskop (f.eks en 100 x 15 mm plast Petriskål, undgå kanterne).
      BEMÆRK: For at indsamle pupper bruger vi en 3 mL plast Pasteur pipette med ca. 10 mm snit fra slutningen for at udvide enden og forhindre skade på myggene. Screening og sexing kan afsluttes på enkeltpersoner, men dette er meget langsomt. Det anbefales at udføre screening og sexing på grupper på 50-200 pupper (størrelsen af den mulige gruppe er begrænset af størrelsen af den anvendte skål og er underlagt personlig præference). Hvis et stort antal bliver screenet, kan effektiviteten øges ved først at justere pupper omkring 4 til 5 dybt i linjer og flytte målpuppen ud af denne linje.
    3. Brug en Pasteur pipette, fjern forsigtigt næsten alt vandet fra omkring puppen. Efterlad lige nok vand omkring pupper, så de er effektivt immotile, men kan flyttes nemt med en fin børste. Hvis de bliver vanskelige at flytte, så tilsæt mere vand.
      BEMÆRK: Når nok vand er fjernet, vil puppen ligge på deres side, så visualisering af øjne til fluorescensdetektering og identifikation af dimorfe kønsorganer (figur 4DE).
      FORSIGTIG: Sørg for, at pupper ikke udtørres. Hvis der kun er en meget lille mængde vand tilbage, kan det reduceres yderligere med varmen fra mikroskopets lampe og når den deles mellem puljer af pupper. Yderligere vand skal undertiden tilsættes under processen ved hjælp af en 3 mL Pasteur pipette til den eller de ønskede grupper.
  2. Identifikation af fluorescerende markører i pupper
    BEMÆRK: Brugen af et lavt forstørrelsesstereoskop giver mulighed for bred feltscreening, sortering kan udføres på et omvendt sammensat mikroskop, men skal gøres individuelt.
    1. Ved screening for en fluorescerende markør er det først afgørende at kende de forventede mønstre for udtryk og arv. Overvej følgende:
      1. Farve(er): Bestemme, hvilket filter(er) der skal visualiseres udtrykket.
      2. Spatiotemporalt udtryksmønster: Forstå hvor og i hvilket livsstadium du forventer at se udtryk.
      3. Forholdet mellem forskellige fænotyper: fastslå, hvor stor en procentdel af befolkningen skal bære markører af interesse.
    2. Udfør fluorescerende screening i mørke, da selv svagt lys kan forstyrre opløsningen af fluorescens. Brug dog en lampe ved siden af stereoskopet, når der kræves lys til andre manipulationer.
      FORSIGTIG: Sørg for, at arbejdsområdet omkring det fluorescerende stereoskop er ryddet, før lyset slukkes.
    3. Tænd lysstofrør og lad det varme i producentens anbefalede periode (Normalt 10-15 min). Vælg det nødvendige filter på det fluorescerende stereoskop, og kontroller, at der er en farvet lysstråle synlig, der er rettet mod midten af scenepladen. Hvis dette ikke er synligt eller er meget svagt, er lysstofrøret muligvis ikke helt opvarmet, lukkeren er lukket, eller mikroskopoptik er ikke godt justeret.
    4. Brug hvidt lys, centrer pupperne i synsfeltet og bringer dem i fokus. Det kan være nødvendigt at ændre denne forstørrelse, når der skiftes mellem forskellige filtre afhængigt af fluorescensintensiteten.
    5. Brug en fin detaljemalt pensel sikre, at den undersøgte puppe ikke overlapper hinanden.
    6. Sluk for stereoskopets hvide lys, og brug det fine fokus til at sætte fokus på puppens område, der bærer fænotypen af interesse. Det fluorescerende mønster skal være synligt. Eksempler på 3xP3 promotorstyret fluorescens findes i figur 3.
      1. Brug den laveste forstørrelse, hvor den forventede fluorescerende fænotype kan skelnes pålideligt fra personer uden fluorescene.
      2. For stammer med lys fluorescens bruge en lav intensitet brightfield lys samt under screening, hvis fluorescerende signal er stadig klart identificerbare.
      3. Når du er færdig med primær screening, scannes populationer under andre filtre for at opdage potentiel forurening.
        FORSIGTIG: Sørg for, at der er en klar afstand mellem grupperne af sorterede pupper for at forhindre forurening med pupperbevægelse. Vær opmærksom på, at størrelsen af grupperne vil ændre sig som pupper er kønnet, og at afstande kan synes større, når man ser under forstørrelse. Vær særlig forsigtig, når puljerne ikke er inden for synsfeltet.

Figure 3
Figur 3 - Anopheles gambiae pupae udtrykker fluorescerende markører drevet af 3xP3 promotor (A) eYFP, (B) dsRed og (C) eCFP. Forstørrelse: A=16X, B,C=20X.

