Summary
Aqui, apresentamos um protocolo para estabelecer um novo modelo de infecção ativa pelo HIV usando HIV quimérico (EcoHIV), que é fundamental para melhorar nossa compreensão dos reservatórios virais do HIV-1 no cérebro e oferecer um sistema para estudar distúrbios neurocognitivos associados ao HIV e comorbidades associadas (ou seja, abuso de drogas).
Abstract
Tem sido bem estudado que o modelo de camundongo infectado pelo EcoHIV é de utilidade significativa na investigação de complicações neurológicas associadas ao HIV. O estabelecimento do modelo de ratos infectados pelo EcoHIV para estudos de abuso de drogas e distúrbios neurocognitivos seria benéfico no estudo de distúrbios neurocognitivos associados ao neurocognitivo neurocognitivo neurocognitivo (HAND) neurohiv e HIV-1. No presente estudo, demonstramos a criação bem-sucedida de um modelo de rato de infecção ativa pelo HIV usando HIV quimérico (EcoHIV). Primeiro, a construção lentiviral do EcoHIV foi embalada em células cultivadas de 293 FT por 48 horas. Em seguida, o meio condicional se concentrou e se concentrou. Em seguida, realizamos injeções estereóxicas bilaterais do EcoHIV-EGFP no tecido cerebral de rato F344/N. Uma semana após a infecção, sinais de fluorescência EGFP foram detectados no tecido cerebral infectado, indicando que o EcoHIV induz com sucesso uma infecção ativa pelo HIV em ratos. Além disso, foi realizada a imunostaining para o marcador de células microgliais, Iba1. Os resultados indicaram que a microglia era o tipo de célula predominante que abrigava o EcoHIV. Além disso, os ratos EcoHIV apresentaram alterações no processamento temporal, um potencial mecanismo neuroabportavioral subjacente da MÃO, bem como disfunção sináptica oito semanas após a infecção. Coletivamente, o presente estudo estende o modelo EcoHIV de infecção pelo HIV-1 ao rato oferecendo um valioso sistema biológico para estudar reservatórios virais do HIV-1 no cérebro, bem como comorbidades associadas à MÃO e comorbidades associadas, como o abuso de drogas.
Introduction
Os sistemas biológicos melhoraram nossa compreensão das doenças neurocognitivas associadas ao HIV-1 (HAND) e seus mecanismos neurais subjacentes2. Determinar qual sistema biológico é mais adequado para qualquer estudo, muitas vezes depende da questão do interesse2. A limitação da gama de modelos animais hospedeiros desafia os estudos sobre o desenvolvimento da doença do HIV-1. Para investigar a replicação viral e a patogênese do HIV-1, Potash et al.3 criaram um modelo de camundongo de infecção ativa pelo HIV-1, substituindo a região de codificação da glicoproteína de envelope de superfície do HIV, gp120, por gp 80 MLV ecotropic, que levou à replicação viral bem sucedida em camundongos4. Após injeções de veias na cauda em camundongos quióricos de HIV (EcoHIV), muitas características foram observadas semelhantes às de indivíduos soropositivos HIV-1 (por exemplo, linfócitos e macrófagos infectados, destinados a respostas imunes antivirais, e inflamação3,5,6).
Embora camundongos e ratos sejam ambos membros do Muridae, diferenças fundamentais de espécies podem influenciar sua adequação para questões experimentais específicas7. Portanto, a extensão do modelo de infecção do EcoHIV aos ratos (comumente utilizado em estudos de abuso de drogas e distúrbios neurocognitivos) seria vantajosa no estudo do neuroHIV. Por exemplo, seu tamanho maior torna a implantação do cateter jugular para procedimentos de autoadministração de medicamentos mais práticos8. Técnicas de autoadministração de medicamentos em ratos têm sidoutilizadas para avaliar a motivação no HIV-19 . Além disso, muitas tarefas neurocognitivas/comportamentais foram inicialmente projetadas para ratos10. Aqui, relatamos a utilização de injeções estereotribuíficas de EcoHIV em ratos para ampliar o modelo de infecção do EcoHIV e dar uma oportunidade fundamental para abordar novas questões relacionadas ao neuroHIV e à MÃO.
