Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

4-dimensjonal bildebehandling av sebrafiskoptisk kopp morfogenese

Published: May 26, 2021 doi: 10.3791/62155
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Human Genetics, University of Utah

Summary

Denne protokollen beskriver en tilnærming for in toto merking og flerdimensjonal avbildning av sebrafisk tidlig øyeutvikling. Vi beskriver merking, innebygging og firedimensjonal (4D) avbildning ved hjelp av laserskanning av konfokal mikroskopi, og vurderinger for optimalisering av innsamling av datasett for dissekeringsmekanismer for optisk koppmorfogenese.

Abstract

Visuell systemfunksjon krever etablering av presise vevs- og organstrukturer. I virveldyrøyet er strukturelle feil en vanlig årsak til synshemming, men mekanismer for øyemorfogenese er fortsatt dårlig forstått. Den grunnleggende organiseringen av det embryonale øyet er bevart gjennom vertebrater, og dermed har levende avbildning av sebrafiskembryoer blitt en kraftig tilnærming for å direkte observere øyeutvikling i sanntid under normale og patologiske forhold. Dynamiske celleprosesser, inkludert bevegelser, morfologier, interaksjoner, divisjon og død, kan visualiseres i embryoet. Vi har utviklet metoder for jevn merking av subcellulære strukturer og timelapse konfektmikroskopi av tidlig øyeutvikling i sebrafisk. Denne protokollen skisserer metoden for å generere capped mRNA for injeksjon i 1-cellers sebrafiskembryo, montere embryoer på optisk vesicle stadium (~ 12 timer etter befruktning, HPF), og utføre flerdimensjonal tidsforløpavbildning av optisk koppmorfogenese på et laserskanning konfokalt mikroskop, slik at flere datasett er anskaffet sekvensielt i samme bildebehandlingsøkt. En slik tilnærming gir data som kan brukes til en rekke formål, inkludert cellesporing, volummålinger, tredimensjonal (3D) gjengivelse og visualisering. Våre tilnærminger gjør det mulig for oss å finne de cellulære og molekylære mekanismene som driver utvikling av optisk kopp, både under ville og genetiske mutantforhold. Disse metodene kan brukes direkte av andre grupper eller tilpasses for å visualisere mange ekstra aspekter ved sebrafisk øyeutvikling.

Introduction

Virveldyr øye utvikling begynner med fremveksten, eller evagination, av de optiske vesikler fra den potensielle hjernen neuroepithelium. De optiske vesiklene gjennomgår deretter en rekke vevsformendringer, forlenger og deretter invaginerer for å generere den optiske koppen. I den optiske koppen, nevral netthinnen og netthinnen pigment epitel, begge avledet fra nevroepithelium, enwrap nascent linsen, som er avledet fra overflaten ektoderm. Hele prosessen krever en kompleks serie celle- og vevsbevegelser og molekylær signalering, koordinert mellom nevroepithelium, ektoderm og mesenchymale cellepopulasjoner. Disse innledende hendelsene etablerer øyets grunnleggende struktur, og senere trinn i øyeutvikling, inkludert iris- og hornhinnedannelse, er utarbeidelser på tidlig organisering. Forstyrrelser i tidlig øyeutvikling og morfogenese ligger til grunn for mange synshemmingsforhold hos mennesker, inkludert anoftalmi, mikroftalmi og coloboma. Å låse opp de cellulære og molekylære mekanismene som styrer optisk koppmorfogenese er avgjørende for å forstå visuell systemutvikling og de patologiske forholdene som resulterer når disse prosessene går galt.

Vår forståelse av virveldyr øyeutvikling og morfogenese kom fra en enorm mengde arbeid som spenner over klassiske histologiske studier til embryologiske og genetiske tilnærminger i en rekke modellorganismer, inkludert mus, kylling, frosk og fisk1,2,3,4,5. Mens denne kroppen av arbeid etablerte molekylære mekanismer som regulerer tidlig øyeutvikling, eksisterer det historisk en dårlig forståelse av øyets morfogenese: fremveksten av 3D-strukturen. Hovedtyngden av disse funnene har kommet fra bildebehandling av seksjonerte embryoer på diskrete tidspunkter. Selv om dette er tilstrekkelig til å gi et syn på vevsmorfologi i 2 dimensjoner, er morfogenese en dynamisk 3D-prosess. For å bestemme hvordan formen på vevet endres i 3 dimensjoner over tid, hvordan enkeltceller oppfører seg, og hvordan disse atferdene bidrar til endringer i 3D-vevsform, er det nødvendig med forskjellige tilnærminger.

En løsning for å adressere dette betydelige kunnskapsgapet er levende avbildning, noe som muliggjør dynamisk observasjon av celler og vev i sanntid når orgelet tar form. Dessverre er dette ikke lett mulig i mange modellorganismer på grunn av begrensningene i embryonal utvikling. For eksempel er mus- og kyllingembryoer (utvikler seg i utero eller innenfor et eggeskall) ikke lett tilgjengelig, og mange levende embryoer er ikke optisk gjennomsiktige, noe som forårsaker betydelig lysspredning og begrenser dybden som bilder kan skaffes. Sebrafisk, med ekstern utvikling og gjennomsiktige embryoer, gir en unik mulighet til å utføre levende avbildning av øyemorfogenese6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19. Rikelig med transgene og mutante linjer er også tilgjengelige, i tillegg til verktøy for å generere nye transgener og mutanter20,21,22,23,24. Videre forekommer optisk koppmorfogenese raskt i sebrafisk, over en 12 timers tidsramme (12-24 timer etter befruktning, HPF), noe som gjør avbildning av hele prosessen mulig.

