Summary
Dit protocol beschrijft een benadering voor in toto labeling en multidimensionale beeldvorming van zebravissen vroege oogontwikkeling. We beschrijven labeling, embedding en vierdimensionale (4D) beeldvorming met behulp van laserscannen confocale microscopie, en overwegingen voor het optimaliseren van de verwerving van datasets voor het ontleden van mechanismen van optische cupmorfogenese.
Abstract
Visuele systeemfunctie vereist de vaststelling van nauwkeurige weefsel- en orgaanstructuren. In het gewervelde oog zijn structurele defecten een veel voorkomende oorzaak van visuele beperking, maar mechanismen van oogmorfogenese worden nog steeds slecht begrepen. De basisorganisatie van het embryonale oog wordt in alle gewervelde dieren bewaard, dus levende beeldvorming van zebravisembryo's is een krachtige benadering geworden om de oogontwikkeling direct in realtime te observeren onder normale en pathologische omstandigheden. Dynamische celprocessen zoals bewegingen, morfologieën, interacties, deling en dood kunnen in het embryo worden gevisualiseerd. We hebben methoden ontwikkeld voor uniforme etikettering van subcellulaire structuren en timelapse confocale microscopie van vroege oogontwikkeling bij zebravissen. Dit protocol schetst de methode voor het genereren van gecapitpt mRNA voor injectie in het 1-cel zebravisembryo, het monteren van embryo's in het optische blaasstadium (~ 12 uur na bevruchting, hpf) en het uitvoeren van multidimensionale timelapse-beeldvorming van optische cupmorfogenese op een laserscan confocale microscoop, zodat meerdere datasets opeenvolgend worden verkregen in dezelfde beeldvormingssessie. Een dergelijke aanpak levert gegevens op die voor verschillende doeleinden kunnen worden gebruikt, waaronder celtracering, volumemetingen, driedimensionale (3D) rendering en visualisatie. Onze benaderingen stellen ons in staat om de cellulaire en moleculaire mechanismen te lokaliseren die de ontwikkeling van optische bekers stimuleren, zowel in wilde als genetische mutante omstandigheden. Deze methoden kunnen direct door andere groepen worden gebruikt of worden aangepast om veel extra aspecten van de ontwikkeling van zebravissen te visualiseren.
Introduction
Gewervelde oogontwikkeling begint met de opkomst, of ontwijking, van de optische blaasjes uit het prospectieve neuro-epitheel van de hersenen. De optische blaasjes ondergaan vervolgens een reeks weefselvormveranderingen, verlengen en vervolgens invagineren om de optische beker te genereren. In de optische beker pakken het neurale netvlies en het retinale pigmentepitheel, beide afgeleid van het neuro-epitheel, de ontluikende lens, die is afgeleid van het oppervlakte-ectoderm. Het hele proces vereist een complexe reeks cel- en weefselbewegingen en moleculaire signalering, gecoördineerd tussen neuro-epithelium,ectoderm, en mesenchymale celpopulaties. Deze eerste gebeurtenissen bepalen de basisstructuur van het oog, en latere stappen van oogontwikkeling, waaronder iris- en hoornvliesvorming, zijn uitwerkingen op vroege organisatie. Verstoringen van de vroege oogontwikkeling en morfogenese liggen ten grondslag aan talrijke aandoeningen van visuele beperkingen bij mensen, waaronder anoftalmie, microftalmie en coloboom. Het ontsluiten van de cellulaire en moleculaire mechanismen die de morfogenese van optische cup regelen, is cruciaal voor een beter begrip van de visuele systeemontwikkeling en de pathologische omstandigheden die ontstaan wanneer deze processen misgaan.
Ons begrip van gewervelde oogontwikkeling en morfogenese kwam voort uit een enorme hoeveelheid werk dat klassieke histologische studies omvatte tot embryologische en genetische benaderingen in een verscheidenheid aan modelorganismen, waaronder muis, kuiken, kikker en vis1,2,3,4,5. Terwijl dit oeuvre moleculaire mechanismen heeft vastgesteld die de vroege ontwikkeling van de ogen reguleren, bestaat er historisch gezien een slecht begrip van de morfogenese van het oog: de opkomst van de 3D-structuur. Het grootste deel van deze bevindingen is afkomstig van beeldvorming gesectiede embryo's op discrete tijdstippen. Hoewel dit voldoende is om een beeld te geven van weefselmorfologie in 2 dimensies, is morfogenese een dynamisch, 3D-proces. Om te bepalen hoe de vorm van het weefsel in de loop van de tijd in 3 dimensies verandert, hoe afzonderlijke cellen zich gedragen en hoe dat gedrag bijdraagt aan veranderingen in de vorm van 3D-weefsel, zijn verschillende benaderingen nodig.
Een oplossing om deze aanzienlijke kloof in kennis aan te pakken is live beeldvorming, die dynamische observatie van cellen en weefsels in realtime mogelijk maakt naarmate het orgaan vorm krijgt. Helaas is dit bij veel modelorganismen niet gemakkelijk haalbaar vanwege de beperkingen van de embryonale ontwikkeling. Muis- en kuikenembryo's (die zich in de baarmoeder of in een eierschaal ontwikkelen) zijn bijvoorbeeld niet gemakkelijk toegankelijk en veel levende embryo's zijn niet optisch transparant, waardoor aanzienlijke lichtverstrooiing ontstaat en de diepte wordt beperkt waartoe beelden kunnen worden verkregen. Zebravissen, met externe ontwikkeling en transparante embryo's, bieden een unieke kans om live beeldvorming van oogmorfogenese uit te voeren6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19. Er zijn ook voldoende transgene en mutante lijnen beschikbaar, evenals hulpmiddelen om nieuwe transgenics en mutanten20,21,22,23,24te genereren . Verder treedt optische cupmorfogenese snel op bij zebravissen, gedurende een tijdsbestek van 12 uur (12-24 uur na bevruchting, hpf), waardoor beeldvorming van het hele proces haalbaar is.
Live imaging-inspanningen zijn versneld door uitbreiding en optimalisatie van de familie van fluorescerende eiwitten, die genetisch gecodeerde vitale etikettering van subcellulaire structuren mogelijk maken, evenals verbeteringen en innovaties in microscopiemethoden. Het hier beschreven protocol maakt gebruik van laserscanning confocale microscopie, in plaats van andere huidige benaderingen van beeldvorming zebravis embryogenese, waaronder spinnende schijf confocale microscopie, selectieve vlakverlichting microscopie (SPIM en zijn varianten), en andere meer gespecialiseerde microscopie methoden. Voor het zich ontwikkelende zebravisoog ontdekten we dat het draaien van schijfconocale microscopie niet voldoende was voor beeldvorming dieper in het weefsel. Hoewel SPIM een extreem snelle beeldtijd heeft en steeds vaker wordt gebruikt, blijft het verwerken van de grote datasets voor visualisatie en analyse een uitdaging. Laserscanning confocale microscopie is daarentegen gemakkelijk toegankelijk, vooral voor personen die geen expertise hebben in het assembleren van optische hardware. We hopen dat de brede beschikbaarheid van laserscannen confocale microscopie ons protocol nuttig zal maken voor veel laboratoria.
Hier beschrijven we onze methode voor het vastleggen van 4D-datasets van optische cupmorfogenese, met behulp van toto-etikettering van het embryo voor membranen en chromatine, en een laserscan confocale microscoop voor beeldverwerving (schema in figuur 1). De fluorescerende eiwitten die hier worden gebruikt (EGFP-CAAX en H2A. F/Z-mCherry) werden gekozen om weefseletikettering te voorzien van een enkele celresolutie. We gebruiken datasets die met dit protocol zijn gegenereerd voor verschillende beeldanalyse- en visualisatiefuncties. Dit protocol kan eenvoudig worden aangepast als andere subcellulaire structuren gewenst zijn. Plasmamembraanetikettering werd geselecteerd voor visualisatie van celvorm: we gebruiken EGFP-CAAX, waarbij de laatste 21 aminozuren van H-ras, die dienen als een prenylation signaalsequentie, worden versmolten met het C-eindpunt van EGFP13. Andere plasmamembraangetargete fluorescerende eiwitten (bijv. transmembranefusie of myristoylated) werken waarschijnlijk net zo goed. Om kernen te markeren, selecteerden we H2A. F/Z-mCherry, waarin mCherry wordt versmolten tot een histoneiwit13. Dit zorgt ervoor dat celdeling, inclusief mitotische spindeloriëntatie, eenvoudig wordt gevisualiseerd.
