Este artículo describe un protocolo detallado para el uso de la enzima Cas13D dirigida al ARN (RfxCas13D) en moscas.
CasRx, un miembro de la familia Cas13 dirigida al ARN, es una nueva adición prometedora de las tecnologías CRISPR / Cas en la reducción eficiente de la transcripción de genes con un atractivo perfil fuera del objetivo tanto a nivel celular como de organismo. Recientemente se ha informado de que el sistema CRISPR/CasRx se puede utilizar para lograr una reducción ubicua y específica de la transcripción de genes en Drosophila melanogaster. Este artículo detalla los métodos del trabajo reciente, que consta de tres partes: 1) orientación ubicua de ARN endógeno in vivo utilizando un sistema CasRx de dos componentes; 2) orientación ubicua de ARN exógeno in vivo utilizando un sistema CasRx de tres componentes; y 3) la orientación de ARN in vivo específica del tejido utilizando un sistema CasRx de tres componentes. Los efectos de la orientación del ARN observados incluyen cambios fenotípicos específicos de genes dirigidos, reducción dirigida de la transcripción del ARN y fenotipos de letalidad ocasionales asociados con una alta expresión de la proteína CasRx y la actividad colateral. En general, estos resultados mostraron que el sistema CasRx es capaz de apuntar a la reducción de la transcripción de ARN a nivel del organismo de una manera programable y eficiente, lo que demuestra que la orientación y la ingeniería del transcriptoma in vivo son factibles y sientan las bases para futuras tecnologías de orientación de ARN basadas en CRISPR in vivo.
Desde el advenimiento de las tecnologías Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR), gran parte del enfoque en este campo se ha centrado en la edición de ADN, que ofrece aplicaciones transformadoras en medicina y biotecnología1. La alteración permanente de las secuencias de ADN, sin embargo, no siempre se desea debido a consideraciones éticas. A la luz de esto, estudios recientes comenzaron a desarrollar herramientas basadas en CRISPR para dirigirse al ARN y demostraron que las tecnologías CRISPR pueden usarse para la orientación del ARN en una variedad de sistemas biológicos2,3,4,5,6,7. En muchos de estos sistemas probados, el enfoque actual ampliamente utilizado para dirigirse a la reducción de ARN y transcripción es la interferencia de ARN (ARNi), que está lejos de ser perfecta, a menudo exhibe una eficacia variada y una alta actividad fuera del objetivo cuando se usa in vivo8,9,10,11,12,13,14,15,16,17 . Por lo tanto, dado el estado de estas tecnologías, vale la pena explorar más a fondo los potenciales de las herramientas basadas en CRISPR para la orientación de ARN.
Un estudio reciente notable informó que la ribonucleasa CasRx, un miembro de la clase Cas13d, puede reducir eficientemente los niveles de transcripción de genes en cultivos celulares humanos y posee un atractivo perfil fuera del objetivo4. Este hallazgo llevó a la pregunta de si esta nueva ribonucleasa puede mantener su eficacia y una baja tasa fuera del objetivo para el ARN dirigido a nivel del organismo. Un estudio reciente abordó esta pregunta al mostrar que el sistema CasRx se puede utilizar para lograr una reducción de la transcripción de genes ubicua y específica del tejido en Drosophila melanogaster5.
Para agilizar la usabilidad de este enfoque recientemente publicado, este protocolo detalla los métodos de este trabajo reciente, que consta de tres partes principales: 1) orientación de ARN in vivo ubicua utilizando un sistema CasRx de dos componentes; 2) orientación ubicua de ARN exógeno in vivo utilizando un sistema CasRx de tres componentes; y 3) la orientación de ARN in vivo específica del tejido utilizando un sistema CasRx de tres componentes.
Se diseñaron ARN guía (ARNg) dirigidos a diferentes genes diana bajo el control de un promotor ubicuo y se generaron líneas de mosca que expresan estas construcciones que contienen ARNg. También se diseñaron construcciones casRx bajo el control de un promotor ubicuo o un promotor de secuencia de activación ascendente condicional (UASt) activable por el factor de transcripción GAL4 y se generaron líneas de vuelo que albergan estas construcciones que contienen CasRx. Los constructos CasRx catalíticamente inactivos, dCasRx, fueron diseñados y utilizados como controles negativos. La orientación ubicua de ARN en moscas se logra cruzando líneas de mosca que expresan gRNA con líneas de mosca que expresan CasRx de forma ubicua. La progenie que expresa tanto la construcción de ARNg dirigida a una transcripción genética específica como la proteína CasRx tiene una reducción ubicua de las transcripciones de genes dirigidos. La focalización de ARN específico de tejido en moscas se logra cruzando primero moscas que expresan ARNg con moscas que expresan UASt-CasRx, obteniendo moscas transheterocigotas que transportan construcciones de gRNA y UASt-CasRx. Tales moscas a su vez se cruzan con moscas que expresan GAL4 específicas del tejido, lo que resulta en la generación de la expresión de CasRx específica del tejido y la orientación de ARN en las moscas.