Live bildebehandlingsarbeid har blitt akselerert ved utvidelse og optimalisering av familien av fluorescerende proteiner, noe som tillater genetisk kodet vital merking av subcellulære strukturer, samt forbedringer og innovasjoner til mikroskopimetoder. Protokollen som er beskrevet her bruker laserskanning konfektmikroskopi, i stedet for andre nåværende tilnærminger til avbildning av sebrafisk embryogenese, inkludert spinnende diskkonfektmikroskopi, selektiv planbelysningsmikroskopi (SPIM og dens varianter), og andre mer spesialiserte mikroskopimetoder. For det utviklende sebrafiskøyet fant vi ut at spinnende disk konfektmikroskopi ikke var tilstrekkelig for avbildning dypere i vevet. Selv om SPIM har en ekstremt rask bildetid og blir mer utbredt, er håndtering av de store datasettene for visualisering og analyse fortsatt en utfordring. I motsetning til dette er laserskanning av konfektmikroskopi lett tilgjengelig, spesielt for personer som mangler ekspertise innen montering av optisk maskinvare. Vi håper at den brede tilgjengeligheten av laserskanning av konfektmikroskopi vil gjøre protokollen vår nyttig for mange laboratorier.

Her beskriver vi vår metode for å fange 4D-datasett av optisk koppmorfogenese, ved hjelp av toto merking av embryoet for membraner og kromatin, og et laserskanningskonfokalt mikroskop for bildeanskaffelse (skjematisert i figur 1). De fluorescerende proteinene som brukes her (EGFP-CAAX og H2A. F/Z-mCherry) ble valgt for å gi vevsmerking med encellet oppløsning. Vi bruker datasett generert med denne protokollen for en rekke bildeanalyse- og visualiseringsfunksjoner. Denne protokollen kan enkelt tilpasses hvis andre subcellulære strukturer ønskes. Plasmamembranmerking ble valgt for visualisering av celleform: Vi bruker EGFP-CAAX, der de siste 21 aminosyrene av H-ras, som fungerer som en preyleringssignalsekvens, smeltes sammen til C-terminus av EGFP13. Andre plasmamembran målrettede fluorescerende proteiner (f.eks. transmembranfusjon eller myristoyler) vil sannsynligvis fungere like bra. For å markere kjerner valgte vi H2A. F/ Z-mCherry, der mCherry er smeltet sammen til et histoneprotein13. Dette sikrer at celledeling, inkludert mititotisk spindelorientering, lett visualiseres.

Med enhver tilnærming til levende bilder må man vurdere avveininger mellom å øke bildehastigheten samtidig som man maksimerer signal-til-støy-forhold, aksial oppløsning og prøvebevaring. Vi har optimalisert metodene våre for å maksimere bildekvaliteten og antall embryoer som kan avbildes i en enkelt kjøring. Ofte er målet å bildeoptisk koppmorfogenese i et homozygot mutantembryo, som kan være fenotypisk uutslettelig fra vill type ved utbruddet av optisk koppmorfogenese og avkom av en heterozygot incross (25% av embryoene er ønsket genotype). Ved å optimalisere, og deretter multiplekse bildeinnhenting, er det økt sannsynlighet for å fange et datasett av et homozygot mutantembryo.

Tidsoppløsning, eller hvor ofte volumdata (Z-stabler) anskaffes, er et viktig aspekt ved tidsforløpavbildning. Avhengig av formålet med slike datasett, er det forskjellige krav til hastighet. I utgangspunktet ble denne protokollen utviklet for manuell 4D-cellesporing. Sporing av individuelle celler i et jevnt merket vev krever høy nok tidsoppløsning for å gi tillit til at en celle spores kontinuerlig over tid. Vi fant ut at Z-stabler av sebrafiskoptisk koppmorfogenese må anskaffes minst hver 3.1 min over 12 timer; her har vi optimalisert oppkjøpet vårt på et laserskanningskonfokalt mikroskop slik at vi kan skaffe Z-stabler på 4-5 embryoer hvert 2.5 min.

Etablering av Z-trinnstørrelse var et avgjørende skritt i protokolloptimalisering: For 3D-gjengivelse og visualisering er isotrope data ideelle, der Z-trinnstørrelsen er lik XY-pikseldimensjonen. I virkeligheten er det ekstremt vanskelig å skaffe slike tidsforløpdata med levende prøver, gitt begrensninger med bildetid og fotobleaching. Derfor er det viktig å bestemme tilstrekkelig Z-trinnstørrelse for gjengivelses- og visualiseringsbehovene til eksperimentet, og spesielt hva X: Y: Z-voxel-forholdet er nødvendig for å maksimere aksial informasjon samtidig som du opprettholder hastigheten og forhindrer fotobleaching. For denne protokollen var voxel-forholdet som ble etablert 1: 1: 3,5 (0,6 μm x 0,6 μm x 2,1 μm Z-trinns størrelse ved hjelp av et 40x langt arbeidsavstandsvann nedsenkingsmål). Når du kjøper en Z-dybde på 130-140 μm, gir dette volumdata med passende temporal oppløsning og lite fotobleaching.

Som diskutert ovenfor, er denne protokollen spesifikk for 4D-avbildning av sebrafiskoptisk koppmorfogenese, ved hjelp av embryoer i toto merket for plasmamembran og kromatin, og et laserskanning konfokalt mikroskop. Protokollen nedenfor kan enkelt tilpasses for en rekke eksperimenter og behov. For det første, med hensyn til subcellulære strukturer, kan enhver struktur som det finnes en levende cellemarkør for, avbildes. Deretter, selv om fokuset her utelukkende er på optisk koppmorfogenese, kan timelapse-avbildning tilpasses andre stadier av øyeutvikling, for eksempel neurogenese25,26,27,28,29,30,31,32,33. For avbildning senere utvikling, kan det være nødvendig å vurdere embryo immobilisering (som spontan muskelaktivitet begynner rundt 24 HPF), pigmentering (som begynner å dukke opp rundt 24 HPF), vevsstørrelse (øyet vokser betydelig i volum under neurogenese), og bildehastighet (som bør justeres avhengig av hastigheten på interesseprosessen). Alle disse hensynene kan enkelt håndteres. Protokollen er ganske fleksibel; I tillegg til detaljene i den spesifikke protokollen her, er det generelle prinsipper som vil hjelpe de som er interessert i levende avbildning av andre aspekter ved øyeutvikling.

Protocol

Alle metoder beskrevet her ved hjelp av sebrafisk er dekket under Dr. Kristen Kwans dyreprotokoll, "Cellulære og molekylære mekanismer for visuell systemutvikling i sebrafisk", og godkjent av Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) ved University of Utah.