Bij elke live beeldvormingsbenadering moet men rekening houden met afwegingen tussen het verhogen van de beeldsnelheid en het maximaliseren van de signaal-ruisverhouding, axiale resolutie en monsterbehoud. We hebben onze methoden geoptimaliseerd om de beeldkwaliteit en het aantal embryo's dat in één keer kan worden afgebeeld, te maximaliseren. Vaak is het doel om optische cupmorfogenese in beeld te brengen in een homozygous mutant embryo, dat fenotypisch niet te onderscheiden is van wild type bij het begin van optische cupmorfogenese en de nakomelingen van een heterozygote incross (25% van de embryo's is het gewenste genotype). Door het optimaliseren en vervolgens multiplexen van beeldverwerving is de kans groter dat een dataset van een homozygoot mutant embryo wordt vastgelegd.
Tijdelijke resolutie, of hoe vaak volumegegevens (Z-stacks) worden verkregen, is een belangrijk aspect van timelapse-beeldvorming. Afhankelijk van het doel van dergelijke gegevenssets zijn er verschillende vereisten voor snelheid. Aanvankelijk werd dit protocol ontwikkeld voor handmatige 4D-celtracking. Het volgen van individuele cellen in een uniform gelabeld weefsel vereist een hoge tijdsresolutie om het vertrouwen te geven dat een cel in de loop van de tijd continu wordt gevolgd. We ontdekten dat Z-stapels zebravis optische cup morfogenese ten minste elke 3,1 minuten gedurende 12 uur moeten worden verworven; hier hebben we onze acquisitie geoptimaliseerd op een laserscan confocale microscoop, zodat we elke 2,5 minuut Z-stacks van 4-5 embryo's kunnen verwerven.
Het vaststellen van de Z-stapgrootte was een cruciale stap in protocoloptimalisatie: voor 3D-rendering en visualisatie zijn isotrope gegevens ideaal, waarbij de Z-stapgrootte gelijk is aan XY-pixeldimensie. In werkelijkheid is het uiterst moeilijk om dergelijke timelapse-gegevens te verkrijgen met live monsters, gezien beperkingen met beeldtijd en fotobleaching. Daarom is het bepalen van de juiste Z-stapgrootte belangrijk voor de rendering- en visualisatiebehoeften van het experiment, en specifiek welke X:Y:Z voxel-verhouding nodig is om axiale informatie te maximaliseren met behoud van snelheid en het voorkomen van fotobleaching. Voor dit protocol was de vastgestelde voxelverhouding 1:1:3.5 (0,6 μm x 0,6 μm x 2,1 μm Z-stapgrootte met behulp van een 40x lange werkafstand wateronderdompelingsdoelstelling). Bij het verkrijgen van een Z-diepte van 130-140 μm levert dit volumegegevens op met een geschikte tijdresolutie en weinig fotobleaching.
Zoals hierboven besproken, is dit protocol specifiek voor 4D-beeldvorming van zebravis optische cup morfogenese, met behulp van embryo's in toto gelabeld voor plasmamembraan en chromatine, en een laserscan confocale microscoop. Het onderstaande protocol kan eenvoudig worden aangepast voor een verscheidenheid aan experimenten en behoeften. Ten eerste, met betrekking tot subcellulaire structuren, kan elke structuur waarvoor een live celmarker bestaat, worden afgebeeld. Vervolgens, hoewel de focus hier uitsluitend ligt op optische cupmorfogenese, kan timelapse-beeldvorming worden aangepast voor andere stadia van oogontwikkeling, bijvoorbeeld neurogenese25,26,27,28,29,30,31,32,33. Voor beeldvorming latere ontwikkeling, kan men embryo immobilisatie overwegen (als spontane spieractiviteit begint rond 24 hpf), pigmentatie (die begint te ontstaan rond 24 hpf), weefselgrootte (het oog groeit aanzienlijk in volume tijdens neurogenese), en beeldvorming snelheid (die moet worden aangepast afhankelijk van de snelheid van het proces van interesse). Al deze overwegingen kunnen gemakkelijk worden beheerd. Het protocol is vrij flexibel; naast de details van het specifieke protocol hier, zijn er algemene principes die degenen die geïnteresseerd zijn in live beeldvorming andere aspecten van oogontwikkeling zullen helpen.
Protocol
Alle methoden die hier worden beschreven met zebravissen vallen onder het dierprotocol van Dr. Kristen Kwan, "Cellular and Molecular Mechanisms of Visual System Development in Zebrafish", en goedgekeurd door het Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) van de Universiteit van Utah.
1. Gecapteerde RNA-synthese
- Genereer de DNA-sjabloon voor in vitro transcriptie.
- Lineariseer de DNA-sjabloon door 10 μg DNA te verteren in 100 μL volume van het reactiemengsel. Een typische reactie wordt als volgt geassembleerd: verteer 10 μg DNA met 3 μL enzym en 10 μL buffer, breng het reactievolume met water op 100 μL.
OPMERKING: Een typische sjabloon voor digest is een pCS2-vector, bijvoorbeeld pCS2-EGFP-CAAX of pCS2FA-H2A.F/Z-mCherry voor het membraan- en chromatinelabel dat hier wordt beschreven. In dit geval worden de plasmide-NOA's elk verteerd met behulp van het enzym NotI. Gebruikers moeten voorzichtig zijn met steractiviteit; in dit geval wordt een high-fidelity enzym aanbevolen en in de handel verkrijgbaar. - Incubeer de reactie 's nachts bij 37 °C om ervoor te zorgen dat het DNA wordt verteerd tot voltooiing.
- Reinig de beperkingsvergistering met behulp van een PCR-zuiveringskit volgens het protocol van de fabrikant. Elute het DNA met 30 μL ddH2O. Bewaar het ge lineariseerde DNA bij -20 °C en gebruik indien nodig.
OPMERKING: De hoeveelheid verteerd DNA en het elutievolume leveren ongeveer 0,3 μg/μL op; dit is voldoende voor ~ 5 rondes in vitro transcriptie, elke ronde met ~ 2 μg DNA als sjabloon.
- Lineariseer de DNA-sjabloon door 10 μg DNA te verteren in 100 μL volume van het reactiemengsel. Een typische reactie wordt als volgt geassembleerd: verteer 10 μg DNA met 3 μL enzym en 10 μL buffer, breng het reactievolume met water op 100 μL.
- In vitro transcriberen van gecapitscribeeerd RNA met behulp van een in vitro transcriptiekit. Gebruik voor pCS2-sjablonen (zoals hier beschreven) een SP6-kit.
- Stel de in vitro transcriptiereactie als volgt samen: Verteer 2 μg DNA-sjabloon of tot 6 μL met 2 μL 10x reactiebuffer, 10 μL 2x Ribonucleotide Mix en 2 μL 10x enzymmix.
- Incubeer bij 37 °C gedurende 2-4 uur of langer (langere tijden zullen leiden tot een grotere opbrengst). Indien gewenst kan halverwege de incubatieperiode 1 μL Enzymmix worden aangevuld.
- Verteer de DNA-sjabloon door 1 μL RNase-vrije DNase toe te voegen en gedurende 15 minuten bij 37 °C te broeden.
- Zuiver het afgetopte RNA met behulp van een RNA-zuiveringskit volgens het protocol van de fabrikant (zie tabel met materialen). Elute met 100 μL RNase-vrije H2O.
OPMERKING: De toevoeging van β-mercaptoethanol is niet nodig voor deze toepassing. Hoewel de in dit protocol beschreven methode eenvoudig is, kunnen alternatieve reagentia ook worden gebruikt om RNA te zuiveren. - Precipitate de RNA.
- Voeg 10 μL 3 M RNase-vrije NaOAc en 2,5 volumes (~275 μL) ijskoude RNase-vrije 100% EtOH toe aan het geëlede RNA.
- Incubeer de reactie bij -20 °C gedurende 15-30 min. Draai gedurende 15 minuten op hoge snelheid bij 4 °C om het RNA te pelleteren.
OPMERKING: De pellet moet zichtbaar zijn tegen de wand van de buis. Het is handig om op te merken hoe de buis in deze stap in de centrifuge is uitgelijnd, om te voorspellen waar de pellet aan het einde van de spin moet zijn. - Verwijder EtOH voorzichtig met een spuit en zorg ervoor dat u de pellet niet verwarmt, overdroogt of loslaat. Resuspend de pellet in 20 μL RNase-vrije H2O.
- Controleer het RNA om er zeker van te zijn dat de synthese succesvol is. Gebruik 1 μL om de concentratie op een spectrofotometer te controleren en voer 0,5 μL uit op een 1% agarosegel om te controleren op een of twee afzonderlijke banden, in plaats van een uitstrijkje met een laag molecuulgewicht. De opbrengst van de in vitro transcriptiereactie moet ~1 μg/μL zijn.