  1. Sexing Pupae
    1. Saml pupper. Fjern overskydende vand, men giv tilstrækkelig til, at anal padler en del lidt fra kønsorganerne for at støtte visualisering og morfologisk karakterisering (Figur 4D,E).
    2. Hvis nogen pupper / e ikke er på deres side, skal du bruge en fin detaljer pensel til forsigtigt at dreje puppen og flytte anal padler, så eksterne kønsorganer kan identificeres.
    3. Separat pupper baseret på karakteristiske ydre kønsorganer; hannerne har et langt rør, der ekstruderer fra det endelige rygsegment ca. halvdelen af anal pagajernes længde (Figur 4B). De ydre kønsorganer af kvindelige pupper er betydeligt kortere og bifurcate (figur 4A).
      BEMÆRK: Hvis det 4. instar larval exoskelet forbliver fastgjort eller de ydre kønsorganer er beskadiget (Figur 4C), er sikker identifikation af kønnet vanskeligere. Når en puppes køn ikke er klart, er det bedste praksis at kassere det. Hvis den enkelte skal holdes, skal puppen have lov til at dukke op isoleret og dets køn bestemmes ved hjælp af voksne morfologiske træk. Det er sandsynligt, at hvis dens kønsorganer er beskadiget den enkelte kan ikke parre sig med succes.
    4. Lav en pool til hvert køn i den modsatte ende af skålen til den usexede pool, der flytter identificerede pupper over skålen ved hjælp af en fin detaljeringsmalingsbørste. Mærk undersiden af fadet, hvor de to puljer vil blive samlet for at identificere dem senere.
    5. Når både sexing og fluorescerende screening er påkrævet, udføre fluorescerende screening først, da det er den hurtigere proces af de to.

Figure 4
Figur 4 - Sexing Anopheles gambiae pupper. Individuelle pupper, der angiver de ydre kønsorganer af (A) en hun (B) en han og (C) en person, som ikke umiddelbart kan identificeres på grund af ufuldstændig løsrivelse af larve exoskelet. Forstørrede billeder nedenfor fremhæve de ydre kønsorganer. Pupper med ♀ (kvinde) og ♂ (han) angiver de ydre kønsorganer af pupper med (D) ~ 50% af puppen nedsænket i vand og med (E) alt vand fjernet fremhæve forskellen i nem visualisering af de ydre kønsorganer. Forstørrelse: A,B,C=40x, D,E=30x. Klik her for at se en større version af dette tal. 

  1. Sex bekræftelse som voksne
    1. Indtil en meget lav fejlprocent er blevet påvist, bekræfte puppesexing af voksne morfologi efter fremkomsten. Adskil kønnet pupper i grupper på 10 eller mindre i et klart 20 mL rør med et par mL vand, forsegling med en kugle af bomuldsuld, mærket med det forventede køn og lad det komme frem natten over.
      BEMÆRK: Da voksne overføres den følgende morgen, er det ikke nødvendigt at forsyne nye voksne med mad.
    2. Bekræft køn af viste voksne ved hjælp af morfologiske træk den følgende dag.
    3. Hvis der er mænd til stede i de kvindelige samlinger, skal du kassere hunnerne, hvis parring allerede har fundet sted.
    4. Hvis der er kvinder til stede i mandlig samling, skal du fjerne kvinden/ hunnerne og holde hannerne til krydsning.
  2. Opsætning af GAL4-UAS-system krydser
    1. Aspirere det ønskede antal mandlige og kvindelige voksne fra rørene i trin 2.4 i et bur eller en lille spand, der er oprettet på standardmetoden til An. gambiae opdræt.
      BEMÆRK: Pas på ikke at beskadige de voksne under denne overførsel.
    2. Brug ca. 50 hunner med et lige antal mænd, når ~ 2000 voksne er påkrævet fra afkomet.
      BEMÆRK: Hvis et kryds skal fodres flere gange for at generere flere partier op til 200 af hvert køn kan sættes op i 30cm x 30cm x 30cm bure. Når kun et lille antal kvinder (<20) er tilgængelige for korset, tilføjer vi ~ 4x antallet af mænd for at øge sandsynligheden for vellykket parring.
    3. Blod fodrer de krydsede hunner og bageste afkom til et passende stadium efter standardprotokoller26 for at foretage fænotypisk vurdering (f.eks. insekticidresistens, vektorkapacitet og fitnessomkostningsanalyser).
    4. Hvis det er sandsynligt, at modereffekten af transgeneudtryk er sandsynlig, skal der opsættes gensidige kryds af fører- og responderlinjerne og analysens forventede fænotype.
      BEMÆRK: Kors ved hjælp af 'heterozygot' eller blandede populationer af fører- og responderlinjer producerer afkom med hver af 4 mulige genotyper. Dette giver vilde type, UAS kun og GAL4 kun kontrol, samt transheterozygotes GAL4-UAS med til at analysere fænotype. Hvis homozygote populationer krydses, oprette yderligere kors til at give passende kontrol til at sammenligne fænotyper. Afkommet skal screenes som ovenfor, der adskiller afkom, der bærer begge eller kun enten markør, samt negativer, for fænotypisk vurdering.
  3. Etablering af homozygote populationer fra linjer genereret gennem RCME med alternative fluorescerende markører
    BEMÆRK: Det er vigtigt, at fluorescerende markør for begge linjer er til stede på samme genomiske placering, og de er helt skelnes.
    1. Opret et forældrekors på ca. 200 voksne med lige mange differentierede mænd af den ene linje og kvinder i den anden linje efter screening for at vælge personer, der udviser korrekt fluorescens og køn, som beskrevet ovenfor. Omkring en uge senere blod foder korset ved hjælp af etablerede protokoller26.
      1. Bag F1 afkom til pupper ved hjælp af standard protokoller og indsamle pupper som beskrevet tidligere.
    2. Skærm for fluorescens vælge dem, der bærer begge forældre markører (transheterozygous). Opret en F1 intercross med disse pupper.
    3. En uge senere, blod foder F1 hunner og bageste afkom til pupal fase efter standard protokoller.
    4. Screen F2 pupper vælge dem, der viser kun en af markører. Disse vil være homozygot til indsættelse. Kun 25% af afkommet vil være homozygot for hver indsættelse, så sørg for, at nok afkom er opdrættet til at give en bestand bur (400-500).
      BEMÆRK: Udvælgelsen af transheterozygous afkom skal være helt streng ellers processen bliver forurenet, og fuldstændig homozygositet kan ikke opnås. Dobbelttjek alle de afkom, der er valgt til F1 intercross.

