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Neuroscience

EcoHIV मस्तिष्क संक्रमण का एक चूहा मॉडल

Published: January 21, 2021 doi: 10.3791/62137
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Program in Behavioral Neuroscience, Department of Psychology, University of South Carolina

Summary

यहां, हम चिमरिक एचआईवी (EcoHIV) का उपयोग करके सक्रिय एचआईवी संक्रमण का एक नया चूहा मॉडल स्थापित करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं, जो मस्तिष्क में एचआईवी-1 वायरल जलाशयों की हमारी समझ को बढ़ाने और एचआईवी से जुड़े न्यूरोकॉग्निटिव विकारों और संबद्ध comorbidities (यानी, नशीली दवाओं के दुरुपयोग) का अध्ययन करने के लिए एक प्रणाली की पेशकश के लिए महत्वपूर्ण है ।

Abstract

यह अच्छी तरह से अध्ययन किया गया है कि EcoHIV संक्रमित माउस मॉडल एचआईवी से जुड़े तंत्रिका संबंधी जटिलताओं की जांच में महत्वपूर्ण उपयोगिता का है । नशीली दवाओं के दुरुपयोग और न्यूरोकॉग्निटिव विकारों के अध्ययन के लिए इकोहिव संक्रमित चूहा मॉडल की स्थापना, न्यूरोहिव और एचआईवी-1 संबद्ध न्यूरोकॉग्निटिव विकारों (हाथ) के अध्ययन में फायदेमंद होगी। वर्तमान अध्ययन में, हम चिमरिक एचआईवी (EcoHIV) का उपयोग करके सक्रिय एचआईवी संक्रमण के चूहे मॉडल के सफल निर्माण को प्रदर्शित करते हैं। सबसे पहले, इकोहिव के लेंटीवियरल निर्माण को 48 घंटे के लिए सुसंस्कृत 293 फीट कोशिकाओं में पैक किया गया था। फिर, सशर्त माध्यम केंद्रित और titered था। इसके बाद, हमने F344/N चूहा मस्तिष्क ऊतक में EcoHIV-EGFP के द्विपक्षीय स्टीरियोटैक्सिक इंजेक्शन का प्रदर्शन किया । संक्रमण के एक सप्ताह बाद, संक्रमित मस्तिष्क ऊतक में EGFP फ्लोरेसेंस संकेतों का पता चला, यह दर्शाता है कि EcoHIV सफलतापूर्वक चूहों में एक सक्रिय एचआईवी संक्रमण लाती है । इसके अलावा माइक्रोग्लियल सेल मार्कर, आईबीए1 के लिए इम्यूनोस्टेटिंग का प्रदर्शन किया गया । परिणामों से संकेत मिलता है कि माइक्रोग्लिया प्रमुख सेल प्रकार इकोहिव को शरण देते थे। इसके अलावा, इकोहिव चूहों ने अस्थायी प्रसंस्करण में परिवर्तन का प्रदर्शन किया, जो संक्रमण के आठ सप्ताह बाद हाथ के संभावित अंतर्निहित न्यूरोबिहेवियरल तंत्र के साथ-साथ सिनैप्टिक डिसफंक्शन भी है। सामूहिक रूप से, वर्तमान अध्ययन एचआईवी-1 संक्रमण के EcoHIV मॉडल को मस्तिष्क में एचआईवी-1 वायरल जलाशयों के साथ-साथ नशीली दवाओं के दुरुपयोग जैसे हाथ और संबद्ध comorbidities का अध्ययन करने के लिए एक मूल्यवान जैविक प्रणाली की पेशकश चूहे के लिए फैली हुई है ।