- Aliquot en bewaar RNA bij -20 °C of -80 °C. Het RNA wordt pas vlak voor injecties verdund.
2. Micro-injection van 1-cel zebravis embryo's
OPMERKING: Injecteer 200-300 pg per RNA om alomtegenwoordige expressie van chromatine en celmembranen te verkrijgen in de morfogenese van de optische cup. Bereid 5-10 μL van de RNA-verdunning en laad 2,5-5 μL/naald; plan voor extra in het geval de naald breekt.
- Preparaten voor injecties.
- Bereid een spuitgietschaal voor om de uitlijning en oriëntatie van 1-cel embryo's voor micro-injectie te vergemakkelijken. Smelt 2% agarose in E3 (standaard embryomedium) en giet in een petrischaaltje. Drijf de spuitgietmatrijs (zie tabel met materialen)voorzichtig op de bovenkant van de hete agarose om de afdruk van de troggen in de agarose te genereren terwijl deze stolt. Zodra de agarose stolt, verwijdert u de spuitgietmatrijs.
OPMERKING: Spuitgietschalen kunnen enkele maanden worden gebruikt; deksel in E3 en bewaren bij 4 °C wanneer het niet in gebruik is. - Trek aan micro-injectienaalden. Trek glazen haarvaten naar een lange taps toelopend om micro-injection naalden te maken met behulp van een naaldtrekker machine. Programmeer de machine die specifiek is voor het type haarvaten dat wordt gebruikt. Gebruik voor 1,0 x 0,78 mm borosilicaatcapillairen het volgende programma: warmte = 546 °C, trekken = 130, snelheid = 70, tijd = 90 (Figuur 2F). Bewaar de naalden in een petrischaal en zet deze vast met boetseerklei.
OPMERKING: Het trekrecept zal variëren, afhankelijk van de machine en het filament, en nieuwe filamenten moeten altijd worden gekalibreerd. Elke trekronde produceert twee naalden(figuur 2G); doe dit meerdere keren om voldoende naalden te produceren in geval van toevallige breuken en toekomstige experimenten. - Verdun het afgetopte RNA voor injectie. Verdun zowel EGFP-CAAX als H2A-mCherry RNAs tot 200-300 ng/μL concentratie met RNase-vrije H2O en 1 μL fenolrood in een totaal volume van 5 μL (eindconcentratie fenolrood is 0,1%). Veeg het mengsel en draai kort naar beneden om het totale volume te verzamelen. Houd het verdunde RNA op ijs voordat u het injecteert.
- Bereid een spuitgietschaal voor om de uitlijning en oriëntatie van 1-cel embryo's voor micro-injectie te vergemakkelijken. Smelt 2% agarose in E3 (standaard embryomedium) en giet in een petrischaaltje. Drijf de spuitgietmatrijs (zie tabel met materialen)voorzichtig op de bovenkant van de hete agarose om de afdruk van de troggen in de agarose te genereren terwijl deze stolt. Zodra de agarose stolt, verwijdert u de spuitgietmatrijs.
- Injectie van 1-cel embryo's
- Zodra de vissen beginnen te broeden, laat ~ 15-20 minuten om ervoor te zorgen dat de eieren bevrucht raken. Laad de naald gedurende deze tijd terug met 2,5-5 μL van de RNA-verdunning met behulp van een P10- en P10-microladertips.
- Kalibreer de naald met behulp van een oculair reticle (een micrometerkalibratieschuif is ook voldoende) om het volume van de druppel te meten (volume van een bol = (4/3) * pi * radius^3). Pas de injectietijd en -druk zodanig aan dat het injectievolume 1 nL(figuur 2I) bedraagt.
- Laad met een roller/transferpipet voorzichtig eieren in de spuitgietmatrijs (figuur 2J). Gebruik indien nuttig een tang om embryo's zo te rollen dat de enkele cel zichtbaar is, voorafgaand aan of tijdens de injectie. Het is de voorkeur van de gebruiker om een micromanipulator te gebruiken.
- Injecteer embryo's in het stadium van 1 cel, gericht op de cel en niet op de dooier (figuur 2M). Dit zorgt voor een uniforme etikettering van het zich ontwikkelende embryo.
- Breng embryo's naar het gewenste stadium (vóór 12 hpf, volgens standaard enscenering34). Geïnjecteerde embryo's zullen een vertraagde ontwikkeling hebben, dus verhoog ze op een iets hogere temperatuur (29,0-29,5 °C) om de tijd in te halen. Controleer 's middags de embryo's en verwijder de embryo's die dood zijn om de gezondheid van de koppeling te behouden.
3. Montage van optische blaasjes stadium zebravis embryo's voor timelapse beeldvorming
- Bereid voor montage 1,6% smeltarme agarose in E3. Als u meerdere beeldvormingsexperimenten plant, bereidt u ~ 20 ml laagsmeltagarose voor en slaat u deze op kamertemperatuur op. Smelt dit op de dag van embryomontage om een verse aliquot (1-5 ml) te genereren in een buis die vóór de montage in een hitteblok van 42 °C kan worden geplaatst.
- Screen embryo's op succesvolle injectie en algehele helderheid van fluorescentie met behulp van een fluorescentiemicroscoop voorafgaand aan de montage. Een ideaal monster zal een sterke EGFP- en mCherry-fluorescentie hebben en zich in de juiste ontwikkelingsfase bevinden (figuur 3B - B'').
- Screen embryo's met behulp van een fluorescentiemicroscoop. Selecteer embryo's die zowel EGFP- als mCherry-fluorescentie sterk uitdrukken voor montage.
- Selecteer embryo's van 11 hpf. Tel somieten om de embryo's goed in scène tebrengen 34; bij 11 hpf zouden er 3 somieten moeten zijn, en bij 12 hpf zijn er 6 somieten.
OPMERKING: Door embryo's vóór 12 hpf (bij 11 hpf) te monteren, worden de monsters op de juiste manier geënsceneerd bij 12 hpf wanneer de timelapse begint.
- Dechorionaatembryo's voorafgaand aan de montage. Doe dit handmatig met een fijne tang of chemisch met pronase (2 mg/ml). Bij embryo's zo jong is het essentieel dat dechorionatie wordt uitgevoerd in een met agar bedekt gerecht en dat embryo's geen contact maken met de lucht-waterinterface.
- Zuig met behulp van een glazen rolpipet een embryo op en gooi zoveel mogelijk E3 uit, zodat het embryo aan de punt van de glazen Pasteur pipet zit.
- Laat het embryo in de buis van agarose uit het hitteblok vallen. Laat het een paar seconden in de agarose zinken, zuig dan eerst wat agarose op en dan het embryo, zorg ervoor dat het embryo aan de punt van de pipet blijft (Figuur 3C - C').
- Plaats een schotel met glazen bodem voor beeldvorming onder een ontleedbereik. Gooi het embryo uit en agarose in een agarosedruppel in de schaal met glazen bodem. Gebruik tangen om zeer snel te oriënteren, zodat het embryo dorsaal naar beneden is (bovenkant van het hoofd op de glazen bodem). Laat de agarosedruppel uitharden (figuur 3D - D'). Deze stap moet snel maar voorzichtig worden uitgevoerd, omdat embryo's in dit stadium kwetsbaar zijn. Beschadigde embryo's zullen het timelapse-beeldvormingsproces niet overleven.
OPMERKING: Het is belangrijk om alle embryo's consistent te oriënteren voor dit experiment. Bij het uitvoeren van de timelapse moeten de embryo's binnen het toegewezen gezichtsveld passen met behoud van extra ruimte voor het optische blaasje om in uit te groeien. Een optimale oriëntatie is om de voorste-achterste as van alle embryo's "verticaal" of langs 12 en 6 uur op een wijzerplaat uit te lijnen (figuur 3G). - Monteer tussen 10-12 embryo's, wat meer dan twee keer zoveel is als er in beeld zullen worden gezien, zodat de beste monsters kunnen worden geselecteerd zodra ze op de confocale worden geëvalueerd (figuur 3E - E'). Monsters worden beoordeeld op leeftijd, uniformiteit van fluorescerende etikettering en precisie van montageoriëntatie.
- Na het monteren van de embryo's ontstond er meer pipet om de bodem van de schaal volledig te bedekken, waardoor alle afzonderlijke agarosedruppels in één grote agaroseschijf werden verpakt (Figuur 3F - F'). Een voldoende hoeveelheid agarose zorgt ervoor dat de individuele embryodruppels of de hele schijf niet van de bodem van de schaal optilt en uit het zicht zweeft.
- Eenmaal gehard, bedekt u de agarose met E3 om de monsters gehydrateerd te houden voor de duur van het timelapse-beeldvormingsexperiment (een zorg afhankelijk van de vochtigheid van het gebouw en in de omgeving).
