Summary
Aquí, presentamos un protocolo para establecer un nuevo modelo de rata de infección activa por VIH usando VIH quimérico (EcoHIV), que es fundamental para mejorar nuestra comprensión de los reservorios virales del VIH-1 en el cerebro y ofrecer un sistema para estudiar los trastornos neurocognitivos asociados al VIH y las comorbilidades asociadas (es decir, el abuso de drogas).
Abstract
Se ha estudiado bien que el modelo de ratón infectado ecoHIV es de gran utilidad en la investigación de las complicaciones neurológicas asociadas al VIH. El establecimiento del modelo de rata infectada EcoHIV para estudios de abuso de drogas y trastornos neurocognitivos, sería beneficioso en el estudio de neuroHIV y trastornos neurocognitivos asociados al VIH-1 (HAND). En el actual estudio, demostramos la creación acertada de un modelo de la rata de la infección vih activa usando el VIH quimérico (EcoHIV). En primer lugar, la construcción lentiviral de EcoHIV se envasaba en células cultivadas de 293 FT durante 48 horas. Entonces, el medio condicional fue concentrado y ºteado. Después, realizamos inyecciones stereotaxic bilaterales del EcoHIV-EGFP en el tejido cerebral de la rata de F344/N. Una semana después de la infección, se detectaron señales de fluorescencia de EGFP en el tejido cerebral infectado, lo que indica que EcoHIV induce con éxito una infección activa por VIH en ratas. Además, immunostaining para el marcador microglial de la célula, Iba1, fue realizado. Los resultados indicaron que la microglía era el tipo de célula predominante que albergaba EcoHIV. Además, las ratas de EcoHIV exhibieron alteraciones en el proceso temporal, un mecanismo neurobehavioral subyacente potencial de la MANO así como la disfunción sináptica ocho semanas después de la infección. En conjunto, el presente estudio extiende el modelo EcoHIV de la infección por VIH-1 a la rata que ofrece un valioso sistema biológico para estudiar los reservorios virales del VIH-1 en el cerebro, así como la MANO y las comorbilidades asociadas, como el abuso de drogas.
Introduction
Los sistemas biológicos han mejorado nuestra comprensión de los trastornos neurocognitivos asociados al VIH-1 (HAND) y sus mecanismos neuronales subyacentes2. La determinación del sistema biológico más apropiado para un estudio determinado depende a menudo de la cuestión de interés2. La limitación de la gama de modelos animales huésped desafía los estudios de desarrollo de la enfermedad VIH-1. Para investigar la replicación viral y la patogénesis del VIH-1, Potash et al.3 crearon un modelo de ratón de infección activa por VIH-1, reemplazando la región codificante de la glicoproteína de la envoltura superficial del VIH, gp120, con mlv ecotrópica gp80, lo que llevó a la replicación viral exitosa en ratones4. Después de las inyecciones de venas de cola en ratones quiméricos de VIH (EcoHIV), se observaron muchas características que se asemejaban a las de los individuos seropositivos del VIH-1 (por ejemplo, linfocitos y macrófagos infectados, dirigidos a respuestas inmunitarias antivirales, e inflamación3,5,6).
Aunque los ratones y las ratas son miembros de muridos, las diferencias fundamentales de las especies pueden influir en su idoneidad para cuestiones experimentales específicas7. Por lo tanto, la extensión del modelo de infección por EcoHIV a ratas (comúnmente utilizado en estudios de abuso de drogas y trastornos neurocognitivos) sería ventajosa en el estudio de neuroHIV. Por ejemplo, su mayor tamaño hace que la implantación de catéteres yugulares para procedimientos de autoadministración de fármacos sea más práctica8. Las técnicas de autoadministración de fármacos en ratas se han utilizado para evaluar la motivación en el VIH-19. Además, muchas tareas neurocognitivas/conductuales fueron diseñadas inicialmente para ratas10. Aquí, divulgamos la utilización de inyecciones stereotaxic de EcoHIV en ratas para extender el modelo de la infección de EcoHIV y para permitir una oportunidad dominante de dirigir las preguntas nuevas relacionadas con neuroHIV y la MANO.