Introduction

जैविक प्रणालियों ने एचआईवी-1 संबद्ध न्यूरोकॉग्निटिव विकारों (हाथ) और उनके अंतर्निहित तंत्रिका तंत्र2के बारे में हमारी समझ को बढ़ाया है । यह निर्धारित करना कि किसी भी अध्ययन के लिए कौन सी जैविक प्रणाली सबसे उपयुक्त है , यह अक्सर ब्याज के प्रश्न पर निर्भर करता है2. मेजबान पशु मॉडल की सीमा की सीमा एचआईवी-1 रोग विकास के अध्ययन को चुनौती देता है। एचआईवी-1 वायरल प्रतिकृति और रोगजनन की जांच करने के लिए, पोटाश एट अल3 ने सक्रिय एचआईवी-1 संक्रमण का एक माउस मॉडल बनाया, एचआईवी सतह लिफाफा ग्लाइकोप्रोटीन, gp120 के कोडिंग क्षेत्र की जगह, इकोट्रॉपिक एमएलवी जीपी 80 के साथ, जिसके कारण चूहों में सफल वायरल प्रतिकृति4। चिमरिक एचआईवी (इकोएचआईवी) चूहों में पूंछ नस इंजेक्शन के बाद, एचआईवी-1 सेरोपॉजिटिव व्यक्तियों (उदाहरण के लिए, संक्रमित लिम्फोसाइट्स और मैक्रोफेज, एंटीवायरल प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं और सूजन3,5,6)के समान कई विशेषताओं को देखा गया।

यद्यपि चूहे और चूहे दोनों मुरीडी के सदस्य हैं, लेकिन मौलिक प्रजातियों के अंतर विशिष्ट प्रयोगात्मक प्रश्नों के लिए उनकी उपयुक्तता को प्रभावित कर सकते हैं7। इसलिए, चूहों के लिए इकोहिव संक्रमण मॉडल का विस्तार (आमतौर पर नशीली दवाओं के दुरुपयोग और न्यूरोकॉग्निटिव विकारों के अध्ययन में उपयोग किया जाता है) न्यूरोहिव के अध्ययन में लाभप्रद होगा। उदाहरण के लिए, उनका बड़ा आकार दवा स्व-प्रशासन प्रक्रियाओं के लिए जुगुलर कैथेटर प्रत्यारोपण को अधिक व्यावहारिक8बनाता है। चूहों में दवा स्व-प्रशासन तकनीकों का उपयोग एचआईवी-19में प्रेरणा का मूल्यांकन करने के लिए किया गया है। इसके अलावा, कई न्यूरोकॉग्निटिव/व्यवहार कार्यों को शुरू में चूहों10के लिए डिजाइन किया गया था । यहां, हम इकोहिव संक्रमण मॉडल का विस्तार करने के लिए चूहों में इकोहीव के स्टीरियोटैक्सिक इंजेक्शन के उपयोग की रिपोर्ट करते हैं और न्यूरोहिव और हैंड से संबंधित उपन्यास प्रश्नों को संबोधित करने का एक महत्वपूर्ण अवसर प्रदान करते हैं।

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Protocol

सभी पशु प्रोटोकॉल की समीक्षा की और दक्षिण कैरोलिना विश्वविद्यालय में पशु देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित किया गया (संघीय आश्वासन संख्या: D16-00028) । छह वयस्क पुरुष F344/N चूहा एक 12/12 प्रकाश के तहत एक नियंत्रित वातावरण में रखे जोड़ी: भोजन और पानी के लिए विज्ञापन libitum उपयोग के साथ अंधेरे चक्र था । सभी जानवरों की देखभाल और प्रयोगशाला जानवरों के उपयोग के लिए गाइड में स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थानों द्वारा स्थापित दिशा निर्देशों का उपयोग करने के लिए देखभाल की गई ।