OPMERKING: Tricaine is niet nodig voor deze specifieke timelapse imaging experimenten, omdat deze embryo's voldoende jong zijn; indien gewenst, en als het werken met oudere stadia van embryo's, tricaine kan worden toegevoegd aan de agarose zelf en bedekt in de media. - Teken op papier een kaart van de embryo's voor eenvoudige referentie tijdens het instellen van timelapse. Dit is cruciaal om de positie later te associëren met het genotype van elk monster.
4. Meerdere positie confocale timelapse met een laser scanning confocale microscoop
OPMERKING: Dit timelapse imaging protocol is ontworpen voor gebruik met een laser scanning confocale microscoop uitgerust met software van de fabrikant (zie Tabel van materialen). Dit systeem is uitgerust met een piëzo Z-stage apparaat dat een snelle acquisitie van Z-stacks mogelijk maakt. De laserlijnen die in dit protocol worden gebruikt zijn een 488 nm Argon ionenlaser en een DPSS 561 nm laser. De 561 nm laser is zeer geschikt voor het in beeld brengen van de mCherry fluorofoor: hij ligt dicht genoeg bij de piek van mCherry excitatie (587 nm) en goed aangedreven.
- Zet de confocale op.
- Schakel de confocale in en log in op de desktopcomputer.
- Installeer de piëzo Z-trap insert(figuur 4B)en start vervolgens de acquisitiesoftware.
- Schakel in de software in de acquisitiemodus de lasers 488 en 561 in via het vervolgkeuzemenu (Afbeelding 4F). De lasers hebben enkele minuten nodig om op te warmen, dus deze stap wordt vroeg uitgevoerd om tijd te besparen.
OPMERKING: De aanschafparameters zijn als volgt: Controleer de vakken Z-stack, Tijdreeksen Positie. Stel framegrootte in op 512 (X) x 384 (Y), scansnelheid op 9, scanmodus op bidirectioneel, zoom op 0,7, pinhole op 60,2 (1,63 luchtige eenheden ~= 1,6 μm sectie) en Z-interval op 2,1 μm. Dit levert een beeldgrootte op van 303,6 μm x 227,7 μm en een pixelgrootte van 0,59 μm. De lasers 488 en 561 moeten worden gecontroleerd en aan hetzelfde spoor worden toegewezen; het EGFP-detectiebereik is 494-545 nm en het detectiebereik van mCherry is 598-679 (figuur 4F). - Bedek de bodem van de glazen schaal royaal met een dompelmedium dat overeenkomt met de brekingsindex van water, waarbij u voorzichtig moet zijn om luchtbellen te vermijden (figuur 4C). Selecteer de 40x waterdoelstelling en breng een kleine druppel dompelmedium aan op de doelstelling (figuur 4D). Zet de schaal met glazen bodem vast in het podiuminzetstuk, breng E3 aan om de embryo's 's nachts vochtig te houden en gebruik vervolgens modelleerklei om het plastic deksel over de schaal af te dichten (afbeelding 4E). Verhoog het doel om contact te maken met het gerecht.
- Screen monsters en bereid je voor op timelapse.
- Schakel over van het tabblad Acquisitie naar het tabblad Zoeken en klik op het gloeilampsymbool om verzonden licht in te schakelen. Zoek met het verzonden licht het eerste monster met de joystick: beweeg het monster eerst met het oog naar de lichtstraal, gebruik vervolgens de oculairs naar het midden en concentreer u op een optisch blaasje.
- Ga terug naar het tabblad Acquisitie. Zorg ervoor dat de vakken Z-stack, Time Seriesen Positions zijn aangevinkt en dat de lasers zijn opgewarmd voor gebruik.
- Stel de framegrootte in op 512 (X) x 384 (Y), scansnelheid op 9, scanmodus op bidirectioneel en stel Zoom in op 0,7.
- Onder de rubriek Kanalen begint u met het toewijzen van de lasers 488 en 561 aan Power 2.0 en Gain 550 (dit kan later worden aangepast). Stel het pinhole in op 60,2 (1,63 Luchtige eenheden ~= 1,6 μm sectie).
- Begin met scannen met de knop Continu. Zoek met de fijne scherpstelknop het monster in de Z-as en plaats de X-Y-as in het frame. Stop met scannen.
- Klik onder het kopje Posities op Toevoegen om de XYZ-informatie in het eerste voorbeeld op te slaan (figuur 4F). Doe dit alleen als de monsters een timelapse hebben. Selecteer monsters voor hun sterke fluorescentie en optimale montage.
- Schakel over naar het tabblad Zoeken, ga naar het volgende voorbeeld en herhaal stap 4.2.5-4.2.6, waarbij u selectief bent bij het kiezen van voorbeelden.
- Voltooi voorbeeldposities, wijs z-bereik toe en start vervolgens timelapse. Zodra alle monsters zijn geselecteerd (het is mogelijk om 4-5 monsters binnen het totale tijdsinterval van 2,5 minuten weer te geven) en posities zijn opgeslagen, doorloopt u elk monster en past u de XYZ-positie binnen het weergaveframe aan.
- Markeer de eerste positie en klik op Verplaatsen naar. Terwijl u continu scant, lijnt u het optische blaasje in het frame op. Laat voldoende ruimte over in de voorste en distale gebieden ten opzichte van het optische blaasje en de hersenen.
- Wijs vervolgens de eerste en laatste Z-segmenten toe door Set First en Set Last te selecteren terwijl u door de Z-richting beweegt met de fijne scherpstelknop. Houd een totaal segmentnummer van ~ 63 aan, omdat dit de groei van de optische beker zal opvangen. Zorg voor extra ruimte aan de ventrale kant van het optische blaasje om ruimte te maken voor groei.
- Zodra de eerste en laatste Z-segmenten zijn ingesteld, klikt u op de C-knop om naar het midden van de Z-stack te gaan. Pas laservermogen en versterking aan voor beide lasers; houd indien mogelijk het laservermogen onder 5 en gebruik indien nodig een hogere versterking. Stop met scannen. Werk de positiegegevens bij door op Bijwerkente klikken.
- Ga naar de volgende positie door op Positie 2te klikken. Herhaal stap 4.3.1-4.3.3 voor elke toegewezen positie. Het laservermogen en de laserwinst moeten zo worden ingesteld dat alle monsters voldoende verlicht zijn.
- Zodra zowel positie-informatie als laserinstellingen zijn voltooid, wijst u instellingen voor de tijdreeks toe. Wijs onder de kop Tijdreeks tijdsinterval toe aan 2,5 min en Cycli aan 300 (figuur 4F). Het aantal cycli wordt zodanig berekend dat de timelapse voorbij de 24 hpf-fase gaat, wanneer de ontwikkeling van de optische beker is voltooid.
- Klik op Start om de timelapse te starten. Bewaak de eerste volledige cyclus: gebruik een timer om ervoor te zorgen dat één volledige cyclus (alle posities weergeven) minder dan 2,5 minuten is en controleer of elke positie er correct uitziet. De microscoop loopt 's nachts onafhankelijk en hoeft niet te worden gecontroleerd.
OPMERKING: Hoewel de confocale ruimte temperatuurgestuurd is, is de kamertemperatuur 20-25 °C. Met de lopende apparatuur en het laserscannen lijkt de temperatuur op het podium dichter bij 28,5 °C te liggen, aangezien de embryonale ontwikkeling in dit verwachte tempo verloopt, zoals visueel wordt bepaald met morfologische oriëntatiepunten. - Met deze instellingen duurt de timelapse 12,5 uur. Sla het bestand op zodra de timelapse is voltooid. Het zal groot zijn (~ 40 GB) en kan worden gescheiden in individuele posities nadat het is opgeslagen met behulp van de acquisitiesoftware.
Representative Results
Injectie van fluorescerende RNA's maakt subcellulaire etikettering mogelijk
RNA's die het plasmamembraan en de histonen van de cel labelen, worden geïnjecteerd om de individuele celmorfologieën en bewegingen vast te leggen die ten grondslag liggen aan optische cupmorfogenese. Figuur 2 toont elke stap van het proces van micro-invoeging van zebravisembryo's in het 1-celstadium. Kortom, zebravissen worden gedekt (figuur 2E) en embryo's worden verzameld en in de spuitgietmatrijs geladen (figuur 2J). Een micro-injectienaald wordt opgevuld(figuur 2H)en embryo's worden rechtstreeks in de enkele cel geïnjecteerd (figuur 2K-M), wat nodig is om een uniforme etikettering te verkrijgen ( figuur2M, figuur 4I-I''', film1). Naast uniforme etikettering wordt robuuste fluorescentie waargenomen en verloopt de ontwikkeling ongestoord (figuur 3B-B'').