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Protocol
Todos los protocolos de animales fueron revisados y aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Carolina del Sur (número de garantía federal: D16-00028). La rata masculina adulta de seises F344/N era par alojada en un ambiente controlado bajo luz 12/12: ciclo oscuro con el acceso del ad libitum al alimento y al agua. Todos los animales fueron atendidos utilizando las directrices establecidas por los Institutos Nacionales de Salud en la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio.
1. Empaquetado de virus en 293 células FT
- Cultivar las 293 células FT (5×105/mL)en matraces recubiertos de gelatina de 75 cm2 con DMEM más FBS al 10%11. Cultivar células a 37 °C para que sean confluentes al 50% en la transfección.
- Diluir 22,5 μL de reactivo de transfección (por ejemplo, lipofectamina 3000) en 750 μL de medio (por ejemplo, Opti-MEM) en un tubo de microcentrifugación de 1,5 mL y vórtice durante 3 s.
- Diluir 20 μg de ADN plásmido EcoHIV en 750 μL de medio en un tubo de microcentrifugación de 1,5 mL y mezclar bien.
- Agregue adn diluido en el tubo del reactivo de transfección diluido y mezcle suavemente. Incubar durante 15 min a temperatura ambiente.
- Añadir la mezcla a 10 mL de medio DMEM precalentado en matraz de 75 cm2. Incubar las células durante 2 días a 37 °C.
- Cosechar y combinar 24 mL de medio condicional de los dos matraces que incluyen el lentivirus envasado.
- Centrifugar los 24 mL de medio condicional a 500 x g durante 10 minutos a 4 °C. Transfiera el sobrenadante clarificado a un tubo estéril de 50 mL.
- Combinar 8 mL de concentrador Lenti-x con 24 mL de sobrenadante clarificado (relación 1:3). Mezclar por inversión suave. Incubar la mezcla a 4 °C durante dos días.
- Mezcla de centrífuga a 1.500 x g durante 45 minutos a 4 °C. Retire cuidadosamente el sobrenadante.
- Vuelva a suspender suavemente el pellet con 100 μL de PBS de 100 mM.
- Concentración del virus del título con un kit p24 ELISA.
2. Cirugías estereotáxicas del virus EcoHIV-EGFP
- Anestesiar ratas usando sevoflurano al 3%. Proceda al paso 2.2 cuando las ratas no responden a los estímulos nocivos y los reflejos están ausentes.
- Afeitarse los pelos de la región del cerebro y esterilizar la piel dos veces con etanol al 70% y un exfoliante a base de clorhexidina. Asegure la rata en una posición propensa en el aparato estereotáxico.
- Haga una incisión (5-6 cm) a través de la piel a lo largo de la línea media del cuero cabelludo.
- Marque dos posiciones de perforación a 0,8 mm laterales, 1,2 mm rostral a bregma. Taladrar un agujero (diámetro 0,4 mm) en cada posición del cráneo.
- Llene la solución de lentivirus EcoHIV con título (1,04 × 106 TU/mL) en una jeringa de inyección de 10 μL. Asegure la jeringa al aparato estereotáxico.
- Mueva hacia abajo la aguja cerca de la superficie del orificio de perforación. Medir y mover 2,5 mm de profundidad.
- Infundir 1 μL de solución de virus a una velocidad de 0,2 μL/min. Mantenga la aguja dentro del área de inyección durante 5 min. Mueva lentamente la aguja hacia arriba hasta que esté fuera del cráneo de la rata.
- Sutura la piel con un hilo de seda 4-0.
- Esterilice la incisión con etanol al 70% una vez. Inyectar butorfenol por vía subcutánea (Dorolex, 0,1 mg/kg de peso corporal).
- Transfiera la rata a una cámara de recuperación con una almohadilla térmica hasta que se despierte.
3. Visualización de las secciones cerebrales
NOTA: Espere de una a ocho semanas después de la infusión viral de EcoHIV.
- Anestesiar la rata con 5% sevoflurano. Continúe con el paso 3.2 cuando las ratas no responden a los estímulos nocivos y los reflejos están ausentes.
- Fije la rata en una posición supina dentro de una campana extractora de humos.
- Incise la piel a lo largo de la línea media torácica. Cortar el diafragma y abrir la cavidad torácica.