La naturaleza programable del sistema CasRx ofrece la posibilidad de personalización y optimización para ayudar a lograr una alta eficacia y una baja actividad fuera del objetivo para la orientación de ARN in vivo. Las aplicaciones potenciales de la orientación de ARN basada en CRISPR son numerosas, incluida la sustitución de ARNi en el laboratorio y la contribución al control de insectos vectores en la naturaleza. De estos últimos, una de las necesidades globales insatisfechas es el desarrollo de herramientas eficientes para combatir las infecciones de virus de ARN transmitidas a través de mosquitos. Muchos virus de ARN, como el dengue, el Zika y el virus chikungunya, se transmiten a través de mosquitos, lo que afecta la salud humana y contribuye a la mortalidad. Se han hecho muchas propuestas para diseñar poblaciones de mosquitos con resistencia al virus para la prevención de enfermedades; sin embargo, ninguna tecnología actual es capaz de hacer que los mosquitos sean simultáneamente resistentes a todos los virus de ARN significativos18,19,20,21,22,23. Los sistemas Cas dirigidos al ARN pueden proporcionar un punto de partida para dicha tecnología al permitir una plataforma programable para atacar todos los virus de ARN transmitidos por mosquitos.
Con tres diseños de aplicación diferentes del sistema CasRx, este trabajo demostró in vivo la orientación de ARN programable en moscas. Las diferentes estrategias satisfacen las diferentes necesidades del proyecto, como la orientación génica endógena versus exógena y la orientación ubicua versus específica del TEJIDO. Los efectos de la orientación del ARN incluyeron cambios fenotípicos específicos del gen objetivo, reducción de la transcripción del ARN objetivo y fenotipos de letalidad ocasionales asociados con la alta expresión de la proteína CasRx y la actividad colateral. En general, estos resultados mostraron que el sistema CasRx es capaz de apuntar a la reducción de la transcripción de ARN a nivel del organismo de una manera programable y eficiente.
Uno de los factores clave en la personalización exitosa del sistema CasRx es el diseño de gRNAs. Específicamente, se prestarán atención a los siguientes consejos: la secuencia objetivo tiene una longitud de alrededor de 30 nucleótidos, la longitud de los estiramientos poli-U en la secuencia objetivo es de 4 pares de bases o menos, el contenido de GC de la secuencia objetivo está en el rango del 30% al 70%, no se predice que la secuencia objetivo forme estructuras de horquilla de ARN fuertes y la secuencia objetivo contiene una estructura secundaria o terciaria mínima de ARN predicha5.
Además de los diseños de ARNg, el paso de genética de moscas en cada protocolo también es crítico en una implementación exitosa. La presencia o falta de los fenotipos definidos transmitidos por los padres en las progenies son importantes para identificar y cuantificar los fenotipos inducidos por el sistema CasRx en las progenies transheterocigotas. Además, la configuración de cruces de control utilizando las moscas dCasRx en paralelo también es útil para descartar fenotipos no específicos en las progenies transheterocigotas.
Vale la pena señalar que estos resultados revelaron el problema de toxicidad introducido por la expresión ubicua de casRx y la proteína dCasRx en la mosca, una limitación del sistema CasRx. La expresión ubicua de CasRx o dCasRx bajo el promotor Ubiq solo, sin gRNAs, vino con costos de aptitud no triviales, ya que ni ubiq-CasRx ni ubiq-dCasRx volaron como líneas homocigotas. Por el contrario, las moscas UASt-CasRx y UASt-dCasRx pueden establecerse como poblaciones homocigotas sanas, aunque debido al diseño del esquema cruzado se mantuvieron como poblaciones de doble equilibrio, un hecho que respalda la existencia de toxicidad inducida por la expresión ubicua de la proteína CasRx. Otra evidencia de apoyo es que en experimentos de control que involucran dCasRx, que es catalíticamente inactivo, los porcentajes de moscas que llevan construcciones de dCasRx y gRNA del número total de moscas en la generación F1 fueron consistentemente inferiores al 50%, la proporción esperada basada en la genética mendeliana si no había toxicidad asociada a dCasRx. Esto indicó que la expresión ubicua de dCasRx, junto con los gRNAs, induce toxicidad en la mosca, lo que resulta en una relación de herencia inferior a la esperada. Las relaciones de herencia de las moscas transheterocigotas UASt-dCasRx, gRNA, GAL4 siguieron la genética mendeliana, lo que nuevamente sugiere la toxicidad inducida específicamente por la expresión ubicua de las proteínas CasRx y dCasRx. La toxicidad en el sistema CRISPR/Cas no es nueva. Se ha demostrado que altas cantidades de proteína Cas9 son tóxicas en varios organismos, incluidas las moscas29,30,31,32. Un estudio reciente ha desarrollado un sistema GAL4/UAS personalizado que puede ajustar la cantidad de proteína Cas9 expresada en moscas mediante la adición de un marco de lectura abierta de longitud variable entre la secuencia UAS y la secuencia Cas9 en la construcción UAS-Cas933. Por lo tanto, vale la pena explorar formas de reducir la toxicidad inducida por CasRx ajustando el nivel de expresión de la proteína CasRx.
