Summary
Hier stellen wir ein Protokoll vor, um ein neues Rattenmodell der aktiven HIV-Infektion mit chimärem HIV (EcoHIV) zu etablieren, das entscheidend ist, um unser Verständnis von HIV-1-Virusreservoirs im Gehirn zu verbessern und ein System zur Untersuchung von HIV-assoziierten neurokognitiven Störungen und damit verbundenen Komorbiditäten (dh Drogenmissbrauch) anzubieten.
Abstract
Es wurde gut untersucht, dass das EcoHIV-infizierte Mausmodell bei der Untersuchung von HIV-assoziierten neurologischen Komplikationen von erheblichem Nutzen ist. Die Etablierung des EcoHIV-infizierten Rattenmodells für Studien zu Drogenmissbrauch und neurokognitiven Störungen wäre bei der Untersuchung von neuroHIV- und HIV-1-assoziierten neurokognitiven Störungen (HAND) von Vorteil. In der vorliegenden Studie demonstrieren wir die erfolgreiche Erstellung eines Rattenmodells der aktiven HIV-Infektion mit chimärem HIV (EcoHIV). Zunächst wurde das lentivirale Konstrukt von EcoHIV 48 Stunden lang in kultivierten 293 FT-Zellen verpackt. Dann wurde das bedingte Medium konzentriert und titeriert. Als nächstes führten wir bilaterale stereotaktische Injektionen des EcoHIV-EGFP in F344/ N Rattenhirngewebe durch. Eine Woche nach der Infektion wurden EGFP-Fluoreszenzsignale im infizierten Hirngewebe nachgewiesen, was darauf hindeutet, dass EcoHIV bei Ratten erfolgreich eine aktive HIV-Infektion induziert. Zusätzlich wurde eine Immunfärbung für den mikroglialen Zellmarker Iba1 durchgeführt. Die Ergebnisse zeigten, dass Mikroglia der vorherrschende Zelltyp waren, der EcoHIV beherbergte. Darüber hinaus zeigten EcoHIV-Ratten Veränderungen in der zeitlichen Verarbeitung, einen möglicherweise zugrunde liegenden neurobehavioralen Mechanismus von HAND sowie synaptische Dysfunktion acht Wochen nach der Infektion. Insgesamt erweitert die vorliegende Studie das EcoHIV-Modell der HIV-1-Infektion auf die Ratte und bietet ein wertvolles biologisches System, um HIV-1-Virusreservoirs im Gehirn sowie HAND und damit verbundene Komorbiditäten wie Drogenmissbrauch zu untersuchen.
Introduction
Biologische Systeme haben unser Verständnis von HIV-1-assoziierten neurokognitiven Störungen (HAND) und ihren zugrunde liegenden neuronalen Mechanismen verbessert2. Die Bestimmung, welches biologische System für eine bestimmte Studie am besten geeignet ist, hängt oft von der Frage des Interesses ab2. Die Begrenzung der Bandbreite der Wirtstiermodelle stellt Studien zur Entwicklung der HIV-1-Krankheit in Den mittelpunkt. Um die HIV-1-Virusreplikation und Pathogenese zu untersuchen, erstellten Potash et al.3 ein Mausmodell der aktiven HIV-1-Infektion, das die kodierende Region des HIV-Oberflächenhüllenglykoproteins gp120 durch ökotropes MLV gp80 ersetzte, was zu einer erfolgreichen Virusreplikation bei Mäusen führte4. Nach Injektionen von Schwanzvenen bei chimären HIV-Mäusen (EcoHIV) wurden viele Merkmale beobachtet, die denen von HIV-1-seropositiven Personen ähneln (z. B. infizierte Lymphozyten und Makrophagen, die auf antivirale Immunantworten abzielen, und Entzündungen3,5,6).