3. En protokol om clearing af gambiae embryoner

  1. Blodfodring og vedligeholdelse
    1. Bageste An. gambiae myg til voksne efter standardprotokoller (f.eks. MR4).
    2. Blodfoder 5-7 dage gamle kvindelige voksne, hvilket sikrer, at de fleste er fuldt engorged.
      FORSIGTIG: I hele denne protokol arbejde hurtigt er afgørende for at sikre, at æg ikke får lov til at udtørre.
  2. Induceret æglægning
    1. 3 dage efter blod fodring indsamle æg gennem induceret lægning.
    2. Saml ovipositionskammeret.
      1. Fyld oviposition pot med vand til en dybde på ca. 5 mm. Fastgør gryden til den ene ende af et 50 mL polypropylenrør, der tidligere er skåret med en nedstryger, så begge ender er åbne. (Vi bruger en plastikskive til en gryde (figur 5), men det oprindelige låg på røret kan bruges i stedet).
      2. Dæk den anden ende af det afskårne polypropylenrør med materiale (slange/strømpebukser) eller dele af latexhandske fastgjort med et elastikbånd, så voksne kan introduceres, men ikke kan undslippe (figur 5). Andre alternative oviposition kammer design findes og kan bruges26.
    3. 10-15 hunner (blod i trin 3.1.2) føres forsigtigt til ovipositionskammeret. Dæk ovipositionskammeret for at producere mørke og lad i 20 minutter.
      FORSIGTIG: Undgå at flytte fårpositionspotten, når æggene er lagt for at forhindre stranding og udtørring af æg.
    4. Forsigtigt løsne 50 mL polypropylen rør fra oviposition pot, samtidig med at det sikres ikke at frigive myg. Hvide æg skal være synlige. Kontroller, at der er lagt tilstrækkeligt til forbudt formål. Gentag om nødvendigt.
    5. Dæk gryden (til støvbeskyttelse) og lad æg modnes til udviklingsstadiet af interesse.
    6. Brug en fin detaljering pensel til at afhente æg fra gryden og placere dem på vand i en 40 mm2 udgravet glas blok.

Figure 5
Figur 5 - Eksempel på en Oviposition Chamber (A) demonteret for at fremhæve komponenterne og (B) samlet. Klik her for at se en større version af dette tal. 

  1. Embryo fastsættelse
    FORSIGTIG: Udfør alle fastgørelsestrin (trin 3.3) i en røghætte på grund af brug af formaldehyd.
    1. Forbered FAA-løsning som beskrevet i Kaiser et al. (2014)22. FAA består af 3,6 M formaldehyd, 0,87 M eddikesyre og 8,5 M absolut ethanol, der består af volumen med destilleret vand (dH2O).
      1. For 10 ml FAA kombinere 2,68 ml 13,42 M formaldehyd, 4,96 ml 17,14 M ethanol og 0,5 ml 17,4 M eddikesyre med 1,86 ml destilleret H2O. Fiksativ kan opbevares i mindst 3 måneder i en tæt forseglet glasbeholder, opbevares i et udpeget kemisk skab.
    2. Fjern forsigtigt vandet fra glasblokken med en mikropipette og dæk æg i 500 μL FAA og sving forsigtigt (~ 25 RPM) på en orbital shaker ved stuetemperatur i 30 minutter. Ingen farveændring er synlig på nuværende tidspunkt.
    3. Skyl æg grundigt med destilleret vand. Udfør skylning 15 gange for at fjerne alle spor af formaldehyd. Ved hjælp af en 1000 μL mikropipette tilsættes og fjernes derefter 1 mL dH2O ad gangen for ikke at beskadige æggene, mens du gør det.
    4. Opbevar spildevand fra skylninger i en udpeget formaldehyd kassere beholder til bortskaffelse i henhold til sikkerhedsretningslinjer.
    5. På dette tidspunkt kan faste æg opbevares ved 4 °C natten over i vand for at holde dem hydreret.
  2. Blegning af embryoner
    FORSIGTIG: Udfør alle blegning trin (trin 4) i en røghætte på grund af den potentielle frigivelse af klorgas, når natriumhypochlorit og eddikesyre kombineres.
    1. Klargør blegeopløsning (Trpiš-opløsning - beskrevet i Trpiš (1970)21 og modificeret i henhold til Kaiser et al. (2014)22). Trpiš opløsning er 0,59 M natriumhypochlorit og 0,35 M eddikesyre opløst i destilleret H2O.
      1. For en 10 ml ovolume Trpiš-opløsning kombineres 2,68 ml 2,2 M natriumhypochlorit og 0,2 ml 17,4 M eddikesyre med 7,12 ml destilleret H2O.
        BEMÆRK:Trpiš-opløsningen kan opbevares i mindst 3 måneder i en tætslutt glasbeholder og opbevares i et sikkert kemisk skab. Opløsningen skal muligvis hvirvles efter opbevaring og bør altid åbnes i en røghætte i tilfælde af frigivelse af klorgas.
    2. Dæk faste æg med 1 mL Trpiš opløsning og inkuber ved stuetemperatur i 30 minutter. Æg vil begynde at udvikle blege pletter efter ca. 5 minutters inkubation og til sidst nå en mælkeagtig hvid farve, når den er ryddet.
    3. Skyl æggene som i trin 3.3.3 for at fjerne Trpiš-opløsningen.
    4. Opbevar spildevand i en udpeget affaldsbeholder og smid overskydende vand ned i afløbet.
  3. Oplagring
    1. Opbevares i 500 μL dH2O og holdes mellem 2-8 °C i et par dage. Fjern det meste af vandet omhyggeligt forud for visning og billeddannelse på masse, men undgå udtørring af æggene ved at efterlade en lille mængde vand i urglasset. Dette vil ikke forstyrre fotografering af æggene. Individuelle æg kan placeres på mikroskop dias for højere forstørrelse billeddannelse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