Effectieve montage is essentieel voor timelapse imaging OCM van 12-24 hpf
Om optische cupmorfogenese, die over een langere periode optreedt, in beeld te brengen, is het van cruciaal belang om zowel ideale embryo's te selecteren als elk monster goed te positioneren tijdens het insluiten. Figuur 3 toont een gedetailleerd overzicht van de succesvolle montage van 11 hpf-embryo's. Geïnjecteerde embryo's worden eerst gescreend op voldoende fluorescentie (figuur 3B',B'',F'',F'''). Individuele embryo's worden ondergedompeld in agarose (figuur 3C,C') en dorsaal gemonteerd in een individuele druppel agarose (figuur 3D,D'). Alle monsters worden gemonteerd in een collectieve schijf van agarose (figuur 3E-F'). Wanneer embryo's correct, voldoende fluorescerend en adequaat zijn gemonteerd(figuur 3G),blijven de monsters tijdens de timelapse in het beeldvormingskader, zodat het hele orgaan in beeld kan worden gebeeld (figuur 4G-G'', I-I''', Film1). Als een van deze stappen niet wordt uitgevoerd, resulteert dit in een gemonteerd embryo dat geen optimaal monster is voor timelapse-beeldvorming. De kleinste variatie in de mate van rotatie zal een dramatisch effect hebben op de richting van embryogroei tijdens de timelapse. Suboptimale rotaties worden weergegeven in figuur 3, met inbegrip van een embryo dat overgewerveld is (figuur 3I), wat zal resulteren in een meer posterieure timelapse, en een embryo dat ondergewerveld is (figuur 3J) waarin alleen het meest voorste weefsel kan worden waargenomen. Naast de juiste rotatie tijdens de montage, hebben monsters die zijn gemonteerd met betrekking tot de oriëntatie van het frame meer kans op een succesvolle timelapse (Figuur 4G-G'', I-I''', Film 1). Optimale monsters zijn monsters die verticaal op de schotel zijn gericht, met de voorste-achterste as in lijn met 12 en 6 uur op een wijzerplaat (figuur 3G). Suboptimale monsters zijn monsters die niet op deze as zijn gericht, zoals die welke horizontaal of diagonaal zijn (figuur 3H). Deze monsters zullen uit het beeldvormingskader groeien naarmate de timelapse vordert en kunnen niet worden gebruikt voor verdere analyse (figuur 4H-H'', J-J''').
Een timelapse-gegevensset aanschaffen die geschikt is voor toekomstige analyse
Embryo's die nauwkeurig worden geïnjecteerd, verhoogd en gemonteerd, zorgen voor succesvolle confocale monsters. Figuur 4 toont een optimaal monster voor timelapse: er is zelfs fluorescentie en het monster is 12 pkf. De z-stack voor beeldvorming is zo toegewezen dat het eerste segment gewoon dorsaal is voor het optische blaasje, terwijl het laatste segment verschillende segmenten voorbij de ventrale grens van het 12 hpf optische blaasje laat (Figuur 4G-G''). Deze bias naar de ventrale kant biedt overtollige ruimte voor weefselgroei in de ventrale richting. Deze factoren resulteren, wanneer voldaan, in een optimale timelapse (Figuur 4I-I''', Film 1). Een suboptimaal monster heeft mozaïek of dim fluorescentie, heeft zich al voorbij 12 hpf ontwikkeld (wanneer optische cupmorfogenese aan de gang is), of is slecht gepositioneerd in de Z-stack of het XY-frame (Figuur 4H-H''). Wanneer niet aan deze criteria wordt voldaan, zal de timelapse niet langer het volledige 3D-volume van het weefsel opvangen naarmate het zich ontwikkelt en kan het niet worden gebruikt voor verdere analyse (figuur 4J-J''').
Figuur 1: Workflow van 4D timelapse imaging van zebrafish optic cup morphogenesis. (A) Om subcellulaire structuren van belang fluorescerend te labelen, synthetiseert u de juiste gemaximeerde mRNAs. (B) Micro-inject mRNA(s) in zebravisembryo's in het 1-celstadium. (C) Embryo's worden dorsaal gemonteerd, of head-down voor een omgekeerde confocale microscoop, in het optische blaasjesstadium, ~ 11 uur na de bevruchting of 3 somietstadium. (D) Meerdere embryo's kunnen opeenvolgend worden afgebeeld tijdens een enkele timelapse-beeldvormingssessie. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 2: Een visuele gids voor het micro-insintecteren van 1-cel zebravisembryo's. (A) Items op te nemen in een injectiekit (met de klok mee): middelgrote doos die de hele kit kan bevatten met wegwerp nitrilhandschoenen; een schaal met micronaalden; tangen; een hoeveelheid minerale olie en in stukken gesneden vierkanten parafilm; microloading tips; verdund RNA op ijs; agarose spuitgietmatrijs; markering; rol/transferpipet; en P10 pipet. (B) Micro-injection set-up: een ontleedmicroscoop naast een pico-injector die is aangesloten op een externe gecomprimeerde gasbron. Aan de pico-injector zijn een voetpedaal en micromanipulator bevestigd. De micromanipulator is uitgerust met een naaldhouder en geplaatst boven het microscoopstadium. (C) Een agarose spuitgietmatrijs met zes rijen groeven met een hoek van 90 graden aan de ene kant en een hoek van 45 graden aan de andere kant. (D) Het pico-injector voorpaneel. Het drukdisplay leest 7,8 PSI; dit kan worden aangepast met de knop met het label Pinjecteren. Daaronder bevinden zich drukknoppen om handmatig druk uit te oefenen om te injecteren, om de injectietijd te wijzigen of om de vloeistof in de naald te wissen, te vullen of vast te houden. De injectietijd is ingesteld op 08 (gelijk aan 8 x 10 msec). Een uitgangsslang is aangesloten op Pout en is bevestigd aan de injectienaald. De bronschakelaar van de drukmeter is ingesteld opP-injectie tijdens het instellen van de injectiedruk en kan worden geschakeld naarP-balans om de basale druk op de naald aan te passen wanneer er geen injecties worden uitgevoerd. DeP-balansregelaar bevindt zich naast deP-injectieregelaar. De aan/uit-knop brandt om aan te geven dat de machine is ingeschakeld. Volwassenzebravissen worden gedekt in kleine kweektanks die een geneste tank bevatten met een gaasbodem die volwassen vissen scheidt van bevruchte eieren en een gemakkelijke verzameling mogelijk maakt. Het waterniveau wordt verlaagd om ondiepe wateromstandigheden na te bootsen en tankverdelers worden verwijderd om paringsgedrag te initiëren. (F) Het voorpaneel van de micropipet (naald) trekker: bevat een display dat de specifieke omstandigheden weergeeft die worden gebruikt om naalden te trekken. De drukinstelling is P = 500, gevolgd door de laatste datum en tijd waarop het programma is bewerkt, het programmanummer, HEAT = 546, PULL = 130, VEL = 70 en TIME = 90. (G) Een glazen capillair wordt in de micropipet (naald) trekker gestoken en op zijn plaats vastgezet. Elke geprogrammeerde pull run resulteert in twee lange taps toelopende naalden (rode pijlpunten). (H) De RNA-verdunning wordt teruggeladen in een naald; de fenolrode kleurstof maakt een eenvoudige visualisatie van de oplossing mogelijk. (I) Na het breken van de punt van de naald wordt de bolus van RNA gemeten met behulp van een oculair-reticle op de ontleedijker. Voor deze stereomicroscoop is bij 30x totale vergroting 6 hash-markeringen gelijk aan 1 nL-volume. (J) Bevruchte eieren worden in de agarose spuitgietmatrijs geladen en met behulp van een rolpipet langs de troggen van de mal verdeeld. (K) De spuitgietvorm met embryo's in één celstadium wordt onder de microscoop geplaatst en embryo's worden opeenvolgend geïnjecteerd. (L) De injectienaald wordt in elk embryo ingebracht dat zich op de enkele cel richt. (M) Eenmaal in de cel wordt het voetpedaal gebruikt om een gereguleerde hoeveelheid druk en het vrijkomen van 1 nL RNA in de cel van het embryo te activeren (zoals gevisualiseerd door fenolrood). Schaalbalken: I = 0,1 mm; L, M = 0,5 mm. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 3: Een visuele gids voor het monteren vanembryo's voor beeldvorming. (A) Montageopstelling (van links naar rechts): een hitteblok geprogrammeerd tot 42 °C, verwarmingsbuizen van laagsmeltende agarose; een rolpipet; een tang; een met agarose bedekte schaal met gedechorioneerde embryo's; en een ontledende stereomicroscoop verbonden met een metalen halide fluorescentielamp. (B,B',B'') Een embryo van 11 hpf geïnjecteerd met EGFP-CAAX mRNA en mCherry-H2A mRNA, weergegeven onder respectievelijk brightfield, GFP fluorescentie en mCherry fluorescentie. (C,C') Een glazen pasteurpipet met agarose en een embryo in de punt; C' is een uitvergroot beeld. (D,D') Een embryo gemonteerd in een druppel van laag-smelt agarose op een glazen bodem schotel, gezien zowel vanaf het stadium van de microscoop en door de microscoop oculairs. (E,E') 12 embryo's gemonteerd in individuele druppeltjes van laagsmeltende agarose op een glazen bodemschaal, zowel gezien vanaf het stadium van de microscoop als door de microscoop oculairs. (F,F',F'',F''') Alle gemonteerde embryo's zijn bedekt met een volledige laag agarose om de bodem van de schaal te vullen, zowel gezien vanaf het stadium van de microscoop als vanaf de microscoop oculairs die in helder veld worden getoond; F'' GFP fluorescentie; en F''' mCherry fluorescentie. (G) Een optimaal monster bij 12 pkf wordt dorsaal gemonteerd en verticaal georiënteerd in lijn met 12 en 6 uur met beide optische blaasjes in hetzelfde vlak. (H) Een suboptimaal monster: hoewel gemonteerde dorsaal en optische blaasjes in vlak met elkaar zijn, is dit monster georiënteerd op een diagonale as en zal het uit de framegrootte groeien naarmate de ontwikkeling vordert. (I) Een suboptimaal monster: dit monster is overgewerveld en geen dorsale mount, als gevolg hiervan wordt het voorste deel van het optische blaasje niet in de timelapse opgevangen. (J) Een suboptimaal monster: dit monster is ondergewerveld en geen dorsale mount, als gevolg hiervan wordt het achterste deel van het optische blaasje niet in de timelapse vastgelegd. Stippellijnen geven elk optisch blaasje aan. Schaalbalken: B = 0,1 mm; D' = 1,5 mm; E', F' = 2,5 mm; G = 0,1 mm. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 4: Het instellen van een timelapse met meerdere posities en mogelijke resultaten. (Een) Laser scanning confocale microscoop. (B) Piëzo Z-traps insert. (C) De bodem van een glazen bodemschaal met embryo's ingebed in agarose is bedekt met een onderdompelingsmedium dat overeenkomt met de brekingsindex van water. (D) Op de 40x W doelstelling (lange werkafstand) wordt een druppel dompelmedium geplaatst. (E) De schaal wordt op zijn plaats gehouden met de podiuminzet, E3 wordt bovenop de agaroselaag toegevoegd en het deksel wordt vastgezet met boetseerklei. (F) Aanschafsoftware-instellingen: De gewenste laserlijnen worden ingeschakeld vanuit het vervolgkeuzemenu. Voor embryo's geïnjecteerd met EGFP-CAAX RNA en H2A-mCherry RNA worden de Argon en DPSS 561-10 lasers ingeschakeld. Het rode hoogtepunt geeft aan dat de Argon laser aan het opwarmen is. Om het monster boven het objectief te lokaliseren, wordt het verzonden licht ingeschakeld via het bedieningspaneel van de microscoop. Zowel EGFP als mCherry worden toegewezen aan track 1 (voor gelijktijdige beeldvorming) en het bereik van elke detector wordt ingesteld. Hier is het EGFP-bereik ingesteld op 494-545 nm en het mCherry-bereik is ingesteld op 598-679 nm. Onder de Kanalen menu, kan de lasermacht worden geplaatst. Nadat de lasers zijn opgewarmd, kan het vermogen worden verhoogd tot 5.0 en kan de gain (master) worden aangepast. Het pinhole is ingesteld op 60,2, wat gelijk is aan 1,63 Airy Units of 1,6 μm sectie. Onder de Aanwinst menu, is de framegrootte ingesteld op 512 x 384, is de scansnelheid 9,0, is de middeling bidirectioneel en is zoom ingesteld op 0,7. Onder de Z-Stapel de eerste en laatste positie in de Z-as worden ingesteld terwijl de confocale scant. Het interval (stapgrootte) is ingesteld op 2,1 μm. Bij het kiezen van de eerste en laatste Z-positie wordt over het algemeen een standaardaantal van 63 segmenten gehandhaafd; dit past de algehele groei van het oog aan. De optie "piëzo gebruiken" is geselecteerd. Onder de Posities menu wordt elke geselecteerde positie weergegeven, inclusief een toegewezen nummer en de X-, Y- en Z-positie. Er zijn extra knoppen om het aantal embryo's (afzonderlijke posities) te bepalen, inclusief toevoegen, bijwerken of verwijderen. Onder de Tijdreeks is de cyclus ingesteld op 300 (het aantal Z-stacks dat wordt verkregen) en interval (tijdstap) is ingesteld op 2,5 min. Zodra de instellingen zijn voltooid, wordt timelapse-acquisitie gestart door op start te drukken. De software toont het segment van de Z-stack, de cyclus en de positie die momenteel wordt gescand. Wanneer de timelapse is voltooid, wordt het bestand opgeslagen door op het diskettepictogram in de Afbeeldingen en documenten paneel. (G-J) Celmembranen (green) zijn gelabeld met EGFP-CAAX en celkernen (chromatine, magenta) zijn gelabeld met H2A-mCherry RNAs. (G,G',G'') Een voorbeeld van het instellen van de eerste en laatste Z-slice voor een optimaal gemonteerd monster. De eerste Z-slice (aan de dorsale kant) gaat ten koste van dorsaal ectoderm, terwijl de laatste Z-slice (aan de ventrale kant) ver onder het optische blaasje ligt, om zijn groei in de ventrale richting aan te passen. (H,H',H'') Een voorbeeld van het instellen van het eerste en laatste Z-segment van een suboptimaal monster. Het monster heeft een zwakke mCherry fluorescentie en het is diagonaal gemonteerd, zodat het onwaarschijnlijk is dat de zich ontwikkelende optische beker gedurende de duur van de timelapse in beeld blijft. (Ik,ik',ik'',ik''') Een voorbeeld van een timelapse van een optimaal monster. Afbeeldingen met één segment uit het midden van de Z-stack worden genomen van het volledige volume van 63 segmenten op 4 tijdpunten (T-waarde). Br, hersenen; NR, neuraal netvlies; RPE, retinaal gepigmenteerd epitheel; Le, lens. (J,J',J'',J''') Een voorbeeld van een timelapse uit een suboptimaal monster. In dit geval verplaatste het monster zich uit het Z-vlak en werd slechts een schuin deel van de voorste optische beker gevangen. Schaalbalken: G, I = 50 μm. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Film 1: Timelapse van optische cup morfogenese in een optimaal wild type embryo. Een dorsale weergave van een wild type embryo dat is gelabeld met EGFP-CAAX (plasmamembranen, groen)en H2A. F/Z-mCherry (chromatine, magenta). De timelapse is van ~12-24 hpf en bevat een enkele confocale sectie uit een volledige 4D-dataset. Tijdsinterval is 2,5 min tussen z-stacks en wordt weergegeven bij 22,5 frames per seconde. Klik hier om deze film te downloaden.
Discussion
Hier beschrijven we een protocol voor in toto labeling en 4D timelapse imaging van optic cup morphogenesis. We doorlopen het proces van het genereren van afgetopte RNA-codering van fluorescerende eiwitten om verschillende subcellulaire compartimenten te markeren; injecteren van zebravis 1-cel embryo's; inbedding van 11 hpf-embryo's in agarose voor multiplexe beeldvorming; en het verkrijgen van 4D datasets van meerdere embryo's voor de duur van optic cup morphogenesis (12–24 hpf).
Een groot aantal vragen kan worden beantwoord met deze informatierijke datasets. 4D-gegevens kunnen op verschillende manieren worden gevisualiseerd en kwantitatief worden geanalyseerd. Hoewel buiten het bereik van dit protocol, nemen we hier enkele van onze doelen en standaardtoepassingen op als een voorbeeld van de soorten dingen die kunnen worden bereikt. Natuurlijk worden er voortdurend kwantitatieve beeldanalysemethoden ontwikkeld en kunnen zowel commercieel beschikbare als op maat gemaakte tools worden gebruikt. Als men dergelijke methoden nog niet eerder heeft gebruikt, moet men bereid zijn om enige optimalisatie uit te voeren om ervoor te zorgen dat de verworven datasets geschikt zijn voor de kwantitatieve analysebenadering van keuze.