- Inserte una aguja de 20 G × 25 mm en el ventrículo izquierdo.
- Abra inmediatamente la aurícula derecha con unas tijeras.
- Perfundir 50 mL de PBS prechilled 100 mM a razón de 5 mL/min.
- Perfundir 100 mL de paraformadehído frío al 4% a razón de 5 mL/min.
- Decapitar la rata, abrir el cuero cabelludo y quitar el cerebro.
- Postfix durante la noche con paraformaformadehído al 4%.
- Transfiera el cerebro a 40 mL de sacarosa al 30% en PBS de 100 mM en un tubo de 50 mL hasta que el cerebro flote hasta el fondo (aproximadamente 3 días).
- Snap congelar el cerebro en metilbutanol durante 2 min a - 80 °C.
- Asegure el tejido cerebral en una plataforma metálica dentro de un criostato de -20 °C.
- Corte las secciones coronales de 50 μm de espesor usando el criostato.
- Transfiera las rebanadas cerebrales a los portaobjetos de vidrio con un cepillo fino.
- Montar secciones en 0,3 mL de medio antifade y cubrir con cubrebocas de 22 mm y 50 mm.
- Mantenga los portaobjetos de vidrio en la oscuridad a temperatura ambiente hasta que se sequen.
- Imagen de las neuronas objetivo con un microscopio confocal utilizando Z-pila basada en los límites de la región del cerebro y las características morfológicas de las neuronas.
NOTA: Los ajustes de microscopio confocal utilizados fueron: aumento de 60 X (A/1.4, aceite), y un intervalo de plano Z de 0.15 μm (tamaño del agujero de alfiler 30 μm; radio del agujero de alfiler proyectado hacia atrás 167 nm) utilizando una longitud de onda de 488 nm.
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Representative Results
El medio condicionado fue recogido del lentivirus de las células infectadas EcoHIV-EGFP 293FT. Después, fue concentrado y ºdado, entonces stereotaxically inyectado en el cerebro (región cortical) de las ratas de F344/N. Siete días después de la inyección, las ratas fueron sacrificadas y las imágenes fueron tomadas de las rebanadas coronales del cerebro que se extendían de bregma 5.64 milímetros a bregma -4.68 milímetros. En la Figura 1A,hay señales significativas de EcoHIV-EGFP en todo el cerebro, especialmente en la corteza y la circunvolución dentada del hipocampo. Además, el etiquetado dual con sondas Iba1 y EcoHIV-EGFP proporcionó una fuerte evidencia de que la microglía era el tipo de célula predominante que albergaba la expresión de EcoHIV en el cerebro(Figura 1B). En particular, el patrón de distribución de EcoHIV-EGFP es consistente con las concentraciones regionales relativas de microglía en el cerebro de rata (es decir, corteza y giro dentado del hipocampo).
En un estudio posterior, validamos la utilidad de la infección por EcoHIV en ratas para modelar aspectos clave de HAND. Usando el protocolo detallado arriba, las ratas de F344/N fueron inyectadas stereotaxically con EcoHIV-EGFP o salino. En primer lugar, ocho semanas después de la infección, el procesamiento temporal, una dimensión elemental potencial de hand12,se evaluó mediante la inhibición del prepulso de brecha visual(Figura 2). Los animales de EcoHIV exhibieron una insensibilidad relativa a la manipulación del intervalo del interstimulus (ISI), evidenciado por una función relativamente más plana de ISI comparada a los controles salinos. Específicamente, se observaron diferencias significativas en la pendiente de la función ISI de los 50 ms ISI a los 200 ms ISI (Semilog Line-X es Log, Y es Lineal,R2s ≥ 0,99; F(1,2)=642,9, p≤0,001). En segundo lugar, el etiquetado balístico se utilizó para investigar el impacto de las inyecciones de EcoHIV-EGFP en la morfología de las espinas dendríticas en las neuronas espinosas medianas (MSN) del núcleo accumbens (NAc; Figura 3); parámetros que pueden utilizarse para extraer inferencias sobre la función sináptica13. Las ratas de EcoHIV exhibieron alteraciones profundas en morfología dendrítica de la espina dorsal, evidenciada por una frecuencia relativa creciente de espinas dendríticas más cortas (interacción del compartimiento del genotipo x, F (16, 218) = 4,3, p ≤ 0,001) con un diámetro principal creciente (interacción del compartimiento del genotipo x, F (12, 96) = 18,7, p ≤ 0,001) y diámetro creciente del cuello (interacción del compartimiento del genotipo x, F (15, 120) = 16,3, p ≤ 0,001) en relación con los animales de control. La metodología detallada para el gravamen del proceso temporal14 y del etiquetado balístico13 se ha divulgado previamente.
Figura 1. Las células infectadas ecoHIV-EGFP distribuidas en el cerebro de rata. (A)Las imágenes confocales representativas (20x) de la expresión de EcoHIV-EGFP en la circunvolución dentada del hipocampo o en las regiones de la corteza a los 7 días después de la inyección. (B) Las imágenes confocales representativas (60X) de co-localización de Iba1 inmunostaining con las células infectadas EcoHIV-EGFP en 7 días después de la inyección. Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.
Figura 2. La infección de EcoHIV indujo déficits neurocognitive prominentes en el proceso temporal. La inhibición visual del prepulse del boquete fue conducida ocho semanas después de las inyecciones stereotaxic de EcoHIV o salino. La infección de EcoHIV indujo alteraciones prominentes en el proceso temporal evidenciado por la insensibilidad relativa a la manipulación del intervalo del interstimulus en relación con las ratas del control. Metodología detallada descrita en McLaurin et al.13. Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.
Figura 3. La infectividad con EcoHIV-EGFP alteró los parámetros morfológicos de espinas dendríticas, apoyando la disfunción sináptica profunda. Las ratas ecoHIV mostraron alteraciones profundas en la morfología dendrítica de la columna vertebral, evidenciadas por un aumento de la frecuencia relativa de espinas dendríticas más cortas(A)con un mayor diámetro de la cabeza(B)y un mayor diámetro del cuello(C)en relación con los animales de control. Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.
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Discussion
En este protocolo, establecimos un modelo de infección por VIH inducida por EcoHIV en ratas. Específicamente, describimos una inyección stereotaxic bilateral de EcoHIV en la corteza que indujo con éxito la infección vih activa en el cerebro de la rata 7 días de poste-inyección. Además, demostramos que la infección por EcoHIV en ratas podría ser un buen sistema biológico para estudiar aspectos clave de HAND. Ocho semanas de infección post-EcoHIV, ratas exhibieron deterioros neurocognitivos significativos, que incluyeron las alteraciones en el procesamiento temporal y la disfunción sináptica en MSNs del NAc. Dada la importancia de los modelos animales para el estudio del neuroHIV y hand2,el desarrollo de un nuevo sistema biológico puede ser ventajoso para abordar nuevas cuestiones dentro del campo. Potash et al.3 informaron por primera vez el uso de EcoHIV para inducir la infección activa por VIH-1 en ratones. Específicamente, los ratones fueron inoculados con una solución de 0,1 mL de solución del virus EcoHIV a través de inyecciones de venas de cola3. Seis semanas después de la infección, la DNA viral HIV-1 fue detectada en células y linfocitos del bazo. Además, una inoculación de la inyección de EcoHIV fue suficiente para inducir la infección en más del 75% de los ratones. La utilización de inyecciones stereotaxic bilaterales, como en este estudio, infectó con éxito el 100% de las ratas (n = 6 o n = 4, respectivamente) evidenciadas por la detección de EcoHIV-EGFP en el cerebro siete días después de la inyección.
Estudios anteriores han demostrado que la infección por EcoHIV en el ratón implica fuertemente que la microglía cerebral es altamente susceptible a la infección por el virus EcoHIV3. En este estudio, combinado con Iba1 (un marcador microglial de la célula) immunostaining, una co-localización significativa de la señal de EGFP con las células de Iba1+fue observada, sugiriendo fuertemente que la microglia era el tipo principal de la célula para la infección de EcoHIV en cerebro de la rata. Las observaciones de la infección significativa por EcoHIV en la microglía son consistentes con los datos en ratones infectados con EcoHIV6,así como en individuos seropositivos conVIH-1 15 y otros sistemas biológicos comúnmente utilizados para modelar el VIH16,17. También realizamos la inyección retro-orbital de EcoHIV-EGFP en ratas de F344/N y los datos también indicaron la alta expresión de EcoHIV-EGFP en la corteza y la convolución del cerebro dentada hippocampal después de solamente siete días (datos no mostrados). En cambio, la inyección de I.P. de EcoHIV en ratas de F344/N llevó a la expresión viral imperceptible en el cerebro de la rata, a pesar de altas dosis del lentivirus de EcoHIV.