Obwohl Mäuse und Ratten beide Mitglieder der Muridae sind, können grundlegende Artenunterschiede ihre Eignung für spezifische experimentelle Fragen beeinflussen7. Daher wäre die Ausweitung des EcoHIV-Infektionsmodells auf Ratten (häufig in Studien zu Drogenmissbrauch und neurokognitiven Störungen verwendet) bei der Untersuchung von neuroHIV von Vorteil. Zum Beispiel macht ihre größere Größe die Implantation von Jugularkathetern für Selbstverabreichungsverfahren von Medikamenten praktischer8. Techniken der Selbstverabreichung von Medikamenten bei Ratten wurden verwendet, um die Motivation bei HIV-19zu bewerten. Darüber hinaus wurden viele neurokognitive / verhaltende Aufgaben ursprünglich für Ratten entwickelt10. Hier berichten wir über die Verwendung stereotaktischer Injektionen von EcoHIV bei Ratten, um das EcoHIV-Infektionsmodell zu erweitern und eine wichtige Gelegenheit zu bieten, neue Fragen im Zusammenhang mit neuroHIV und HAND zu beantworten.
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Protocol
Alle Tierprotokolle wurden vom Animal Care and Use Committee der University of South Carolina überprüft und genehmigt (Bundesversicherungsnummer: D16-00028). Sechs erwachsene männliche F344/ N-Ratten wurden in einer kontrollierten Umgebung unter einem 12/12 Light: Dark-Zyklus mit ad libitum Zugang zu Nahrung und Wasser untergebracht. Alle Tiere wurden nach Richtlinien gepflegt, die von den National Institutes of Health im Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren festgelegt wurden.
1. Virusverpackung in 293 FT-Zellen
- Die 293 FT-Zellen (5×105/ml) werden in gelatinebeschichteten 75 cm2 Kolben mit DMEM plus 10% FBS11 kultiviert. Züchten Sie Zellen bei 37 °C, um bei der Transfektion zu 50% konfluent zu sein.
- 22,5 μL Transfektionsreagenz (z. B. Lipofectamin 3000) in 750 μL Medium (z. B. Opti-MEM) in einem 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen und Wirbel für 3 s verdünnen.
- 20 μg EcoHIV-Plasmid-DNA in 750 μL Medium in einem 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen verdünnen und gut mischen.
- Verdünnte DNA in die Tube des verdünnten Transfektionsreagenzes geben und vorsichtig mischen. 15 min bei Raumtemperatur inkubieren.
- Die Mischung wird in 10 ml vorgewärmtes DMEM-Medium in 75 cm2 Kolben geben. Inkubieren Sie die Zellen für 2 Tage bei 37 °C.
- Ernten und kombinieren Sie 24 ml konditioniertes Medium aus den beiden Kolben, die das verpackte Lentivirus enthalten.
- Zentrifugieren Sie alle 24 ml Konditionalmedium bei 500 x g für 10 Minuten bei 4 °C. Den geklärten Überstand in ein steriles 50 ml Röhrchen geben.
- Kombinieren Sie 8 ml Lenti-x-Konzentrator mit 24 ml geklärten Überstand (Verhältnis 1:3). Mischen Sie durch sanfte Inversion. Mischung bei 4 °C für zwei Tage inkubieren.
- Zentrifugenmischung bei 1.500 x g für 45 Minuten bei 4 °C. Entfernen Sie vorsichtig den Überstand.
- Suspendieren Sie das Pellet vorsichtig mit 100 μL 100 mM PBS.
- Titerviruskonzentration mit einem p24 ELISA-Kit.
2. EcoHIV-EGFP Virus stereotaxische Operationen
- Anästhesieren Sie Ratten mit 3% Sevofluran. Fahren Sie mit Schritt 2.2 fort, wenn die Ratten nicht auf schädliche Reize reagieren und Reflexe fehlen.
- Rasieren Sie die Haare aus der Gehirnregion und sterilisieren Sie die Haut zweimal mit 70% Ethanol und einem Peeling auf Chlorhexidinbasis. Sichern Sie die Ratte in Bauchlage im stereotaxischen Apparat.
- Machen Sie einen Schnitt (5-6 cm) durch die Haut entlang der Kopfhautmittellinie.
- Markieren Sie zwei Bohrpositionen bei 0,8 mm seitlich, 1,2 mm rostral bis bregma. Bohren Sie in jede Schädelposition ein Loch (Durchmesser 0,4 mm).
