Summary
Her presenterer vi en protokoll for å etablere en ny rottemodell av aktiv HIV-infeksjon ved hjelp av chimerisk HIV (EcoHIV), som er avgjørende for å styrke vår forståelse av HIV-1-virusreservoarer i hjernen og tilby et system for å studere HIV-assosierte nevrokognitive lidelser og tilhørende komorbiditeter (dvs. narkotikamisbruk).
Abstract
Det har blitt godt studert at EcoHIV-infisert musemodell er av betydelig nytte i å undersøke HIV-assosierte nevrologiske komplikasjoner. Etablering av EcoHIV-infisert rottemodell for studier av narkotikamisbruk og nevrokognitive lidelser, ville være gunstig i studiet av nevroHIV og HIV-1 assosierte nevrokognitive lidelser (HAND). I den nåværende studien demonstrerer vi vellykket opprettelse av en rottemodell av aktiv HIV-infeksjon ved hjelp av chimerisk HIV (EcoHIV). For det første ble lentiviral konstruksjon av EcoHIV pakket i dyrkede 293 FT-celler i 48 timer. Deretter ble det betingede mediet konsentrert og titert. Deretter utførte vi bilaterale stereotaksiske injeksjoner av EcoHIV-EGFP i F344 / N rotte hjernevev. En uke etter infeksjon ble EGFP fluorescenssignaler oppdaget i det infiserte hjernevevet, noe som indikerer at EcoHIV med hell induserer en aktiv HIV-infeksjon hos rotter. I tillegg ble immunostaining for den mikrogliale cellemarkøren, Iba1, utført. Resultatene indikerte at mikroglia var den dominerende celletypen som inneholdt EcoHIV. Videre viste EcoHIV-rotter endringer i tidsbehandling, en potensiell underliggende nevrobehavioral mekanisme for HAND samt synaptisk dysfunksjon åtte uker etter infeksjon. Samlet utvider den nåværende studien EcoHIV-modellen for HIV-1-infeksjon til rotten som tilbyr et verdifullt biologisk system for å studere HIV-1 virusreservoarer i hjernen, samt HÅND og tilhørende komorbiditeter som narkotikamisbruk.
Introduction
Biologiske systemer har forbedret vår forståelse av HIV-1 assosierte nevrokognitive lidelser (HAND) og deres underliggende nevrale mekanismer2. Å bestemme hvilket biologisk system som passer best for en gitt studie, er ofte avhengig av spørsmålet om interesse2. Begrensningen i utvalget av vertsdyrmodeller utfordrer studier av HIV-1 sykdomsutvikling. For å undersøke HIV-1 viral replikasjon og patogenese opprettet Potash et al.3 en musemodell av aktiv HIV-1-infeksjon, og erstattet kodingsområdet for HIV-overflatekonvolutt glykoprotein, gp120, med økotropisk MLV gp80, noe som førte til vellykket viral replikasjon hos mus4. Etter hale vene injeksjoner i chimeric HIV (EcoHIV) mus, mange egenskaper ble observert som ligner de av HIV-1 seropositive individer (f.eks. infiserte lymfocytter og makrofager, rettet mot antivirale immunresponser, og betennelse3,5,6).
Selv om mus og rotter begge er medlemmer av Muridae, kan grunnleggende artsforskjeller påvirke deres egnethet for spesifikke eksperimentelle spørsmål7. Derfor vil utvidelsen av EcoHIV-infeksjonsmodellen til rotter (ofte brukt i studier av narkotikamisbruk og nevrokognitive lidelser) være fordelaktig i studiet av nevroHIV. For eksempel gjør deres større størrelse jugularkateterimplantasjon for selvadbemanningsprosedyrer for legemidler mer praktisk8. Selvadberettigede teknikker for narkotika hos rotter har blitt brukt til å evaluere motivasjon i HIV-19. Videre ble mange nevrokognitive / atferdsoppgaver opprinnelig designet for rotter10. Her rapporterer vi bruken av stereotaksiske injeksjoner av EcoHIV hos rotter for å utvide EcoHIV-infeksjonsmodellen og har råd til en nøkkelmulighet til å ta opp nye spørsmål relatert til neuroHIV og HAND.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyreprotokoller ble gjennomgått og godkjent av Animal Care and Use Committee ved University of South Carolina (føderalt forsikringsnummer: D16-00028). Seks voksne menn F344/N rotte ble paret plassert i et kontrollert miljø under en 12/12 lys: mørk syklus med ad libitum tilgang til mat og vann. Alle dyrene ble tatt vare på ved hjelp av retningslinjer fastsatt av National Institutes of Health i Guide for care and use of Laboratory Animals.