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Protocol
Todos os protocolos de animais foram revisados e aprovados pelo Comitê de Cuidados e Uso de Animais da Universidade da Carolina do Sul (número de garantia federal: D16-00028). Seis ratos F344/N machos adultos foram alojados em um ambiente controlado sob uma luz de 12/12: ciclo escuro com acesso ad libitum a alimentos e água. Todos os animais foram atendidos utilizando-se orientações estabelecidas pelos Institutos Nacionais de Saúde no Guia de Cuidado e Uso de Animais de Laboratório.
1. Embalagem de vírus em células de 293 FT
- Cultura as células de 293 FT (5×105/mL) em gelatina revestida 75 cm2 frascos com DMEM mais 10% FBS11. Crescer células a 37 °C para ser 50% confluente na transfecção.
- Diluir 22,5 μL de reagente transfecção (por exemplo, Lipofectamina 3000) em 750 μL de médio (por exemplo, Opti-MEM) em um tubo micro-centrífuga de 1,5 mL e vórtice para 3 s.
- Diluir 20 μg de DNA plasmídeo EcoHIV em 750 μL de meio em um tubo de microcrédito de 1,5 mL e misturar bem.
- Adicione DNA diluído no tubo de reagente de transfecção diluído e misture suavemente. Incubar por 15 minutos em temperatura ambiente.
- Adicione a mistura a 10 mL de mMEM médio pré-armado em frasco de 75 cm2. Incubar células por 2 dias a 37 °C.
- Colher e combinar 24 mL de meio condicional dos dois frascos que incluem o lentivírus embalado.
- Centrifugar todos os 24 mL de meio condicional a 500 x g por 10 minutos a 4 °C. Transfira o supernante esclarecido para um tubo estéril de 50 mL.
- Combine 8 mL de concentrador Lenti-x com 24 mL de supernanato esclarecido (proporção 1:3). Misture por inversão suave. Incubar a mistura a 4 °C durante dois dias.
- Mistura centrífuga a 1.500 x g por 45 minutos a 4 °C. Remova cuidadosamente o supernatante.
- Suspenda suavemente a pelota com 100 μL de 100 mM PBS.
- Concentração do vírus Titer com um kit P24 ELISA.
2. Cirurgias estereóxiis do vírus EcoHIV-EGFP
- Anesthetize ratos usando 3% de sevoflurano. Prossiga para a etapa 2.2 quando os ratos não respondem a estímulos nocivos e os reflexos estão ausentes.
- Raspe os cabelos da região cerebral e esterilize a pele duas vezes com 70% de etanol e um esfoliante à base de clorexidina. Fixar o rato em uma posição propensa no aparelho estereotaxico.
- Faça uma incisão (5-6 cm) através da pele ao longo da linha média do couro cabeludo.
- Marque duas posições de perfuração a 0,8 mm laterais, 1,2 mm rostral para bregma. Faça um orifício (diâmetro 0,4 mm) em cada posição do crânio.
- Encha a solução de lentivírus EcoHIV (1,04 × 106 TU/mL) em uma seringa de injeção de 10 μL. Fixar a seringa no aparelho estereotaxico.
- Mova a agulha para baixo perto da superfície do furo de perfuração. Meça e mova 2,5 mm de profundidade.
- Infundir 1 μL de solução de vírus a uma taxa de 0,2 μL/min. Mantenha a agulha dentro da área de injeção por 5 minutos. Mova lentamente a agulha até que esteja fora do crânio do rato.
- Suture a pele com um fio de seda 4-0.
- Esterilize a incisão com 70% de etanol uma vez. Injetar butorfenol subcutâneamente (Dorolex, 0,1 mg/kg de peso corporal).
- Transfira o rato para uma câmara de recuperação com uma almofada de aquecimento até acordar.
3. Visualização de seções cerebrais
NOTA: Aguarde de uma a oito semanas após a infusão viral do EcoHIV.
- Anestesiar o rato com 5% de sevoflurano. Continue a passo 3.2 quando os ratos não respondem a estímulos nocivos e os reflexos estão ausentes.