3xP3 udtryk for eYFP, dsRed og eCFP giver pålidelig, let skelnes identifikation af personer, der besidder markøren gener producerer udtryk i øjne og ventrale ganglier af An. gambiae pupper (Figur 3). Den differentialmorfologi, der observeres hos ydre kønsorganer hos mænd og kvinder, og som anvendes til sexing, og et eksempel på en uidentificerbar pupper er fremhævet i figur 4. Fjernelse af alt vand fra pupper øger kønsvanskeligheder som anal padler obskur visualisering af kønsorganer (Figur 4D, E). Det todelte GAL4-UAS-system tillader ændring af genekspression på en kontrolleret spatio-temporal måde, der kan visualiseres ved at krydse de allestedsnærværende (figur 6A, C) og oenocyte driver (Figur 6B, D) linjer med responderlinjen UAS-mCD8:mCherry10. De morfologiske egenskaber, der observeres i forskellige stadier af embryonal udvikling ved 12, 24 og 36 h efter æglægning, er tydelige efter afslutningen af protokol nummer 3 (figur 7).

Figure 6
Figur 6 - Vævsspecifik udtryksvisualisering. (A, B) Larver og (C, D) voksne, der udtrykker mCherry drevet af (A, C) allestedsnærværende og (B, D) ønsespecifikke førerlinjer. Forstørrelse: A,B=32X, C=25X, D=40X. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 7
Figur 7 - Eksempelresultater for embryorensning. Billeder af embryoner efter den beskrevne protokol (A) 12, (B) 24 og (C) 36 timer efter oviposition og (D) et mislykket forsøg på at bruge husholdningsblegning, hvor over blegning forårsagede misfarvning og sprængning af embryoner. Forstørrelse: 50x. Klik her for at se en større version af dette tal. 

Slags Linje Indhold 3xP3-markør Beskrivelse Kilde
Responder mCherry UAS-mCD8:mCherry eCFP, eYFP Udtrykker mCherry-kodningssekvensen, når den krydses med en driverlinje Adolfi. A et al.(2018)
16i UAS-RNAi cyp4g16 eYFP Indeholder en RNAi hårnål konstruktion, som er rettet mod cyp4g16 , som er udtrykt og forårsager knockdown af cyp4g16 når krydset med en førerlinje Lynd. A et al.(2020)
17i UAS-RNAi cyp4g17 eYFP Indeholder en RNAi hårnål konstruktion, som er rettet mod cyp4g17 , som er udtrykt og forårsager knockdown af cyp4g17 når krydset med en førerlinje Lynd. A et al.(2020)
M2 UAS-cyp6m2 eYFP Udtrykker cyp6m2 , når den krydses med en førerlinje Adolfi. A et al. (2019)
P3 UAS-cyp6p3 eYFP Udtrykker cyp6p3 , når den krydses med en førerlinje Adolfi. A et al. (2019)
e2 UAS-GSTe2 eYFP Udtrykker GSTe2 , når den krydses med en førerlinje Adolfi. A et al. (2019)
SAP2 UAS-Sap2 eYFP Udtrykker Sap2 , når den krydses med en førerlinje Ingham. V et al .(2019)
FAS1899i UAS-RNAi FAS1899 eYFP Indeholder en RNAi hårnål konstruere, som er rettet mod FAS1899 , som er udtrykt og forårsager knockdown af FAS1899 når krydset med en driver linje Grigoraki. L et al.(2020)
3050i UAS-RNAi Desat3050 eYFP Indeholder en RNAi hårnål konstruktion, som er rettet mod Desat3050 , som er udtrykt og forårsager knockdown af Desat3050 når krydset med en førerlinje Grigoraki. L et al.(2020)
Wnd UAS-eYFPnls-luc eCFP Når den krydses med en GAL4-linje, udtrykkes eYFP. Genereret ved hjælp af piggybac (MR4-kode: MRA-1165) Lynd. A et al.-2011)
MBL UAS-eYFPnls-luc eCFP Når den krydses med en GAL4-linje, udtrykkes eYFP. Genereret ved hjælp af piggybac (MR4-kode: MRA-1164) Lynd. A et al.-2011)
Docking A11 VG-LRIM1 eCFP Transport af de nødvendige attP docking sites kræves for ΦC31 medieret kassette udveksling Lynd.A et al. (2019)
Driver + Docking A10 Ubi-A10 GAL4 eCFP Indeholder transskriptionsfaktoren GAL4-kodningssekvensen, der styres af An. gambiae Polyubiquitin-c (PUBc)- genet. Bærer også attP docking sites kræves for ΦC31 medieret kassette udveksling Adolfi. A et al.(2018)
Chauffør Gareth Oenocyte forstærker-GAL4 dsRed Udtrykker GAL4 kontrolleret af en oenocyte specifik forstærker Lynd. A et al. (2012)
hml- GAL4 hml-GAL4-hml- GAL80 eYFP-nls Udtrykker GAL4 og GAL80 drevet af en hæmocyt specifik promotor Pondeville. E et al.-2020)
F carboxypeptidase promotor - GFY-GAL4 dsRed Udtrykker GAL4 i midgut og når krydset med en UAS linje vil udtrykke YFP. Genereret ved hjælp af piggybac (MR4-kode: MRA-1167) Lynd. A et al.-2011)
DGL carboxypeptidase promotor - GFY-GAL4 dsRed Udtrykker GAL4 i midgut og når krydset med en UAS linje vil udtrykke YFP. Genereret ved hjælp af piggybac (MR4-kode: MRA-1166) Lynd. A et al.-2011)