1. Virusemballasje i 293 FT-celler
- Kultur de 293 FT cellene (5×105/ ml) i gelatin belagt 75 cm2 kolber med DMEM pluss 10% FBS11. Vokse celler ved 37 °C for å være 50 % sammenfallende ved transfeksjon.
- Fortynn 22,5 μL transfeksjonsreagens (f.eks. Lipofectamine 3000) i 750 μL medium (f.eks. Opti-MEM) i et 1,5 ml mikrosentrifugerør og virvel i 3 s.
- Fortynn 20 μg EcoHIV plasmid DNA i 750 μL medium i et 1,5 ml mikrosentrifugerør og bland godt.
- Tilsett fortynnet DNA i røret med fortynnet transfeksjonsreagens og bland forsiktig. Inkuber i 15 min ved romtemperatur.
- Tilsett blandingen til 10 ml forvarselt DMEM-medium i 75 cm2 kolbe. Inkuber celler i 2 dager ved 37 °C.
- Høst og kombiner 24 ml betinget medium fra de to kolbeene som inkluderer det pakkede lentiviruset.
- Sentrifuger alle 24 ml betinget medium ved 500 x g i 10 minutter ved 4 °C. Overfør den klargjorte supernatanten til et sterilt 50 ml rør.
- Kombiner 8 ml lenti-x konsentrator med 24 ml klargjort supernatant (1:3-forhold). Bland ved mild inversjon. Inkuber blandingen ved 4 °C i to dager.
- Sentrifugeblanding ved 1500 x g i 45 minutter ved 4 °C. Fjern forsiktig supernatanten.
- Re-suspendere pelletsen forsiktig med 100 μL 100 mM PBS.
- Titerviruskonsentrasjon med et p24 ELISA-sett.
2. EcoHIV-EGFP virus stereotaxic operasjoner
- Bedøv rotter ved hjelp av 3% sevofluran. Fortsett til trinn 2.2 når rottene ikke reagerer på skadelige stimuli og reflekser er fraværende.
- Barber hårene fra hjerneregionen og steriliser huden to ganger med 70% etanol og en klorhexidinbasert skrubb. Sikre rotten i en utsatt posisjon i stereotaxisk apparat.
- Lag et snitt (5-6 cm) gjennom huden langs hodebunnen midtlinjen.
- Merk to boreposisjoner på 0,8 mm lateral, 1,2 mm rostral til bregma. Bor et hull (diameter 0,4 mm) i hver skalleposisjon.
- Fyll titerert EcoHIV lentivirusoppløsning (1,04 × 106 TU/ml) i en 10 μL injeksjonssprøyte. Fest sprøyten til det stereotaktiske apparatet.
- Flytt ned nålen nær overflaten av borehullet. Mål og beveg deg 2,5 mm i dybden.
- Tilsett 1 μL virusløsning med en hastighet på 0,2 μL/min. Hold kanylen inne i injeksjonsområdet i 5 min. Beveg nålen sakte opp til den er utenfor rotteskallen.
- Suturer huden med en 4-0 silketråd.
- Steriliser snittet med 70% etanol en gang. Subkutant injisere butorfenol (Dorolex, 0,1 mg/kg kroppsvekt).
- Overfør rotten til et gjenopprettingskammer med en varmepute til den våkner.
3. Visualisering av hjerneseksjoner
MERK: Vent en til åtte uker etter EcoHIV viral infusjon.
- Bedøv rotten med 5% sevofluran. Fortsett til trinn 3.2 når rottene ikke reagerer på skadelige stimuli og reflekser er fraværende.
- Fest rotten i en liggende stilling inne i en avtrekkshette.