- Füllen Sie titerierte EcoHIV-Lentiviruslösung (1,04 × 106 TU/ml) in eine 10 μL Injektionsspritze. Befestigen Sie die Spritze am stereotaktischen Gerät.
- Bewegen Sie die Nadel nahe an die Oberfläche des Bohrlochs. Messen und bewegen Sie 2,5 mm in der Tiefe.
- 1 μL Viruslösung mit einer Rate von 0,2 μL/min infundieren. Halten Sie die Nadel 5 Minuten lang im Injektionsbereich. Bewegen Sie die Nadel langsam nach oben, bis sie sich außerhalb des Rattenschädels befindet.
- Nähen Sie die Haut mit einem 4-0 Seidenfaden.
- Sterilisieren Sie den Schnitt einmal mit 70% Ethanol. Subkutane Injektion von Butorphenol (Dorolex, 0,1 mg/kg Körpergewicht).
- Die Ratte mit einem Heizkissen in eine Aufwachkammer bringen, bis sie aufwacht.
3. Visualisierung von Hirnschnitten
HINWEIS: Warten Sie ein bis acht Wochen nach der EcoHIV-Virusinfusion.
- Betäuben Sie die Ratte mit 5% Sevofluran. Fahren Sie mit Schritt 3.2 fort, wenn die Ratten nicht auf schädliche Reize reagieren und Reflexe fehlen.
- Befestigen Sie die Ratte in Rückenlage in einem Abzug.
- Schneiden Sie die Haut entlang der thorakalen Mittellinie. Schneiden Sie das Zwerchfell ab und öffnen Sie die Brusthöhle.
- Führen Sie eine 20 G × 25 mm Nadel in den linken Ventrikel ein.
- Öffnen Sie sofort das rechte Atrium mit einer Schere.
- 50 ml vorgefertigtes 100 mM PBS mit einer Geschwindigkeit von 5 ml/min perperieren.
- 100 ml kaltes 4% Paraformaldehyd mit einer Geschwindigkeit von 5 ml/min perfundieren.
- Enthaupten Sie die Ratte, öffnen Sie die Kopfhaut und entfernen Sie das Gehirn.
- Postfix über Nacht mit 4% Paraformaldehyd.
- Übertragen Sie das Gehirn auf 40 ml 30% Saccharose in 100 mM PBS in 50 ml Röhrchen, bis das Gehirn nach unten schwebt (ca. 3 Tage).
- Schnappen Sie das Gehirn in Methylbutanol für 2 min bei - 80 °C ein.
- Sichern Sie das Hirngewebe auf einer Metallplattform in einem -20 °C Kryostaten.
- Schneiden Sie 50 μm dicke koronale Abschnitte mit dem Kryostaten.
- Übertragen Sie die Gehirnscheiben mit einem feinen Pinsel auf Glasobjektträger.
- Montageabschnitte in 0,3 mL Antifademedium und Abdeckung mit 22 mm 50 mm Deckrippen.
- Halten Sie die Glasobjektträger im Dunkeln bei Raumtemperatur, bis sie trocken sind.
- Stellen Sie die anvisierten Neuronen mit einem konfokalen Mikroskop mit Z-Stack ab, der auf den Grenzen der Hirnregion und den morphologischen Merkmalen der Neuronen basiert.
HINWEIS: Die verwendeten konfokalen Mikroskopeinstellungen waren: Vergrößerung von 60 X (A/1,4, Öl) und ein Z-Ebenenintervall von 0,15 μm (Lochgröße 30 μm; rückprojektierter Lochradius 167 nm) mit einer Wellenlänge von 488 nm.