Tabel 1 - Tabel over offentliggjorte linjer, korte beskrivelser og den reference, som skabelsesmetoden er beskrevet i. Katalognumrene for linjer, der aktuelt er gemt i MR4-lageret, er angivet i beskrivelsen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Forståelse myg genfunktion er afgørende for at udvikle nye tilgange til at kontrollere Anopheles og indvirkning malaria transmission. Det beskrevne GAL4-UAS-system er et alsidigt og kraftfuldt system til funktionel analyse af kandidatgener, og til dato har vi brugt systemet til at undersøge det genetiske grundlag for insekticidresistens17 og cuticular kulbrinteproduktion15,23 samt til fluorescerende tag forskellige myggecellepopulationer8 . Hidtil er der blevet genereret rendekonstruktioner gennem kloning af restriktionsenzym til en plasmid, der bærer et flere kloningssted nedstrøms af UAS (figur 1, tabel 1). På grund af den modulære karakter af de konstruktioner, der bærer flere elementer (attB-steder, 3xP3-YFP og sigøjnerisatorsekvenser), er mere moderne teknikker imidlertid mulige til at konstruere nye responderplasmider. Typisk sekvenser for overekspression kan forstærkes fra cDNA eller gDNA ved hjælp af PCR, men kommerciel syntese kan undertiden reducere arbejdskraft og tid, der er involveret i at generere nye konstruktioner. Det er vigtigt at sekvensere målgener, når de er forstærket fra respektive skabeloner for at validere identitet og identificere potentielle SNPs. Dette er især relevant, når kommercielt syntetisere DNA, da det ikke anbefales at stole udelukkende på database anmærkninger.

Generering sekvenser til RNAi konstruktioner er ofte mere kompleks på grund af kravet om at klone en i sagens natur ustabil omvendt gentagelse af målet sekvens for dsRNA dannelse af hårnål produkt. Denne kloning opnås ofte ved at inkludere en intronsekvens mellem gentagelserne for at muliggøre stabil replikation i Escherichia coli og effektiv splejsning i myggen27. Forstærkning af hårnål konstruktioner ved hjælp af asymmetrisk PCR er effektiv på grund af det enkelte trin karakter. I de tidlige cyklusser af asymmetrisk PCR forstærkes den streng, der forstærkes af den fremadrettede primer, fortrinsvis, da denne primer leveres til reaktionen i overskud (2x koncentration af broprimer). Dette produkt akkumuleres som enkeltstrenge. 3' ende af disse strenge supplerer begyndelsen af målet exon. I midten af fase cyklusser, en løkke former som den supplerende 3 'ende anneals til starten af målet exon. Når dette sker, forstærkes mål exonens komplementære sekvens fra 3's ende, der genererer et produkt [omvendt exon: intron: exon]. I sene cyklusser dette endelige produkt forstærkes af den forreste primer og kan let isoleres og klones. En lignende omvendt gentagelseskonstruktion kan fremstilles ved fusion PCR28 som angivet i figur 2. For begge metoder skal et egnet målsted, der opfylder de krævede egenskaber for RNAi24, dog være direkte ved siden af en intron af passende størrelse til kloning. Når et passende mål ikke er tilgængeligt, kan der anvendes en modificeret fusions-PCR eller kommerciel syntese, hvor de omvendte sekvenser er smeltet sammen med en intronsekvens som tre separate fragmenter i henholdsvis en PCR-reaktion eller i silico. Vi har med succes brugt den 4. intron af Drosophila hvide gen som en spaltet spacer sekvens23. I dette tilfælde krævede virksomheden en afstandsplads (intron) med mindst samme længde som målgengangssekvenserne for at muliggøre effektiv syntese. Som omkostningerne ved kommerciel syntese stiger med størrelsen og kompleksiteten af fragmentet, typisk kun hårnålen eller gen fragment er syntetiseret derefter klonet til den ønskede vektor i modsætning til syntese af hele plasmid. Når du bruger kommerciel syntese til at generere konstruktioner til transgenese, er det vigtigt at huske på, at den forventede sekvensanmærkning kan have forskelle, såsom SNPs, sammenlignet med sekvenser, der findes i laboratoriestammer. Derudover er det vigtigt at overveje virkningen af Kozak-sekvenser og sikre, at de indgår i den endelige konstruktion, hvor det er nødvendigt29.