1. 293 एफटी कोशिकाओं में वायरस पैकेजिंग

  1. संस्कृति जिलेटिन में २९३ एफटी कोशिकाओं (५×१०5/एमएल)को लेपित ७५ सेमी2 फ्लास्क के साथ डीएमईएम प्लस 10% एफबीएस11। 37 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं को विकसित करने के लिए ट्रांसफैक्शन पर 50% संकुचित हो।
  2. 1.5 एमएल माइक्रो-सेंट्रलाइज ट्यूब और 3 एस के लिए भंवर में 750 माइक्रोल ऑफ मीडियम (जैसे, ऑप्टी-एमईएम) में ट्रांसफेक्शन रिएजेंट (जैसे, लिपोफेटामाइन 3000) का पतला 22.5 माइक्रोल।
  3. 1.5 एमएल माइक्रो-सेंट्रलाइज ट्यूब में माध्यम के 750 माइक्रोल में इकोएचआईवी प्लाज्मिड डीएनए के 20 माइक्रोग्राम को पतला करें और अच्छी तरह से मिलाएं।
  4. पतला ट्रांसफैक्शन रिएजेंट की ट्यूब में पतला डीएनए जोड़ें और धीरे-धीरे मिलाएं। कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए इनक्यूबेट।
  5. मिश्रण को 75 सेमी2 फ्लास्क में प्रीवार्म्ड डीएमईएम माध्यम के 10 एमएल में जोड़ें। 37 डिग्री सेल्सियस पर 2 दिनों के लिए इनक्यूबेट कोशिकाओं।
  6. फसल और पैक लेंटीवायरस शामिल दो फ्लास्क से सशर्त माध्यम के 24 एमएल गठबंधन।
  7. सेंट्रलाइज सशर्त माध्यम के सभी 24 एमएल 500 एक्स ग्राम पर 10 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर। स्पष्ट सुपरनेट को बाँझ 50 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें।
  8. स्पष्ट सुपरनेट (1:3 अनुपात) के 24 एमएल के साथ लेंटी-एक्स ध्यान केंद्रित के 8 एमएल को मिलाएं। कोमल उलटा द्वारा मिलाएं। दो दिनों के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर मिश्रण इनक्यूबेट करें।
  9. 4 डिग्री सेल्सियस पर 45 मिनट के लिए 1,500 x ग्राम पर सेंट्रलाइज मिश्रण। सुपरनेट को सावधानी से दूर करें।
  10. धीरे-धीरे 100 m M PBS के 100 μL के साथ गोली को फिर से निलंबित करें।
  11. एक p24 एलिसा किट के साथ टाइटर वायरस एकाग्रता।

2. इकोहिव-ईजीएफपी वायरस स्टीरियोटैक्सिक सर्जरी

  1. 3% सेवोफ्लुरन का उपयोग करके चूहों को एनेस्थेटाइज करें। जब चूहे हानिकारक उत्तेजनाओं के प्रति उत्तरदायी नहीं होते हैं और सजगता अनुपस्थित होती है तो 2.2 चरण के लिए आगे बढ़ें।
  2. मस्तिष्क क्षेत्र से बाल दाढ़ी और 70% इथेनॉल और एक क्लोरहेक्सीडीन आधारित स्क्रब के साथ दो बार त्वचा को निष्फल करें। स्टीरियोटैक्सिक उपकरण में प्रवण स्थिति में चूहे को सुरक्षित करें।
  3. स्कैल्प मिडलाइन के साथ त्वचा के माध्यम से एक चीरा (5-6 सेमी) बनाएं।
  4. 0.8 मिमी पार्श्व, 1.2 मिमी रोस्ट्रल से ब्रेग्मा पर दो ड्रिलिंग पदों को चिह्नित करें। प्रत्येक खोपड़ी की स्थिति में एक छेद (व्यास 0.4 मिमी) ड्रिल करें।
  5. 10 माइक्रोन इंजेक्शन सिरिंज में टाइटर इकोहीव लेंटीवायरस समाधान (1.04 × 106 टीयू/एमएल) भरें। सिरिंज को स्टीरियोटैक्सिक उपकरण में सुरक्षित करें।
  6. ड्रिलिंग छेद की सतह के करीब सुई नीचे ले जाएँ। उपाय करें और गहराई में 2.5 मिमी ले जाएं।
  7. 0.2 μL/मिनट की दर से वायरस समाधान के 1 μL इन्फ्यूज करें। सुई को इंजेक्शन क्षेत्र के अंदर 5 मिनट के लिए रखें। धीरे-धीरे सुई को तब तक ले जाएं जब तक कि यह चूहे की खोपड़ी के बाहर न हो जाए।
  8. 4-0 रेशम धागे के साथ त्वचा को सीवन करें।
  9. एक बार 70% इथेनॉल के साथ चीरा स्टरलाइज करें। चमड़े के नीचे बुटोरफेनॉल (डोरोलेक्स, 0.1 मिलीग्राम/किलो शरीर के वजन) इंजेक्ट करते हैं।
  10. चूहे को एक हीटिंग पैड के साथ एक रिकवरी चैंबर में स्थानांतरित करें जब तक कि यह जाग न जाए।