1. Capped RNA syntese

  1. Generer DNA-malen for in vitro transkripsjon.
    1. Lineariser DNA-malen ved å fordøye 10 μg DNA i 100 μL volum av reaksjonsblandingen. En typisk reaksjon er montert som følger: fordøye 10 μg DNA ved hjelp av 3 μL enzym og 10 μL buffer, bringe reaksjonsvolumet til 100 μL med vann.
      MERK: En typisk mal for sammendrag er en pCS2-vektor, for eksempel pCS2-EGFP-CAAX eller pCS2FA-H2A.F/Z-mCherry for membranen og kromatinmerkingen som er beskrevet her. I dette tilfellet fordøyes de plasmide DNAene hver ved hjelp av enzymet NotI. Brukere bør være forsiktige med stjerneaktivitet; I dette tilfellet anbefales et high-fidelity-enzym og kommersielt tilgjengelig.
    2. Inkuber reaksjonen ved 37 °C over natten for å sikre at DNA-et fordøyes til ferdigstillelse.
    3. Rydd opp i begrensningssammendraget ved hjelp av et PCR-rensesett etter produsentens protokoll. Elute DNA med 30 μL ddH2O. Oppbevar det lineariserte DNA-et ved -20 °C og bruk etter behov.
      MERK: Mengden DNA som fordøyes og elutionvolumet gir ca. 0,3 μg/μL; Dette er tilstrekkelig for ~ 5 runder med in vitro transkripsjon, hver runde ved hjelp av ~ 2 μg DNA som mal.
  2. In vitro transkriberte kappet RNA ved hjelp av et in vitro transkripsjonssett. For pCS2-maler (som beskrevet her), bruk et SP6-sett.
    1. Sett sammen in vitro transkripsjonsreaksjonen, som følger: Fordøye 2 μg DNA-mal eller opptil 6 μL med 2 μL 10x reaksjonsbuffer, 10 μL 2x Ribonukleotidblanding og 2 μL 10x enzymblanding.
    2. Inkuber ved 37 °C i 2-4 timer eller lenger (lengre tider vil føre til større utbytte). Om ønskelig kan 1 μL enzymblanding suppleres halvveis gjennom inkubasjonsperioden.
    3. Fordøye DNA-malen ved å legge til 1 μL RNase-fri DNase og inkubere i 15 min ved 37 °C.
  3. Rens den kappede RNA ved hjelp av et RNA-rensesett etter produsentens protokoll (se Materialfortegnelse). Elute med 100 μL RNase-fri H2O.
    MERK: Tilsetning av β-mercaptoetanol er ikke nødvendig for dette programmet. Selv om metoden beskrevet i denne protokollen er enkel, kan alternative reagenser også brukes til å rense RNA.
  4. Utfell RNA.
    1. Tilsett 10 μL 3 M RNase-fri NaOAc og 2,5 volumer (~275 μL) med iskald RNase-fri 100 % EtOH til den eluterte RNA.
    2. Inkuber reaksjonen ved -20 °C i 15-30 min. Spinn i 15 min ved høy hastighet ved 4 °C for å pellets RNA.
      MERK: Pelletsen skal være synlig mot rørets vegg. Det er nyttig å merke seg hvordan røret er justert i sentrifugen på dette trinnet, for å forutsi hvor pelletsen skal være på slutten av spinnet.
    3. Fjern EtOH forsiktig med en sprøyte, vær forsiktig så du unngår oppvarming, overtørking eller løsner pelletsen. Resuspend pellet i 20 μL RNase-fri H2O.
    4. Kontroller RNA for å sikre at syntesen er vellykket. Bruk 1 μL for å analysekonsentrasjon på et spektrofotometer og kjør 0,5 μL på en 1% agarose gel for å se etter ett eller to diskrete bånd, i stedet for et smør med lav molekylvekt. Utbyttet av in vitro transkripsjonsreaksjonen skal være ~ 1 μg / μL.
    5. Aliquot og oppbevar RNA ved -20 °C eller -80 °C. RNA fortynnes ikke før umiddelbart før injeksjoner.

2. Mikroinjeksjon av 1-cellers sebrafiskembryoer

MERK: Injiser 200-300 pg per RNA for å oppnå allestedsnærværende uttrykk for kromatin og cellemembraner gjennom optisk koppmorfogenese. Forbered 5-10 μL av RNA-fortynning, og last 2,5-5 μL / nål; ekstra i tilfelle nålen går i stykker.

  1. Avanserte preparater for injeksjoner.
    1. Forbered en sprøyteformrett for å lette justering og orientering av 1-cellers embryoer for mikroinjeksjon. Smelt 2% agarose i E3 (standard embryomedium) og hell i en Petri-tallerken. Flyt forsiktig injeksjonsformen (se Materialbord) på toppen av den varme agarose for å generere avtrykket av troughs i agarose som det størkner. Når agarose størkner, fjern injeksjonsformen.
      MERK: Injeksjon mold retter kan brukes i flere måneder; dekselet i E3 og oppbevares ved 4 °C når det ikke er i bruk.
    2. Trekk mikroinjeksjon nåler. Trekk glass kapillærene til en lang kon for å lage mikroinjeksjonsnåler ved hjelp av en nåletrekkermaskin. Programmer maskinen som er spesifikk for typen kapillærer som brukes. For 1,0 x 0,78 mm borosilikat kapillærer bruk følgende program: varme = 546 °C, trekk = 130, hastighet = 70, tid = 90 (Figur 2F). Oppbevar nålene i en Petri-tallerken og fest den med modelleringsleire.
      MERK: Trekkoppskriften vil variere, avhengig av maskinen og filamentet, og nye filamenter skal alltid kalibreres. Hver runde med trekking produserer to nåler (Figur 2G); gjør dette flere ganger for å produsere nok nåler i tilfelle utilsiktede pauser og fremtidige eksperimenter.
    3. Fortynn den kappede RNA til injeksjon. Fortynn både EGFP-CAAX og H2A-mCherry RNAer til 200-300 ng/μL konsentrasjon ved hjelp av RNase-fri H2O og 1 μL fenolrød i et totalt volum på 5 μL (endelig konsentrasjon av fenolrød er 0,1%). Sveip blandingen og spinn kort ned for å samle det totale volumet. Hold den fortynnede RNA på is før injisering.
  2. Injeksjon av 1-cellers embryoer
    1. Når fisken begynner å avle, la ~ 15-20 min for å sikre at eggene blir befruktet. I løpet av denne tiden, tilbakelast nålen med 2,5-5 μL av RNA-fortynning ved hjelp av en P10 og P10 mikrolasterspisser.
    2. Bruk en picoinjector til å kalibrere nålen ved hjelp av et okularretretikale (en mikrometerkalibreringssklie er også tilstrekkelig) til å måle volumet på dråpen (volumet av en sfære = (4/3) * pi * radius^3). Juster injeksjonstiden og trykket slik at injeksjonsvolumet er 1 nL (figur 2I).
    3. Med en rulle-/overføringspipette må du forsiktig laste egg inn i injeksjonsformen (Figur 2J). Hvis det er nyttig, bruk tang til å rulle embryoer slik at den ene cellen er synlig, enten før eller under injeksjon. Det er brukerens preferanse å bruke en mikromanipulator.
    4. Injiser embryoer i 1-cellers fase, rettet mot cellen og ikke eggeplommen (Figur 2M). Dette vil sikre jevn merking av det utviklende embryoet.
  3. Hev embryoer til ønsket stadium (før 12 hkf, i henhold til standard iscenesettelse34). Injiserte embryoer vil ha en forsinket utvikling, så øk dem ved en litt høyere temperatur (29,0-29,5 °C) for å gjøre opp tiden. I løpet av ettermiddagen, sjekk embryoene og fjern de som er døde for å bevare helsen til koblingen.

3. Montering av optisk vesicle stadium sebrafisk embryoer for timelapse avbildning

  1. Før montering, lag 1,6% lavsmelting agarose i E3. Hvis du planlegger flere bildebehandlingsforsøk, klargjør du ~ 20 ml lavsmelting og lagrer ved romtemperatur. På dagen for embryomontering smelter du dette for å generere en frisk aliquot (1-5 ml) i et rør som kan plasseres i en 42 °C varmeblokk før montering.
  2. Skjermembryoer for vellykket injeksjon og total lysstyrke av fluorescens ved hjelp av et fluorescensmikroskop før montering. En ideell prøve vil ha sterk EGFP og mCherry fluorescens og være på riktig utviklingsstadium (Figur 3B - B'').
    1. Screen embryoer ved hjelp av et fluorescensmikroskop. Velg embryoer som sterkt uttrykker både EGFP og mCherry fluorescens for montering.
    2. Velg embryoer som er 11 hkf. Tell somitter for å riktig iscenesette embryoene34; ved 11 hkf bør det være 3 somitter, og med 12 hkf er det 6 somitter.
      MERK: Ved å montere embryoer før 12 hkf (ved 11 hkf), vil prøvene bli riktig iscenesatt ved 12 hkf når tidsforløpet begynner.
  3. Dechorionate embryoer før montering. Gjør dette enten manuelt med fine tang eller kjemisk ved hjelp av pronase (2 mg /ml). Med embryoer så unge er det viktig at dechorionation utføres i en agarbelagt tallerken og at embryoer ikke kommer i kontakt med luftvannsgrensesnittet.
  4. Bruk en glassrullepipette, suge opp et embryo og kaste ut så mye E3 som mulig, slik at embryoet sitter på spissen av glasset Pasteur pipette.
  5. Slipp embryoet inn i agaroserøret fra varmeblokken. La det synke inn i agarose i noen sekunder, deretter suge opp noen agarose først og deretter embryoet, og sørg for at embryoet forblir på spissen av pipetten (Figur 3C - C ').
  6. Plasser en glassbunnsfat for avbildning under et dissekeringsomfang. Kast ut embryoet og agarose i en agarose dråpe i glassbunnsfatet. Bruk tang til å orientere seg veldig raskt, slik at embryoet er dorsal-down (øverst på hodet på glassbunnen). La agarosedråpen herdes (Figur 3D - D'). Dette trinnet må gjøres raskt, men forsiktig, da embryoer på dette stadiet er skjøre. Skadede embryoer vil ikke overleve tidsforløpavbildningsprosessen.
    MERK: Det er viktig å orientere alle embryoer konsekvent for dette eksperimentet. Når du utfører tidsforløpet, må embryoene passe innenfor det tildelte synsfeltet samtidig som det opprettholdes ekstra plass for den optiske vesicle å vokse inn i. En optimal orientering er å justere den fremre bakre aksen til alle embryoer "vertikalt" eller langs klokken 12 og 6 på en urskive (figur 3G).
  7. Monter mellom 10-12 embryoer, som er mer enn dobbelt så mange som vil bli avbildet, slik at de beste prøvene kan velges når de er evaluert på konfokalen (Figur 3E - E'). Prøver vil bli evaluert for alder, ensartethet av fluorescerende merking og presisjon av monteringsretning.
  8. Etter montering av embryoene oppstod pipetten mer for å dekke bunnen av parabolen helt, og omsluttet dermed alle de separate agarosedråpene i en enkelt stor agaroseskive (Figur 3F - F '). En tilstrekkelig mengde agarose vil sikre at de enkelte embryodråpene eller hele platen ikke løfter opp fra bunnen av parabolen og flyter ut av syne.
  9. Når de er herdet, legger du over agarose med E3 for å holde prøvene hydrert i løpet av tidsforløpavbildningseksperimentet (en bekymring avhengig av bygningens fuktighet og i miljøet).
    MERK: Trikain er ikke nødvendig for disse spesifikke tidsforløpavbildningsforsøkene, da disse embryoene er tilstrekkelig unge; Men om ønskelig, og hvis du arbeider med eldre stadier av embryoer, kan trikain legges inn i agarose selv og overlaid i media.
  10. Tegn et kart over embryoene på papir for enkel referanse under timelapse satt opp. Dette er avgjørende for senere å knytte stillingen til genotypen for hvert utvalg.

4. Flere posisjoner konfokal tidsforløp med et laserskanningskonfokalt mikroskop

MERK: Denne tidsforløpavbildningsprotokollen ble utformet for å brukes med et konfokalt mikroskop for laserskanning utstyrt med produsentens programvare (se Materialfortegnelse). Dette systemet er utstyrt med en piezo Z-trinns enhet som muliggjør rask oppkjøp av Z-stabler. Laserlinjene som brukes i denne protokollen er en 488 nm Argon ion laser og en DPSS 561 nm laser. 561 nm laser er velegnet til å forestille seg mCherry fluorophore: den er nær nok til toppen av mCherry excitation (587 nm) og godt drevet.

  1. Sett opp konfekten.
    1. Slå på konfekten og logg deg på den stasjonære PCen.
    2. Installer piezo Z-stage insert (Figur 4B), og start deretter anskaffelsesprogramvaren.
    3. I programvaren i anskaffelsesmodus slår du på 488- og 561-laserne ved hjelp av rullegardinmenyen (Figur 4F). Laserne tar flere minutter å varme opp, så dette trinnet utføres tidlig for å spare tid.
      MERK: Anskaffelsesparameterne er som følger: Merk av for Z-stack, Time Seriesog Position . Sett Rammestørrelse til 512 (X) x 384 (Y), Skannehastighet til 9, Skannemodus til toveis, Zoom til 0,7, Hull til 60,2 (1,63 Luftige enheter ~= 1,6 μm) og Z-intervall til 2,1 μm. Dette vil gi en bildestørrelse på 303,6 μm x 227,7 μm og pikselstørrelse på 0,59 μm. 488- og 561-laserne skal kontrolleres og tilordnes samme spor. EGFP-deteksjonsområdet er 494-545 nm og mCherry-deteksjonsområdet er 598-679 (figur 4F).
    4. Belegge bunnen av glassfatet liberalt med nedsenkingsmedium som matcher brytningsindeksen for vann, og pass på at du unngår luftbobler (Figur 4C). Velg målet om 40x vann og bruk en liten dråpe nedsenkingsmedium på målet (Figur 4D). Fest den glassbunnede retten i sceneinnlegget, påfør E3 for å holde embryoene fuktige over natten, og bruk deretter modelleringsleire til å forsegle plastlokket over parabolen (Figur 4E). Øk målet om å komme i kontakt med parabolen.
  2. Screen prøver og forberede for timelapse.
    1. Bytt fra Kategorien Anskaffelse til Finn-fanen, og klikk på lyspæresymbolet for å slå på overført lys. Med det overførte lyset, finn den første prøven med styrespaken: Beveg prøven først inn i lysstrålen, bruk deretter okularene til midten og fokuser på en optisk vesicle.
    2. Gå tilbake til fanebladet Anskaffelse. Kontroller at det er merket av for Z-stack, Time Seriesog Positions , og at laserne varmes opp for bruk.
    3. Sett rammestørrelsen til 512 (X) x 384 (Y), skannehastigheten til 9, skannemodus til toveis og sett Zoom til 0,7.
    4. Begynn med å tilordne 488- og 561-laserne til Power 2.0 og Gain 550 under Kanal-overskriften (dette kan justeres senere). Sett hullet til 60,2 (1,63 luftige enheter ~= 1,6 μm seksjon).
    5. Begynn å skanne ved hjelp av kontinuerlig-knappen. Med den fine fokusknappen finner du prøven i Z-aksen og plasserer X-Y-aksen i rammen. Slutt å skanne.
    6. Under overskriften Posisjoner klikker du Legg til for å lagre XYZ-informasjonen i det første eksemplet (Figur 4F). Gjør dette bare for at prøver skal tidsforløpes. Velg prøver for deres sterke fluorescens og optimal montering.
    7. Bytt til Finn-fanen, gå til neste eksempel, og gjenta trinn 4.2.5-4.2.6, som er selektive når det gjelder å velge prøver.
  3. Fullfør eksempelposisjoner, tilordne z-område, og start deretter tidsforløp. Når alle prøvene er valgt (det er mulig å bilde 4-5 prøver innenfor det totale tidsintervallet på 2,5 minutter) og posisjonene er lagret, går du gjennom hver prøve og justerer XYZ-posisjonen innenfor visningsrammen.
    1. Merk den første posisjonen, og klikk Flytt til. Under kontinuerlig skanning stiller du opp den optiske vesicleen i rammen. La det være god plass i de fremre og distale områdene i forhold til den optiske vesicleen og hjernen.
    2. Deretter tilordner du første og siste Z-stykker ved å velge Angi først og Angi siste mens du beveger deg gjennom Z-retningen med den fine fokusknappen. Oppretthold et totalt stykkenummer på ~ 63, da dette vil imøtekomme veksten av den optiske koppen. Gi ekstra plass på ventralsiden av den optiske vesicleen for å gi rom for vekst.
    3. Når første og siste Z-stykker er angitt, klikker du på C-knappen for å flytte til midten av Z-stakken. Juster laserkraft og forsterkning for begge laserne; Om mulig, hold laserstrømmen under 5 og bruk en høyere forsterkning om nødvendig. Stopp skanningen. Oppdater posisjonsinformasjonen ved å klikke Oppdater.
    4. Gå til neste posisjon ved å klikke posisjon 2. Gjenta trinn 4.3.1-4.3.3 for hver tildelte stilling. Laserkraften og forsterkningen bør stilles inn slik at alle prøver er tilstrekkelig opplyst.
    5. Når både posisjonsinformasjon og laserinnstillinger er fullført, tilordner du innstillinger for Time Series. Under overskriften Tidsserie tilordner du Tidsintervall til 2,5 min, og Sykluser til 300 (Figur 4F). Antall sykluser beregnes slik at tidsforløpet fortsetter forbi 24 hk-stadiet, når utviklingen av optisk kopp er fullført.
    6. Hvis du vil starte tidsforløpet, klikker du Start. Overvåk den første komplette syklusen: Bruk en timer for å sikre at en komplett syklus (bildebehandling av alle posisjoner) er mindre enn 2,5 min og kontroller at hver posisjon ser riktig ut. Mikroskopet går uavhengig over natten og trenger ikke overvåkes.
      MERK: Selv om det konfiske rommet er temperaturkontrollert, er romtemperaturen 20-25 °C. Når utstyret går og laserskanningen ser temperaturen på scenen ut til å være nærmere 28,5 °C, siden embryonal utvikling fortsetter med denne forventede hastigheten, analysert visuelt med morfologiske landemerker.
    7. Med disse innstillingene vil tidsforløpet vare 12,5 timer. Lagre filen når tidsforløpet er fullført. Den vil være stor (~ 40 GB) og kan deles inn i individuelle posisjoner etter at den er lagret ved hjelp av anskaffelsesprogramvaren.