- Øk huden langs thoracic midline. Klipp membranen og åpne thoracic hulrommet.
- Sett en 20 G × 25 mm nål inn i venstre ventrikel.
- Åpne straks riktig atrium med saks.
- Perfuse 50 ml prechilled 100 mM PBS med en hastighet på 5 ml / min.
- Perfuse 100 ml kald 4% paraformaldehyd med en hastighet på 5 ml / min.
- Decapitate rotten, åpne hodebunnen og fjern hjernen.
- Postfix over natten med 4% paraformaldehyd.
- Overfør hjernen til 40 ml 30% sukrose i 100 mM PBS i 50 ml rør til hjernen flyter ned til bunnen (ca. 3 dager).
- Snap fryse hjernen i metylbutanol i 2 min ved - 80 °C.
- Sikre hjernevevet på en metallplattform inne i en -20 °C kryostat.
- Klipp 50 μm tykke koronar seksjoner ved hjelp av kryostaten.
- Overfør hjerneskivene på glasssklier med en fin børste.
- Monter seksjoner i 0,3 ml antifadmedium og dekk med 22 mm 50 mm deksler.
- Hold glasset glir i mørket ved romtemperatur til det er tørt.
- Bilde de målrettede nevronene med et konfokalt mikroskop ved hjelp av Z-stack basert på hjerneregiongrenser og morfologiske egenskaper hos nevroner.
MERK: De konfokale mikroskopinnstillingene som ble brukt var: forstørrelse på 60 X (A/1,4, olje) og et Z-planintervall på 0,15 μm (pinhole størrelse 30 μm; bak projisert pinhole radius 167 nm) ved hjelp av en bølgelengde på 488 nm.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Det betingede mediet ble samlet inn fra lentivirus av EcoHIV-EGFP-infiserte 293FT-celler. Deretter ble den konsentrert og titerert, deretter stereotaxically injisert i hjernen (kortikale regionen) av F344 / N rotter. Syv dager etter injeksjon ble rotter ofret og bilder ble tatt fra koronal hjerneskiver fra bregma 5,64 mm til bregma -4,68 mm. I figur 1Aer det betydelige EcoHIV-EGFP-signaler i hele hjernen, spesielt i cortex og hippocampal dentate gyrus. Videre ga dobbeltmerking med Iba1 og EcoHIV-EGFP-sonder sterke bevis på at mikroglia var den dominerende celletypen som inneholdt EcoHIV-uttrykk i hjernen (Figur 1B). Spesielt er distribusjonsmønsteret til EcoHIV-EGFP i samsvar med de relative regionale konsentrasjonene av mikroglia i rottehjernen (dvs. cortex og dentate gyrus av hippocampus).
I en etterfølgende studie validerte vi nytten av EcoHIV-infeksjon hos rotter for å modellere viktige aspekter ved HAND. Ved hjelp av protokollen beskrevet ovenfor ble F344/N-rotter stereotaktisk injisert med enten EcoHIV-EGFP eller saltvann. Først ble åtte uker etter infeksjon, tidsbehandling, en potensiell elementær dimensjon på HÅND12, evaluert ved hjelp av visuell gapprepulsinhibering (figur 2). EcoHIV-dyr viste en relativ ufølsomhet overfor manipulering av interstimulusintervall (ISI), noe som fremgår av en relativt flatere ISI-funksjon sammenlignet med saltvannskontroller. Spesielt ble signifikante forskjeller i hellingen av ISI-funksjonen fra 50 ms ISI til 200 ms ISI observert (Semilog Line-X er Log, Y is Linear, R2s ≥ 0,99; F(1,2)=642,9, s≤0,001). For det andre ble ballistisk merking brukt til å undersøke virkningen av EcoHIV-EGFP-injeksjoner på morfologien til dendritiske spines i middels spiny nevroner (MSN) av kjernen accumbens (NAc; Figur 3); parametere som kan brukes til å trekke slutninger om synaptisk funksjon13. EcoHIV rotter viste dype endringer i dendritisk ryggmorfologi, vist ved en økt relativ frekvens av kortere dendrittiske spines (Genotype x Bin Interaction, F(16, 218) = 4,3, p ≤ 0,001) med økt hodediameter (Genotype x Bin Interaction, F(12, 96) = 18,7, p ≤ 0,001) og økt nakkediameter (Genotype x Bin Interaction, F(15, 120) = 16,3, p ≤ 0,001) i forhold til kontrolldyr. Detaljert metodikk for vurdering av tidsbehandling14 og ballistisk merking13 er tidligere rapportert.