Som beskrevet ovenfor udvider adskillelsen af GAL4- og UAS-komponenterne potentialet i hver linje, der gør det muligt at evaluere i kombinationer og analyse af dødelige eller skadelige fænotyper. For eksempel blev meget forskellige resistensfænotyper observeret, når de udtrykte metaboliske enzymer allestedsnærværende, snarere end i tarmen eller ønocytter, som tidligere blev anset for at være nogle af de vigtigste væv, der giver insekticidresistens17. Desuden har vævsspecifikt udtryk/knockdown af gener, der er involveret i cuticular kulbrinteproduktion, fremhævet oenocytters rolle i larveudvikling og voksen ekslosion15,23. Fremadrettet kan generering af førerlinjer med alternative rumlige-tidsmæssige vævsspecifikke GAL4-udtryk meget vel forenkles af CRISPR-Cas-teknologi. Tidligere driverlinjer blev genereret med begrænset kendskab til promotorsekvenser for at regulere udtryk og blev ofte 'hit and miss' i deres aktivitet, som ofte forværres af positionseffekter. Dette kan overvindes ved målrettet indsættelse af GAL4 med en selvspaltningspeptid (f.eks. T2A)30 nedstrøms af et målgen, som skal frembringe ekspression af GAL4 på den spatiotemporale måde af det målrettede gen31. Denne strategi er blevet effektivt anvendt i D. melanogaster32, herunder oprettelse af et bibliotek af bestande, der udtrykker GAL4 under kontrol af forskellige endogene initiativtagere33. Selvom det ikke er testet udførligt i myg endnu, og der er anekdotiske spørgsmål omkring effektiviteten af co-udtryk, alsidigheden og tilpasningsevnen af denne målrettede tilgang er spændende.

Selv når man bruger sådanne metoder til chaufførproduktion, er sexing og screening af pupper på en effektiv og pålidelig måde afgørende for brugen af GAL4-UAS-systemet i myg. De protokoller, der er beskrevet her, er robuste metoder til analyse i mindre skalaer. Når højere myg numre er påkrævet bliver det meget tidskrævende at manuelt skærmen for genotype. Dette kan overvindes ved at krydse homozygot driver og responder linjer, så alle afkom vil være transheterozygous, og så kræver ikke streng screening og adskillelse. Det er ofte muligt at skelne homozygot myg baseret på intensiteten af markør fluorescens og dermed at krydse disse for at producere stabile homozygode linjer. Men, effekten af denne metode er noget afhængig af brugerens kendskab til udtryksmønstre. Desuden har nogle linjer ikke konsekvente, utvetydige udtryksforskelle med hensyn til markørkopinummer. En nemmere måde at generere homozygoe linjer på er beskrevet i protokol 2.6 og gælder, når der er genereret to linjer med forskellige fluorescerende markører i samme genomiske græshoppe (f.eks. gennemΦC31-stedet , der dirigeres til den samme dockinglinje). Enten eller begge linjer kan pålideligt gøres homozygot gennem simpel krydsning og screening. Metoden er afhængig af at kunne skelne mellem de forskellige fluorescerende markører, og af de mest anvendte markører kan eCFP, eYFP og dsRED utvetydigt diskrimineres ved hjælp af passende filtersæt. Desværre overlapper eGFP's emissionsspektre betydeligt med eCFP og eYFP og kan generelt ikke anvendes sammen med disse markører, selv om dsRED og eGFP gør en passende parring.

Højere gennemløb af analyse kan også opnås ved automatisk sortering af fluorescerende mærkede larver. Dette er blevet beskrevet med Complex Object Parametric Analyzer and Sorter (COPAS) machine34, som fungerer på samme måde som en fluorescensaktiveret cellesortering for at gate individuelle myg baseret på deres markørudtryk. Metoden er også blevet brugt til at isolere differentieret mærkede mænd og kvinder34. På grund af størrelse, større faser såsom pupper, er endnu ikke blevet screenet med succes ved hjælp af COPAS-systemet. Automatiseret voksensexsortering ved hjælp af video- og maskinlæringsalgoritmer er også blevet udviklet til store feltudgivelser35, men dette er endnu ikke omkostningseffektivt for den skala, som GAL4-UAS-systemtransgenics typisk anvendes på. Differentieret mærkede køn er endnu ikke tilgængelige for GAL4-UAS myg og så manuel sexing som pupper er stadig nødvendigt at udføre specifikke kors. Den metode, der er beskrevet her for sexing pupper baseret på morfologiske forskelle i eksterne kønsorganer er robust. Det er dog genstand for operatørfejl, og for praktikanter er det god praksis at bekræfte nøjagtigheden af sexing ved at observere, om det korrekte voksne køn er blevet isoleret. Når puppen er sikker på 100% nøjagtighed, kan den placeres direkte i parringsburet for at spare tid.