Representative Results

Injeksjon av fluorescerende RNAer muliggjør subcellulær merking
RNAer som merker cellens plasmamembran og histoner injiseres for å fange de enkelte cellemorfologiene og bevegelsene som ligger til grunn for optisk koppmorfogenese. Figur 2 viser hvert trinn i prosessen med mikroinjektive sebrafiskembryoer i 1-cellersfasen. Kort sagt, sebrafisk er parret (Figur 2E), og embryoer samles og lastes inn i injeksjonsformen (Figur 2J). En mikroinjeksjonsnål fylles på nytt (figur 2H), og embryoer injiseres direkte i enkeltcellen (Figur 2K-M), som er nødvendig for å oppnå ensartet merking (Figur 2M, Figur 4I-I''', Film1). I tillegg til jevn merking observeres robust fluorescens og utviklingen fortsetter uforstyrret (Figur 3B-B'').

Effektiv montering er avgjørende for tidsforløpavbildning av OCM fra 12til24 hkf
For å bildeoptisk koppmorfogenese, som oppstår over en lengre periode, er det viktig å både velge ideelle embryoer og plassere hver prøve riktig mens du bygger inn. Figur 3 viser en detaljert redegjørelse for vellykket montering av 11 hpf embryoer. Injiserte embryoer screenes først for tilstrekkelig fluorescens (figur 3B',B',F',F'''). Individuelle embryoer er nedsenket i agarose (Figur 3C,C') og montert dorsalt i en individuell dråpe agarose (Figur 3D,D'). Alle prøver er montert i en kollektiv plate med agarose (Figur 3E-F'). Når embryoer er iscenesatt riktig, tilstrekkelig fluorescerende og tilstrekkelig montert (Figur 3G), vil prøvene forbli i bilderammen i løpet av tidsforløpet slik at hele orgelet kan avbildes (Figur 4G-G'',I-I''', Film1). Unnlatelse av å utføre noen av disse trinnene vil resultere i et montert embryo som ikke er en optimal prøve for tidsforløpavbildning. Den minste variasjonen i rotasjonsgraden vil ha en dramatisk effekt på retningen av embryovekst i løpet av tidsforløpet. Suboptimale rotasjoner vises i figur 3, inkludert et embryo som er overrotert (figur 3I), noe som vil resultere i et mer bakre tidsforløp, og et embryo som er underrotert (figur 3J) der bare det mest fremre vevet kan observeres. I tillegg til riktig rotasjon under montering, er det mer sannsynlig at prøver som er montert med hensyn til rammens orientering, gir et vellykket tidsforløp (Figur 4G-G'', I-I''', Film 1). Optimale prøver er de som er orientert vertikalt på parabolen, med den fremre bakre aksen i tråd med klokken 12 og 6 på en urskive (Figur 3G). Sub-optimale prøver er de som ikke er orientert på denne aksen, for eksempel de som er horisontale eller diagonale (Figur 3H). Disse prøvene vil vokse ut av bilderammen etter hvert som tidsforløpet fortsetter og kan ikke brukes til videre analyse (Figur 4H-H'', J-J''').

Anskaffe et tidsforløpsdatasett som er egnet for fremtidig analyse
Embryoer som injiseres, heves og monteres nøyaktig, vil gi vellykkede konfokale bilder. Figur 4 viser en optimal prøve for tidsforløp: det er til og med fluorescens, og prøven er 12 hkf. Z-stabelen for avbildning tildeles slik at den første sektoren bare er dorsal til den optiske vesicleen, mens den siste skiven etterlater flere skiver utenfor ventralgrensen til den 12 hkoptiske vesicleen (Figur 4G-G''). Denne skjevheten mot ventralsiden gir overskytende plass til vevsvekst i ventral retning. Disse faktorene, når de oppfylles, resulterer i et optimalt tidsforløp (Figur 4I-I''', Film 1). En sub-optimal prøve har mosaikk eller svak fluorescens, har allerede utviklet seg forbi 12 hpf (når optisk koppmorfogenese er i gang), eller er plassert dårlig i Z-stabelen eller XY-rammen (Figur 4H-H''). Når disse kriteriene ikke er oppfylt, vil tidsforløpet ikke lenger fange opp hele 3D-volumet av vevet etter hvert som det utvikler seg og ikke kan brukes til videre analyse (Figur 4J-J''').

