Summary
在这里，我们提出了一个协议，建立一个新的大鼠模式，使用有幻想的艾滋病毒（EcoHIV），这是关键，以提高我们对HIV-1病毒库在大脑中的理解，并提供一个系统，以研究艾滋病毒相关的神经认知障碍和相关的合并症（即药物滥用）。
Abstract
据充分研究，EcoHIV感染小鼠模型在研究艾滋病毒相关神经并发症方面具有重大效用。建立EcoHIV感染大鼠模型，用于研究药物滥用和神经认知障碍，将有利于神经HIV和HIV-1相关神经认知障碍（HAND）的研究。在本研究中，我们演示了使用有幻想的艾滋病毒（EcoHIV）成功创建了活性艾滋病毒感染的老鼠模型。首先，EcoHIV 的扁桃体结构在培养的 293 FT 单元中包装了 48 小时。然后，有条件的介质被集中和滴答作响。接下来，我们将EcoHIV-EGFP的双边立体毒性注射到F344/N大鼠脑组织中。感染一周后，在受感染的脑组织中检测到EGFP荧光信号，表明EcoHIV成功地诱发大鼠的艾滋病毒感染。此外，还对微胶质细胞标记物Ibba1进行了免疫染色。结果表明，微胶质是窝藏EcoHIV的主要细胞类型。此外，EcoHIV大鼠在时间处理方面表现出改变，这是HAND潜在的神经行为机制，感染后8周出现突触功能障碍。本研究将EcoHIV艾滋病毒-1感染模型共同扩展至大鼠，为研究大脑中的HIV-1病毒库以及手部和药物滥用等相关合并症提供了宝贵的生物系统。
Introduction
生物系统增强了我们对HIV-1相关神经认知障碍（HAND）及其基础神经机制2的理解。确定哪个生物系统最适合任何特定的研究，往往取决于利益问题2。宿主动物模型范围的限制对艾滋病毒-1疾病发展的研究提出了挑战。为了研究HIV-1病毒的复制和发病机理，Potash等人3日创建了活性HIV-1感染的小鼠模型，用生态MLV gp80取代了HIV表面包络糖蛋白gp120的编码区域，从而成功地在4号小鼠身上进行了病毒复制。在有幻想的HIV（EcoHIV）小鼠注射尾静脉后，观察到许多特征与HIV-1血清阳性个体（如受感染的淋巴细胞和巨噬细胞，针对抗病毒免疫反应，以及炎症3，5，6）相似。
虽然老鼠和老鼠都是Muridae的成员，但基本物种的差异可能会影响它们适合特定的实验问题7。因此，将EcoHIV感染模型推广到大鼠（通常用于药物滥用和神经认知障碍的研究）将有利于神经HIV的研究。例如，其较大的尺寸使朱拉导管植入药物自我管理程序更实用8。大鼠的药物自我管理技术被用来评估艾滋病毒-19的动机。此外，许多神经认知/行为任务最初是为10号大鼠设计的。在这里，我们报告利用大鼠EcoHIV的立体毒性注射来扩展EcoHIV感染模式，并提供了一个关键的机会来解决与神经HIV和HAND相关的新问题。
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Protocol
所有动物协议均由南卡罗来纳大学动物护理和使用委员会审查和批准（联邦保证号：D16-00028）。六只成年雄性F344/N大鼠被配对安置在12/12光下的受控环境中：暗循环，可获得食物和水。所有动物都受到照料，使用国家卫生研究院在《实验室动物护理和使用指南》中制定的准则。
1. 293 个 FT 细胞中的病毒包装
- 培养293 FT细胞（5×105/mL）在明胶涂层75厘米2 烧瓶与DMEM加10%FBS11。在37°C下生长细胞，在转染时达到50%的汇流。
- 在 1.5 mL 微离心管和涡流 3s 中稀释 750 μL 介质（例如 Opti-MEM）中的 22.5 μL 转染试剂（例如，脂质胺 3000）。
- 在 1.5 mL 微离心管中将 20μg 的 EcoHIV 质粒DNA稀释到 750 μL 的介质中，并很好地混合在一起。
- 将稀释后的DNA加入稀释的输血试剂管中，轻轻混合。在室温下孵育15分钟。
- 将混合物加入 10 mL 预热 DMEM 介质，75 厘米2 瓶。在37°C下孵化细胞2天。
- 从包括包装扁豆病毒在内的两个烧瓶中收获并组合 24 mL 的有条件介质。
- 离心机所有24 mL的有条件介质在500 x g 10分钟在4°C。 将澄清的超自然人转移到无菌的 50 mL 管中。
- 将 8 mL 的 Lenti-x 浓缩器与 24 mL 的澄清超音量（1：3 比例）混合。通过温柔的反转混合。在4°C下孵化混合物两天。
- 离心机混合物在1，500 x g 45分钟在4°C。 小心地去除超自然。