Figur 1. EcoHIV-EGFP-infiserte celler distribuert i rottehjernen. (A) De representative konfokale bildene (20x) av EcoHIV-EGFP uttrykk i hippocampal dentate gyrus eller cortex regioner på 7 dager etter injeksjon. (B) De representative konfektbildene (60X) av samlokalisering av Iba1-immunostaining med EcoHIV-EGFP-infiserte celler 7 dager etter injeksjon. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2. EcoHIV-infeksjon induserte fremtredende nevrokognitive underskudd i tidsbehandling. Visuell gapprepulsinhibering ble utført åtte uker etter stereotoksiske injeksjoner av enten EcoHIV eller saltvann. EcoHIV-infeksjon induserte fremtredende endringer i tidsbehandling som fremgår av den relative ufølsomheten for manipulering av interstimulusintervall i forhold til kontrollrotter. Detaljert metodikk beskrevet i McLaurin et al.13. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3. Infektivitet med EcoHIV-EGFP endret de morfologiske parametrene til dendritiske spines, og støttet dyp synaptisk dysfunksjon. EcoHIV rotter viste dype endringer i dendrittisk ryggmorfologi, noe som fremgår av en økt relativ frekvens av kortere dendrittiske spines (A) med økt hodediameter (B) og økt nakkediameter (C) i forhold til kontroll av dyr. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I denne protokollen etablerte vi en EcoHIV-indusert HIV-infeksjonsmodell hos rotter. Spesielt beskrev vi en bilateral stereotaxisk injeksjon av EcoHIV i cortex som med hell induserte aktiv HIV-infeksjon i rottehjernen 7 dager etter injeksjon. Futhermore, vi viser at EcoHIV infeksjon hos rotter kan være et godt biologisk system for å studere viktige aspekter av HAND. Åtte uker etter EcoHIV-infeksjon viste rotter betydelige nevrokognitive svekkelser, som inkluderte endringene i tidsbehandling og synaptisk dysfunksjon hos MSNer i NAc. Gitt betydningen av dyremodeller for studiet av neuroHIV og HAND2, kan utviklingen av et nytt biologisk system være fordelaktig for å ta opp nye spørsmål innen feltet. Potash et al.3 rapporterte først bruk av EcoHIV for å indusere aktiv HIV-1-infeksjon hos mus. Spesielt ble mus inokulert med en 0,1 ml løsning av EcoHIV-virus gjennom hale veneinjeksjoner3. Seks uker etter infeksjon ble HIV-1 viralt DNA påvist i miltceller og lymfocytter. I tillegg var en inokulasjon av EcoHIV injeksjon tilstrekkelig til å indusere infeksjon hos mer enn 75% av musene. Utnyttelse av bilaterale stereotaksiske injeksjoner, som i denne studien, smittet vellykket 100% av rottene (henholdsvis n = 6 eller n = 4) som fremgår av påvisning av EcoHIV-EGFP i hjernen syv dager etter injeksjon.
Tidligere studier har vist at infeksjon av EcoHIV i musen sterkt impliserte at hjernen mikroglia er svært utsatt for EcoHIV virusinfeksjon3. I denne studien, kombinert med Iba1 (en mikroglial cellemarkør) immunostaining, ble det observert en betydelig samlokalisering av EGFP-signal med Iba1+ celler, noe som sterkt tyder på at mikroglia var den viktigste celletypen for EcoHIV-infeksjon i rottehjernen. Observasjoner av signifikant EcoHIV-infeksjon i mikroglia er i samsvar med data i EcoHIV-infiserte mus6, samt HIV-1 seropositive individer15 og andre biologiske systemer som vanligvis brukes til å modellere HIV16,17. Vi utførte også retro-orbital injeksjon av EcoHIV-EGFP i F344/N rotter og dataene indikerte også høyt uttrykk for EcoHIV-EGFP i både cortex og hippocampal dentate gyrus etter bare syv dager (data ikke vist). I motsetning til dette førte I.P. injeksjon av EcoHIV hos F344/N-rotter til uoppdagelig viralt uttrykk i rottehjernen, inspitt av høye doser EcoHIV lentivirus.