Vi beskriver også en tilpasset metode til analyse af embryoudvikling gennem fiksering og afklaring af æg efter netop tidsindet indsamling. Vores tidligere forsøg på at rydde embryoner ved hjælp af husholdningsblegemiddel som beskrevet i Goltsev, Rezende, et al.36, Rezende, Martins, et al.37, Vargas, Farnesi, et al.38 og Chang, Liu, et al.39, forårsagede afbrænding af embryonerne som angivet i figur 7D. Klorkoncentrationen i husholdningsblegning kan variere betydeligt, så vi valgte at bruge kemikalier af høj kvalitet. Vi har brugt denne metode til at observere omfanget af embryoudvikling efter genetisk modifikation af hormonel aktivering. Gennem observation af det udviklende embryo blev det klart, at fraværet af larveudklækning skyldtes udviklingsmæssige ændringer snarere end fertilitetsproblemer hos de voksne. Lignende teknikker er blevet anvendt til immun-histo kemi og RNA hybridisering som beskrevet af Clemons, Flannery, et al.40 og Juhn og James 41 henholdsvis. Som vi har vist, har GAL4-UAS-systemet i An. gambiae vist sig uvurderligt til at undersøge særlige aspekter af mygbiologi og -udvikling, og de grundlæggende protokoller, der er beskrevet for transgene design, fluorescerende screening, manuel puppesexing og embryo clearing er nødvendige for effektiv udnyttelse af dette vigtige system.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Vi anerkender taknemmeligt finansiering fra LSTM og IVCC (Adriana Adolfi), BBSRC (New Investigator Award (AL), MRC (ph.d.-studerende til BCP: MR / P016197 / 1), Wellcome (Sir Henry Wellcome Postdoctoral stipendium til LG: 215894 / Z / 19 / Z), der har indarbejdet Gal4UAS analyse i forslagene.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
100 x 15 mm plastic Petri dish SLS 2175546 Pack of 10
1000 µL Gilson Pipette Gilson F144059P
20/25 mL Universal Tubes Starlab E1412-3020 Pack of 400
3 mL Pasteur Pipettes SLS G612398 Greiner Pasteur pipette 3 mL sterile individually wrapped
50 mL Falcon Tubes Fisher Scientific 11512303
Absolute Ethanol Fisher Scientific BP2818-500 500 mL
Acetic Acid SLS 45726-1L-F 1 L
Cages SLS E6099 30x30x30 with screen port
Fine Paint Brushes Amazon UKDPB66 KOLAMOON 9 Pieces Detail Painting Brush Set Miniture Brushes for Watercolor, Acrylic Painting, Oil Painting (Wine Red)
Fish food Amazon Tetra Min Fish Food, Complete Food for All Tropical Fish for Health, Colour and Vitality, 10 L 
Formaldehyde Solution Sigma Aldrich F8775
Mouth Aspirator John Hock 612
Pond Salt Amazon Blagdon Guardian Pond Tonic Salt, for Fish Health, Water Quality, General Tonic, pH Buffer, 9.08 kg, treats 9,092 L 
Pupae Pots Cater4you SP8OZ 250 pots with lids
Small Plastic Buckets Amazon 2.5 L White Plastic Pail Complete with White Lid (Pack of 10) 
Sodium Hypochlorite Fisher Scientific S25552