- 用 100 μL 的 100 mM PBS 轻轻重新悬浮颗粒。
- 带p24 ELISA套件的滴定病毒浓度。
2. 生态HIV-EGFP病毒立体毒性手术
- 使用3%的塞沃氟兰麻醉大鼠。当大鼠对有毒刺激没有反应且没有反射时，继续进入第 2.2 步。
- 剃掉大脑区域的头发，用70%的乙醇和氯西丁砂对皮肤进行两次消毒。将大鼠固定在立体声装置的易发位置。
- 沿着头皮中线穿过皮肤切口（5-6 厘米）。
- 标记两个钻井位置，横向 0.8 毫米，1.2 毫米旋转到布雷格马。在每个头骨位置钻一个孔（直径0.4毫米）。
- 在 10 μL 注射注射注射器中填充滴定 EcoHIV 扁豆病毒溶液 （1.04 × 106 TU/mL）。将注射器固定在立体声毒装置上。
- 向下移动靠近钻孔表面的针头。测量并移动 2.5 毫米深度。
- 以 0.2 μL/min 的速度注入 1 μL 病毒溶液。将针头放在注射区域内5分钟。慢慢地把针头移上去，直到它从老鼠头骨外面。
- 用 4 -0 丝线缝合皮肤。
- 用70%乙醇消毒切口一次。皮下注射丁酚（多罗莱克斯，0.1毫克/千克体重）。
- 将老鼠转移到带加热垫的恢复室，直到它醒来。
3. 大脑部分的可视化
注：在 EcoHIV 病毒输液后等待一到八周。
- 用5%的雌氟氨酰氨基麻醉大鼠。当大鼠对有毒刺激没有反应且没有反射时，继续踩 3.2。
- 将老鼠固定在烟罩内的超平位置。
- 沿着胸腔中线将皮肤倾斜。切开隔膜，打开胸腔。
- 在左心室插入20G×25毫米针头。
- 立即用剪刀打开右中庭。
- 以 5 mL/min 的速度灌注 50 mL 的预制 100 mM PBS。
- 以5mL/min的速度，将100mL的冷4%副甲醛灌注。
- 斩首大鼠，打开头皮，取出大脑。
- 后缀过夜与4%的副甲醛。
- 在50mL管中的100mM PBS中将大脑转移到40mL的30%蔗糖，直到大脑漂浮到底部（大约3天）。
- 捕捉冻结大脑在甲基丁醇2分钟在-80°C。
- 将脑组织固定在 -20 °C 冷冻站台内的金属平台上。
- 使用冷冻统计器切割 50μm 厚的日冕部分。
- 用细刷将脑片转移到玻璃滑梯上。
- 0.3 mL 防法介质的安装部分，并覆盖 22 毫米 50 毫米覆盖点。
- 在室温下将玻璃滑梯保持在黑暗中直到干燥。
- 根据大脑区域边界和神经元的形态特征，使用 Z 堆栈使用共焦显微镜对目标神经元进行成像。
注：使用的共焦显微镜设置为：放大60 X（A/1.4，油），Z平面间隔为0.15微米（针孔大小30微米;背投针孔半径167 nm），波长为488 nm。
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Representative Results
条件介质是从感染了293FT细胞的EcoHIV-EGFP的扁豆病毒中收集的。接下来，它被浓缩和滴答作响，然后立体地注入F344/N大鼠的大脑（皮质区域）。注射后七天，老鼠被牺牲，图像从冠状脑切片从胸围5.64毫米到布雷格玛-4.68毫米不等。在 图1A中，整个大脑都有显著的EcoHIV-EGFP信号，特别是在皮层和海马凹痕陀螺中。此外，与Iba1和EcoHIV-EGFP探头的双重标记提供了有力的证据，证明微胶质是大脑中含有EcoHIV表达的主要细胞类型（图1B）。值得注意的是，EcoHIV-EGFP的分布模式与大鼠大脑中微胶质的相对区域浓度（即海马皮层和凹痕陀螺）一致。
在随后的研究中，我们验证了EcoHIV感染在大鼠中的效用，以模拟HAND的关键方面。使用上述协议，F344/N大鼠被立体地注射EcoHIV-EGFP或盐水。首先，使用视觉间隙前脉冲抑制（图2）评估感染后八周，时间处理，手12的潜在元素维度。EcoHIV 动物对控制间歇 （ISI） 表现出相对麻木不仁，与盐水控制相比，ISI 功能相对平坦。具体来说，观察到从 50 ms ISI 到 200 ms ISI 的 ISI 函数的斜率存在显著差异（半日线 X 是日志，Y 是线性，R2s ≥ 0.99：F （1，2） =642.9， p≤0.001）.其次，用于弹道标签用于调查EcoHIV-EGFP注射对核积膜（NAc）中脊髓神经元（MSN）树突脊柱形态的影响：图3）：参数，可用于绘制关于突触功能13的推论。EcoHIV 大鼠在树突状脊柱形态上表现出深刻的变化，短树突脊柱的相对频率增加（Genotype x Bin 交互，F （16， 218） = 4.3， p ≤ 0.001） 头径增加 （Genotype x Bin 交互， F （12， 96） = 18.7， p ≤ 0.001） 和增加的颈部直径 （Genotype x Bin 交互， F （15， 120） = 16.3， p ≤ 0.001） 相对于对照动物.先前曾报告过评估时间处理14和弹道标签13的详细方法。