Når det gjelder denne protokollen, bør forskerne sørge for at det betingede mediet, inkludert EcoHIV lentivirusemballasje i 293 FT-celler, er konsentrert og titerert før bruk til stereotaxisk injeksjon. Disse trinnene er avgjørende for å sikre konsistente og repliserbare resultater på tvers av eksperimenter. Videre fant vi også at EcoHIV-infeksjon ble forplantet fra stereotoksisk injeksjon i hjernen til miltvev ved 8 uker etter injeksjon. I mellomtiden ble de tidsmessige behandlingsunderskuddene observert hos EcoHIV-infiserte rotter så tidlig som 14 dager og opprettholdt gjennom 8 uker etter infeksjon (gjeldende eksperimentell terminaltid, figur 2). Sammenlignet med den generaliserte EcoHIV-infeksjonsmodellen hos mus, produserte den mer spesifikke regionale stereotaksiske injeksjonen av EcoHIV effektiv HIV-infeksjon i hjerneområder og produserte et tidsmessig behandlingsunderskudd hos rotter, noe som er nøkkelen til studiet av HIV-assosiert nevrokognitiv dysfunksjon.
Begrensninger som gir ytterligere muligheter for den nåværende protokollen inkluderer identifisering av andre celletyper som nevroner og astrocytter, en tidskursstudie av endringer i EcoHIV-EGFP-uttrykk etter infeksjon for å indikere viral replikasjon og latens i hjernen, en langsgående studie for å adressere de potensielle virkningene av HIV-tilknyttede nevrokognitive underskudd, og evaluere om den stereotaksiske injeksjonen av EcoHIV unngår immunforsvaret ytterligere sprer viralt uttrykk gjennom hele b ody. I tillegg bør dette testes på andre rottestammer for å bekrefte generaliserbarheten av EcoHIV-infeksjon hos rotter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen av forfatterne har interessekonflikter å erklære.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble finansiert av NIH-tilskudd HD043680, MH106392, DA013137 og NS100624.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 293FT cells | ThermoFisher Scientific | R70007 | |
| Antibiotic-Antimycotic solution | Cellgro | 30004CI | 100X |
| Corning BioCoatGelatin 75cm² Rectangular Canted Neck Cell Culture Flask with Vented Cap | Life Technologies | 354488 | |
| Corning DMEM with L-Glutamine, 4.5 g/L Glucose and Sodium Pyruvate | Life Technologies | 10013CV | |
| Cover glass | VWR | 637-137 | |
| drill | |||
| Dumont #5 Forceps | World Precision Instruments | 14095 | |
| Dumont #7 Forceps | World Precision Instruments | 14097 | |
| Eppendorf Snap-Cap Microcentrifuge Biopur Safe-Lock Tubes | Life Technologies | 22600028 | |
| Ethicon Vicryl Plus Antibacterial, 4-0 Polyglactin 910 Suture, 27in. FS-2 | Med Vet International | VCP422H | |
| Hamilton syringe | Hamilton | 1701 | |
| Invitrogen Lipofectamine 3000 Transfection Reagent | Life Technologies | L3000015 | |
| Iris Forceps | World Precision Instruments | 15914 | |
| Iris Scissors | World Precision Instruments | 500216 | |
| Lentivirus-Associated p24 ELISA Kit | Cell Biolabs, inc. | VPK-107-5 | |
| Lenti-X Concentrator | Takara | PT4421-2 | |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Life Technologies | 11058021 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127-500G | |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
| ProLong Gold | Fisher Scientific | P36930 | |
| Sevoflurane | Merritt Veterinary Supply | 347075 | |
| stereotaxic apparatus | Kopf Instruments | Model 900 | |
| SuperFrost Plus Slides | Fisher Scientific | 12-550-154% | |
| Vannas Scissors | World Precision Instruments | 500086 |
References
- Illenberger, J. M., et al. HIV Infection and Neurocognitive Disorders in the Context of Chronic Drug Abuse: Evidence for Divergent Findings Dependent upon Prior Drug History. Journal of Neuroimmune Pharmacology. 15 (4), 715-728 (2020).