3. मस्तिष्क वर्गों का दृश्य

नोट: EcoHIV वायरल जलसेक के बाद एक से आठ सप्ताह रुको ।

  1. 5% सेवोफ्लुरन के साथ चूहे को एनेस्थेटाइज करें। 3.2 कदम जारी रखें जब चूहे हानिकारक उत्तेजनाओं के प्रति उत्तरदायी नहीं हैं और सजगता अनुपस्थित हैं।
  2. एक धुएं हुड के अंदर एक रीढ़ की स्थिति में चूहे को ठीक करें।
  3. छाती मिडलाइन के साथ त्वचा को झुकाना। डायाफ्राम काटें और छाती गुहा खोलें।
  4. बाएं वेंट्रिकल में 20 ग्राम × 25 मिमी सुई डालें।
  5. तुरंत कैंची से सही एट्रियम खोलें।
  6. 50 एमएल प्रीचिल्ड 100 एमएम पीबीएस की 50 एमएल/मिनट की दर से परफयूज करें।
  7. 5 एमएल/मिनट की दर से 100 एमएल ठंडी 4% पैराफॉर्मलडिहाइड।
  8. चूहे को काटना, खोपड़ी खोलें और मस्तिष्क को हटा दें।
  9. 4% पैराफॉर्मल्डिहाइड के साथ रात भर पोस्टफिक्स।
  10. मस्तिष्क को 50 एमएल ट्यूब में 100 m M PBS में 30% सुक्रोज के 40 एमएल में स्थानांतरित करें जब तक कि मस्तिष्क नीचे (लगभग 3 दिन) तक नहीं तैरता।
  11. स्नैप मिथाइलबुटानॉल में मस्तिष्क को 2 मिनट के लिए फ्रीज करें - 80 डिग्री सेल्सियस।
  12. एक -20 डिग्री सेल्सियस क्रायोस्टेट के अंदर एक धातु मंच पर मस्तिष्क के ऊतकों को सुरक्षित करें।
  13. क्रायोस्टेट का उपयोग करके 50 माइक्रोन मोटी कोरोनल सेक्शन काटें।
  14. एक ठीक ब्रश के साथ ग्लास स्लाइड पर मस्तिष्क स्लाइस स्थानांतरित करें।
  15. एंटीफैड माध्यम के 0.3 एमएल में माउंट सेक्शन और 22 मिमी 50 मिमी कवर्लिप्स के साथ कवर करें।
  16. कांच की स्लाइड को कमरे के तापमान पर अंधेरे में सूखने तक रखें।
  17. मस्तिष्क क्षेत्र की सीमाओं और न्यूरॉन्स की रूपात्मक विशेषताओं के आधार पर जेड-स्टैक का उपयोग करके एक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप के साथ लक्षित न्यूरॉन्स की छवि।
    नोट: कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप सेटिंग्स का उपयोग किया गया था: 60 X (A/1.4, तेल) का आवर्धन, और 0.15 माइक्रोन (पिनहोल आकार 30 माइक्रोन; बैक-अनुमानित पिनहोल त्रिज्या 167 एनएम) का एक जेड-प्लेन अंतराल 488 एनएम की तरंगदैर्ध्य का उपयोग करके।