Het visualiseren en kwantitatief evalueren van de 4D-datasets kan een uitdaging zijn, vanwege de grootte van de bestanden. De acquisitiesoftware kan worden gebruikt om de datasets in individuele embryo's te scheiden en ImageJ / Fiji kan worden gebruikt om confocale bestanden van commerciële formaten naar meer standaard tif-stacks te converteren, waarin elk tijdpunt als een afzonderlijk bestand wordt opgeslagen. Dit vermindert de bestandsgrootte en standaardiseert de bestandsindelingen. Afzonderlijke optische secties van elk tijdpunt kunnen worden geassembleerd als een 2D (XY) timelapse met behulp van ImageJ / Fiji, waardoor snelle 2D-visualisatie en evaluatie van de gegevens mogelijk is. Film 1 is daar precies een voorbeeld van: een enkele optische sectie in de loop van de tijd, samengesteld als een timelapse van het optimale monster in figuur 4I–I'''. Van daaruit gebruiken we voor 3D- en 4D-visualisatie vaak FluoRender35,36, die vrij beschikbaar is, maar specifieke grafische kaartvereisten heeft. Met FluoRender kan men 3D-gerenderde gegevens in elke as roteren, de gegevensset in de loop van de tijd in 4D visualiseren, cutaways in elk vlak genereren en de rotaties en visualisaties opslaan als een film of reeks tif-afbeeldingen.
Op het gebied van kwantitatieve analyse zijn er tal van vragen die beantwoord moeten worden. We hebben software in eigen huis ontwikkeld om onze eigen specifieke doelen te helpen bij het begrijpen van het celgedrag dat ten grondslag ligt aan optische cupmorfogenese. Ons programma, LongTracker, gebruikt het nucleaire signaal als een proxy voor positie om cellen13te volgen. Met deze gegevens kunnen we bepalen wanneer, waar en hoe cellen bewegen; hoe snel en hoe ver cellen bewegen; en hoe vaak cellen zich delen. Naast onze eigen software zijn er meerdere commercieel beschikbare en op maat gemaakte opties voor 4D-celtracking. We hebben ook het programma LongAxis ontwikkeld om celsegmentatie uit te voeren en celvorm en -organisatie binnen het neurale netvlies te kwantificeren37. De gegevenssets die in LongAxis worden ingevoerd, zijn echter enkele Z-stacks, genomen met een hoge resolutie. Een aanhoudende uitdaging is het genereren van timelapse datasets met een hoge resolutie dat cellen met vertrouwen kunnen worden gesegmenteerd en hun morfologie kan worden geëxtrapoleerd. Een alternatief is mozaïek (schaars) labelen met behulp van een fotoconverteerbare fluorofoor zoals Kaede voor directe visualisatie van celvorm, zoals wij en anderen hebben uitgevoerd in het ontwikkelende oog8,11,13. Dit vereenvoudigt het probleem met celsegmentatie en celvorm en -grootte kunnen gemakkelijk worden gekwantificeerd door 3D-rendering in FluoRender.
Elke stap van dit protocol is specifiek geoptimaliseerd voor onze doeleinden. De specificiteit van dit protocol resulteert in verschillende beperkingen: het protocol, zoals geschreven, is niet geoptimaliseerd voor beeldvorming van andere aspecten van de ontwikkeling van zebravissenogen (zoals retinale neurogenese), andere oogstructuren, andere ontwikkelingsstadia of andere subcellulaire compartimenten. De oriëntatie van inbedding, de snelheid van beeldvorming en de labels zijn allemaal ontworpen om ons in staat te stellen onze biologische vragen te beantwoorden. Om bijvoorbeeld retinale neurogenese in beeld te brengen, is de dorsale oriëntatie van het embryo zoals hier beschreven mogelijk geen visualisatie van specifieke kenmerken van belang en is de snelheid van beeldvorming mogelijk niet geschikt. Veel aspecten van het protocol kunnen worden aangepast en aangepast aan verschillende behoeften, afhankelijk van iemands specifieke interesses en doelen. Ten eerste maakt het gebruik van RNA-injecties het etiketteringsproces zeer flexibel. Fluorescerende eiwitfusieconstructies kunnen worden gebruikt om subcellulaire structuren van belang te labelen en de hoeveelheid RNA-injectie kan worden gevarieerd om de etikettering te optimaliseren. Op basis van ons werk met de fotoconverteerbare fluorofoor Kaede lijken RNA-injecties een uitbarsting van vertaling te ondersteunen die voorbij is met 12 hpf11,13. Hoge niveaus van fluorescerende eiwitexpressie door RNA-injectie kunnen fotobleaching tegengaan, maar een dergelijke aanpak ondersteunt geen aanhoudende expressie van het fluorescerende label van belang. Als aanhoudende expressie nodig is, zoals bij het in beeld brengen van embryo's in latere stadia, zijn transgene lijnen een optie en is het construeren van nieuwe lijnen in zebravissen eenvoudig24.
Vervolgens kan het protocol worden aangepast voor latere stadia van ontwikkeling. Omdat pigment de beeldvorming in latere stadia kan belemmeren, kunnen embryo's worden behandeld met fenylthiourea (PTU) om pigmentvorming te remmen, of genetische mutanten voor pigmentsynthese kunnen worden gebruikt. Om te voorkomen dat embryo's trillen, kan tricaine worden toegevoegd aan de agarose en embryo media overlay oplossingen, en het percentage agarose kan worden aangepast indien nodig. Naarmate het oog groeit, kan het nodig zijn om de montagerichting te wijzigen; hier monteren we embryo's dorsaal, maar in latere stadia kan het logischer zijn om lateraal of anterieure te monteren, afhankelijk van de structuur van belang. Omdat verschillende processen plaatsvinden over verschillende ruimtelijke en temporele schalen, kan men ook de Z-stap en tijdstap van beeldverwerving optimaliseren. Deze kenmerken kunnen eigenlijk alleen empirisch worden bepaald voor de behoeften van elk lab.
Ten slotte is dit protocol speciaal ontwikkeld voor een confocale microscoop voor laserscanning, waarbij embryo's in een relatief hoog percentage agarose zijn ingebed in een vroeg stadium van oogontwikkeling. Als men beeldvorming op verschillende tijdstippen of verschillende locaties tijdens de oogontwikkeling, dit protocol zal moeten worden aangepast voor het proces van belang. Veel verschillende beeldvormingsbenaderingen zijn momenteel mogelijk, waarbij er meer worden ontwikkeld door optische ingenieurs. Elke aanpak brengt zijn eigen reeks uitdagingen met zich mee, van verschillende manieren om embryo's in te bedden en te monteren voor beeldvorming, tot verschillende bestandsgroottes en formaten. We schetsen overwegingen in de inleiding om het optimalisatieproces te begeleiden, waarbij maximale ruimtelijke en temporele resolutie worden uitgebalanceerd met fotobleaching, fototoxiciteit en immense bestandsgroottes. We hopen dat deze algemene beginselen, naast de hierboven beschreven praktische informatie, anderen zullen helpen bij het vaststellen van timelapse-beeldvormingsbenaderingen om de vele open vragen in de oogontwikkeling te bestuderen.
Disclosures
De auteurs hebben niets bekend te maken.