- Joseph, S. B., Swanstrom, R. The evolution of HIV-1 entry phenotypes as a guide to changing target cells. Journal of Leukocyte Biology. 103 (3), 421-431 (2018).
- Potash, M. J., et al. A mouse model for study of systemic HIV-1 infection, antiviral immune responses, and neuroinvasiveness. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 102 (10), 3760-3765 (2005).
- Albritton, L. M., Tseng, L., Scadden, D., Cunningham, J. M. A putative murine ecotropic retrovirus receptor gene encodes a multiple membrane-spanning protein and confers susceptibility to virus infection. Cell. 57, 659-666 (1989).
- Geraghty, P., Hadas, E., Kim, B. H., Dabo, A. J., Volsky, D. J., Foronjy, R. HIV infection model of chronic obstructive pulmonary disease in mice. American Journal of Physiology - Lung Cellular and Molecular Physiology. 312 (4), 500-509 (2017).
- Gu, C. J., et al. EcoHIV infection of mice establishes latent viral reservoirs in T cells and active viral reservoirs in macrophages that are sufficient for induction of neurocognitive impairment. PLoS Pathogens. 14 (6), 1007061 (2018).
- Ellenbroek, B., Youn, J. Rodent models in neuroscience research: is it a rat race. Disease Models, Mechanisms. 9 (10), 1079-1087 (2016).
- Feduccia, A. A., Duvauchelle, C. L. Novel apparatus and method for drug reinforcement. Journal of Visualized Experiments. (42), e1998 (2010).
- Bertrand, S. J., Mactutus, C. F., Harrod, S. B., Moran, L. M., Booze, R. M. HIV-1 proteins dysregulate motivational processes and dopamine circuitry. Scientific Reports. 8 (1), 7869 (2018).
- McGaughy, J., Sarter, M. Behavioral vigilance in rats: task validation and effects of age, amphetamine, and benzodiazepine receptor ligands. Psychopharmacology. 117 (3), Berl. 340-357 (1995).
- Li, H., Aksenova, M., Bertrand, S., Mactutus, C. F., Booze, R. M. Quantification of filamentous actin (F-actin) puncta in rat cortical neurons. Journal of Visualized Experiments. (108), (2016).
- McLaurin, K. A., Li, H., Booze, R. M., Mactutus, C. F. Disruption of Timing: NeuroHIV Progression in the Post-cART Era. Scientific Reports. 9 (1), 827 (2019).
- McLaurin, K. A., Moran, L. M., Li, H., Booze, R. M., Mactutus, C. F. The Power of Interstimulus Interval for the Assessment of Temporal Processing in Rodents. Journal of Visualized Experiments. (146), e58659 (2019).
- Li, H., McLaurin, K. A., Mactutus, C. F., Booze, R. M. Ballistic Labeling of Pyramidal Neurons in Brain Slices and in Primary Cell Culture. Journal of Visualized Experiments. (158), (2020).
- Ko, A., et al. Macrophages but not Astrocytes Harbor HIV DNA in the Brains of HIV-1-Infected Aviremic Individuals on Suppressive Antiretroviral Therapy. Journal of Neuroimmune Pharmacology. 14 (1), 110-119 (2019).
- Sopper, S., et al. The effect of simian immunodeficiency virus infection in vitro and in vivo on the cytokine production of isolated microglia and peripheral macrophages from rhesus monkey. Virology. 220 (2), 320-329 (1996).
- Llewellyn, G. N., Alvarez-Carbonell, D., Chateau, M., Karn, J., Cannon, P. M. HIV-1 infection of microglial cells in a reconstituted humanized mouse model and identification of compounds that selectively reverse HIV latency. Journal of NeuroVirology. 24 (2), 192-203 (2018).