- Conserte o rato em uma posição supina dentro de um capô de fumaça.
- Inciso a pele ao longo da linha média torácica. Corte o diafragma e abra a cavidade torácica.
- Insira uma agulha de 20 G × 25 mm no ventrículo esquerdo.
- Abra imediatamente o átrio direito com uma tesoura.
- Perfuse 50 mL de PBS pré-100 mM a uma taxa de 5 mL/min.
- Perfuse 100 mL de paraformaldeído frio de 4% a uma taxa de 5 mL/min.
- Decapitar o rato, abrir o couro cabeludo e remover o cérebro.
- Pós-fixado durante a noite com 4% de paraformaldeído.
- Transfira o cérebro para 40 mL de 30% de sacarose em 100 mM PBS em tubo de 50 mL até que o cérebro flutue até o fundo (cerca de 3 dias).
- Es clique para congelar o cérebro em metilbutanol por 2 min a - 80 °C.
- Fixar o tecido cerebral em uma plataforma metálica dentro de um criostat de -20 °C.
- Corte seções coronais de 50 μm de espessura usando o criostat.
- Transfira as fatias cerebrais para lâminas de vidro com uma escova fina.
- Monte seções em 0,3 mL de meio antifado e cubra com tampas de 22 mm de 50 mm.
- Mantenha os deslizamentos de vidro no escuro à temperatura ambiente até secar.
- Imagem dos neurônios alvo com um microscópio confocal usando z-stack baseado em limites da região cerebral e características morfológicas dos neurônios.
NOTA: As configurações do microscópio confocal utilizada foram: ampliação de 60 X (A/1.4, óleo) e um intervalo de plano Z de 0,15 μm (tamanho pinhole 30 μm; raio pinhole projetado para trás 167 nm) usando um comprimento de onda de 488 nm.
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Representative Results
O meio condicionado foi coletado a partir de células infectadas pelo EcoHIV-EGFP de 293FT. Em seguida, foi concentrado e titulado, em seguida, estereotaxicamente injetado no cérebro (região cortical) de ratos F344/N. Sete dias após a injeção, os ratos foram sacrificados e as imagens foram tiradas de fatias cerebrais coronais que variavam de bregma de 5,64 mm a bregma -4,68 mm. Na Figura 1A,há sinais ecohiv-egfp significativos em todo o cérebro, especialmente no córtex e no giro dento de hipocampal. Além disso, a rotulagem dupla com sondas Iba1 e EcoHIV-EGFP forneceu fortes evidências de que a microglia era o tipo de célula predominante que abrigava a expressão EcoHIV no cérebro(Figura 1B). Notavelmente, o padrão de distribuição do EcoHIV-EGFP é consistente com as concentrações regionais relativas de microglia no cérebro de rato (ou seja, córtex e giro dento do hipocampo).
Em um estudo subsequente, validamos a utilidade da infecção pelo EcoHIV em ratos para modelar aspectos-chave da MÃO. Usando o protocolo detalhado acima, os ratos F344/N foram estereotaxicamente injetados com EcoHIV-EGFP ou soro fisiológico. Primeiro, oito semanas após a infecção, processamento temporal, uma dimensão elementar potencial da MÃO12,foi avaliada por inibição de gap visual pré-pulso(Figura 2). Os animais EcoHIV apresentaram uma relativa insensibilidade à manipulação do intervalo interestimuloso (ISI), evidenciado por uma função ISI relativamente mais plana em comparação com os controles salinos. Especificamente, foram observadas diferenças significativas na inclinação da função ISI do ISI de 50 ms para o ISI de 200 ms (Semilog Line-X is Log, Y is Linear, R2s ≥ 0,99; F(1,2)=642,9, p≤0,001). Em segundo lugar, a rotulagem balística foi usada para investigar o impacto das injeções ecohiv-EGFP na morfologia das espinhas dendríticas em neurônios espinhosos médios (MSN) do núcleo accumbens (NAc; Figura 3); parâmetros que podem ser utilizados para desenhar inferências sobre a função sináptica13. Os ratos ecoHIV apresentaram alterações profundas na morfologia da coluna dendrítica, evidenciadas por uma frequência relativa aumentada de espinhas dendríticas mais curtas (Genótipo x Interação bin, F(16, 218) = 4,3, p ≤ 0,001) com maior diâmetro da cabeça (Genótipo x Interação Bin, F(12, 96) = 18,7, p ≤ 0,001) e diâmetro do pescoço aumentado (Genótipo x Interação Bin, F(15, 120) = 16,3, p ≤ 0,001) relativo ao controle de animais. Metodologia detalhada para avaliação do processamento temporal14 e rotulagem balística13 foram previamente relatadas.