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Brand, A. H., Perimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
  2. Duffy, J. B. GAL4 system in drosophila: A fly geneticist's swiss army knife. Journal of Genetics and Development. 34 (1-2), 1-15 (2002).
  3. Dow, J. A. ELS. , John WIley & Sons, Ltd. (2012).
  4. Edi, C. V., et al. CYP6 P450 Enzymes and ACE-1 Duplication Produce Extreme and Multiple Insecticide Resistance in the Malaria Mosquito Anopheles gambiae. PLoS Genetics. 10 (3), 1004236 (2014).
  5. Daborn, P. J., et al. Using Drosophila melanogaster to validate metabolism-based insecticide resistance from insect pests. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 42 (12), 918-924 (2012).
  6. Riveron, J. M., et al. Genome-wide transcription and functional analyses reveal heterogeneous molecular mechanisms driving pyrethroids resistance in the major malaria vector Anopheles funestus across Africa. Genes Genomes Genetics. 7 (6), 1819-1832 (2017).
  7. Riveron, J. M., et al. A single mutation in the GSTe2 gene allows tracking of metabolically based insecticide resistance in a major malaria vector. Genome Biology. 15 (2), (2014).
  8. Lynd, A., Lycett, G. J. Development of the Bi-Partite Gal4-UAS System in the African Malaria Mosquito, Anopheles gambiae. PLoS ONE. 7 (2), 31552 (2012).
  9. Lynd, A., Lycett, G. J. Optimization of the Gal4-UAS system in an Anopheles gambiae cell line. Insect Molecular Biology. 20 (5), 599-608 (2011).
  10. Adolfi, A., Pondeville, E., Lynd, A., Bourgouin, C., Lycett, G. J. Multi-tissue GAL4-mediated gene expression in all Anopheles gambiae life stages using an endogenous polyubiquitin promoter. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 96, 1-9 (2018).
  11. Kokoza, V. A., Raikhel, A. A. Targeted gene expression in the transgenic Aedes aegypti using the binary Gal4-UAS system. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 41, 637-644 (2011).
  12. O'Brochta, D. A., Pilitt, K. L., Harrell, R. A., Aluvihare, C., Alford, R. T. Gal4-based Enhancer-Trapping in the Malaria Mosquito Anopheles stephensi. Genes Genomes Genetics. 2, 21305-21315 (2012).
  13. Zhao, B., et al. Regulation of the Gut-Specific Carboxypeptidase: A Study Using the Binary Gal4/UAS System in the Mosquito Aedes Aegypti. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 54, 1-10 (2014).
  14. Imamura, M., et al. Targeted Gene Expression Using the GAL4/UAS System in the Silkworm Bombyx mori. Genetics. 165 (3), 1329-1340 (2003).
  15. Lynd, A., et al. Development of a functional genetic tool for Anopheles gambiae oenocyte characterisation: application to cuticular hydrocarbon synthesis. bioRxiv. , (2019).
  16. Pondeville, E., et al. Hemocyte-targeted gene expression in the female malaria mosquito using the hemolectin promoter from Drosophila. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 120, 103339 (2020).
  17. Adolfi, A., et al. Functional genetic validation of key genes conferring insecticide resistance in the major African malaria vector, Anopheles gambiae. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (51), 25764-25772 (2019).
  18. Pondeville, E., et al. Efficient integrase-mediated site-specific germline transformation of Anopheles gambiae. Nature Protocols. 9 (7), 1698-1712 (2014).
  19. Horn, C., Schmid, B. G. M., Pogoda, F. S., Wimmer, E. A. Fluorescent transformation markers for insect transgenesis. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 32, 1221-1235 (2002).
  20. Clements, A. A. Biology of Mosquitoes, Volume 1: Development, Nutrition and Reproduction. 1, CABI Publishing. (1992).
  21. Trpiš, M. A new bleaching and decalcifying method for general use in zoology. Canadian Journal of Zoology. 48, 892-893 (1970).
  22. Kaiser, M. L., Duncan, F. D., Brooke, B. D. Embryonic Development and Rates of Metabolic Activity in Early and Late Hatching Eggs of the Major Malaria Vector Anopheles gambiae. PLoS ONE. 9 (12), 114381 (2014).
  23. Grigoraki, L., Grau-Bové, X., Yates, H. C., Lycett, G. J., Ranson, H. Isolation and transcriptomic analysis of Anopheles gambiae oenocytes enables the delineation of hydrocarbon biosynthesis. eLife. 9, 58019 (2020).
  24. Xiao, Y. -H., Yin, M. -H., Hou, L., Pei, Y. Direct amplification of intron-containing hairpin RNA construct from genomic DNA. BioTechniques. 41 (5), 548-552 (2006).
  25. Livak, K. J. Organization and Mapping of a Sequence on the Drosophila melanogaster X and Y Chromosomes That Is Transcribed during Spermatogenesis. Genetics. 107 (4), 611-634 (1984).
  26. MR4, CDC, NEI & beiResources. The MR4 Methods in Anopheles Research Laboratory Manual. 5th Edition. , (2015).
  27. Sik Lee, Y., Carthew, R. W. Making a better RNAi vector for Drosophila: use of intron spacers. Methods. 30 (4), 322-329 (2003).
  28. Cha-aim, K., Hoshida, H., Fukunaga, T., Akada, R. Gene Synthesis: Methods and Protocols. Peccoud, J. , Humana Press. 97-110 (2012).
  29. Cavener, D. R. Comparison of the consensus sequence flanking translational start sites in Drosophila and vertebrates. Nucleic Acids Research. 15 (4), 1353-1361 (1987).
  30. Wang, Y., Wang, F., Wang, R., Zhao, P., Xia, Q. 2A self-cleaving peptide-based multi-gene expression system in the silkworm Bombyx mori. Scientific Reports. 5, (2015).
  31. Galizi, R., et al. A synthetic sex ratio distortion system for the control of the human malaria mosquito. Nature Communications. 5, 3977 (2014).
  32. Kondo, S., et al. Neurochemical organisation of the Drosophila Brain Visualised by Endogenously Tagged Neurotransmitter Receptors. Cell Reports. 30 (1), 284-297 (2020).
  33. Lee, P. -T., et al. A gene-specific T2A-GAL4 library for Drosophila. eLife. 7, 35574 (2018).
  34. Marois, E., et al. High-throughput sorting of mosquito larvae for laboratory studies and for future vector control interventions. Malaria Journal. 11, 302 (2012).
  35. Crawford, J. E., et al. Efficient production of male Wolbachia-infected Aedes aegypti mosquitoes enables large-scale suppression of wild populations. Nature Biotechnology. 38 (4), 482-492 (2020).
  36. Goltsev, Y., et al. Developmental and evolutionary basis for drought tolerance of the Anopheles gambiae embryo. Developmental Biology. 330 (2), 462-470 (2009).
  37. Rezende, G. L., et al. Embryonic desiccation resistance in Aedes aegypti: presumptive role of the chitinized Serosal Cuticle. BMC Developmental Biology. 8 (1), 82 (2008).
  38. Vargas, H. C. M., Farnesi, L. C., Martins, A. J., Valle, D., Rezende, G. L. Serosal cuticle formation and distinct degrees of desiccation resistance in embryos of the mosquito vectors Aedes aegypti, Anopheles aquasalis and Culex quinquefasciatus. Journal of Insect Physiology. 62, 54-60 (2014).
  39. Chang, C. -H., et al. The non-canonical Notch signaling is essential for the control of fertility in Aedes aegypti. PLOS Neglected Tropical Diseases. 12 (3), 0006307 (2018).
  40. Clemons, A., Flannery, E., Kast, K., Severson, D., Duman-Scheel, M. Immunohistochemical Analysis of Protein Expression during Aedes aegypti Development. Spring Harbor Protocols. 10, 1-4 (2010).
  41. Juhn, J., James, A. A. Hybridization in situ of Salivary Glands, Ovaries and Embryos of Vector Mosquitoes. Journal of Visualized Experiments. , e3709 (2012).

Tags

Genetik Udgave 170 3xP3 Lokalisering Endogenous Expression RNAi Knockdown Mikroskopi tværpolitisk Insekticidresistens vektorkapacitet.
Brug af GAL4-UAS System for Funktionel Genetik i <em>Anopheles gambiae</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Poulton, B. C., Colman, F.,… More

Poulton, B. C., Colman, F., Anthousi, A., Grigoraki, L., Adolfi, A., Lynd, A., Lycett, G. J. Using the GAL4-UAS System for Functional Genetics in Anopheles gambiae. J. Vis. Exp. (170), e62131, doi:10.3791/62131 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter