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Neuroscience

4-ज़ेब्राफिश ऑप्टिक कप मॉर्फोजेनेसिस के आयामी इमेजिंग

Published: May 26, 2021 doi: 10.3791/62155
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Human Genetics, University of Utah

Summary

यह प्रोटोकॉल जेब्राफिश अर्ली आई डेवलपमेंट के टोटो लेबलिंग और बहुआयामी इमेजिंग के लिए एक दृष्टिकोण का वर्णन करता है। हम लेजर स्कैनिंग कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके लेबलिंग, एम्बेडिंग और चार आयामी (4D) इमेजिंग का वर्णन करते हैं, और ऑप्टिक कप मॉर्फोजेनेसिस के तंत्र को विच्छेदन के लिए डेटासेट के अधिग्रहण को अनुकूलित करने के लिए विचार करते हैं।

Abstract

दृश्य प्रणाली समारोह सटीक ऊतक और अंग संरचनाओं की स्थापना की आवश्यकता है। कशेरुकी आंख में, संरचनात्मक दोष दृश्य हानि का एक आम कारण हैं, फिर भी आंख मॉर्फोजेनेसिस के तंत्र अभी भी खराब समझ रहे हैं। भ्रूणीय आंखों का मूल संगठन कशेरुकी भर में संरक्षित है, इस प्रकार जेब्राफिश भ्रूण की लाइव इमेजिंग सामान्य और रोग स्थितियों के तहत वास्तविक समय में सीधे आंखों के विकास का निरीक्षण करने के लिए एक शक्तिशाली दृष्टिकोण बन गया है। आंदोलनों, मॉर्फोलोजी, इंटरैक्शन, विभाजन और मृत्यु सहित गतिशील कोशिका प्रक्रियाओं को भ्रूण में कल्पना की जा सकती है। हमने जेब्राफिश में प्रारंभिक आंखों के विकास की उपकोशिकीय संरचनाओं और टाइमलैप्स कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी की एक समान लेबलिंग के लिए तरीके विकसित किए हैं। यह प्रोटोकॉल 1-सेल जेब्राफिश भ्रूण में इंजेक्शन के लिए छाया हुआ एमआरएनए उत्पन्न करने की विधि को रेखांकित करता है, ऑप्टिक वेसिकल चरण (~ 12 घंटे बाद निषेचन, एचपीएफ) पर बढ़ते भ्रूण, और लेजर स्कैनिंग कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप पर ऑप्टिक कप मॉर्फोजेनेसिस की बहु-आयामी टाइमलैप्स इमेजिंग का प्रदर्शन करता है, जैसे कि कई डेटासेट एक ही इमेजिंग सत्र में अनुक्रमिक रूप से प्राप्त किए जाते हैं। इस तरह के दृष्टिकोण से डेटा पैदा होता है जिसका उपयोग विभिन्न उद्देश्यों के लिए किया जा सकता है, जिसमें सेल ट्रैकिंग, वॉल्यूम मापन, त्रि-आयामी (3 डी) प्रतिपादन और दृश्य शामिल हैं। हमारे दृष्टिकोण हमें दोनों जंगली प्रकार और आनुवंशिक उत्परिवर्ती स्थितियों में ऑप्टिक कप विकास ड्राइविंग सेलुलर और आणविक तंत्र तुच्छ करने के लिए अनुमति देते हैं । इन तरीकों को सीधे अन्य समूहों द्वारा नियोजित किया जा सकता है या जेब्राफिश नेत्र विकास के कई अतिरिक्त पहलुओं की कल्पना करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है।

Introduction

कशेरुकी आंखों का विकास संभावित मस्तिष्क न्यूरोएपिथेलियम से ऑप्टिक वेसिकल्स के उद्भव, या वाष्पीकरण के साथ शुरू होता है। इसके बाद ऑप्टिक वेसिकल्स में ऊतक आकार परिवर्तनों की एक श्रृंखला से गुजरना पड़ता है, विस्तार होता है और फिर ऑप्टिक कप उत्पन्न करने के लिए इनवेजिनिंग होता है। ऑप्टिक कप में, तंत्रिका रेटिना और रेटिना वर्णक एपिथेलियम, दोनों न्यूरोएपिथेलियम से प्राप्त होते हैं, नवजात लेंस को लपेटते हैं, जो सतह ectoderm से प्राप्त होता है। पूरी प्रक्रिया के लिए कोशिका और ऊतक आंदोलनों और आणविक संकेत की एक जटिल श्रृंखला की आवश्यकता होती है, जो न्यूरोएपिथेलियम, एक्टोडेर्म और मेसेंचिमल सेल आबादी के बीच समन्वित होती है। ये प्रारंभिक घटनाएं आंखों की बुनियादी संरचना स्थापित करते हैं, और आईरिस और कॉर्निया गठन सहित आंखों के विकास के बाद के कदम, प्रारंभिक संगठन पर विस्तार से प्रकाश डालते हैं। प्रारंभिक आंखों के विकास और मॉर्फोजेनेसिस में व्यवधान मनुष्यों में कई दृश्य हानि स्थितियों को कम करते हैं, जिनमें एनोथैलमिया, माइक्रोथैल्मिया और कोलोबोमा शामिल हैं। ऑप्टिक कप रूपोजेनेसिस को नियंत्रित करने वाले सेलुलर और आणविक तंत्र को अनलॉक करना दृश्य प्रणाली के विकास और रोग स्थितियों को समझने के लिए महत्वपूर्ण है जिसके परिणामस्वरूप ये प्रक्रियाएं धराशायी हो जाती हैं।

कशेरुकी आंखों के विकास और रूपोजेने की हमारी समझ माउस, चिक, मेंढक और मछली 1 ,2,3,4,5सहित विभिन्न मॉडल जीवों में भ्रूणविज्ञानी और आनुवंशिक दृष्टिकोणों के लिए क्लासिक हिस्टोलॉजिकल अध्ययनों में फैले काम की एक जबरदस्त मात्रा से उभरी । जबकि काम के इस शरीर ने आणविक तंत्र की स्थापना की जो प्रारंभिक आंखों के विकास को विनियमित करता है, ऐतिहासिक रूप से आंख के मॉर्फोजेनेसिस की खराब समझ मौजूद है: इसकी 3 डी संरचना का उद्भव। इन निष्कर्षों के थोक असतत समय अंक पर इमेजिंग अनुभागित भ्रूण से आए हैं । हालांकि यह 2 आयामों में ऊतक आकृति विज्ञान का एक दृश्य प्रदान करने के लिए पर्याप्त है, मॉर्फोजेनेसिस एक गतिशील, 3 डी प्रक्रिया है। यह निर्धारित करने के लिए कि समय के साथ ऊतक का आकार 3 आयामों में कैसे बदलता है, एकल कोशिकाएं कैसे व्यवहार करती हैं, और वे व्यवहार 3 डी ऊतक आकार में परिवर्तन में कैसे योगदान देते हैं, विभिन्न दृष्टिकोण आवश्यक हैं।

ज्ञान में इस महत्वपूर्ण अंतर को दूर करने के लिए एक समाधान लाइव इमेजिंग है, जो वास्तविक समय में कोशिकाओं और ऊतकों के गतिशील अवलोकन को सक्षम बनाता है क्योंकि अंग आकार लेता है। दुर्भाग्य से, भ्रूणीय विकास की बाधाओं के कारण कई मॉडल जीवों में यह आसानी से व्यवहार्य नहीं है। उदाहरण के लिए, माउस और चिक भ्रूण (गर्भाशय में या अंडे के भीतर विकसित) आसानी से एक्सेस नहीं किए जाते हैं, और कई जीवित भ्रूण ऑप्टिकल रूप से पारदर्शी नहीं होते हैं, जिससे महत्वपूर्ण प्रकाश बिखराव होता है और गहराई को सीमित करता है जिसे छवियों को प्राप्त किया जा सकता है। बाहरी विकास और पारदर्शी भ्रूण के साथ जेब्राफिश, आंखों के मॉर्फोजेनेसिस6, 7,8, 9,10,11, 12,13,14,15,16,17,18,19की लाइव इमेजिंग करने का एक अनूठा अवसर प्रदान करता है। पर्याप्त ट्रांसजेनिक और उत्परिवर्ती रेखाएं भी उपलब्ध हैं, साथ ही नए ट्रांसजेनिक्स और म्यूटेंट20,21, 22,23,24उत्पन्न करनेकेलिए उपकरण भी उपलब्ध हैं। इसके अलावा, ऑप्टिक कप मॉर्फोजेनेसिस जेब्राफिश में तेजी से होता है, एक 12 घंटे की समय सीमा (निषेचन के बाद 12-24 घंटे, एचपीएफ), पूरी प्रक्रिया की इमेजिंग को व्यवहार्य बनाता है।

फ्लोरोसेंट प्रोटीन के परिवार के विस्तार और अनुकूलन द्वारा लाइव इमेजिंग प्रयासों में तेजी लाई गई है, जो आनुवंशिक रूप से उपकोशिकीय संरचनाओं के महत्वपूर्ण लेबलिंग के साथ-साथ माइक्रोस्कोपी विधियों में सुधार और नवाचारों की अनुमति देता है। यहां वर्णित प्रोटोकॉल में लेजर स्कैनिंग कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी का उपयोग किया गया है, बजाय इमेजिंग जेब्राफिश भ्रूणजेनेसिस के लिए अन्य वर्तमान दृष्टिकोणों के बजाय, जिसमें कताई डिस्क कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी, चयनात्मक विमान रोशनी माइक्रोस्कोपी (एसपीआईएम और इसके वेरिएंट), और अन्य अधिक विशेष माइक्रोस्कोपी तरीके शामिल हैं। विकासशील जेब्राफिश आंख के लिए, हमने पाया कि कताई डिस्क कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी ऊतक में गहरी इमेजिंग के लिए पर्याप्त नहीं था। हालांकि SPIM एक बहुत तेजी से इमेजिंग समय समेटे हुए है और अधिक व्यापक रूप से इस्तेमाल किया जा रहा है, दृश्य और विश्लेषण के लिए बड़े डेटासेट हैंडलिंग एक चुनौती बनी हुई है । इसके विपरीत, लेजर स्कैनिंग कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी आसानी से सुलभ है, विशेष रूप से ऑप्टिकल हार्डवेयर कोडांतरण में विशेषज्ञता की कमी वाले व्यक्तियों के लिए। हमें उम्मीद है कि लेजर स्कैनिंग कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी की व्यापक उपलब्धता हमारे प्रोटोकॉल को कई प्रयोगशालाओं के लिए उपयोगी बना देगी।

यहां, हम झिल्ली और क्रोमेटिन के लिए भ्रूण के टोटो लेबलिंग में उपयोग करके ऑप्टिक कप मॉर्फोजेनेसिस के 4D डेटासेट पर कब्जा करने के लिए हमारी विधि का वर्णन करते हैं, और छवि अधिग्रहण के लिए एक लेजर स्कैनिंग कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप (चित्र 1में स्कीमाइज्ड)। फ्लोरोसेंट प्रोटीन यहां इस्तेमाल किया (EGFP-CAAX और H2A । एफ/जेड-एमएचरी) को सिंगल सेल रेजोल्यूशन के साथ टिश्यू लेबलिंग प्रदान करने के लिए चुना गया था । हम विभिन्न प्रकार के छवि विश्लेषण और दृश्य कार्यों के लिए इस प्रोटोकॉल के साथ उत्पन्न डेटासेट का उपयोग करते हैं। यदि अन्य उपकोशिकीय संरचनाएं वांछित हैं तो इस प्रोटोकॉल को आसानी से अनुकूलित किया जा सकता है। प्लाज्मा झिल्ली लेबलिंग सेल आकार के दृश्य के लिए चुना गया था: हम EGFP-CAAX का उपयोग करें, जिसमें एच-रास के अंतिम 21 अमीनो एसिड, एक prenylation संकेत अनुक्रम के रूप में सेवारत, EGFP13के सी-टर्मिनस के लिए जुड़े हुए हैं । अन्य प्लाज्मा झिल्ली लक्षित फ्लोरोसेंट प्रोटीन (उदाहरण के लिए, ट्रांसमेम्ब्रेन फ्यूजन या मेरिस्टोइलेटेड) बस के रूप में अच्छी तरह से काम करने की संभावना है। नाभिक को चिह्नित करने के लिए, हमने H2A का चयन किया। एफ/जेड-एमएचरी, जिसमें रीचरी को हिस्टोन प्रोटीन13से जोड़ा जाता है । यह सुनिश्चित करता है कि माइटोटिक स्पिंडल ओरिएंटेशन सहित सेल डिवीजन, आसानी से कल्पना की जाती है।

किसी भी लाइव इमेजिंग दृष्टिकोण के साथ, सिग्नल-टू-शोर अनुपात, अक्षीय संकल्प और नमूना संरक्षण को अधिकतम करते हुए इमेजिंग गति बढ़ाने के बीच व्यापार-नापसंद पर विचार करना चाहिए। हमने छवि की गुणवत्ता और भ्रूण की संख्या को अधिकतम करने के लिए अपने तरीकों को अनुकूलित किया है जिन्हें एक ही रन में इमेज किया जा सकता है। अक्सर, लक्ष्य एक होमोज़िगस उत्परिवर्ती भ्रूण में ऑप्टिक कप मॉर्फोजेनेसिस की छवि बनाना है, जो ऑप्टिक कप मॉर्फोजेनेसिस की शुरुआत में जंगली प्रकार से फेनोथिप्टिक रूप से अविवेच्य हो सकता है और एक विषम incross की संतान (भ्रूण का 25% वांछित जीनोटाइप हैं)। अनुकूलन, और फिर छवि अधिग्रहण मल्टीप्लेक्स द्वारा, एक होमोज़िगस उत्परिवर्ती भ्रूण के डेटासेट पर कब्जा करने की संभावना बढ़ जाती है।

अस्थायी संकल्प, या कितनी बार वॉल्यूम डेटा (जेड-स्टैक) का अधिग्रहण किया जाता है, टाइमलैप्स इमेजिंग का एक महत्वपूर्ण पहलू है। इस तरह के डेटासेट के लिए उद्देश्य के आधार पर, गति के लिए अलग-अलग आवश्यकताएं हैं। प्रारंभ में यह प्रोटोकॉल मैनुअल 4D सेल ट्रैकिंग के लिए विकसित किया गया था। एक समान रूप से लेबल ऊतक के भीतर व्यक्तिगत कोशिकाओं की ट्रैकिंग उच्च पर्याप्त लौकिक संकल्प की आवश्यकता है विश्वास है कि किसी भी एक सेल लगातार समय के साथ ट्रैक किया जा रहा है प्रदान करते हैं । हमने पाया कि जेब्राफिश ऑप्टिक कप मॉर्फोजेनेसिस के जेड-स्टैक को 12 घंटे से कम हर 3.1 मिनट में अधिग्रहीत किया जाना चाहिए; यहां, हमने लेजर स्कैनिंग कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप पर अपने अधिग्रहण को अनुकूलित किया है ताकि हम हर 2.5 मिनट में 4-5 भ्रूण के जेड-स्टैक प्राप्त कर सकें।

जेड-स्टेप आकार की स्थापना प्रोटोकॉल अनुकूलन में एक महत्वपूर्ण कदम था: 3डी रेंडरिंग और विज़ुअलाइज़ेशन के लिए, आइसोट्रोपिक डेटा आदर्श हैं, जिसमें जेड-स्टेप आकार XY पिक्सेल आयाम के बराबर है। वास्तव में, इमेजिंग समय और फोटोब्लैचिंग के साथ बाधाओं को देखते हुए जीवित नमूनों के साथ इस तरह के टाइमलैप्स डेटा प्राप्त करना बेहद मुश्किल है। इसलिए, प्रयोग की प्रतिपादन और दृश्य आवश्यकताओं के लिए पर्याप्त जेड-स्टेप आकार का निर्धारण महत्वपूर्ण है, और विशेष रूप से, गति को बनाए रखने और फोटोब्लैचिंग को रोकने के दौरान अक्षीय जानकारी को अधिकतम करने के लिए एक्स: वाई: जेड वोक्सल अनुपात की आवश्यकता है। इस प्रोटोकॉल के लिए, स्थापित स्वर अनुपात 1:1:3.5 (0.6 माइक्रोन x 0.6 माइक्रोन x 2.1 माइक्रोन जेड-स्टेप आकार 40x लंबी कार्य दूरी के पानी विसर्जन उद्देश्य का उपयोग करके) था। 130-140 माइक्रोन की जेड-गहराई प्राप्त करते समय, यह उपयुक्त अस्थायी संकल्प और थोड़ा फोटोब्लैचिंग के साथ वॉल्यूम डेटा पैदा करता है।

जैसा कि ऊपर चर्चा की गई है, यह प्रोटोकॉल जेब्राफ़िश ऑप्टिक कप मॉर्फोजेनेसिस के 4डी इमेजिंग के लिए विशिष्ट है, प्लाज्मा झिल्ली और क्रोमेटिन के लिए लेबल किए गए टोटो में भ्रूण का उपयोग करके, और एक लेजर स्कैनिंग कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप। नीचे दिए गए प्रोटोकॉल को विभिन्न प्रकार के प्रयोगों और जरूरतों के लिए आसानी से अनुकूलित किया जा सकता है। सबसे पहले, उपकोशिकीय संरचनाओं के संबंध में, किसी भी संरचना जिसके लिए एक जीवित सेल मार्कर मौजूद है, छवि की जा सकती है। इसके बाद, हालांकि यहां ध्यान विशेष रूप से ऑप्टिक कप मॉर्फोजेनेसिस पर है, लेकिन आंखों के विकास के अन्य चरणों के लिए टाइमलैप्स इमेजिंग को अनुकूलित किया जा सकता है, उदाहरण के लिए, न्यूरोजेनेसिस25,26,27,28,29,30,31,32, 33। बाद के विकास इमेजिंग के लिए, किसी को भ्रूण स्थिरीकरण पर विचार करने की आवश्यकता हो सकती है (जैसा कि सहज मांसपेशी गतिविधि 24 एचपीएफ के आसपास शुरू होती है), पिगमेंटेशन (जो 24 एचपीएफ के आसपास उभरना शुरू होता है), ऊतक आकार (आंख न्यूरोजेनेसिस के दौरान मात्रा में काफी बढ़ता है), और इमेजिंग गति (जिसे ब्याज की प्रक्रिया की गति के आधार पर समायोजित किया जाना चाहिए)। इन सभी बातों को आसानी से प्रबंधित किया जा सकता है। प्रोटोकॉल काफी लचीला है; यहां विशिष्ट प्रोटोकॉल के विवरण के अलावा, सामान्य सिद्धांत हैं जो आंखों के विकास के अन्य पहलुओं लाइव इमेजिंग में रुचि रखने वालों की सहायता करेंगे।

Protocol

जेब्राफिश का उपयोग करके यहां वर्णित सभी तरीकों को डॉ क्रिस्टन क्वान के पशु प्रोटोकॉल, "जेब्राफिश में दृश्य प्रणाली विकास के सेलुलर और आणविक तंत्र" के तहत कवर किया जाता है, और यूटा विश्वविद्यालय की संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (IACUC) द्वारा अनुमोदित किया जाता है।

1. छाया आरएनए संश्लेषण

  1. इन विट्रो ट्रांसक्रिप्शन के लिए डीएनए टेम्पलेट जेनरेट करें।
    1. प्रतिक्रिया मिश्रण के 100 माइक्रोन वॉल्यूम में डीएनए के 10 माइक्रोन को पचाकर डीएनए टेम्पलेट को रैखिक करें। एक विशिष्ट प्रतिक्रिया इस प्रकार इकट्ठा की जाती है: एंजाइम के 3 माइक्रोन और बफर के 10 माइक्रोन का उपयोग करके 10 माइक्रोन डीएनए को पचाएं, प्रतिक्रिया की मात्रा को पानी के साथ 100 माइक्रोन तक लाएं।
      नोट: डाइजेस्ट के लिए एक विशिष्ट टेम्पलेट एक पीसी2 वेक्टर है, उदाहरण के लिए, पीसी2-ईजीएफपी-सीएएएक्स या पीसी2एफए-एच2ए.एफ/जेड-एमचेरी झिल्ली और क्रोमेटिन लेबलिंग के लिए यहां वर्णित है। इस मामले में, प्लाज्मिड डीएनए एंजाइम नोटी का उपयोग करके प्रत्येक पचा रहे हैं। उपयोगकर्ताओं को स्टार गतिविधि से सावधान रहना चाहिए; इस मामले में, एक उच्च निष्ठा एंजाइम की सिफारिश की जाती है और व्यावसायिक रूप से उपलब्ध है।
    2. यह सुनिश्चित करने के लिए कि डीएनए पूरा होने के लिए पचा रहा है, रात भर 37 डिग्री सेल्सियस पर प्रतिक्रिया को इनक्यूबेट करें।
    3. निर्माता के प्रोटोकॉल का पालन करते हुए पीसीआर शुद्धिकरण किट का उपयोग करके प्रतिबंध डाइजेस्ट को साफ करें। 30 μL ddH2O के साथ डीएनए Elute-20 डिग्री सेल्सियस पर रैखिक डीएनए स्टोर और जरूरत के रूप में उपयोग करें ।
      नोट: डीएनए पचाने की मात्रा और एल्यूशन वॉल्यूम लगभग 0.3 μg/μL उपज; यह इन विट्रो ट्रांसक्रिप्शन के ~ 5 राउंड के लिए पर्याप्त है, प्रत्येक दौर में टेम्पलेट के रूप में डीएनए के ~ 2 माइक्रोन का उपयोग किया जाता है।
  2. इन विट्रो ट्रांसक्रिप्शन किट का उपयोग करके आरएनए को छाया हुआ है। PCS2 टेम्पलेट्स (जैसा कि यहां वर्णित है) के लिए, SP6 किट का उपयोग करें।
    1. इन विट्रो ट्रांसक्रिप्शन रिएक्शन को इकट्ठा करें, इस प्रकार: डीएनए टेम्पलेट के 2 माइक्रोन को डाइजेस्ट करें या 10x रिएक्शन बफर के 2 माइक्रोन के साथ 6 माइक्रोन तक, 2x रिबोन्यूक्लियोटाइड मिक्स के 10 माइक्रोन, और 10x एंजाइम मिक्स के 2 माइक्रोन।
    2. 2-4 घंटे या उससे अधिक समय के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट (लंबे समय से अधिक उपज होगी)। यदि वांछित है, तो एंजाइम मिक्स के 1 माइक्रोन को इनक्यूबेशन अवधि के माध्यम से आधे रास्ते में पूरक किया जा सकता है।
    3. डीएनए टेम्पलेट को आरएनएसई-मुक्त DNase के 1 माइक्रोन जोड़कर और 37 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए इनक्यूबेटिंग करके पचाें।
  3. निर्माता के प्रोटोकॉल के बाद आरएनए शुद्धिकरण किट का उपयोग करके छाया आरएनए को शुद्ध करें (सामग्री की तालिकादेखें)। RNase-मुक्त एच2ओ के 100 μL के साथ Elute।
    नोट: इस एप्लिकेशन के लिए β-मर्केप्टोथेनॉल का जोड़ आवश्यक नहीं है। जबकि इस प्रोटोकॉल में वर्णित विधि सीधी है, आरएनए को शुद्ध करने के लिए वैकल्पिक अभिकर् तार का भी उपयोग किया जा सकता है।
  4. आरएनए को उपजी।
    1. eluted आरएनए के लिए 3 एम RNase मुक्त NaOAc के 10 माइक्रोन और 2.5 वॉल्यूम (~ 275 माइक्रोन) बर्फ-ठंडे RNase-मुक्त 100% EtOH जोड़ें।
    2. 15-30 मिनट के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर प्रतिक्रिया को इनक्यूबेट करें। आरएनए को गोली मारने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर उच्च गति पर 15 मिनट तक स्पिन करें।
      नोट: गोली ट्यूब की दीवार के खिलाफ दिखाई देना चाहिए। यह ध्यान रखना उपयोगी है कि ट्यूब को इस चरण में अपकेंद्रित्र में कैसे गठबंधन किया जाता है, ताकि यह भविष्यवाणी की जा सके कि स्पिन के अंत में गोली कहां होनी चाहिए।
    3. एक सिरिंज के साथ एटोह को सावधानी से निकालें, हीटिंग से बचने के लिए सावधान रहें, अधिक सूखने या गोली को उखाड़ फेंकें। RNase-मुक्तएच2 ओ के 20 μL में गोली को फिर से खर्च करें।
    4. यह सुनिश्चित करने के लिए आरएनए की जांच करें कि संश्लेषण सफल हो। एक स्पेक्ट्रोफोटोमीटर पर एकाग्रता परखने के लिए 1 माइक्रोन का उपयोग करें और कम आणविक वजन धब्बा के बजाय एक या दो असतत बैंड की जांच करने के लिए 1% एगर उठे जेल पर 0.5 माइक्रोन चलाएं। इन विट्रो ट्रांसक्रिप्शन रिएक्शन की उपज ~1 माइक्रोन/माइक्रोन होनी चाहिए।
    5. Aliquot और -20 डिग्री सेल्सियस या -80 डिग्री सेल्सियस पर आरएनए स्टोर। आरएनए इंजेक्शन से तुरंत पहले तक पतला नहीं है।

2. 1-सेल जेब्राफिश भ्रूण का माइक्रोइंजेक्शन

नोट: ऑप्टिक कप मॉर्फोजेनेसिस में क्रोमेटिन और कोशिका झिल्ली की सर्वव्यापी अभिव्यक्ति प्राप्त करने के लिए प्रति आरएनए 200-300 स्नातकोत्तर इंजेक्ट करें। आरएनए कमजोर पड़ने के 5-10 μL तैयार करें, और लोड 2.5-5 μL/सुई; घटना सुई टूट जाता है में अतिरिक्त के लिए योजना।

  1. इंजेक्शन के लिए अग्रिम तैयारी।
    1. माइक्रोइंजेक्शन के लिए 1-सेल भ्रूण के संरेखण और अभिविन्यास की सुविधा के लिए एक इंजेक्शन मोल्ड डिश तैयार करें। E3 (मानक भ्रूण माध्यम) में 2% agarose पिघला और एक पेट्री पकवान में डालना। ध्यान से इंजेक्शन मोल्ड (सामग्री की मेजदेखें) गर्म agarose के शीर्ष पर फ्लोट के रूप में यह जमना में गर्त की छाप उत्पन्न करने के लिए। एक बार एगरेज़ जम जाता है, इंजेक्शन मोल्ड को हटा दें।
      नोट: इंजेक्शन मोल्ड व्यंजन कई महीनों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है; E3 में कवर और उपयोग में नहीं होने पर 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    2. माइक्रोइंजेक्शन सुई खींचो। एक सुई खींचने की मशीन का उपयोग कर माइक्रोइंजेक्शन सुई बनाने के लिए एक लंबे टेपर के लिए ग्लास केशिकाओं खींचो। कार्यक्रम मशीन का उपयोग किए जाने वाले केशिकाओं के प्रकार के लिए विशिष्ट है। 1.0 x 0.78 मिमी बोरोसिलिकेट केशिकाओं के लिए निम्नलिखित कार्यक्रम का उपयोग करें: गर्मी = 546 डिग्री सेल्सियस, पुल = 130, वेग = 70, समय = 90(चित्रा 2F)। सुइयों को पेट्री डिश में स्टोर करें और इसे मॉडलिंग क्ले से सुरक्षित करें।
      नोट: मशीन और फिलामेंट के आधार पर पुलिंग रेसिपी अलग-अलग होगी, और नए फिलामेंट्स को हमेशा कैलिब्रेट किया जाना चाहिए। खींचने के प्रत्येक दौर में दो सुइयां(चित्रा 2G); आकस्मिक ब्रेक और भविष्य के प्रयोगों के मामले में पर्याप्त सुइयों का उत्पादन करने के लिए ऐसा कई बार करें।
    3. इंजेक्शन के लिए छाया आरएनए पतला। 5 माइक्रोन की कुल मात्रा में आरएनईई-मुक्त एच2ओ और 1 माइक्रोनल लाल का उपयोग करके ईजीएफपी-सीएएक्स और एच 2ए-एमसीएचरी आरएनए दोनों को पतला करें (फिनोल लाल की अंतिम एकाग्रता 0.1%) मिश्रण झटका और संक्षेप में कुल मात्रा इकट्ठा करने के लिए नीचे स्पिन। इंजेक्शन लगाने से पहले बर्फ पर पतला आरएनए रखें।
  2. 1-सेल भ्रूण का इंजेक्शन
    1. एक बार जब मछली प्रजनन करना शुरू कर देती है, तो ~ 15-20 मिनट की अनुमति दें ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि अंडे निषेचित हो जाते हैं। इस समय के दौरान, P10 और P10 माइक्रो-लोडर युक्तियों का उपयोग करके आरएनए कमजोर पड़ने के 2.5-5 माइक्रोल के साथ सुई को बैकलोड करें।
    2. एक पिकोइंजेक्टर का उपयोग करके, बूंद की मात्रा को मापने के लिए एक आईपीस रेटिकल (एक माइक्रोमीटर कैलिब्रेशन स्लाइड भी पर्याप्त है) का उपयोग करके सुई को कैलिब्रेट करें (एक गोला की मात्रा = (4/3) * पीआई * त्रिज्या ^ 3)। इंजेक्शन के समय और दबाव को समायोजित करें जैसे कि इंजेक्शन की मात्रा 1 एनएल(चित्रा 2I) है।
    3. एक रोलर/ट्रांसफर पिपेट के साथ, ध्यान से इंजेक्शन मोल्ड(चित्रा 2J)में अंडे लोड करें । यदि उपयोगी है, तो भ्रूण को रोल करने के लिए संदंश का उपयोग करें जैसे कि एकल कोशिका दिखाई देती है, या तो इंजेक्शन से पहले या उसके दौरान। माइक्रोमैनीपुलेटर का उपयोग करना उपयोगकर्ता की प्राथमिकता है।
    4. 1-सेल चरण में भ्रूण इंजेक्ट करें, सेल को लक्षित करें और जर्दी(चित्रा 2M)नहीं। इससे विकासशील भ्रूण की एक समान लेबलिंग सुनिश्चित होगी।
  3. वांछित चरण के लिए भ्रूण बढ़ा (12 hpf से पहले, मानक मचान३४के अनुसार) । इंजेक्शन भ्रूण एक देरी विकास होगा, तो उन्हें थोड़ा अधिक तापमान (29.0-29.5 डिग्री सेल्सियस) पर बढ़ाने के लिए समय बनाने के लिए । दोपहर के दौरान, भ्रूण की जांच करें और क्लच के स्वास्थ्य को बनाए रखने के लिए मृत लोगों को हटा दें।

3. टाइमलैप्स इमेजिंग के लिए बढ़ते ऑप्टिक वेसिकल स्टेज जेब्राफिश भ्रूण

  1. बढ़ते से पहले, E3 में 1.6% कम पिघल agarose तैयार करते हैं। यदि कई इमेजिंग प्रयोगों की योजना बना रहे हैं, तो ~ 20 एमएल कम पिघलने वाले एगर उठे और कमरे के तापमान पर स्टोर करें। भ्रूण बढ़ते के दिन, इसे पिघलाकर एक ट्यूब में एक ताजा एलिकोट (1-5 एमएल) उत्पन्न करें जिसे बढ़ते से पहले 42 डिग्री सेल्सियस हीट ब्लॉक में रखा जा सकता है।
  2. सफल इंजेक्शन के लिए स्क्रीन भ्रूण और बढ़ते से पहले फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप का उपयोग करके फ्लोरेसेंस की समग्र चमक। एक आदर्श नमूने में मजबूत ईजीएफपी और रीचेरी फ्लोरेसेंस होगा और सही विकासात्मक चरण में होगा(चित्रा 3 बी - बी')।
    1. फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप का उपयोग करके स्क्रीन भ्रूण। भ्रूण का चयन करें जो बढ़ते के लिए ईजीएफपी और रीचेरी फ्लोरेसेंस दोनों को दृढ़ता से व्यक्त करते हैं।
    2. 11 एचपीएफ वाले भ्रूण का चयन करें। भ्रूण को ठीक से स्टेज करने के लिए सोमाइट्स की गिनती34. 11 एचपीएफ में 3 सोमेन होनी चाहिए, और 12 एचपीएफ तक 6 सोमेन हैं।
      नोट: 12 एचपीएफ (11 एचपीएफ पर) से पहले बढ़ते भ्रूणों द्वारा, टाइमलैप्स शुरू होने पर नमूनों को 12 एचपीएफ पर उचित रूप से मंचन किया जाएगा।
  3. बढ़ते से पहले भ्रूण को डिकोरोनेट करें। यह या तो मैन्युअल रूप से ठीक संदंश के साथ या रासायनिक रूप से प्रोनेज (2 मिलीग्राम/एमएल) का उपयोग करके करें। भ्रूण के साथ इस युवा, यह आवश्यक है कि एक आगर लेपित पकवान के भीतर किया जाता है और भ्रूण हवा पानी इंटरफेस से संपर्क नहीं है ।
  4. एक ग्लास रोलर पिपेट का उपयोग करके, एक भ्रूण को चूस लें और जितना संभव हो उतना E3 बाहर निकालें कि भ्रूण ग्लास पाश्चर पिपेट की नोक पर बैठता है।
  5. भ्रूण को हीट ब्लॉक से एगर उठी की ट्यूब में छोड़ दें। इसे कुछ सेकंड के लिए agarose में सिंक करते हैं, तो कुछ agarose पहले चूसना और फिर भ्रूण, सुनिश्चित करें कि भ्रूण पिपेट की नोक पर रहता है(चित्रा 3C-सी') ।
  6. एक विच्छेदन गुंजाइश के तहत इमेजिंग के लिए एक गिलास नीचे पकवान रखें। भ्रूण को बाहर निकालें और कांच के नीचे की डिश में एक एगरे उठी बूंद में उठी। बहुत जल्दी उन्मुख करने के लिए संदंश का उपयोग करें, जैसे कि भ्रूण पृष्ठीय-नीचे (कांच के नीचे सिर के ऊपर) है। अगर उठे बूंद को कठोर होनेदें (चित्रा 3 डी - डी')। यह कदम जल्दी लेकिन ध्यान से किया जाना चाहिए, के रूप में इस स्तर पर भ्रूण नाजुक हैं । क्षतिग्रस्त भ्रूण टाइमलैप्स इमेजिंग प्रक्रिया से बच नहीं पाएंगे।
    नोट: इस प्रयोग के लिए लगातार सभी भ्रूणों को उन्मुख करना महत्वपूर्ण है। टाइमलैप्स करते समय, भ्रूण को आवंटित क्षेत्र के भीतर फिट होना चाहिए, जबकि ऑप्टिक वेसिकल के लिए अतिरिक्त स्थान बनाए रखना होगा। एक इष्टतम अभिविन्यास सभी भ्रूणों के पूर्वकाल-पीछे की धुरी को "खड़ी" या घड़ी के चेहरे(चित्रा 3जी)पर 12 और 6 बजे के साथ संरेखित करना है।
  7. 10-12 भ्रूण के बीच माउंट, जो दो बार से अधिक है कि कई है कि छवि होगी, ताकि सबसे अच्छा नमूनों एक बार confocal पर मूल्यांकन किया जा सकता है(चित्रा 3E-ई') । नमूनों का मूल्यांकन उम्र, फ्लोरोसेंट लेबलिंग की एकरूपता और बढ़ते अभिविन्यास की सटीकता के लिए किया जाएगा ।
  8. भ्रूण बढ़ते के बाद, पिपेट अधिक एगर पूरी तरह से पकवान के नीचे को कवर करने के लिए उठे, जिससे एक बड़े एगर उठे डिस्क(चित्रा 3F - एफ'में सभी अलग-अलग एगर उठे बूंदों को संलग्न किया गया। पर्याप्त मात्रा में एगर उठे यह सुनिश्चित करेंगे कि व्यक्तिगत भ्रूण की बूंदें या पूरी डिस्क पकवान के नीचे से ऊपर नहीं उठती है और देखने से बाहर तैरती है।
  9. एक बार कठोर होने के बाद, नमूनों को टाइमलैप्स इमेजिंग प्रयोग (इमारत की आर्द्रता और पर्यावरण में) के आधार पर हाइड्रेटेड रखने के लिए E3 के साथ एगर उठे।
    नोट: इन विशिष्ट टाइमलैप्स इमेजिंग प्रयोगों के लिए ट्राइकेन आवश्यक नहीं है, क्योंकि ये भ्रूण पर्याप्त रूप से युवा हैं; हालांकि, अगर वांछित है, और अगर भ्रूण के पुराने चरणों के साथ काम कर रहे हैं, ट्राइकेन को खुद को उत्पन्न और मीडिया में मढ़ा में जोड़ा जा सकता है।
  10. कागज पर, टाइमलैप्स सेट अप के दौरान आसान संदर्भ के लिए भ्रूण का एक नक्शा आकर्षित करें। यह बाद में प्रत्येक नमूने के जीनोटाइप के साथ स्थिति को संबद्ध करने के लिए महत्वपूर्ण है।

4. लेजर स्कैनिंग कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप के साथ मल्टीपल पोजिशन कॉन्फोकल टाइमलैप्स

नोट: इस टाइमलैप्स इमेजिंग प्रोटोकॉल को निर्माता के सॉफ़्टवेयर (सामग्री की तालिकादेखें) से लैस लेजर स्कैनिंग कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप के साथ उपयोग करने के लिए डिज़ाइन किया गया था। यह प्रणाली एक पीजो जेड-स्टेज डिवाइस से लैस है जो जेड-स्टैक के तेजी से अधिग्रहण की अनुमति देता है। इस प्रोटोकॉल में इस्तेमाल होने वाली लेजर लाइनें 488 एनएम आर्गन आयन लेजर और डीपीएसएस 561 एनएम लेजर हैं। 561 एनएम लेजर म्हेरी फ्लोरोफोर इमेजिंग के लिए अच्छी तरह से अनुकूल है: यह म्हेरी उत्तेजन (587 एनएम) और अच्छी तरह से संचालित के शिखर के काफी करीब है।

  1. कॉन्फिडेंट की स्थापना करें।
    1. कॉन्फोकल पर पावर और डेस्कटॉप कंप्यूटर में लॉग इन करें।
    2. पीजो जेड-स्टेज डालने(चित्रा 4B) स्थापितकरें, फिर अधिग्रहण सॉफ्टवेयर शुरू करें।
    3. अधिग्रहण मोड के भीतर सॉफ्टवेयर में, ड्रॉप-डाउन मेनू(चित्रा 4F)का उपयोग करके 488 और 561 लेजर चालू करें। लेजर को गर्म करने में कई मिनट लग जाते हैं, इसलिए यह कदम समय बचाने के लिए जल्दी किया जाता है।
      नोट: अधिग्रहण पैरामीटर इस प्रकार हैं: जेड-स्टैक, टाइम सीरीजऔर स्थिति बक्से की जांच करें। सेट फ्रेम साइज टू 512 (X) x 384 (वाई), स्कैन स्पीड टू 9, स्कैन मोड टू बाइडायरेक्शनल, जूम टू 0.7, पिनहोल से 60.2 (1.63 हवादार यूनिट्स ~ = 1.6 माइक्रोन सेक्शन), और जेड-इंटरवल टू 2.1 μ μ। यह 303.6 माइक्रोन x 227.7 माइक्रोन का एक छवि आकार, और 0.59 माइक्रोन का पिक्सेल आकार होगा। 488 और 561 लेजर की जांच की जानी चाहिए और एक ही ट्रैक को सौंपा जाना चाहिए; ईजीएफपी डिटेक्शन रेंज 494-545 एनएम है और एमएचरी डिटेक्शन रेंज 598-679(चित्रा 4F)है।
    4. उदारतापूर्वक पानी के अपवर्तक सूचकांक मिलान विसर्जन माध्यम के साथ कांच पकवान के नीचे कोट, हवा बुलबुले(चित्रा 4C)से बचने के लिए सावधान किया जा रहा है । 40x पानी उद्देश्य का चयन करें और उद्देश्य(चित्रा 4D)के लिए विसर्जन माध्यम की एक छोटी सी बूंद लागू होते हैं । मंच डालने में ग्लास तली पकवान सुरक्षित, E3 लागू करने के लिए भ्रूण नम रात भर रखने के लिए, तो मॉडलिंग मिट्टी का उपयोग करने के लिए पकवान पर प्लास्टिक के ढक्कन सील(चित्रा 4E)। डिश के साथ संपर्क बनाने के उद्देश्य को बढ़ाएं।
  2. स्क्रीन नमूने और टाइमलैप्स के लिए तैयार करते हैं।
    1. एक्विजिशन टैब से पता लगाने के लिए स्विच करें और ट्रांसमिटेड लाइट चालू करने के लिए लाइटबल्ब सिंबल पर क्लिक करें। प्रेषित प्रकाश के साथ, जॉयस्टिक के साथ पहले नमूने का पता लगाएं: आंखों से, पहले नमूने को प्रकाश की बीम में ले जाएं, फिर केंद्र में आईपीस का उपयोग करें और एक ऑप्टिक वेसिकल पर ध्यान केंद्रित करें।
    2. अधिग्रहण टैब पर लौटें। सुनिश्चित करें कि जेड-स्टैक, टाइम सीरीजऔर पोजिशन बॉक्स की जांच की जाती है, और लेजर उपयोग के लिए गर्म होते हैं।
    3. फ्रेम साइज को 512 (X) x 384 (वाई), स्कैन स्पीड टू 9, स्कैन मोड टू बाइडायरेक्शनल और ज़ूम को 0.7 सेट करें।
    4. शीर्षक चैनलों के तहत, पावर 2.0 और लाभ 550 को 488 और 561 लेजर असाइन करके शुरू करें (इसे बाद में समायोजित किया जा सकता है)। पिनहोल को 60.2 (1.63 हवादार इकाइयां ~ = 1.6 माइक्रोन सेक्शन) में सेट करें।
    5. निरंतर बटन का उपयोग करके स्कैनिंग शुरू करें। ठीक फोकस घुंडी के साथ, जेड-एक्सिस में नमूने का पता लगाएं और फ्रेम में एक्स-वाई एक्सिस की स्थिति रखें। स्कैनिंग बंद करो।
    6. पोजीशन हेडिंग के तहत, पहले नमूने(चित्रा 4F)पर XYZ जानकारी को बचाने के लिए ऐड पर क्लिक करें। ऐसा केवल नमूनों को समय पर करने के लिए करें। उनके मजबूत फ्लोरेसेंस और इष्टतम बढ़ते के लिए नमूनों का चयन करें।
    7. पता लगाने टैब पर स्विच करें, अगले नमूने पर जाएं, और नमूनों को चुनने के बारे में चयनात्मक होने के नाते चरण 4.2.5-4.2.6 दोहराएं।
  3. नमूना पदों को अंतिम रूप दें, जेड-रेंज असाइन करें, और फिर टाइमलैप्स शुरू करें। एक बार सभी नमूनों का चयन कर रहे हैं (यह 2.5 मिनट के कुल समय अंतराल के भीतर 4-5 नमूनों छवि संभव है) और पदों को बचाया जाता है, प्रत्येक नमूने के माध्यम से जाना और देखने के फ्रेम के भीतर XYZ स्थिति को समायोजित करें।
    1. पहली स्थिति को हाइलाइट करें और मूव टूपर क्लिक करें । लगातार स्कैनिंग करते समय, फ्रेम के भीतर ऑप्टिक वेसिकल को लाइन करें। ऑप्टिक वेसिकल और मस्तिष्क के सापेक्ष पूर्वकाल और डिस्टल क्षेत्रों में पर्याप्त जगह छोड़ दें।
    2. इसके बाद, सेट फर्स्ट का चयन करके पहले और अंतिम जेड-स्लाइस असाइन करें और ठीक फोकस नॉब के साथ जेड-दिशा के माध्यम से आगे बढ़ते हुए अंतिम सेट करें। ~ 63 की कुल स्लाइस संख्या बनाए रखें, क्योंकि यह ऑप्टिक कप के विकास को समायोजित करेगा। विकास के लिए कमरे की अनुमति देने के लिए ऑप्टिक वेसिकल के वेंट्रल साइड पर अतिरिक्त कमरा प्रदान करें।
    3. एक बार पहले और आखिरी जेड-स्लाइस सेट किए जाने के बाद, जेड-स्टैक के केंद्र में जाने के लिए सी बटन पर क्लिक करें। लेजर शक्ति को समायोजित करें और दोनों लेजर के लिए लाभ; यदि संभव हो, तो लेजर शक्ति को 5 से नीचे रखें और यदि आवश्यक हो तो उच्च लाभ का उपयोग करें। स्कैनिंग बंद करो। अपडेट पर क्लिक करके स्थिति की जानकारी अपडेट करें।
    4. स्थिति 2पर क्लिक करके अगले स्थान पर ले जाएं । प्रत्येक सौंपे गए स्थान के लिए 4.3.1-4.3.3 चरण दोहराएं। लेजर शक्ति और लाभ इस तरह सेट किया जाना चाहिए कि सभी नमूनों पर्याप्त रूप से प्रकाशित कर रहे हैं।
    5. एक बार स्थिति जानकारी और लेजर सेटिंग्स दोनों को अंतिम रूप दिया जाता है, तो टाइम सीरीज सेटिंग्स असाइन करें। टाइम सीरीज हेडिंग के तहत, 2.5 मिनट के लिए समय अंतराल असाइन करें, और 300(चित्रा 4F)के लिए चक्र। चक्रों की संख्या की गणना इस तरह की जाती है कि ऑप्टिक कप विकास पूरा होने पर 24 एचपीएफ चरण से पहले टाइमलैप्स आय होती है।
    6. टाइमलैप्स शुरू करने के लिए, स्टार्टपर क्लिक करें। पहले पूर्ण चक्र की निगरानी करें: एक पूर्ण चक्र (इमेजिंग सभी पदों) को सुनिश्चित करने के लिए एक टाइमर का उपयोग करें 2.5 मिनट से कम है और सत्यापित करें कि प्रत्येक स्थिति सही दिखती है। माइक्रोस्कोप रातोंरात स्वतंत्र रूप से चलता है और निगरानी की जरूरत नहीं है।
      नोट: हालांकि कॉन्फोकल रूम तापमान नियंत्रित है, कमरे का तापमान 20-25 डिग्री सेल्सियस है। उपकरण चल रहा है और पराबैंगनीकिरण स्कैनिंग के साथ, मंच पर तापमान 28.5 डिग्री सेल्सियस के करीब प्रतीत होता है, के बाद से भ्रूण विकास इस अपेक्षित दर पर आय, के रूप में रूपात्मक स्थलों के साथ नेत्रहीन कहा जाता है ।
    7. इन सेटिंग्स के साथ, टाइमलैप्स 12.5 घंटे तक चलेगा। टाइमलैप्स पूरा होने के बाद फाइल को सेव कर लें। यह बड़ा (~ 40 जीबी) होगा और अधिग्रहण सॉफ्टवेयर का उपयोग करके सहेजे जाने के बाद इसे व्यक्तिगत पदों में अलग किया जा सकता है।

Representative Results

फ्लोरोसेंट आरएनए का इंजेक्शन उपकोशिकीय लेबलिंग को सक्षम बनाता है
आरएनए जो सेल की प्लाज्मा झिल्ली और हिस्टोन को लेबल करते हैं, उन्हें अलग-अलग सेल मॉर्फोलोजी और आंदोलनों को पकड़ने के लिए इंजेक्ट किया जाता है जो ऑप्टिक कप मॉर्फोजेनेसिस को रेखांकित करते हैं। चित्रा 2 1-सेल चरण में जेब्राफिश भ्रूण को माइक्रोइंजेक्ट करने की प्रक्रिया के प्रत्येक चरण को दर्शाता है। संक्षेप में, ज़ेब्राफ़िश(चित्रा 2E)है, और भ्रूण एकत्र कर रहे हैं और इंजेक्शन मोल्ड(चित्रा 2J)में लोड किया जाता है। एक माइक्रोइंजेक्शन सुई बैकफिल्ड होती है(चित्रा 2H),और भ्रूण को सीधे एकल कोशिका(चित्रा 2K-M)में इंजेक्ट किया जाता है, जो समान लेबलिंग(चित्रा 2M, चित्रा 4I-I'',मूवी 1)प्राप्त करने के लिए आवश्यक है। एक समान लेबलिंग के अलावा, मजबूत फ्लोरेसेंस मनाया जाता है और विकास बेफिक्र(चित्रा 3 बी-बी')से आगे बढ़ताहै।

प्रभावी बढ़ते 12-24 एचपीएफ से टाइमलैप्स इमेजिंग ओसीएम के लिए आवश्यक है
ऑप्टिक कप मॉर्फोजेनेसिस की छवि के लिए, जो समय की एक विस्तारित अवधि में होता है, यह दोनों आदर्श भ्रूण का चयन करने के लिए महत्वपूर्ण है और एम्बेड करते समय प्रत्येक नमूने को ठीक से स्थिति में रखता है। चित्रा 3 11 एचपीएफ भ्रूण के सफल बढ़ते के लिए एक विस्तृत खाता दिखाता है। इंजेक्शन भ्रूण पहले पर्याप्त फ्लोरेसेंस के लिए जांच कर रहे है(चित्रा 3B', B'', F'', F'' '। व्यक्तिगत भ्रूण agarose में डूबे हुए हैं(चित्रा 3C,सी')और agarose की एक व्यक्तिगत बूंद में dorsally घुड़सवार(चित्रा 3 डी,डी')। सभी नमूनों को एगरेड(चित्रा 3E-F'की एक सामूहिक डिस्क में रखा जाताहै। जब भ्रूण सही ढंग से मंचन कर रहे हैं, पर्याप्त रूप से फ्लोरोसेंट, और पर्याप्त रूप से घुड़सवार(चित्रा 3G), नमूनेइमेजिंग फ्रेम में पूरे अंग के लिए अनुमति देने के लिए कल्पना की जाएगी(चित्रा 4G-जी',,मैं', फिल्म1)। इनमें से किसी भी चरण को पूरा करने में विफलता के परिणामस्वरूप एक घुड़सवार भ्रूण होगा जो टाइमलैप्स इमेजिंग के लिए इष्टतम नमूना नहीं है। रोटेशन की डिग्री में जरा सा बदलाव टाइमलैप्स के दौरान भ्रूण के विकास की दिशा पर नाटकीय प्रभाव डालेगा। उप-इष्टतम घूर्णन चित्रा 3में दिखाए जाते हैं, जिसमें एक भ्रूण शामिल है जिसे अधिक घुमाया जाता है(चित्रा 3I),जिसके परिणामस्वरूप अधिक पीछे का समय समाप्त हो जाएगा, और एक भ्रूण जिसे कम घुमाया जाता है(चित्रा 3J)जिसमें केवल सबसे पूर्वकाल ऊतक देखा जा सकता है। बढ़ते के दौरान उचित रोटेशन के अलावा, फ्रेम के अभिविन्यास के संबंध में लगाए गए नमूनों में एक सफल टाइमलैप्स(चित्रा 4G-G',I-I'',मूवी 1)निकलने कीअधिक संभावना है। इष्टतम नमूने वे हैं जो पकवान पर खड़ी उन्मुख होते हैं, पूर्वकाल-पीछे की धुरी के साथ एक घड़ी के चेहरे(चित्रा 3जी)पर 12 और 6 बजे के साथ लाइन में। उप-इष्टतम नमूने वे हैं जो इस धुरी पर उन्मुख नहीं हैं, जैसे कि वे जो क्षैतिज या विकर्ण(चित्रा 3H)हैं। ये नमूने इमेजिंग फ्रेम से बाहर हो जाएंगे क्योंकि टाइमलैप्स आय होती है और इसका उपयोग आगे के विश्लेषण के लिए नहीं किया जा सकता है(चित्रा 4H-H',J-J''))।

एक टाइमलैप्स डेटासेट प्राप्त करना जो भविष्य के विश्लेषण के लिए उपयुक्त है
भ्रूण है कि सही इंजेक्शन, उठाया, और घुड़सवार सफल confocal छवि नमूनों के लिए कर देगा । चित्रा 4 टाइमलैप्स के लिए एक इष्टतम नमूना दिखाता है: फ्लोरेसेंस भी है, और नमूना 12 एचपीएफ है। इमेजिंग के लिए जेड-स्टैक को इस तरह सौंपा गया है कि पहला टुकड़ा ऑप्टिक वेसिकल के लिए सिर्फ पृष्ठीय है, जबकि अंतिम टुकड़ा 12 एचपीएफ ऑप्टिक वेसिकल(चित्रा 4G-G''की वेंट्रल सीमा से परे कई स्लाइस छोड़ताहै। वेंट्रल पक्ष की ओर यह पूर्वाग्रह वेंट्रल दिशा में ऊतक विकास के लिए अतिरिक्त स्थान प्रदान करता है। इन कारकों, जब मिले, एक इष्टतम timelapse में परिणाम(चित्रा 4I-मैं'',फिल्म 1)। एक उप-इष्टतम नमूना में मोज़ेक या मंद फ्लोरेसेंस है, पहले से ही पिछले 12 एचपीएफ विकसित कर चुका है (जब ऑप्टिक कप मॉर्फोजेनेसिस चल रहा है), या जेड-स्टैक या एक्सआई फ्रेम(चित्रा 4H-एच''में खराब स्थिति में स्थित है)। जब इन मानदंडों को पूरा नहीं किया जाता है, तो टाइमलैप्स अब ऊतक की पूरी 3डी मात्रा को कैप्चर नहीं करेगा क्योंकि यह विकसित होता है और आगे के विश्लेषण के लिए उपयोग नहीं किया जा सकता है(चित्रा 4J-J'')।

Figure 1
चित्रा 1:जेब्राफिश ऑप्टिक कप मॉर्फोजेनेसिस के 4डी टाइमलैप्स इमेजिंग का वर्कफ्लो। (ए)फ्लोरोसेंटली रूप से ब्याज की उपकोशिकीय संरचनाओं को लेबल करना, उपयुक्त छाया हुए mRNAs को संश्लेषित करना। (B)माइक्रोइंजेक्ट एमआरएनए (1-सेल चरण में जेब्राफिश भ्रूण में) । (ग)भ्रूण को एक उल्टे कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप के लिए डोरस्ली, या हेड-डाउन, ऑप्टिक वेसिकल चरण में, ~ 11 एच पोस्ट निषेचन या 3 सोमाइट-स्टेज पर रखा जाता है। (घ)एक ही टाइमलैप्स इमेजिंग सत्र के दौरान कई भ्रूण क्रमिक रूप से इमेज डे किए जा सकते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2:माइक्रोइंजेक्टिंग के लिए एक दृश्य गाइड 1-सेल जेब्राफिश भ्रूण। (ए)आइटम एक इंजेक्शन किट (दक्षिणावर्त) में शामिल करने के लिए: मध्यम आकार का बॉक्स जो डिस्पोजेबल नाइट्राइल दस्ताने के साथ पूरी किट को पकड़ सकता है; माइक्रोइंजेक्शन सुइयों वाला एक व्यंजन; संदंश; खनिज तेल का एक बहाना और पैराफिल्म के वर्गों को काट दिया; माइक्रोलोडिंग टिप्स; बर्फ पर पतला आरएनए; एगर उठे इंजेक्शन मोल्ड; मार्कर; रोलर/ट्रांसफर पिपेट; और P10 पिपेट। (ख)माइक्रोइंजेक्शन सेट-अप: एक पिको-इंजेक्टर के बगल में एक विच्छेदन माइक्रोस्कोप जो बाहरी संकुचित गैस स्रोत से जुड़ा होता है। पिको-इंजेक्टर से एक फुट पेडल और माइक्रोमैनीपुलेटर जुड़े होते हैं। माइक्रोमैनीपुलेटर एक सुई धारक से लैस है और माइक्रोस्कोप चरण के ऊपर जगह में तैनात है। (ग)एक एगर उठे इंजेक्शन मोल्ड जिसमें एक तरफ ९० डिग्री कोण के साथ खांचे की छह पंक्तियां और दूसरी तरफ ४५ डिग्री का कोण होता है । (घ)पिको-इंजेक्टर फ्रंट पैनल । दबाव प्रदर्शन 7.8 साई पढ़ता है; इस घुंडी लेबल पीइंजेक्टसाथ समायोजित किया जा सकता है . नीचे, इंजेक्शन के समय को बदलने, या सुई में तरल को साफ करने, भरने या पकड़ने के लिए मैन्युअल रूप से दबाव को ट्रिगर करने के लिए पुशबटन हैं। इंजेक्ट समय 08 (8 x 10 मेससेक के बराबर) के लिए निर्धारित है। एक आउटपुट नली पीआउट से जुड़ी होती है और इंजेक्शन सुई से जुड़ी होती है। इंजेक्शन प्रेशर सेट करते समय प्रेशर मीटर सोर्स स्विच पीइंजेक्ट करने के लिए सेट किया जाता है, और इंजेक्शन नहीं बनाए जाने पर सुई पर लागू बेसल प्रेशर को एडजस्ट करने के लिए इसे पीबैलेंस पर स्विच किया जा सकता है । पीबैलेंस रेगुलेटर पीइंजेक्ट रेगुलेटर के बगल में है। मशीन चालू होने का संकेत देने के लिए पावर बटन जलाया जाता है। (ई)वयस्क जेब्राफिश छोटे प्रजनन टैंकों में संभोग किया जाता है जिसमें जाल नीचे के साथ एक नेस्टेड टैंक होता है जो वयस्क मछली को निषेचित अंडों से अलग करता है और आसान संग्रह की अनुमति देता है। जल स्तर उथले पानी की स्थिति की नकल करने के लिए कम है और टैंक डिवाइडर संभोग व्यवहार शुरू करने के लिए हटा रहे हैं । (एफ)माइक्रोपिपेट (सुई) पुलर फ्रंट पैनल: में एक डिस्प्ले होता है जो सुइयों को खींचने के लिए इस्तेमाल की जाने वाली विशिष्ट स्थितियों को दिखाता है । दबाव सेटिंग पी = 500 है, इसके बाद कार्यक्रम को संपादित करने की अंतिम तिथि और समय, कार्यक्रम संख्या, हीट = 546, पुल = 130, VEL = 70, और समय = 90। (जी)एक ग्लास केशिका माइक्रोपिपेट (सुई) खींचने वाले में डाला जाता है और जगह में सुरक्षित होता है । प्रत्येक प्रोग्राम किए गए पुल रन के परिणामस्वरूप दो लंबी पतला सुई (लाल एरोहेड) होती है। (ज)आरएनए कमजोर पड़ने को सुई में बैकलोड किया जाता है; फिनॉल रेड डाई समाधान के आसान दृश्य की अनुमति देता है। (I)सुई की नोक को तोड़ने के बाद, आरएनए के बोलस को विच्छेदन गुंजाइश पर एक आईपीस रेटिकल का उपयोग करके मापा जाता है। इस स्टीरियोमाइक्रोस्कोप के लिए 30x कुल आवर्धन 6 हैश मार्क्स 1 एनएल वॉल्यूम के बराबर है। (जम्मू)उर्वरित अंडे को एगरेंग इंजेक्शन मोल्ड में लोड किया जाता है और रोलर पिपेट का उपयोग करके मोल्ड के गर्त के साथ वितरित किया जाता है। (K)एक सेल स्टेज भ्रूण युक्त इंजेक्शन मोल्ड माइक्रोस्कोप के नीचे तैनात है और भ्रूण क्रमिक रूप से इंजेक्शन हैं । (L)इंजेक्शन सुई एकल कोशिका को लक्षित करने वाले प्रत्येक भ्रूण में डाला जाता है। (एम)एक बार कोशिका में, पैर पेडल का उपयोग दबाव की विनियमित मात्रा को ट्रिगर करने और आरएनए के 1 एन एल को भ्रूण की कोशिका में छोड़ने के लिए किया जाता है (जैसा कि फिनोल लाल द्वारा कल्पना की गई है)। स्केल बार: मैं = 0.1 मिमी; एल, एम = 0.5 मिमी. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्रा 3:इमेजिंग के लिए बढ़ते भ्रूण के लिए एक दृश्य गाइड। (ए)बढ़ते सेट अप (बाएं से दाएं): 42 डिग्री सेल्सियस तक प्रोग्राम किया गया एक हीट ब्लॉक, कम पिघले हुए एगर की हीटिंग ट्यूब; एक रोलर पिपेट; एक जोड़ी संदंश; एक एगर उठे लेपित पकवान जिसमें डिकोरियोनेटेड भ्रूण होते हैं; और एक धातु हैलिड फ्लोरोसेंट लैंप से जुड़ा एक विच्छेदन स्टीरियोमाइक्रोस्कोप। (B,B',B'') एक 11 एचपीएफ भ्रूण EGFP-CAAX mRNA और mCherry-H2A mRNA के साथ इंजेक्शन, ब्राइटफील्ड, GFP फ्लोरेसेंस और mCherry फ्लोरेसेंस के तहत दिखाया गया है, क्रमशः । (C,C') एक ग्लास पाश्चर पिपेट जिसमें एगर उठे और टिप में बैठे भ्रूण; सी ' एक बढ़ाया दृश्य है । (D,D') एक भ्रूण कम पिघल की एक बूंद में घुड़सवार एक गिलास तली हुई डिश पर उठी, माइक्रोस्कोप के मंच से और माइक्रोस्कोप आईपीस के माध्यम से दोनों देखा । (ई, ई') 12 भ्रूण कम पिघल agarose की व्यक्तिगत बूंदों में घुड़सवार एक गिलास तली हुई डिश पर उठी, दोनों माइक्रोस्कोप के मंच से और माइक्रोस्कोप आईपीस के माध्यम से देखा । (F,F',F',F'' सभी घुड़सवार भ्रूण पकवान के नीचे भरने के लिए एगर उठे की एक पूरी परत के साथ मढ़ा जाता है, दोनों माइक्रोस्कोप के चरण से और चमकीले क्षेत्र में दिखाए गए माइक्रोस्कोप आईपीस से देखा जाता है; एफ'' जीएफपी फ्लोरेसेंस; और एफ ''म्हेरी फ्लोरेसेंस। (जी)12 एचपीएफ में एक इष्टतम नमूना एक ही विमान में दोनों ऑप्टिक वेसिकल्स के साथ 12 और 6 बजे के साथ लाइन में पृष्ठीय और उन्मुख खड़ी है । (ज)एक उप-इष्टतम नमूना: हालांकि डोरसैली और ऑप्टिक वेसिकल्स एक दूसरे के साथ विमान में हैं, यह नमूना विकर्ण धुरी पर उन्मुख है और विकास आय के रूप में फ्रेम आकार से बाहर हो जाएगा। (I)एक उप-इष्टतम नमूना: यह नमूना अधिक घुमाया जाता है और पृष्ठीय माउंट नहीं होता है, नतीजतन, ऑप्टिक वेसिकल के पूर्वकाल भाग को टाइमलैप्स में कैप्चर नहीं किया जाएगा। (जम्मू)एक उप-इष्टतम नमूना: इस नमूने को घुमाया जाता है न कि पृष्ठीय माउंट, नतीजतन ऑप्टिक वेसिकल के पीछे के हिस्से को टाइमलैप्स में कैप्चर नहीं किया जाएगा। बिंदीदार रेखाएं प्रत्येक ऑप्टिक वेसिकल को इंगित करती हैं। स्केल बार: बी = 0.1 मिमी; D'= 1.5 मिमी; ई', एफ ' = 2.5 मिमी; जी = 0.1 मिमी. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
अंक 4: एक ाधिक स्थिति टाइमलैप्स और संभावित परिणामों की स्थापना। (एक) लेजर स्कैनिंग कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप। (B) पीजो जेड-स्टेज डालने। (C) एगरेग्ड में एम्बेडेड भ्रूण युक्त ग्लास बॉटम डिश के नीचे पानी के अपवर्तक सूचकांक से मेल खाने वाले विसर्जन माध्यम में लेपित किया जाता है । (D) विसर्जन माध्यम की एक बूंद 40x डब्ल्यू उद्देश्य (लंबी कार्य दूरी) पर रखा गया है। (E) पकवान मंच डालने के साथ जगह में आयोजित किया जाता है, E3 agarose परत के शीर्ष पर जोड़ा जाता है, और ढक्कन मॉडलिंग मिट्टी के साथ सुरक्षित है । (F) अधिग्रहण सॉफ्टवेयर सेटिंग्स: वांछित लेजर लाइनों ड्रॉप-डाउन मेनू से चालू कर रहे हैं। EGFP-CAAX आरएनए और H2A-mCherry आरएनए के साथ इंजेक्शन भ्रूण के लिए, आर्गन और DPSS 561-10 लेजर चालू कर रहे हैं । लाल हाइलाइट इंगित करता है कि आर्गन लेजर वार्मिंग कर रहा है। उद्देश्य पर नमूने का पता लगाने के लिए, प्रेषित प्रकाश माइक्रोस्कोप नियंत्रण कक्ष के माध्यम से चालू किया जाता है। EGFP और mCherry दोनों को ट्रैक 1 (एक साथ इमेजिंग के लिए) सौंपा गया है और प्रत्येक डिटेक्टर की सीमा निर्धारित की गई है। यहां, ईजीएफपी रेंज 494-545 एनएम के लिए सेट है, और mCherry रेंज 598-679 एनएम करने के लिए सेट है । के तहत चैनल मेनू, लेजर पावर सेट किया जा सकता है। लेजर गर्म होने के बाद, बिजली को 5.0 तक बढ़ाया जा सकता है, और लाभ (मास्टर) समायोजित किया जा सकता है। पिनहोल 60.2 पर सेट किया गया है, जो 1.63 हवादार इकाइयों या 1.6 माइक्रोन अनुभाग के बराबर है। के तहत प्राप्ति मेनू, फ्रेम आकार 512 x 384 के लिए सेट किया गया है, स्कैन गति 9.0 है, औसत द्विदिशात्मक है, और ज़ूम 0.7 करने के लिए सेट है। के तहत जेड-स्टैक मेनू, जेड-एक्सिस में पहली और आखिरी पोजीशन सेट की जाती है जबकि कॉन्फोकल स्कैनिंग होती है । अंतराल (चरण आकार) 2.1 माइक्रोन करने के लिए सेट है। पहले और अंतिम जेड-स्थिति का चयन करते समय, 63 स्लाइस की एक मानक संख्या आम तौर पर बनाए रखी जाती है; यह आंख के समग्र विकास को समायोजित करता है। "उपयोग पीजो" विकल्प का चयन किया गया है। के तहत पदों मेनू, प्रत्येक चयनित स्थिति एक सौंपा संख्या और एक्स, वाई, और जेड स्थिति सहित सूचीबद्ध है । ऐड, अपडेट या रिमूवल सहित इमेज में भ्रूण (अलग-अलग पोजिशन) की संख्या को नियंत्रित करने के लिए अतिरिक्त बटन हैं। के तहत टाइम सीरीज मेनू, चक्र 300 (जेड-स्टैक की संख्या जो अधिग्रहीत किया जाएगा) और अंतराल (समय चरण) 2.5 मिनट के लिए सेट किया गया है। एक बार सेटिंग्स को अंतिम रूप दे दिया जाता है, शुरू करके टाइमलैप्स अधिग्रहण शुरू किया जाता है। सॉफ्टवेयर जेड-स्टैक, चक्र और वर्तमान में स्कैनिंग की स्थिति का टुकड़ा दिखाएगा। जब टाइमलैप्स पूरा हो जाता है, तो फ़ाइल में फ्लॉपी डिस्क आइकन पर क्लिक करके सेव किया जाता है छवियां और दस्तावेज़ पैनल। (G-J) कोशिका झिल्ली (green) ईजीएफपी-सीएएएक्स और सेल न्यूक्लियी (क्रोमेटिन, magenta) H2A-mCherry RNAs के साथ लेबल कर रहे हैं । (जी, जी',जी'') एक इष्टतम घुड़सवार नमूने के लिए पहला और आखिरी जेड-स्लाइस स्थापित करने का एक उदाहरण। पहला जेड-स्लाइस (पृष्ठीय पक्ष पर) पृष्ठीय एक्टोर्म की कीमत पर आता है, जबकि अंतिम जेड-स्लाइस (वेंट्रल साइड पर) ऑप्टिक वेसिकल से काफी नीचे है, वेंट्रल दिशा में इसके विकास को समायोजित करने के लिए। (एच, एच', एच'') एक उप-इष्टतम नमूने का पहला और अंतिम जेड-स्लाइस स्थापित करने का एक उदाहरण। नमूने में कमजोर रीचेरी फ्लोरेसेंस है और यह तिरछे रूप से घुड़सवार है, जैसे कि विकासशील ऑप्टिक कप टाइमलैप्स की अवधि के लिए फ्रेम में रहने की संभावना नहीं है। (मैं, मैं',मैं',मैं'।) इष्टतम नमूने से टाइमलैप्स का एक उदाहरण। जेड-स्टैक के बीच से एकल स्लाइस छवियां पूरे 63 स्लाइस वॉल्यूम से 4 समय बिंदुओं (टी वैल्यू) पर ली जाती हैं। बीआर, मस्तिष्क; एनआर, न्यूरल रेटिना; आरपीई, रेटिना पिगमेंटेड एपिथेलियम; ले, लेंस। (जम्मू, जे',जे',जे'') एक उप-कीटनाशक नमूने से एक टाइमलैप्स का एक उदाहरण। इस मामले में, नमूना जेड-प्लेन से बाहर चला गया और पूर्वकाल ऑप्टिक कप के केवल एक तिरछे हिस्से पर कब्जा कर लिया गया। स्केल बार: जी, मैं = 50 माइक्रोन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

फिल्म 1: एक इष्टतम जंगली प्रकार के भ्रूण में ऑप्टिक कप मॉर्फोजेनेसिस का टाइमलैप्स। एक जंगली प्रकार के भ्रूण का एक पृष्ठीय दृश्य जिसे ईजीएफपी-सीएएएक्स (प्लाज्मा झिल्ली, हरे)और एच2ए के साथ लेबल किया जाता है। एफ/जेड-रीचरी (क्रोमेटिन, मजेंटा)। टाइमलैप्स ~ 12-24 एचपीएफ से है और इसमें पूरे 4डी डेटासेट से एक ही कॉन्फोकल सेक्शन होता है। समय अंतराल जेड-स्टैक के बीच 2.5 मिनट है और इसे प्रति सेकंड 22.5 फ्रेम पर दिखाया गया है। कृपया इस फिल्म को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।

Discussion

यहां, हम ऑप्टिक कप मॉर्फोजेनेसिस के टोटो लेबलिंग और 4D टाइमलैप्स इमेजिंग के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं। हम विभिन्न उपकोशिकीय डिब्बों को चिह्नित करने के लिए कैप्ड आरएनए एन्कोडिंग फ्लोरोसेंट प्रोटीन पैदा करने की प्रक्रिया के माध्यम से कदम बढ़ाते हैं; जेब्राफिश 1-सेल भ्रूण इंजेक्शन; मल्टीप्लेक्स इमेजिंग के लिए एगर में 11 एचपीएफ भ्रूण एम्बेड; और ऑप्टिक कप मॉर्फोजेनेसिस (12-24 एचपीएफ) की अवधि के लिए कई भ्रूणों के 4डी डेटासेट प्राप्त करना।

असंख्य सवालों के जवाब इन जानकारियों-घने डेटासेट के साथ दिए जा सकते हैं । 4D डेटा की कल्पना की जा सकती है और मात्रात्मक रूप से विभिन्न तरीकों से विश्लेषण किया जा सकता है। हालांकि इस प्रोटोकॉल के दायरे के बाहर, हम यहां अपने लक्ष्यों और मानक अनुप्रयोगों के प्रकार है कि पूरा किया जा सकता है की एक उदाहरण के रूप में शामिल हैं । बेशक, मात्रात्मक छवि विश्लेषण विधियों को लगातार विकसित किया जा रहा है, और व्यावसायिक रूप से उपलब्ध और कस्टम-निर्मित उपकरण दोनों का उपयोग किया जा सकता है। यदि किसी ने पहले इस तरह के तरीकों का उपयोग नहीं किया है, तो किसी को यह सुनिश्चित करने के लिए कुछ अनुकूलन के माध्यम से काम करने के लिए तैयार रहना चाहिए कि अधिग्रहीत डेटासेट पसंद के मात्रात्मक विश्लेषण दृष्टिकोण के लिए पर्याप्त हैं।

फ़ाइलों के आकार के कारण 4D डेटासेट का कल्पना और मात्रात्मक मूल्यांकन करना चुनौतीपूर्ण हो सकता है। अधिग्रहण सॉफ्टवेयर का उपयोग डेटासेट को व्यक्तिगत भ्रूण में अलग करने के लिए किया जा सकता है, और इमेजजे/फिजी का उपयोग वाणिज्यिक प्रारूपों से कॉन्फोकल फाइलों को अधिक मानक टिफ स्टैक में बदलने के लिए किया जा सकता है, जिसमें प्रत्येक समय बिंदु को एक अलग फ़ाइल के रूप में सहेजा जाता है। इससे फाइल साइज कम हो जाएगा और फाइल फॉर्मेट का मानकीकरण हो जाएगा। प्रत्येक टाइमपॉइंट से व्यक्तिगत ऑप्टिकल अनुभागों को इमेजजे/फिजी का उपयोग करके 2D (XY) टाइमलैप्स के रूप में इकट्ठा किया जा सकता है, जिससे डेटा का तेजी से 2D विज़ुअलाइज़ेशन और मूल्यांकन सक्षम होता है। फिल्म 1 ठीक इसका एक उदाहरण है: समय के साथ एक ऑप्टिकल अनुभाग चित्रा 4Iमें दिखाए गए इष्टतम नमूने के समय के रूप में इकट्ठाहुआ -I''। वहां से, 3D और 4D विज़ुअलाइज़ेशन के लिए, हम आमतौर पर FluoRender35, 36का उपयोग करते हैं, जो स्वतंत्र रूप से उपलब्ध है लेकिन विशिष्ट ग्राफिक्स कार्ड आवश्यकताएं हैं। FluoRender का उपयोग करके, कोई भी किसी भी धुरी में 3D-प्रदान किए गए डेटा को घुमा सकता है, समय के साथ 4D में डेटासेट की कल्पना कर सकता है, किसी भी विमान में कटवे उत्पन्न कर सकता है, और घूर्णन और दृश्यों को फिल्म या टीफ छवियों की श्रृंखला के रूप में सहेज सकता है।

मात्रात्मक विश्लेषण के संदर्भ में, कई सवालों के जवाब दिए जाने हैं । हमने ऑप्टिक कप मॉर्फोजेनेसिस में अंतर्निहित सेल व्यवहारों को समझने के अपने विशिष्ट लक्ष्यों की सहायता करने के लिए सॉफ्टवेयर इन-हाउस विकसित किया है। हमारा कार्यक्रम, LongTracker,13कोशिकाओं को ट्रैक करने की स्थिति के लिए एक प्रॉक्सी के रूप में परमाणु संकेत का उपयोग करता है । इन डेटा के साथ, हम यह निर्धारित कर सकते हैं कि कोशिकाएं कब, कहां और कैसे आगे बढ़ती हैं; कोशिकाएं कितनी तेजी से और कितनी दूर तक बढ़ती हैं; और कितनी बार कोशिकाओं को विभाजित। हमारे अपने सॉफ्टवेयर के अलावा, 4D सेल ट्रैकिंग के लिए कई व्यावसायिक रूप से उपलब्ध और कस्टम-निर्मित विकल्प हैं। हमने कोशिका विभाजन को पूरा करने और तंत्रिका रेटिना37के भीतर सेल आकार और संगठन की मात्रा निर्धारित करने के लिए कार्यक्रम लोंगएक्सिस भी विकसित किया है। LongAxis में डेटासेट इनपुट, हालांकि, एकल जेड-स्टैक हैं, जो एक उच्च रिज़ॉल्यूशन पर लिए गए हैं। एक लगातार चुनौती उच्च पर्याप्त संकल्प के साथ टाइमलैप्स डेटासेट उत्पन्न कर रही है कि कोशिकाओं को आत्मविश्वास और उनके आकृति विज्ञान बाहोपित के साथ खंडित किया जा सकता है। एक विकल्प मोज़ेक (विरल) लेबलिंग है जो सेल आकार के प्रत्यक्ष दृश्य के लिए काडे जैसे फोटोकंवर्टिबल फ्लोरोफोर का उपयोग करके लेबलिंग करता है, जैसा कि हमने और अन्य लोगों ने विकासशील आंख8,11,13में किया है। यह सेल विभाजन की समस्या को सरल बनाता है, और फ्लोरेंडर में 3डी प्रतिपादन के माध्यम से सेल आकार और आकार को आसानी से निर्धारित किया जा सकता है।