Aparte de la toxicidad inducida por la expresión ubicua de las proteínas CasRx y dCasRx, los resultados también mostraron una letalidad vinculada a los efectos colaterales no específicos fuera del objetivo del sistema CasRx, una característica de muchos sistemas CRISPR1,2,7,34. En algunas de las moscas transheterocigotas dobles o triples que expresan gRNA de CasRx y genes no esenciales, por ejemplo, cuando se dirigen a Notch, las moscas transheterocigotas CasRx tienen niveles significativamente más bajos de tasa de supervivencia en comparación con las moscas transheterozgyous dCasRx. En el análisis de ARN-seq de estas moscas transheterocigotas casRx y que expresan ARNg, se observó tanto la reducción de los niveles de transcripción de genes diana como la reducción de transcripciones de genes no objetivo. Estos efectos colaterales fueron dependientes de CasRx y dependientes del objetivo, ya que solo se observaron en moscas transheterocigotas que expresan tanto la proteína CasRx como el ARNg. Vale la pena señalar que uno de los genes objetivo, el blanco, mostró solo una reducción limitada y no estadísticamente significativa en las transcripciones cuando el gen blanco fue atacado por CasRx, lo que contrastaba con el fenotipo de reducción de pigmento claro. Se plantea la hipótesis de que esto puede deberse al hecho de que 1) el momento de la recolección de muestras de ARN-seq no estaba bien alineado con el momento en que el gen blanco alcanza su máxima expresión durante el desarrollo temprano, y 2) la expresión localizada del gen blanco en los ojos hace que sea difícil recolectar los tejidos relevantes durante la fase de desarrollo temprano cuando solo es factible la recolección de muestras de todo el cuerpo. Para reducir la actividad colateral en el sistema CasRx, se requieren estudios futuros para comprender completamente los mecanismos subyacentes al sistema de fenómenos fuera del objetivo a nivel del organismo.
Curiosamente, un estudio reciente35 que describe las herramientas Cas13 dirigidas al ARN en moscas pareció mejorar la toxicidad general asociada con la expresión de CasRx, por varias razones posibles. En primer lugar, los autores recodificaron los transgenes Cas13 para optimizar la expresión en Drosophila y utilizaron un promotor de expresión más débil (actina 5C) en comparación con el promotor de ubiquitina utilizado en el presente estudio, lo que probablemente conduce a niveles más bajos de expresión de Cas13 y, por lo tanto, a una menor toxicidad. De hecho, esto está respaldado por las observaciones de que la expresión de CasRx y dCasRx impulsada por UASt no era, por sí misma, tóxica, ya que este estudio (y los autores en 35) no observaron ninguna letalidad obvia en las moscas UASt-CasRx. Además, estos autores codificaron sus ARNs de manera diferente en comparación con este estudio, lo que puede haber afectado su expresión y reducido la toxicidad del sistema en moscas transheterocigotas Cas13/gRNA. Por ejemplo, en su estudio se expresaron dos ARNg utilizando el promotor U6:3 y flanqueados por ARNt para permitir el procesamiento de ARNg en la maduración del ARNt sin requerir CasRx35. Por el contrario, en este estudio, los gRNAs se codificaron como matrices dirigidas a hasta 4 ubicaciones por gen e imitando la estructura endógena de la matriz Cas13 que se encuentra en las bacterias, que requiere que la enzima Cas13 procese cada gRNA. Estos diferentes enfoques pueden haber llevado a diferencias en los niveles de expresión de ARNg y otros factores que pueden tener efectos inherentes sobre la toxicidad de todo el sistema. Finalmente, Huynh et al. se dirigieron a genes diferentes a los dirigidos en el presente estudio, lo que resulta en diferencias en la interacción objetivo-Cas/gRNA y la actividad colateral y puede tener efectos sobre los niveles observados de letalidad. Estas diferencias en la toxicidad observada justifican una mayor investigación para identificar formas en que se pueden mejorar los sistemas generales.