Acknowledgments
We zijn voormalige en huidige leden van het Kwan Lab dankbaar voor hun werk aan timelapse benaderingen en discussies over dit protocol. Dit werk werd ondersteund door de NIH (R01 EY025378 en R01 EY025780 tot KMK; F31 EY030758 naar SL; en T32 GM007464 naar MAC).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Delta TPG Dish 0.17mm clear | Bioptechs | 0420041500C | coverglass bottom for optical compatibility |
| Disposable Pasteur Pipettes | VWR | 14672-608 | overall length 14.6 cm (53/4") |
| Dumont #5, #55, or #5SF Forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | For style #5: straight tip, 0.05 x 0.01 mm tip, inox, 11 cm long |
| Flaming/Brown Micropipette Puller | Sutter | P-97 | |
| Immersol W | Carl Zeiss Microscopy | 4449690000000 | immersion fluid for water-emission objectives, halogen-free, low fluorescence |
| Microinjection Mold | Adaptive Science Tools | TU-1 | Six ramps, one 90 degree and one 45 degree beveled side. |
| Microloader Tips | Eppendorf | 930001007 | Microloader, tip for filling glass microcapillaries, 0.5 – 20 µL |
| mMessage mMachine SP6 Transcription Kit | Invitrogen | AM1340 | contains SP6 Enzyme Mix, 10X Reaction Buffer, 2XNTP⁄CAP Solution, GTP Solution, pTRI-Xef, TURBO DNase, Ammonium Acetate Stop Solution, Lithium Chloride Precipitation Solution, and Gel Loading Buffer and are all stored at –20°C. Nuclease-free Water may be stored at any temperature. |
| Nikon SMZ645 Stereo Microscope | Nikon | SMZ645 | used for injecting embryos (see Fig. 2B) |
| NotI-HF enzyme | NEB | R3189S | comes with Gel Loading Dye, Purple (6X) |
| NuSieve GTG Agarose | Lonza | 50081 | fine resolution, low melt agarose |
| Objective LD "C-Apochromat" 40x/1.1 W Korr M27 | Carl Zeiss Microscopy | 421867-9970-000 | |
| Olympus SZX16 Stereo Microscope | Olympus | SZX2-ZB16 | used for screening, embedding embryos (see Fig. 3A) |
| Phenol red solution | Sigma-Aldrich | P0290 | 0.5% in DPBS, sterile filtered, endotoxin tested, cell culture tested |
| Pico-liter Microinjector | Harvard Apparatus | PLI-100 | Femtoliter to microliter injections; digital readouts for injection count, time, and pressure; contains 5 pressures including inject, balance, clear, fill, and hold |
| Pipette Pump Pipettor | SP Bel-Art | F37898 | fits a disposable pasteur pipette, contains thumbwheel on side for aspirating or dispensing and plunger for quick emptying |
| Premium Thin Wall Borosilicate Glass Capillaries | Warner Instruments | G100T-4 | 1.0 x 0.78 mm |
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28106 | contains QIAquick Spin Columns, Buffers, Collection Tubes (2 ml) |
| RNase-free H2O | Invitrogen | AM9906 | DNase-Free, Molecular Biology Grade, RNase-Free |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | contains RNeasy Mini Spin Columns, Collection Tubes (1.5 ml and 2 ml), RNase-free Reagents and Buffers |
| Stage Attachment Z PIEZO WSB 500 | Carl Zeiss Microscopy | 432339-9000-000 | |
| Stage Insert Z PIEZO WSB Universal | Carl Zeiss Microscopy | 432339-9030-000 | |
| Zeiss LSM 880 with Airyscan | Carl Zeiss Microscopy | N/A | inverted Axio Observer microscope |
| Zen Black 2.3 SP1 software | Carl Zeiss Microscopy | N/A | Zeiss Efficient Navigation (ZEN) controls all light microscope systems from Zeiss |
References
- Adler, R., Canto-Soler, M. V. Molecular mechanisms of optic vesicle development: complexities, ambiguities and controversies. Developmental Biology. 305 (1), 1-13 (2007).
- Chow, R. L., Lang, R. A.
- Fuhrmann, S. Eye morphogenesis and patterning of the optic vesicle. Current Topics in Developmental Biology. 93, 61-84 (2010).
- Martinez-Morales, J. R., Wittbrodt, J.
- Yang, X. J. Roles of cell-extrinsic growth factors in vertebrate eye pattern formation and retinogenesis. Seminars in Cell & Developmental Biology. 15 (1), 91-103 (2004).
- Bogdanovic, O., et al. Numb/Numbl-Opo antagonism controls retinal epithelium morphogenesis by regulating integrin endocytosis. Developmental Cell. 23 (4), 782-795 (2012).
- Bryan, C. D., Casey, M. A., Pfeiffer, R. L., Jones, B. W., Kwan, K. M. Optic cup morphogenesis requires neural crest-mediated basement membrane assembly. Development. 147 (4), (2020).
- Bryan, C. D., Chien, C. B., Kwan, K. M. Loss of laminin alpha 1 results in multiple structural defects and divergent effects on adhesion during vertebrate optic cup morphogenesis. Developmental Biology. 416 (2), 324-337 (2016).
- Cavodeassi, F., Ivanovitch, K., Wilson, S. W. Eph/Ephrin signalling maintains eye field segregation from adjacent neural plate territories during forebrain morphogenesis. Development. 140 (20), 4193-4202 (2013).
- England, S. J., Blanchard, G. B., Mahadevan, L., Adams, R. J. A dynamic fate map of the forebrain shows how vertebrate eyes form and explains two causes of cyclopia. Development. 133 (23), 4613-4617 (2006).
- Gordon, H. B., et al. Hedgehog signaling regulates cell motility and optic fissure and stalk formation during vertebrate eye morphogenesis. Development. 145 (22), (2018).
- Ivanovitch, K., Cavodeassi, F., Wilson, S. W. Precocious acquisition of neuroepithelial character in the eye field underlies the onset of eye morphogenesis. Developmental Cell. 27 (3), 293-305 (2013).
- Kwan, K. M., et al. A complex choreography of cell movements shapes the vertebrate eye. Development. 139 (2), 359-372 (2012).
- Martinez-Morales, J. R., et al. Ojoplano-mediated basal constriction is essential for optic cup morphogenesis. Development. 136 (13), 2165-2175 (2009).
- Miesfeld, J. B., et al. Yap and Taz regulate retinal pigment epithelial cell fate. Development. 142 (17), 3021-3032 (2015).
- Nicolas-Perez, M., et al. Analysis of cellular behavior and cytoskeletal dynamics reveal a constriction mechanism driving optic cup morphogenesis. eLife. 5, (2016).
- Picker, A., et al. Dynamic coupling of pattern formation and morphogenesis in the developing vertebrate retina. PLoS Biology. 7 (10), e1000214 (2009).
- Rembold, M., Loosli, F., Adams, R. J., Wittbrodt, J. Individual cell migration serves as the driving force for optic vesicle evagination. Science. 313 (5790), 1130-1134 (2006).
- Sidhaye, J., Norden, C. Concerted action of neuroepithelial basal shrinkage and active epithelial migration ensures efficient optic cup morphogenesis. eLife. 6, (2017).
- Driever, W., et al. A genetic screen for mutations affecting embryogenesis in zebrafish. Development. 123, 37-46 (1996).
- Haffter, P., et al. The identification of genes with unique and essential functions in the development of the zebrafish, Danio rerio. Development. 123, 1-36 (1996).
- Nusslein-Volhard, C.
- Hoshijima, K., et al. Highly efficient CRISPR-Cas9-based methods for generating deletion mutations and F0 embryos that lack gene function in zebrafish. Developmental Cell. 51 (5), 645-657 (2019).
- Kwan, K. M., et al. The Tol2kit: a multisite gateway-based construction kit for Tol2 transposon transgenesis constructs. Developmental Dynamics. 236 (11), 3088-3099 (2007).
- Almeida, A. D., et al. Spectrum of Fates: a new approach to the study of the developing zebrafish retina. Development. 141 (9), 1971-1980 (2014).
- Baye, L. M., Link, B. A. Interkinetic nuclear migration and the selection of neurogenic cell divisions during vertebrate retinogenesis. The Journal of Neuroscience. 27 (38), 10143-10152 (2007).
- Clark, B. S., et al. Loss of Llgl1 in retinal neuroepithelia reveals links between apical domain size, Notch activity and neurogenesis. Development. 139 (9), 1599-1610 (2012).
- Das, T., Payer, B., Cayouette, M., Harris, W. A. In vivo time-lapse imaging of cell divisions during neurogenesis in the developing zebrafish retina. Neuron. 37 (4), 597-609 (2003).
- Kay, J. N., et al. Transient requirement for ganglion cells during assembly of retinal synaptic layers. Development. 131 (6), 1331-1342 (2004).
- Norden, C., Young, S., Link, B. A., Harris, W. A. Actomyosin is the main driver of interkinetic nuclear migration in the retina. Cell. 138 (6), 1195-1208 (2009).
- Suzuki, S. C., et al. Cone photoreceptor types in zebrafish are generated by symmetric terminal divisions of dedicated precursors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (37), 15109-15114 (2013).
- Wan, Y., et al. The ciliary marginal zone of the zebrafish retina: clonal and time-lapse analysis of a continuously growing tissue. Development. 143 (7), 1099-1107 (2016).
- Yoshimatsu, T., et al. Presynaptic partner selection during retinal circuit reassembly varies with timing of neuronal regeneration in vivo. Nature Communications. 7, 10590 (2016).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F.
- Wan, Y., Otsuna, H., Chien, C. B., Hansen, C. An interactive visualization tool for multi-channel confocal microscopy data in neurobiology research. IEEE Transactions on Visualization and Computer Graphics. 15 (6), 1489-1496 (2009).
- Wan, Y., Otsuna, H., Chien, C. B., Hansen, C. FluoRender: an application of 2D image space methods for 3D and 4D confocal microscopy data visualization in neurobiology research. IEEE Pacific Visualization Symposium. , 201-208 (2012).
- Carney, K. R., Bryan, C. D., Gordon, H. B., Kwan, K. M. LongAxis: a MATLAB-based program for 3D quantitative analysis of epithelial cell shape and orientation. Developmental Biology. 458 (1), 1-11 (2020).