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Representative Results

वातानुकूलित माध्यम EcoHIV-EGFP संक्रमित 293FT कोशिकाओं के लेंटीवायरस से एकत्र किया गया था । इसके बाद, यह केंद्रित और titered था, तो टकसाली F344/N चूहों के मस्तिष्क (कॉर्टिकल क्षेत्र) में इंजेक्शन । इंजेक्शन के सात दिन बाद चूहों की बलि दी गई और ब्रेग्मा 5.64 मिमी से लेकर ब्रेग्मा -4.68 मिमी तक कोरोनल ब्रेन स्लाइस से छवियां ली गईं। चित्रा 1Aमें, पूरे मस्तिष्क में महत्वपूर्ण इकोएचआईवी-ईजीएफपी संकेत हैं, विशेष रूप से कॉर्टेक्स और हिप्पोकैम्पल डेंटेट जाइरस में। इसके अलावा, Iba1and EcoHIV-EGFP जांच के साथ दोहरी लेबलिंग मजबूत सबूत है कि माइक्रोग्लिया मस्तिष्क में EcoHIV अभिव्यक्ति शरण प्रमुख सेल प्रकार थेप्रदान की (चित्रा 1B)। विशेष रूप से, इकोहिव-ईजीएफपी का वितरण पैटर्न चूहे के मस्तिष्क में माइक्रोग्लिया की सापेक्ष क्षेत्रीय सांद्रता (यानी, कॉर्टेक्स और हिप्पोकैम्पस के डेंटेट जाइरस) के अनुरूप है।

बाद के अध्ययन में, हमने चूहों में इकोहिव संक्रमण की उपयोगिता को हाथ के प्रमुख पहलुओं को मॉडल करने के लिए मान्य किया। ऊपर विस्तृत प्रोटोकॉल का उपयोग करते हुए, F344/N चूहों को स्टीरियोटैक्सिक रूप से या तो इकोएचआईवी-ईजीएफपी या खारा के साथ इंजेक्ट किया गया था। सबसे पहले, आठ सप्ताह के बाद संक्रमण, लौकिक प्रसंस्करण, हाथ12के एक संभावित मौलिक आयाम, दृश्य अंतर prepulse निषेध(चित्रा 2)का उपयोग कर मूल्यांकन किया गया था । EcoHIV जानवरों ने इंटरस्टिमुलस इंटरवल (आईएसआई) के हेरफेर के प्रति एक सापेक्ष संवेदनहीनता का प्रदर्शन किया, जो खारा नियंत्रणों की तुलना में अपेक्षाकृत चापलूसी आईएसआई समारोह द्वारा प्रमाणित है। विशेष रूप से, 50 एमएस आईएसआई से 200 एमएस आईएसआई तक आईएसआई समारोह की ढलान में महत्वपूर्ण अंतर देखा गया (सेमलॉग लाइन-एक्स लॉग है, वाई रैखिक है, आर2एस ≥ 0.99; एफ (1,2) = 642.9, पी≤0.001)। दूसरा, बैलिस्टिक लेबलिंग का उपयोग नाभिक एकुम्बेंस (एनएसी) के मध्यम कांटेदार न्यूरॉन्स (एमएसएन) में डेंड्रिटिक स्पिन की आकृति विज्ञान पर इकोहिव-ईजीएफपी इंजेक्शन के प्रभाव की जांच करने के लिए किया गया था। चित्रा 3); पैरामीटर जो सिनैप्टिक फंक्शन13के बारे में अनुमान आकर्षित करने के लिए उपयोग किया जा सकता है . इकोहिव चूहों ने डेंड्रिटिक स्पाइन आकृति विज्ञान में गहन परिवर्तन प्रदर्शित किए, जो छोटे डेंड्रिटिक कताई (जीनोटाइप एक्स बिन इंटरैक्शन, एफ (16, 218) = 4.3, की बढ़ी हुई सापेक्ष आवृत्ति से सबूत है पी ≤ 0.001) एक वृद्धि हुई सिर व्यास के साथ (Genotype x बिन इंटरैक्शन, एफ (12, 96) = 18.7, पी ≤ 0.001) और वृद्धि हुई गर्दन व्यास (जीनोटाइप एक्स बिन इंटरैक्शन, एफ (15, 120) = 16.3, पी ≤ 0.001) जानवरों को नियंत्रित करने के सापेक्ष। लौकिक प्रसंस्करण14 और बैलिस्टिक लेबलिंग13 के आकलन के लिए विस्तृत कार्यप्रणाली की पहले सूचना दी गई है ।

Figure 1
चित्रा 1। चूहे के मस्तिष्क में वितरित इकोएचआईवी-ईजीएफपी संक्रमित कोशिकाएं। (क)इंजेक्शन के 7 दिन बाद हिप्पोकैम्पल डेंटेट जाइरस या कॉर्टेक्स क्षेत्रों में इकोहिव-ईजीएफपी अभिव्यक्ति की प्रतिनिधि कॉन्फोकल इमेज (20x) । (ख) इंजेक्शन के 7 दिन बाद इकोएचआईवी-ईजीएफपी संक्रमित कोशिकाओं के साथ Iba1 इम्यूनोस्टेटिंग के सह-स्थानीयकरण की प्रतिनिधि कॉन्फोकल इमेज (60X) । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2। इकोहिव संक्रमण ने अस्थायी प्रसंस्करण में प्रमुख न्यूरोकॉग्निटिव घाटे को प्रेरित किया। दृश्य अंतर पूर्वतल निषेध या तो EcoHIV या खारा के स्टीरियोटैक्सिक इंजेक्शन के आठ सप्ताह बाद आयोजित किया गया था । इकोहिव संक्रमण ने चूहों को नियंत्रित करने के सापेक्ष इंटरस्टिमुलस अंतराल के हेरफेर के सापेक्ष संवेदनहीनता के कारण लौकिक प्रसंस्करण में प्रमुख परिवर्तन प्रेरित किया। विस्तृत पद्धति McLaurin एट अल13में वर्णित है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3। इकोहिव-ईजीएफपी के साथ संक्रमितता ने डेंड्रिटिक कताई के रूपात्मक मापदंडों को बदल दिया, जो गहन सिनैप्टिक डिसफंक्शन का समर्थन करता है। इकोएचआईवी चूहों ने जानवरों को नियंत्रित करने के सापेक्ष एक बढ़े हुए सिर व्यास(बी)और बढ़ी हुई गर्दन व्यास(सी)के साथ छोटे डेंड्रिटिक कताई(ए)की बढ़ी हुई सापेक्ष आवृत्ति का सबूत दिया, जो डेंड्रिटिक स्पाइन आकृति विज्ञान में गहरा परिवर्तन प्रदर्शित करता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Discussion

इस प्रोटोकॉल में, हमने चूहों में एक इकोहिव-प्रेरित एचआईवी संक्रमण मॉडल स्थापित किया। विशेष रूप से, हमने कॉर्टेक्स में इकोहीव के एक द्विपक्षीय स्टीरियोटैक्सिक इंजेक्शन का वर्णन किया जो सफलतापूर्वक चूहे के मस्तिष्क में सक्रिय एचआईवी संक्रमण को 7 दिन बाद इंजेक्शन के लिए प्रेरित करता है। फ्यूथरमोर, हम प्रदर्शित करते हैं कि चूहों में इकोहिव संक्रमण हाथ के प्रमुख पहलुओं का अध्ययन करने के लिए एक अच्छी जैविक प्रणाली हो सकती है। आठ सप्ताह बाद- इकोहिव संक्रमण, चूहों ने महत्वपूर्ण न्यूरोकॉग्निटिव हानि का प्रदर्शन किया, जिसमें एनी के एमएसएन में अस्थायी प्रसंस्करण और सिनैप्टिक डिसफंक्शन में परिवर्तन शामिल थे। न्यूरोहिव और हैंड2के अध्ययन के लिए पशु मॉडल के महत्व को देखते हुए, क्षेत्र के भीतर उपन्यास प्रश्नों को संबोधित करने के लिए एक नई जैविक प्रणाली का विकास लाभप्रद हो सकता है। पोटाश एट अल3 ने सबसे पहले चूहों में सक्रिय एचआईवी-1 संक्रमण को प्रेरित करने के लिए EcoHIV के उपयोग की सूचना दी । विशेष रूप से, चूहों को पूंछ नस इंजेक्शन 3 के माध्यम से इकोहिव वायरस के समाधान के 0.1 एमएल के साथ टीकालगायागया था। संक्रमण के छह हफ्ते बाद तिल्ली कोशिकाओं और लिम्फोसाइट्स में एचआईवी-1 वायरल डीएनए का पता चला । इसके अतिरिक्त, इकोहिव इंजेक्शन का एक टीका चूहों के 75% से अधिक में संक्रमण को प्रेरित करने के लिए पर्याप्त था। द्विपक्षीय स्टीरियोटैक्सिक इंजेक्शन का उपयोग, जैसा कि इस अध्ययन में, सफलतापूर्वक 100% चूहों (एन = 6 या एन = 4, क्रमशः संक्रमित) मस्तिष्क में इकोहिव-ईजीएफपी का पता लगाने के सात दिनों बाद इंजेक्शन का सबूत है।