Figura 1. As células infectadas pelo EcoHIV-EGFP distribuídas no cérebro de ratos. (A) As imagens confocal representativas (20x) da expressão EcoHIV-EGFP nas regiões de dento dentado hipocampal ou córtex a 7 dias após a injeção. (B) As imagens confocal representativas (60X) de co-localização de imunostaining Iba1 com células infectadas pelo EcoHIV-EGFP a 7 dias após a injeção. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. A infecção por EcoHIV induziu déficits neurocognitivos proeminentes no processamento temporal. A inibição da lacuna visual prépulso foi realizada oito semanas após injeções estereoléxiis de EcoHIV ou soro fisiológico. A infecção por EcoHIV induziu alterações proeminentes no processamento temporal evidenciadas pela relativa insensibilidade à manipulação do intervalo interestimuloso em relação aos ratos de controle. Metodologia detalhada descrita em McLaurin et al.13. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3. A infectividade com EcoHIV-EGFP alterou os parâmetros morfológicos das espinhas dendríticas, suportando disfunção sináptica profunda. Os ratos EcoHIV apresentaram alterações profundas na morfologia da coluna dendrítica, evidenciadas por uma frequência relativa aumentada de espinhas dendríticas mais curtas(A)com maior diâmetro da cabeça(B) e aumento do diâmetro do pescoço(C)em relação aos animais de controle. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Neste protocolo, estabelecemos um modelo de infecção por HIV induzida pelo EcoHIV em ratos. Especificamente, descrevemos uma injeção estereotaxa bilateral de EcoHIV no córtex que induziu com sucesso a infecção ativa do HIV no cérebro de rato 7 dias após a injeção. Futhermore, demonstramos que a infecção pelo EcoHIV em ratos pode ser um bom sistema biológico para estudar aspectos-chave da MÃO. Oito semanas após a infecção pelo EcoHIV, os ratos apresentaram prejuízos neurocognitivos significativos, que incluíram as alterações no processamento temporal e disfunção sináptica em MSNs do NAc. Dada a importância dos modelos animais para o estudo do neuroHIV e hand2,o desenvolvimento de um novo sistema biológico pode ser vantajoso para abordar novas questões no campo. Potash et al.3 relataram pela primeira vez o uso de EcoHIV para induzir infecção ativa pelo HIV-1 em camundongos. Especificamente, os camundongos foram vacinados com uma solução de 0,1 mL do vírus EcoHIV através de injeções de veias traseiras3. Seis semanas após a infecção, o DNA viral do HIV-1 foi detectado em células de baço e linfócitos. Além disso, uma inoculação da injeção de EcoHIV foi suficiente para induzir a infecção em mais de 75% dos camundongos. A utilização de injeções estereóxicas bilaterais, como neste estudo, infectou com sucesso 100% dos ratos (n = 6 ou n = 4, respectivamente) evidenciados pela detecção de EcoHIV-EGFP no cérebro sete dias após a injeção.
Estudos anteriores mostraram que a infecção pelo EcoHIV no camundongo implicava fortemente que a microglia cerebral é altamente suscetível à infecção pelo vírus EcoHIV3. Neste estudo, combinado com a imunostaining Iba1 (um marcador de células microgliais), observou-se uma co-localização significativa do sinal EGFP com células Iba1+, sugerindo fortemente que a microglia era o principal tipo celular para infecção por EcoHIV no cérebro de rato. Observações de infecção significativa do EcoHIV na microglia são consistentes com dados em camundongos infectados pelo EcoHIV6, bem como indivíduos soropositivos HIV-115 e outros sistemas biológicos comumente utilizados para modelar o HIV16,17. Também realizamos injeção retro-orbital de EcoHIV-EGFP em ratos F344/N e os dados também indicaram alta expressão do EcoHIV-EGFP tanto no córtex quanto no giro dento hipocampal após apenas sete dias (dados não mostrados). Em contraste, a injeção de EcoHIV em ratos F344/N levou à expressão viral indetectável no cérebro de rato, inspito de altas doses de lentivírus EcoHIV.