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Representative Results
Das konditionierte Medium wurde aus Lentivirus von EcoHIV-EGFP-infizierten 293FT-Zellen entnommen. Als nächstes wurde es konzentriert und titeriert, dann stereotrisch in das Gehirn (kortikale Region) von F344 / N-Ratten injiziert. Sieben Tage nach der Injektion wurden Ratten geopfert und Bilder von koronalen Hirnschnitten von Bregma 5,64 mm bis Bregma -4,68 mm aufgenommen. In Abbildung 1Agibt es signifikante EcoHIV-EGFP-Signale im gesamten Gehirn, insbesondere im Kortex und im Gyrus hippocampus dentatus. Darüber hinaus lieferte die Dual-Labeling mit Iba1- und EcoHIV-EGFP-Sonden starke Beweise dafür, dass Mikroglia der vorherrschende Zelltyp waren, der die EcoHIV-Expression im Gehirn beherbergte (Abbildung 1B). Bemerkenswerterweise stimmt das Verteilungsmuster von EcoHIV-EGFP mit den relativen regionalen Konzentrationen von Mikroglia im Rattengehirn (d. H. Kortex und Gyrus dentatus des Hippocampus) überein.
In einer anschließenden Studie haben wir den Nutzen einer EcoHIV-Infektion bei Ratten validiert, um Schlüsselaspekte von HAND zu modellieren. Unter Verwendung des oben beschriebenen Protokolls wurden F344/N-Ratten stereotaxisch entweder mit EcoHIV-EGFP oder Kochsalzlösung injiziert. Zunächst wurde acht Wochen nach der Infektion die zeitliche Verarbeitung, eine mögliche elementare Dimension von HAND12,mittels visueller Spaltvorpulshemmung bewertet (Abbildung 2). EcoHIV-Tiere zeigten eine relative Unempfindlichkeit gegenüber der Manipulation des Interstimulusintervalls (ISI), was durch eine relativ flachere ISI-Funktion im Vergleich zu Salzkontrollen belegt wird. Insbesondere wurden signifikante Unterschiede in der Steigung der ISI-Funktion von der 50 ms ISI zur 200 ms ISI beobachtet (Semilog Line-X ist Log, Y ist linear,R2s ≥ 0,99; F(1,2)=642,9, S≤0,001). Zweitens wurde die ballistische Markierung verwendet, um den Einfluss von EcoHIV-EGFP-Injektionen auf die Morphologie dendritischer Stacheln in medium stacheligen Neuronen (MSN) des Nucleus accumbens (NAc; Abbildung 3); Parameter, die verwendet werden können, um Rückschlüsse auf die synaptische Funktion13zu ziehen. EcoHIV-Ratten zeigten tiefgreifende Veränderungen in der morphologischen Wirbelsäule, was durch eine erhöhte relative Häufigkeit kürzerer dendritischer Stacheln (Genotyp x Bin Interaction, F(16, 218) = 4,3, p ≤ 0,001) mit einem erhöhten Kopfdurchmesser (Genotyp x Bin Interaction, F(12, 96) = 18,7, p ≤ 0,001) und einem erhöhten Halsdurchmesser (Genotype x Bin Interaction, F(15, 120) = 16,3, p ≤ 0,001) im Vergleich zu Kontrolltieren belegt wird. Detaillierte Methodik für die Bewertung der zeitlichen Verarbeitung14 und ballistischen Markierung13 wurden bereits berichtet.