图1。EcoHIV-EGFP受感染的细胞分布在老鼠大脑中。 （A） 注射后7天，在海马凹痕陀螺或皮层区域的EcoHIV-EGFP表达的代表性共聚焦图像（20倍）。（B） 注射后7天与EcoHIV-EGFP受感染细胞共同本地化的Iba1免疫共聚图像（60倍）。 请单击此处查看此图的较大版本。
图2。EcoHIV感染在时间处理中引起突出的神经认知缺陷。视觉间隙前脉冲抑制是在EcoHIV或盐水的立体毒性注射八周后进行的。EcoHIV感染导致时间处理发生显著变化，这表现为相对于对控制大鼠的刺激间歇的操纵相对不敏感。麦克劳林等人描述的详细方法。请单击此处查看此图的较大版本。
图3。EcoHIV-EGFP 的感染改变了树突状脊柱的形态参数，支持了深刻的突触功能障碍。 EcoHIV大鼠在树突状脊柱形态上表现出深刻的变化，短树突状脊柱（A）相对频率增加，头部直径（B）增加，颈部直径（C）相对于对照动物增加。 请单击此处查看此图的较大版本。
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Discussion
在本议定书中，我们建立了大鼠感染EcoHIV的艾滋病毒模式。具体来说，我们描述了EcoHIV的双边立体毒性注射到皮层，在注射后7天成功地诱导了大鼠大脑中的活性HIV感染。此外，我们证明，大鼠的EcoHIV感染可能是研究HAND关键方面的一个很好的生物系统。在EcoHIV感染后八周，大鼠表现出严重的神经认知障碍，其中包括在NAc的MSN中时间处理和突触功能障碍的改变。鉴于动物模型对神经HIV和HAND2研究的重要性，开发新的生物系统可能有利于解决该领域的新问题。钾肥等3 日首次报告使用EcoHIV诱导小鼠感染HIV-1。具体来说，小鼠通过尾静脉注射3接种了0.1mL的EcoHIV病毒溶液。感染六周后，在脾脏细胞和淋巴细胞中检测到HIV-1病毒DNA。此外，一次EcoHIV注射的接种足以诱发超过75%的小鼠感染。利用双边立体毒性注射，如本研究，成功感染了100%的大鼠（分别为n = 6或n = 4），通过注射后7天在大脑中检测EcoHIV-EGFP证明。
先前的研究表明，EcoHIV在小鼠身上的感染强烈地暗示，大脑微胶质极易感染EcoHIV病毒。在这项研究中，结合Iba1（微胶质细胞标记）免疫学，观察到EGFP信号与Iba1+细胞的重要共同定位，强烈表明微胶质是大鼠大脑中EcoHIV感染的主要细胞类型。微胶质中显著的EcoHIV感染的观察与EcoHIV感染小鼠6的数据以及HIV-1血清活性个体15和其他通常用于模拟HIV16、17的生物系统一致。我们还对F344/N大鼠进行了EcoHIV-EGFP的逆轨注射，数据还表明，仅7天后，EcoHIV-EGFP在皮层和海马凹痕陀螺中都表现良好（数据未显示）。相比之下，在F344/N大鼠中注射EcoHIV会导致大鼠大脑中检测不到病毒表达，而没有高剂量的EcoHIV扁豆病毒。
关于此协议，研究人员应确保条件介质（包括 293 FT 细胞中的 EcoHIV 扁豆病毒包装）在用于立体酸注射之前进行浓缩和滴定。这些步骤对于确保在整个实验中取得一致和可复制的结果至关重要。此外，我们还发现EcoHIV感染在注射后8周从大脑中的立体毒性注射传播到脾脏组织。同时，在EcoHIV感染的老鼠中观察到时间处理缺陷，最早为14天，并在感染后维持8周（目前的实验终端时间， 图2）。与小鼠的通用EcoHIV感染模式相比，EcoHIV更具体的区域立体毒性注射在大脑区域产生有效的HIV感染，并产生大鼠的时效处理缺陷，这是研究HIV相关神经认知功能障碍的关键。
为当前协议提供更多机会的限制包括识别其他细胞类型，如神经元和星形细胞，对感染后EcoHIV-EGFP表达的变化进行时间过程研究，以指示病毒复制和大脑延迟，纵向研究，以解决艾滋病毒相关神经认知缺陷的潜在影响，以及评估EcoHIV的立体税性注射是否避开免疫系统进一步传播病毒表达在整个b奥迪此外，这应该在其他大鼠菌株上进行测试，以确认EcoHIV感染在大鼠中的普遍性。