Em relação a este protocolo, os pesquisadores devem garantir que o meio condicionado, incluindo a embalagem de lentivírus EcoHIV em células de 293 FT, esteja concentrado e titulado antes de usar para injeção estereotaxica. Essas etapas são fundamentais para garantir resultados consistentes e replicáveis em experimentos. Além disso, também descobrimos que a infecção pelo EcoHIV foi propagada a partir de injeção estereotaxica no cérebro para o tecido do baço às 8 semanas após a injeção. Enquanto isso, os déficits de processamento temporal foram observados em ratos infectados pelo EcoHIV até 14 dias e mantidos até 8 semanas após a infecção (o tempo terminal experimental atual, Figura 2). Em comparação com o modelo generalizado de infecção ecoHIV em camundongos, a injeção estereóxica regional mais específica do EcoHIV produziu infecção eficiente pelo HIV em áreas cerebrais e produziu um déficit de processamento temporal em ratos, o que é fundamental para o estudo da disfunção neurocognitiva associada ao HIV.
As limitações que oferecem mais oportunidades para o protocolo atual incluem a identificação de outros tipos celulares, como neurônios e astrócitos, um estudo de tempo de mudanças na expressão EcoHIV-EGFP após infecção para indicar replicação viral e latência no cérebro, um estudo longitudinal para abordar os potenciais impactos dos déficits neurocognitivos associados ao HIV, e avaliar se a injeção estereotaxa do EcoHIV escapa da expressão viral Ody. Além disso, isso deve ser testado em outras cepas de ratos para confirmar a generalizabilidade da infecção pelo EcoHIV em ratos.
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Disclosures
Nenhum dos autores tem conflitos de interesse para declarar.
Acknowledgments
Este trabalho foi financiado pelas bolsas NIH HD043680, MH106392, DA013137 e NS100624.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 293FT cells | ThermoFisher Scientific | R70007 | |
| Antibiotic-Antimycotic solution | Cellgro | 30004CI | 100X |
| Corning BioCoatGelatin 75cm² Rectangular Canted Neck Cell Culture Flask with Vented Cap | Life Technologies | 354488 | |
| Corning DMEM with L-Glutamine, 4.5 g/L Glucose and Sodium Pyruvate | Life Technologies | 10013CV | |
| Cover glass | VWR | 637-137 | |
| drill | |||
| Dumont #5 Forceps | World Precision Instruments | 14095 | |
| Dumont #7 Forceps | World Precision Instruments | 14097 | |
| Eppendorf Snap-Cap Microcentrifuge Biopur Safe-Lock Tubes | Life Technologies | 22600028 | |
| Ethicon Vicryl Plus Antibacterial, 4-0 Polyglactin 910 Suture, 27in. FS-2 | Med Vet International | VCP422H | |
| Hamilton syringe | Hamilton | 1701 | |
| Invitrogen Lipofectamine 3000 Transfection Reagent | Life Technologies | L3000015 | |
| Iris Forceps | World Precision Instruments | 15914 | |
| Iris Scissors | World Precision Instruments | 500216 | |
| Lentivirus-Associated p24 ELISA Kit | Cell Biolabs, inc. | VPK-107-5 | |
| Lenti-X Concentrator | Takara | PT4421-2 | |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Life Technologies | 11058021 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127-500G | |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
| ProLong Gold | Fisher Scientific | P36930 | |
| Sevoflurane | Merritt Veterinary Supply | 347075 | |
| stereotaxic apparatus | Kopf Instruments | Model 900 | |
| SuperFrost Plus Slides | Fisher Scientific | 12-550-154% | |
| Vannas Scissors | World Precision Instruments | 500086 |
References
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