Abbildung 1. Das EcoHIV-EGFP infizierte Zellen, die im Rattengehirn verteilt sind. (A) Die repräsentativen konfokalen Bilder (20x) der EcoHIV-EGFP-Expression in Gyrus- oder Kortexregionen des Hippocampus dentatus oder der Kortexregionen 7 Tage nach der Injektion. (B) Die repräsentativen konfokalen Bilder (60X) der Co-Lokalisation von Iba1-Immunfärbung mit EcoHIV-EGFP-infizierten Zellen 7 Tage nach der Injektion. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2. Die EcoHIV-Infektion induzierte prominente neurokognitive Defizite in der zeitlichen Verarbeitung. Die Hemmung des visuellen Spaltvorpulses wurde acht Wochen nach stereotaktischen Injektionen von EcoHIV oder Kochsalzlösung durchgeführt. Die EcoHIV-Infektion induzierte prominente Veränderungen in der zeitlichen Verarbeitung, die durch die relative Unempfindlichkeit gegenüber der Manipulation des Interstimulusintervalls im Vergleich zu Kontrollratten belegt werden. Detaillierte Methodik beschrieben in McLaurin et al.13. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3. Die Infektiosität mit EcoHIV-EGFP veränderte die morphologischen Parameter der dendritischen Stacheln und unterstützte eine tiefgreifende synaptische Dysfunktion. EcoHIV-Ratten zeigten tiefgreifende Veränderungen in der morphologischen dendritischen Wirbelsäule, was durch eine erhöhte relative Häufigkeit kürzerer dendritischer Stacheln (A) mit einem erhöhten Kopfdurchmesser (B) und einem erhöhten Halsdurchmesser (C) im Vergleich zu Kontrolltieren belegt wird. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
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Discussion
In diesem Protokoll haben wir ein EcoHIV-induziertes HIV-Infektionsmodell bei Ratten etabliert. Insbesondere beschrieben wir eine bilaterale stereotaktische Injektion von EcoHIV in den Kortex, die 7 Tage nach der Injektion erfolgreich eine aktive HIV-Infektion im Rattengehirn induzierte. Darüber hinaus zeigen wir, dass ecoHIV-Infektionen bei Ratten ein gutes biologisches System sein könnten, um Schlüsselaspekte von HAND zu untersuchen. Acht Wochen nach der EcoHIV-Infektion zeigten Ratten signifikante neurokognitive Beeinträchtigungen, einschließlich der Veränderungen in der zeitlichen Verarbeitung und synaptischen Dysfunktion in MSNs des NAc. Angesichts der Bedeutung von Tiermodellen für die Untersuchung von neuroHIV und HAND2kann die Entwicklung eines neuen biologischen Systems vorteilhaft sein, um neue Fragen innerhalb des Feldes zu beantworten. Potash et al.3 berichteten zuerst über die Verwendung von EcoHIV zur Induktion einer aktiven HIV-1-Infektion bei Mäusen. Insbesondere wurden Mäuse mit einer 0,1 ml Lösung des EcoHIV-Virus durch Injektionen in die Schwanzvenegeimpft 3. Sechs Wochen nach der Infektion wurde die HIV-1-Virus-DNA in Milzzellen und Lymphozyten nachgewiesen. Darüber hinaus reichte eine Impfung der EcoHIV-Injektion aus, um bei mehr als 75% der Mäuse eine Infektion auszulösen. Die Verwendung bilateraler stereotaxischer Injektionen, wie in dieser Studie, infizierte erfolgreich 100% der Ratten (n = 6 bzw. n = 4), was durch den Nachweis von EcoHIV-EGFP im Gehirn sieben Tage nach der Injektion belegt wurde.
Frühere Studien haben gezeigt, dass eine Infektion durch EcoHIV in der Maus stark impliziert, dass Mikroglia im Gehirn sehr anfällig für ecoHIV-Virusinfektionen sind3. In dieser Studie, kombiniert mit Iba1 (einem Mikrogliazellmarker) Immunfärbung, wurde eine signifikante Co-Lokalisation des EGFP-Signals mit Iba1 + -Zellen beobachtet, was stark darauf hindeutet, dass Mikroglia der Hauptzelltyp für EcoHIV-Infektionen im Rattengehirn waren. Beobachtungen einer signifikanten EcoHIV-Infektion in Mikroglia stimmen mit Daten bei EcoHIV-infizierten Mäusen6sowie HIV-1-seropositiven Personen15 und anderen biologischen Systemen überein, die üblicherweise zur Modellierung von HIV16verwendet werden,17. Wir führten auch eine retroorbitale Injektion von EcoHIV-EGFP in F344/N-Ratten durch, und die Daten zeigten auch eine hohe Expression von EcoHIV-EGFP sowohl im Kortex als auch im Gyrus hippocampus dentatus nach nur sieben Tagen (Daten nicht gezeigt). Im Gegensatz dazu führte die I.P.-Injektion von EcoHIV in F344/N-Ratten trotz hoher Dosen von EcoHIV-Lentivirus zu einer nicht nachweisbaren viralen Expression im Rattengehirn.