पिछले अध्ययनों से पता चला है कि माउस में इकोएचआईवी द्वारा संक्रमण ने दृढ़ता से फंसाया कि मस्तिष्क माइक्रोग्लिया इकोहिव वायरस संक्रमण के लिए अतिसंवेदनशील होते हैं3। इस अध्ययन में, Iba1 (एक माइक्रोग्लियल सेल मार्कर) इम्यूनोस्टेटिंग के साथ संयुक्त, Iba1 + कोशिकाओं के साथ ईजीएफपी सिग्नल का एक महत्वपूर्ण सह-स्थानीयकरण देखा गया था, दृढ़ता से सुझाव दिया गया था कि माइक्रोग्लिया चूहे के मस्तिष्क में इकोहिव संक्रमण के लिए प्रमुख कोशिका प्रकार थे। माइक्रोग्लिया में महत्वपूर्ण इकोहीव संक्रमण की टिप्पणियां इकोहिव संक्रमित चूहों6के साथ - साथ एचआईवी-1 सेरोपॉजिटिव व्यक्तियों15 और अन्य जैविक प्रणालियों में डेटा के अनुरूप हैं, जिनका उपयोग आमतौर पर एचआईवी16, 17मॉडल के लिए कियाजाताहै। हमने F344/N चूहों में इकोहिव-ईजीएफपी के रेट्रो-ऑर्बिटल इंजेक्शन का भी प्रदर्शन किया और डेटा ने केवल सात दिनों (डेटा नहीं दिखाए गए) के बाद कॉर्टेक्स और हिप्पोकैम्पल डेंटेट जाइरस दोनों में इकोहिव-ईजीएफपी की उच्च अभिव्यक्ति का भी संकेत दिया। इसके विपरीत, F344/N चूहों में EcoHIV के आईपी इंजेक्शन चूहे मस्तिष्क में अज्ञेय वायरल अभिव्यक्ति के लिए नेतृत्व किया, EcoHIV lentivirus की उच्च खुराक के बावजूद ।

इस प्रोटोकॉल के बारे में, शोधकर्ताओं को यह सुनिश्चित करना चाहिए कि २९३ फीट कोशिकाओं में EcoHIV लेंटीवायरस पैकेजिंग सहित वातानुकूलित माध्यम, स्टीरियोटैक्सिक इंजेक्शन के लिए उपयोग करने से पहले केंद्रित और titered है । ये कदम प्रयोगों में लगातार और प्रतिकृति परिणाम सुनिश्चित करने के लिए महत्वपूर्ण हैं । इसके अलावा, हमने यह भी पाया कि EcoHIV संक्रमण मस्तिष्क में स्टीरियोटैक्सिक इंजेक्शन से तिल्ली ऊतक के लिए इंजेक्शन के बाद 8 सप्ताह में प्रचारित किया गया था । इस बीच, 14 दिनों के रूप में इकोहिव संक्रमित चूहों में अस्थायी प्रसंस्करण घाटे को देखा गया और संक्रमण के बाद 8 सप्ताह (वर्तमान प्रयोगात्मक टर्मिनल समय, चित्रा 2)के माध्यम से बनाए रखा गया। चूहों में सामान्यीकृत इकोहिव संक्रमण मॉडल की तुलना में, इकोएचआईवी के अधिक विशिष्ट क्षेत्रीय स्टीरियोटैक्सिक इंजेक्शन ने मस्तिष्क क्षेत्रों में कुशल एचआईवी संक्रमण का उत्पादन किया और चूहों में एक लौकिक प्रसंस्करण घाटे का उत्पादन किया, जो एचआईवी से जुड़े न्यूरोकॉग्निटिव डिसफंक्शन के अध्ययन के लिए महत्वपूर्ण है।