En general, este estudio es la primera demostración de un sistema Cas funcional codificable programable dirigido a ARN codificado genéticamente en D. melanogaster, aunque se requerirá una mayor optimización del sistema CasRx (en línea con lo que se informa35) para reducir aún más la letalidad asociada fuera del objetivo y aumentar la eficacia de la escisión CasRx en el objetivo. La orientación de ARN con enzimas Cas es un campo en rápida evolución con muchas aplicaciones potenciales que van desde el control de insectos vectores hasta usos terapéuticos1,2,3,4,5,6,7, y este protocolo ofrece un paquete de inicio para cualquier persona interesada en diseñar su primer sistema CasRx en moscas, al tiempo que es compatible con la personalización y la optimización adicional del sistema. Los ejemplos presentados aquí demuestran una gama de resultados que uno puede encontrar durante la implementación de este sistema in vivo y pueden servir como puntos de referencia para otros usuarios en la evaluación del rendimiento del sistema CasRx en sus aplicaciones.
The authors have nothing to disclose.
Este trabajo fue apoyado en parte por la financiación de una subvención del Programa de Genes Seguros de DARPA (HR0011-17-2-0047) y los premios de los NIH (R21RAI149161A, DP2AI152071) otorgados a O.S.A.
100% Grape Juice | Welch Foods Inc. | N/A | |
Active Dry Yeast (908g) | Red Star Yeast Company, LLC | N/A | |
DMC4500 color camera | Leica Microsystems | DMC4500 | |
Dual-Luciferase Reporter Assay System | Promega | E1910 | |
GAL4-GMR flies | Bloomington Drosophila Stock Center | 29967 | |
GAL4-y flies | Bloomington Drosophila Stock Center | 44373 | |
Glomax 20/20 Luminometer | Promega | E5331 | |
Illumina HiSeq2500 Sequencer | Illumina, Inc. | HiSeq2500 | |
M165FC fluorescent stereomicroscope | Leica Microsystems | M165FC | |
Nanodrop OneC UV-vis spectrophotometer | ThermoFisher | NDONEC-W | |
NEBNext Ultra II RNA Library Prep Kit | New England Biolabs, Inc. | E7770 | |
plasmid # 112686 | Addgene | 112686 | |
plasmid # 112688 | Addgene | 112688 | |
plasmid # 132416 | Addgene | 132416 | |
plasmid # 132417 | Addgene | 132417 | |
plasmid # 132419 | Addgene | 132419 | |
plasmid # 132420 | Addgene | 132420 | |
plasmid # 132421 | Addgene | 132421 | |
plasmid # 132422 | Addgene | 132422 | |
plasmid # 132425 | Addgene | 132425 | |
plasmid # 132426 | Addgene | 132426 | |
plasmid # 133304 | Addgene | 133304 | |
plasmid # 164586 | Addgene | 164586 | |
plasmid #132418 | Addgene | 132418 | |
plasmid pJFRC81 | Addgene | 36432 | |
Qiagen RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | |
Restriction endonucleases AscI | New England Biolabs Inc. | R0558L | |
Restriction endonucleases NotI | New England Biolabs Inc. | R0189L | |
Restriction endonucleases PacI | New England Biolabs Inc. | R0547L | |
Restriction endonucleases PstI | New England Biolabs Inc. | R0140L | |
Restriction endonucleases SwaI | New England Biolabs Inc. | R0604L | |
Restriction endonucleases XbaI | New England Biolabs Inc. | R0145L | |
RNA 6000 Pico Kit for Bioanalyzer | Agilent Technologies | 5067-1513 | |
Turbo DNase | Invitrogen | AM2238 | |
U6-3:4-gRNA-Fluc flies | Bloomington Drosophila Stock Center | 84125 | |
U6-3:4-gRNA-GFP; OpIE2-GFP flies | Bloomington Drosophila Stock Center | 84986 | |
U6-3:4-gRNA-N flies | Bloomington Drosophila Stock Center | 84122 | |
U6-3:4-gRNA-w flies | Bloomington Drosophila Stock Center | 84124 | |
U6-3:4-gRNA-y flies | Bloomington Drosophila Stock Center | 84123 | |
UASt-CasRx flies | Bloomington Drosophila Stock Center | 84121 | |
UASt-dCasRx flies | Bloomington Drosophila Stock Center | 84120 | |
Ubiq-CasRx flies | Bloomington Drosophila Stock Center | 84118 | |
Ubiq-dCasRx flies | Bloomington Drosophila Stock Center | 84119 | |
Ubiq-Firefly-T2A-eGFP-Ubiq-Renilla flies | Bloomington Drosophila Stock Center | 84127 | |
Zymoclean Gel DNA Recovery Kits | Zymo Research Corporation | D4007 |