इस प्रोटोकॉल के प्रत्येक चरण को विशेष रूप से हमारे उद्देश्यों के लिए अनुकूलित किया गया था। इस प्रोटोकॉल की विशिष्टता के परिणामस्वरूप कई सीमाएं होती हैं: प्रोटोकॉल, जैसा कि लिखा गया है, जेब्राफिश नेत्र विकास (जैसे रेटिना न्यूरोजेनेसिस), अन्य आंखों की संरचनाओं, अन्य विकासात्मक चरणों, या अन्य उपकोशिकीय डिब्बों के अन्य पहलुओं को इमेजिंग के लिए अनुकूलित नहीं किया गया है। एम्बेडिंग का अभिविन्यास, इमेजिंग की गति, और लेबल सभी हमें हमारे जैविक सवालों के जवाब देने के लिए डिज़ाइन किए गए हैं। रेटिना न्यूरोजेनेसिस को इमेज करने के लिए, उदाहरण के लिए, यहां वर्णित भ्रूण का पृष्ठीय अभिविन्यास ब्याज की विशिष्ट विशेषताओं के दृश्य के लिए अनुमति नहीं दे सकता है, और इमेजिंग की गति उचित नहीं हो सकती है। प्रोटोकॉल के कई पहलुओं को किसी के विशिष्ट हितों और लक्ष्यों के आधार पर विभिन्न आवश्यकताओं के लिए अनुकूलित और संशोधित किया जा सकता है। सबसे पहले, आरएनए इंजेक्शन का उपयोग करने से लेबलिंग प्रक्रिया बहुत लचीली हो जाती है। फ्लोरोसेंट प्रोटीन फ्यूजन निर्माण का उपयोग ब्याज की उपकोशिकीय संरचनाओं को लेबल करने के लिए किया जा सकता है, और आरएनए इंजेक्शन राशि लेबलिंग को अनुकूलित करने के लिए भिन्न हो सकती है। फोटोकंवर्टिबल फ्लोरोफोर काडे के साथ हमारे काम के आधार पर, आरएनए इंजेक्शन अनुवाद के एक फट का समर्थन करते दिखाई देते हैं जो 12 एचपीएफ11,13से खत्म हो गया है। आरएनए इंजेक्शन से फ्लोरोसेंट प्रोटीन अभिव्यक्ति के उच्च स्तर फोटोब्लीचिंग का मुकाबला कर सकते हैं, लेकिन इस तरह के एक दृष्टिकोण ब्याज के फ्लोरोसेंट लेबल की निरंतर अभिव्यक्ति का समर्थन नहीं करता है । यदि निरंतर अभिव्यक्ति आवश्यक है, जैसे कि बाद के चरणों में इमेजिंग भ्रूण, ट्रांसजेनिक लाइनें एक विकल्प हैं, और जेब्राफिश में नई लाइनों का निर्माण24सीधा है।

इसके बाद, प्रोटोकॉल को विकास के बाद के चरणों के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। चूंकि वर्णक बाद के चरणों में इमेजिंग में बाधा डाल सकता है, इसलिए वर्णक संश्लेषण के लिए भ्रूण (पीटीयू) के साथ भ्रूण का इलाज किया जा सकता है, या वर्णक संश्लेषण के लिए आनुवंशिक म्यूटेंट का उपयोग किया जा सकता है। भ्रूण हिल को रोकने के लिए, ट्राइकेन को एगर उठे और भ्रूण मीडिया ओवरले समाधानों में जोड़ा जा सकता है, और प्रतिशत agarose को आवश्यक के रूप में समायोजित किया जा सकता है। जैसे-जैसे आंख बढ़ती है, बढ़ते अभिविन्यास को बदलना आवश्यक हो सकता है; यहां, हम भ्रूण को पृष्ठीय रूप से माउंट करते हैं, लेकिन बाद के चरणों में, ब्याज की संरचना के आधार पर, पार्श्व या पूर्वकाल में माउंट करना अधिक समझ में आ सकता है। चूंकि विभिन्न स्थानिक और लौकिक तराजू पर विभिन्न प्रक्रियाएं होती हैं, इसलिए कोई भी छवि अधिग्रहण के जेड-स्टेप और समय चरण को अनुकूलित कर सकता है। इन सुविधाओं को वास्तव में केवल प्रत्येक प्रयोगशाला की जरूरतों के लिए अनुभवजन्य रूप से निर्धारित किया जा सकता है ।

अंत में, इस प्रोटोकॉल को विशेष रूप से लेजर स्कैनिंग कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप के लिए विकसित किया गया था, जिसमें भ्रूण आंखों के विकास के प्रारंभिक चरण में एगर उठे के अपेक्षाकृत उच्च प्रतिशत में एम्बेडेड था। यदि कोई आंखों के विकास के दौरान अलग-अलग समय या विभिन्न स्थानों पर इमेजिंग कर रहा है, तो इस प्रोटोकॉल को ब्याज की प्रक्रिया के लिए अनुकूलित करने की आवश्यकता होगी। कई अलग-अलग इमेजिंग दृष्टिकोण वर्तमान में संभव हैं, ऑप्टिकल इंजीनियरों द्वारा अधिक विकसित किए जा रहे हैं। प्रत्येक दृष्टिकोण विभिन्न फ़ाइल आकारों और प्रारूपों के लिए, इमेजिंग के लिए भ्रूण को एम्बेड और माउंट करने के विभिन्न तरीकों से चुनौतियों का अपना सेट लाता है। हम अनुकूलन प्रक्रिया का मार्गदर्शन करने के लिए परिचय में विचारों को रेखांकित करते हैं, जिसमें अधिकतम स्थानिक और लौकिक संकल्प फोटोब्लैचिंग, फोटोटॉक्सिसिटी और विशाल फ़ाइल आकारों के साथ संतुलित होते हैं। हमें आशा है कि इन सामांय सिद्धांतों, व्यावहारिक ऊपर वर्णित जानकारी के अलावा, आंख के विकास में कई खुले सवालों का अध्ययन करने के लिए timelapse इमेजिंग दृष्टिकोण स्थापित करने में दूसरों की सहायता करेगा ।

Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

हम इस प्रोटोकॉल के टाइमलैप्स दृष्टिकोण और चर्चाओं पर काम के लिए क्वान लैब के अतीत और वर्तमान सदस्यों के आभारी हैं। इस काम को एनआईएच (R01 EY025378 और R01 EY025780 से केएमके) द्वारा समर्थित किया गया था; F31 EY030758 SL के लिए; और T32 GM007464 मैक के लिए) ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Delta TPG Dish 0.17mm clear Bioptechs 0420041500C coverglass bottom for optical compatibility
Disposable Pasteur Pipettes VWR 14672-608 overall length 14.6 cm (53/4")
Dumont #5, #55, or #5SF Forceps Fine Science Tools 11254-20 For style #5: straight tip, 0.05 x 0.01 mm tip, inox, 11 cm long
Flaming/Brown Micropipette Puller Sutter P-97
Immersol W Carl Zeiss Microscopy 4449690000000 immersion fluid for water-emission objectives, halogen-free, low fluorescence
Microinjection Mold Adaptive Science Tools TU-1 Six ramps, one 90 degree and one 45 degree beveled side.
Microloader Tips Eppendorf 930001007 Microloader, tip for filling glass microcapillaries, 0.5 – 20 µL
mMessage mMachine SP6 Transcription Kit Invitrogen AM1340 contains SP6 Enzyme Mix, 10X Reaction Buffer, 2XNTP⁄CAP Solution, GTP Solution, pTRI-Xef, TURBO DNase, Ammonium Acetate Stop Solution, Lithium Chloride Precipitation Solution, and Gel Loading Buffer and are all stored at –20°C. Nuclease-free Water may be stored at any temperature.
Nikon SMZ645 Stereo Microscope Nikon SMZ645 used for injecting embryos (see Fig. 2B)
NotI-HF enzyme NEB R3189S comes with Gel Loading Dye, Purple (6X)
NuSieve GTG Agarose Lonza 50081 fine resolution, low melt agarose
Objective LD "C-Apochromat" 40x/1.1 W Korr M27 Carl Zeiss Microscopy 421867-9970-000
Olympus SZX16 Stereo Microscope Olympus SZX2-ZB16 used for screening, embedding embryos (see Fig. 3A)
Phenol red solution Sigma-Aldrich P0290 0.5% in DPBS, sterile filtered, endotoxin tested, cell culture tested
Pico-liter Microinjector Harvard Apparatus PLI-100 Femtoliter to microliter injections; digital readouts for injection count, time, and pressure; contains 5 pressures including inject, balance, clear, fill, and hold
Pipette Pump Pipettor SP Bel-Art F37898 fits a disposable pasteur pipette, contains thumbwheel on side for aspirating or dispensing and plunger for quick emptying
Premium Thin Wall Borosilicate Glass Capillaries Warner Instruments G100T-4 1.0 x 0.78 mm
QIAquick PCR Purification Kit Qiagen 28106 contains QIAquick Spin Columns, Buffers, Collection Tubes (2 ml)
RNase-free H2O Invitrogen AM9906 DNase-Free, Molecular Biology Grade, RNase-Free
RNeasy Mini Kit Qiagen 74104 contains RNeasy Mini Spin Columns, Collection Tubes (1.5 ml and 2 ml), RNase-free Reagents and Buffers
Stage Attachment Z PIEZO WSB 500 Carl Zeiss Microscopy 432339-9000-000
Stage Insert Z PIEZO WSB Universal Carl Zeiss Microscopy 432339-9030-000
Zeiss LSM 880 with Airyscan Carl Zeiss Microscopy N/A inverted Axio Observer microscope
Zen Black 2.3 SP1 software Carl Zeiss Microscopy N/A Zeiss Efficient Navigation (ZEN) controls all light microscope systems from Zeiss

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References

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Lusk, S., Casey, M. A., Kwan, K. M. 4-Dimensional Imaging of Zebrafish Optic Cup Morphogenesis. J. Vis. Exp. (171), e62155, doi:10.3791/62155 (2021).

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