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Disclosures
作者无一有利益冲突要申报。
Acknowledgments
这项工作由NIH赠款HD043680、MH106392、DA013137和NS100624资助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 293FT cells | ThermoFisher Scientific | R70007 | |
| Antibiotic-Antimycotic solution | Cellgro | 30004CI | 100X |
| Corning BioCoatGelatin 75cm² Rectangular Canted Neck Cell Culture Flask with Vented Cap | Life Technologies | 354488 | |
| Corning DMEM with L-Glutamine, 4.5 g/L Glucose and Sodium Pyruvate | Life Technologies | 10013CV | |
| Cover glass | VWR | 637-137 | |
| drill | |||
| Dumont #5 Forceps | World Precision Instruments | 14095 | |
| Dumont #7 Forceps | World Precision Instruments | 14097 | |
| Eppendorf Snap-Cap Microcentrifuge Biopur Safe-Lock Tubes | Life Technologies | 22600028 | |
| Ethicon Vicryl Plus Antibacterial, 4-0 Polyglactin 910 Suture, 27in. FS-2 | Med Vet International | VCP422H | |
| Hamilton syringe | Hamilton | 1701 | |
| Invitrogen Lipofectamine 3000 Transfection Reagent | Life Technologies | L3000015 | |
| Iris Forceps | World Precision Instruments | 15914 | |
| Iris Scissors | World Precision Instruments | 500216 | |
| Lentivirus-Associated p24 ELISA Kit | Cell Biolabs, inc. | VPK-107-5 | |
| Lenti-X Concentrator | Takara | PT4421-2 | |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Life Technologies | 11058021 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127-500G | |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
| ProLong Gold | Fisher Scientific | P36930 | |
| Sevoflurane | Merritt Veterinary Supply | 347075 | |
| stereotaxic apparatus | Kopf Instruments | Model 900 | |
| SuperFrost Plus Slides | Fisher Scientific | 12-550-154% | |
| Vannas Scissors | World Precision Instruments | 500086 |
References
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