Con respecto a este protocolo, los investigadores deben asegurarse de que el medio acondicionado, incluido el envase de lentivirus EcoHIV en 293 células FT, se concentre y se tíree antes de usarlo para la inyección estereotáxica. Estos pasos son fundamentales para garantizar resultados coherentes y replicables en todos los experimentos. Además, también encontramos que la infección de EcoHIV fue propagada de la inyección stereotaxic en cerebro al tejido del bazo en 8 semanas después de la inyección. Mientras tanto, los déficits de procesamiento temporal se observaron en ratas infectadas por EcoHIV tan pronto como 14 días y se mantuvieron durante 8 semanas después de la infección (el tiempo terminal experimental actual, Figura 2). En comparación con el modelo de infección generalizada de EcoHIV en ratones, la inyección estereotáxica regional más específica de EcoHIV produjo una infección eficiente por el VIH en áreas cerebrales y produjo un déficit de procesamiento temporal en ratas, que es clave para el estudio de la disfunción neurocognitiva asociada al VIH.
Las limitaciones que brindan más oportunidades para el protocolo actual incluyen la identificación de otros tipos de células como neuronas y astrocitos, un estudio de tiempo-curso de los cambios en la expresión de EcoHIV-EGFP después de la infección para indicar la replicación viral y la latencia en el cerebro, un estudio longitudinal para abordar los impactos potenciales de los déficits neurocognitivos asociados al VIH, y la evaluación de si la inyección estereotáxica de EcoHIV evade el sistema inmunológico extendiendo aún más la expresión viral a través de la b odia. Además, esto debe probarse en otras cepas de ratas para confirmar la generalización de la infección por EcoHIV en ratas.
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Disclosures
Ninguno de los autores tiene conflictos de intereses que declarar.
Acknowledgments
Este trabajo fue financiado por las subvenciones HD043680, MH106392, DA013137 y NS100624 de los NIH.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 293FT cells | ThermoFisher Scientific | R70007 | |
| Antibiotic-Antimycotic solution | Cellgro | 30004CI | 100X |
| Corning BioCoatGelatin 75cm² Rectangular Canted Neck Cell Culture Flask with Vented Cap | Life Technologies | 354488 | |
| Corning DMEM with L-Glutamine, 4.5 g/L Glucose and Sodium Pyruvate | Life Technologies | 10013CV | |
| Cover glass | VWR | 637-137 | |
| drill | |||
| Dumont #5 Forceps | World Precision Instruments | 14095 | |
| Dumont #7 Forceps | World Precision Instruments | 14097 | |
| Eppendorf Snap-Cap Microcentrifuge Biopur Safe-Lock Tubes | Life Technologies | 22600028 | |
| Ethicon Vicryl Plus Antibacterial, 4-0 Polyglactin 910 Suture, 27in. FS-2 | Med Vet International | VCP422H | |
| Hamilton syringe | Hamilton | 1701 | |
| Invitrogen Lipofectamine 3000 Transfection Reagent | Life Technologies | L3000015 | |
| Iris Forceps | World Precision Instruments | 15914 | |
| Iris Scissors | World Precision Instruments | 500216 | |
| Lentivirus-Associated p24 ELISA Kit | Cell Biolabs, inc. | VPK-107-5 | |
| Lenti-X Concentrator | Takara | PT4421-2 | |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Life Technologies | 11058021 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127-500G | |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
| ProLong Gold | Fisher Scientific | P36930 | |
| Sevoflurane | Merritt Veterinary Supply | 347075 | |
| stereotaxic apparatus | Kopf Instruments | Model 900 | |
| SuperFrost Plus Slides | Fisher Scientific | 12-550-154% | |
| Vannas Scissors | World Precision Instruments | 500086 |
References
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