In Bezug auf dieses Protokoll sollten die Forscher sicherstellen, dass das konditionierte Medium, einschließlich der EcoHIV-Lentivirus-Verpackung in 293 FT-Zellen, konzentriert und titeriert wird, bevor es für die stereotaxische Injektion verwendet wird. Diese Schritte sind entscheidend, um konsistente und replizierbare Ergebnisse über Experimente hinweg sicherzustellen. Darüber hinaus fanden wir auch heraus, dass die EcoHIV-Infektion 8 Wochen nach der Injektion von der stereotaxischen Injektion in das Gehirn auf das Milzgewebe übertragen wurde. In der Zwischenzeit wurden die zeitlichen Verarbeitungsdefizite bei EcoHIV-infizierten Ratten bereits 14 Tage beobachtet und über 8 Wochen nach der Infektion aufrechterhalten (die aktuelle experimentelle Endzeit, Abbildung 2). Im Vergleich zum generalisierten EcoHIV-Infektionsmodell bei Mäusen führte die spezifischere regionale stereotaxische Injektion von EcoHIV zu einer effizienten HIV-Infektion in Gehirnbereichen und zu einem zeitlichen Verarbeitungsdefizit bei Ratten, was für die Untersuchung der HIV-assoziierten neurokognitiven Dysfunktion von entscheidender Bedeutung ist.
Zu den Einschränkungen, die weitere Möglichkeiten für das aktuelle Protokoll bieten, gehören die Identifizierung anderer Zelltypen wie Neuronen und Astrozyten, eine Zeitstudie über Veränderungen der EcoHIV-EGFP-Expression nach einer Infektion, um die Virusreplikation und Latenz im Gehirn anzuzeigen, eine Längsschnittstudie zur Behandlung der potenziellen Auswirkungen von HIV-assoziierten neurokognitiven Defiziten und die Bewertung, ob die stereotaxische Injektion von EcoHIV dem Immunsystem entgeht und die Virusexpression im gesamten b weiter verbreitet ody. Darüber hinaus sollte dies an anderen Rattenstämmen getestet werden, um die Generalisierbarkeit der EcoHIV-Infektion bei Ratten zu bestätigen.
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Disclosures
Keiner der Autoren hat Interessenkonflikte zu erklären.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde durch die NIH-Zuschüsse HD043680, MH106392, DA013137 und NS100624 finanziert.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 293FT cells | ThermoFisher Scientific | R70007 | |
| Antibiotic-Antimycotic solution | Cellgro | 30004CI | 100X |
| Corning BioCoatGelatin 75cm² Rectangular Canted Neck Cell Culture Flask with Vented Cap | Life Technologies | 354488 | |
| Corning DMEM with L-Glutamine, 4.5 g/L Glucose and Sodium Pyruvate | Life Technologies | 10013CV | |
| Cover glass | VWR | 637-137 | |
| drill | |||
| Dumont #5 Forceps | World Precision Instruments | 14095 | |
| Dumont #7 Forceps | World Precision Instruments | 14097 | |
| Eppendorf Snap-Cap Microcentrifuge Biopur Safe-Lock Tubes | Life Technologies | 22600028 | |
| Ethicon Vicryl Plus Antibacterial, 4-0 Polyglactin 910 Suture, 27in. FS-2 | Med Vet International | VCP422H | |
| Hamilton syringe | Hamilton | 1701 | |
| Invitrogen Lipofectamine 3000 Transfection Reagent | Life Technologies | L3000015 | |
| Iris Forceps | World Precision Instruments | 15914 | |
| Iris Scissors | World Precision Instruments | 500216 | |
| Lentivirus-Associated p24 ELISA Kit | Cell Biolabs, inc. | VPK-107-5 | |
| Lenti-X Concentrator | Takara | PT4421-2 | |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Life Technologies | 11058021 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127-500G | |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
| ProLong Gold | Fisher Scientific | P36930 | |
| Sevoflurane | Merritt Veterinary Supply | 347075 | |
| stereotaxic apparatus | Kopf Instruments | Model 900 | |
| SuperFrost Plus Slides | Fisher Scientific | 12-550-154% | |
| Vannas Scissors | World Precision Instruments | 500086 |
References
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