Figure 1
Figur 1: Arbeidsflyt for 4D-tidsforløpavbildning av sebrafiskoptisk koppmorfogenese. (A) For å fluorescerende merke subcellulære strukturer av interesse, syntetiser de aktuelle kappede mRNAene. (B) Mikroinjekt mRNA(er) i sebrafiskembryoer på 1-cellers stadium. (C) Embryoer monteres dorsalt, eller head-down for et invertert konfikalt mikroskop, på det optiske vesicle-stadiet, ~ 11 h etter befruktning eller 3 somite-stage. (D) Flere embryoer kan avbildes sekvensielt under en enkelt avbildningsøkt for tidsforløp. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: En visuell veiledning for mikroinjektivering av 1-cellers sebrafiskembryoer. (A) Gjenstander som skal inkluderes i et injeksjonssett (med urviseren): middels stor boks som kan holde hele settet med engangs nitrilhansker; en tallerken som inneholder mikroinjeksjonsnåler; tang; en aliquot av mineralolje og kutte opp firkanter av parafilm; microloading tips; fortynnet RNA på is; agarose injeksjon mugg; markør; rulle/overføring pipette; og P10 pipette. (B) Mikroinjeksjonsoppsett: et dissekerende mikroskop ved siden av en pico-injektor som er koblet til en ekstern komprimert gasskilde. En fotpedal og mikromanipulator er festet til pico-injektoren. Mikromanipulatoren er utstyrt med en nåleholder og plassert på plass over mikroskopstadiet. (C) En agarose injeksjonsform som inneholder seks rader med spor med en 90-graders vinkel på den ene siden og en 45-graders vinkel på den andre siden. (D) Pico-injektorens frontpanel. Trykkdisplayet viser 7,8 PSI; Dette kan justeres med knotten merket Pinjiser. Under er det trykknapper for å manuelt utløse trykk for å injisere, for å endre injeksjonstiden, eller for å fjerne, fylle eller holde væsken i nålen. Innsettingstiden er satt til 08 (tilsvarende 8 x 10 msek). En utgangsslange er koblet til Put og er festet til injeksjonsnålen. Trykkmålerens kildebryter er satt tilP-injeksjon under innstilling av injeksjonstrykket, og den kan byttes tilP-balanse for å justere basaltrykket som påføres nålen når injeksjoner ikke gjøres. P-balanseregulatoren ligger ved siden avP-injeksjonsregulatoren. Av/på-knappen lyser for å indikere at maskinen er slått på. (E) Voksen sebrafisk er parret i små avlstanker som inneholder en nestet tank med en maskebunn som skiller voksenfisk fra befruktede egg og tillater enkel innsamling. Vannstanden senkes for å etterligne grunne vannforhold og tankdelere fjernes for å starte parringsadferd. (F) Mikropipetten (nålen) trekker frontpanelet: inneholder et display som viser de spesifikke forholdene som brukes til å trekke nåler. Trykkinnstillingen er P = 500, etterfulgt av siste dato og klokkeslett programmet ble redigert, programnummeret, HEAT = 546, PULL = 130, VEL = 70 og TIME = 90. (G) En glasskapillær settes inn i mikropipetten (nål) trekkeren og festes på plass. Hver programmerte trekkløp resulterer i to lange koniske nåler (røde pilspisser). (H) RNA-fortynning er tilbakelastet i en nål; fenolrød fargestoffet gjør det enkelt å visualisere løsningen. (I) Etter å ha brukket spissen av nålen, måles bolus av RNA ved hjelp av et okular retikulering på dissekeringsområdet. For dette stereomikroskopet er 6 hash-merker på 30x totalt forstørrelse lik 1 nL-volum. (J) Befruktede egg lastes inn i agarose injeksjonsformen og fordeles langs moldens troughs ved hjelp av en rullepipette. (K) Injeksjonsformen som inneholder encellede embryoer er plassert under mikroskopet og embryoer injiseres sekvensielt. (L) Injeksjonsnålen settes inn i hvert embryo rettet mot enkeltcellen. (M) Når du er i cellen, brukes fotpedalen til å utløse en regulert mengde trykk og frigjøring av 1 nL RNA i embryoets celle (som visualisert av fenolrød). Skalastenger: I = 0,1 mm; L, M = 0,5 mm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: En visuell veiledning for montering avembryoer for avbildning. (A) Monteringsoppsett (fra venstre mot høyre): en varmeblokk programmert til 42 °C, varmerør med lavsmeltende agarose; en rullepipette; et par tang; en agarose belagt tallerken som inneholder dechorionated embryoer; og et dissekerende stereomikroskop koblet til en metallhalogen fluorescerende lampe. (B,B',B'') Et 11 hkf embryo injisert med henholdsvis EGFP-CAAX mRNA og mCherry-H2A mRNA, vist under brightfield, GFP fluorescens og mCherry fluorescens. (C,C') En glass pasteur pipette som inneholder agarose og et embryo som sitter i spissen; C' er en forstørret visning. (D,D') Ett embryo montert i en dråpe lavsmelting agarose på en glassbunnet tallerken, sett både fra mikroskopets stadium og gjennom mikroskopets okularer. (E,E') 12 embryoer montert i individuelle dråper med lavsmeltende agarose på en glassbunnet tallerken, sett både fra mikroskopets stadium og gjennom mikroskopets okularer. (F,F',F',F''') Alle monterte embryoer er overlagt med et komplett lag av agarose for å fylle bunnen av parabolen, sett både fra mikroskopets stadium og fra mikroskopets okularer vist i lyst felt; F'' GFP fluorescens; og F'' mCherry fluorescens. (G) En optimal prøve på 12 hkf monteres dorsalt og orientert vertikalt i tråd med klokken 12 og 6 med begge optiske vesicles i samme plan. (H) En sub-optimal prøve: Selv om monterte dorsalt og optiske vesikler er i plan med hverandre, er denne prøven orientert på en diagonal akse og vil vokse ut av rammestørrelsen etter hvert som utviklingen fortsetter. (I) En suboptimal prøve: Denne prøven er overrotert og ikke en dorsalbrakett, noe som resulterer i at den fremre delen av den optiske vesicleen ikke vil bli fanget opp i tidsforløpet. (J) En suboptimal prøve: Denne prøven er underrotert og ikke en dorsalbrakett, noe som resulterer i at den bakre delen av den optiske vesicleen ikke vil bli fanget opp i tidsforløpet. Prikkede linjer angir hver optiske vesicle. Skalastenger: B = 0,1 mm; D' = 1,5 mm; E', F' = 2,5 mm; G = 0,1 mm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: Sette opp et tidsforløp med flere posisjoner og potensielle resultater. (En) Laserskanning av konfektmikroskop. (B) Piezo Z-trinns innsats. (C) Bunnen av en glassbunnsfat som inneholder embryoer innebygd i agarose er belagt i nedsenkningsmedium som samsvarer med brytningsindeksen for vann. (D) En dråpe nedsenkingsmedium er plassert på 40x W objektivet (lang arbeidsavstand). (E) Retten holdes på plass med sceneinnsatsen, E3 tilsettes på toppen av agaroselaget, og lokket er festet med modelleringsleire. (F) Innstillinger for anskaffelsesprogramvare: De ønskede laserlinjene slås på fra rullegardinmenyen. For embryoer injisert med EGFP-CAAX RNA og H2A-mCherry RNA, er Argon- og DPSS 561-10-laserne slått på. Det røde høydepunktet indikerer at Argon-laseren varmer opp. For å finne prøven over målet, slås det overførte lyset på gjennom mikroskopets kontrollpanel. Både EGFP og mCherry er tilordnet Spor 1 (for samtidig bildebehandling) og rekkevidden til hver detektor er angitt. Her er EGFP-serien satt til 494-545 nm, og mCherry-serien er satt til 598-679 nm. Under Kanaler -menyen, kan laserkraft stilles inn. Etter at laserne er varmet opp, kan strømmen økes opp til 5,0, og forsterkning (master) kan justeres. Pinhole er satt til 60,2, som er lik 1,63 Luftige enheter eller 1,6 μm seksjon. Under Ervervelse -menyen, er rammestørrelsen satt til 512 x 384, skannehastigheten er 9,0, gjennomsnittet er toveis og zoom er satt til 0,7. Under Z-stabel -menyen, stilles første og siste posisjon i Z-aksen inn mens konfekten skanner. Intervallet (trinnstørrelse) er satt til 2,1 μm. Når du velger første og siste Z-posisjon, opprettholdes vanligvis et standard antall 63 stykker. dette imøtekommer den generelle veksten av øyet. Alternativet "bruk piezo" er valgt. Under Posisjoner -menyen, vises hver valgte posisjon, inkludert et tilordnet nummer og X-, Y- og Z-posisjon. Det finnes flere knapper for å kontrollere antall embryoer (separate posisjoner) til bildet, inkludert legg til, oppdater eller fjern. Under Tidsserie -menyen, er syklusen satt til 300 (antall Z-stabler som skal anskaffes) og intervall (tidstrinn) er satt til 2,5 min. Når innstillingene er fullført, startes tidsforløpanskaffelse ved å trykke på start. Programvaren vil vise stykket av Z-stabelen, syklusen og posisjonen som skanner. Når tidsforløpet er fullført, lagres filen ved å klikke på diskettikonet i Bilder og dokumenter panel. (G-J) Cellemembraner (green) er merket med EGFP-CAAX og cellekjerner (kromatin, magenta) er merket med H2A-mCherry RNAer. (G,G',G'') Et eksempel på å angi første og siste Z-stykke for en optimal montert prøve. Den første Z-skive (på dorsal side) kommer på bekostning av dorsal ektoderm, mens den siste Z-skive (på ventral side) er godt under den optiske vesicle, for å imøtekomme veksten i ventral retning. (H,H',H'') Et eksempel på å angi første og siste Z-stykke i en sub-optimal prøve. Prøven har svak mCherry fluorescens og den er montert diagonalt, slik at den utviklende optiske koppen er usannsynlig å holde seg i rammen i løpet av tidsforløpet. (JEG,JEG',JEG','') Et eksempel på et tidsforløp fra en optimal prøve. Bilder med ett stykke fra midten av Z-stakken hentes fra hele 63-stykkevolumet ved 4 tidspunkt (T-verdi). Br, hjerne; NR, nevral netthinne; RPE, retinal pigmentert epitel; Le, linse. (J,J',J'',J''') Et eksempel på et tidsforløp fra en suboptimal prøve. I dette tilfellet flyttet prøven ut av Z-flyet, og bare en skrå del av den fremre optiske koppen ble fanget. Skalastenger: G, I = 50 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Film 1: Tidsforløp for optisk koppmorfogenese i et optimalt villtype embryo. En dorsal visning av et wild type embryo som er merket med EGFP-CAAX (plasmamembraner, grønn) og H2A. F/Z-mCherry (kromatin, magenta). Tidsforløpet er fra ~ 12-24 hpf og inneholder en enkelt konfokal seksjon fra et helt 4D-datasett. Tidsintervallet er 2,5 min mellom z-stablene og vises med 22,5 bilder per sekund. Klikk her for å laste ned denne filmen.