वर्तमान प्रोटोकॉल के लिए और अधिक अवसर प्रदान करने वाली सीमाओं में न्यूरॉन्स और एस्ट्रोसाइट्स जैसे अन्य सेल प्रकारों की पहचान शामिल है, संक्रमण के बाद इकोहिव-ईजीएफपी अभिव्यक्ति में परिवर्तनों का एक समय-पाठ्यक्रम अध्ययन मस्तिष्क में वायरल प्रतिकृति और विलंबता का संकेत देने के लिए, एचआईवी से जुड़े न्यूरोकॉग्निटिव घाटे के संभावित प्रभावों को संबोधित करने के लिए एक देशांतर अध्ययन, और मूल्यांकन अगर EcoHIV के स्टीरियोटैक्सिक इंजेक्शन प्रतिरक्षा प्रणाली को आगे फैलते हुए बी भर में वायरल अभिव्यक्ति से बच जाता है ओड़ी। इसके अतिरिक्त, चूहों में इकोहिव संक्रमण की सामान्यता की पुष्टि करने के लिए अन्य चूहे उपभेदों पर इसका परीक्षण किया जाना चाहिए।

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Disclosures

किसी भी लेखक के पास घोषित करने के लिए हितों के टकराव नहीं हैं ।

Acknowledgments

इस काम को एनआईएच ग्रांट HD043680, MH106392, DA013137 और NS100624 द्वारा वित्त पोषित किया गया था ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
293FT cells ThermoFisher Scientific R70007
Antibiotic-Antimycotic solution Cellgro 30004CI 100X
Corning BioCoatGelatin 75cm² Rectangular Canted Neck Cell Culture Flask with Vented Cap Life Technologies 354488
Corning DMEM with L-Glutamine, 4.5 g/L Glucose and Sodium Pyruvate Life Technologies 10013CV
Cover glass VWR 637-137
drill
Dumont #5 Forceps World Precision Instruments 14095
Dumont #7 Forceps World Precision Instruments 14097
Eppendorf Snap-Cap Microcentrifuge Biopur Safe-Lock Tubes Life Technologies 22600028
Ethicon Vicryl Plus Antibacterial, 4-0 Polyglactin 910 Suture, 27in. FS-2 Med Vet International VCP422H
Hamilton syringe Hamilton 1701
Invitrogen Lipofectamine 3000 Transfection Reagent Life Technologies L3000015
Iris Forceps World Precision Instruments 15914
Iris Scissors World Precision Instruments 500216
Lentivirus-Associated p24 ELISA Kit Cell Biolabs, inc. VPK-107-5
Lenti-X Concentrator Takara PT4421-2
Opti-MEM I Reduced Serum Medium Life Technologies 11058021
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich 158127-500G
Paraformaldehyde Sigma P6148
ProLong Gold Fisher Scientific P36930
Sevoflurane Merritt Veterinary Supply 347075
stereotaxic apparatus Kopf Instruments Model 900
SuperFrost Plus Slides Fisher Scientific 12-550-154%
Vannas Scissors World Precision Instruments 500086

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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तंत्रिका विज्ञान अंक 167 इकोहिव एचआईवी माइक्रोग्लिया हाथ चूहा
EcoHIV मस्तिष्क संक्रमण का एक चूहा मॉडल
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Li, H., McLaurin, K. A., Mactutus,… More

Li, H., McLaurin, K. A., Mactutus, C. F., Booze, R. M. A Rat Model of EcoHIV Brain Infection. J. Vis. Exp. (167), e62137, doi:10.3791/62137 (2021).

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