Discussion

Her beskriver vi en protokoll for in toto merking og 4D-tidsforløpavbildning av optisk koppmorfogenese. Vi går gjennom prosessen med å generere capped RNA-koding av fluorescerende proteiner for å markere forskjellige subcellulære rom; injisere sebrafisk 1-cellers embryoer; innebygging av 11 hpf embryoer i agarose for multiplekset avbildning; og anskaffe 4D-datasett av flere embryoer så lenge den optiske koppen morfogenese varer (12–24 hkf).

Et utall spørsmål kan besvares med disse informasjonstette datasettene. 4D-data kan visualiseres og analyseres kvantitativt på en rekke måter. Selv om vi utenfor omfanget av denne protokollen inkluderer her noen av våre mål og standardapplikasjoner som et eksempel på hvilke typer ting som kan oppnås. Selvfølgelig utvikles kvantitative bildeanalysemetoder kontinuerlig, og både kommersielt tilgjengelige og spesialbygde verktøy kan brukes. Hvis man ikke har brukt slike metoder før, bør man være forberedt på å arbeide gjennom en viss optimalisering for å sikre at de oppkjøpte datasettene er tilstrekkelige for den kvantitative analysetilnærmingen man velger.

Det kan være utfordrende å visualisere og kvantitativ evaluering av 4D-datasettene på grunn av størrelsen på filene. Oppkjøpsprogramvaren kan brukes til å skille datasettene i individuelle embryoer, og ImageJ / Fiji kan brukes til å konvertere konfokale filer fra kommersielle formater til mer standard tif-stabler, der hvert tidspunkt lagres som en egen fil. Dette vil redusere filstørrelsene og standardisere filformatene. Individuelle optiske seksjoner fra hvert tidspunkt kan settes sammen som et 2D -tidsforløp (XY) ved hjelp av ImageJ/Fiji, noe som muliggjør rask 2D-visualisering og evaluering av dataene. Film 1 er et eksempel på nettopp dette: en enkelt optisk seksjon over tid montert som et tidsforløp for den optimale prøven vist i figur 4I–I''. Derfra, for 3D- og 4D-visualisering, bruker vi vanligvis FluoRender35,36, som er fritt tilgjengelig, men har spesifikke grafikkortkrav. Ved hjelp av FluoRender kan man rotere 3D-gjengitte data i en hvilken som helst akse, visualisere datasettet i 4D over tid, generere utskjæringer i et hvilket som helst plan og lagre rotasjoner og visualiseringer som en film eller serie med tif-bilder.

Når det gjelder kvantitativ analyse, er det mange spørsmål som skal besvares. Vi har utviklet programvare internt for å hjelpe våre egne spesifikke mål om å forstå celleatferden som ligger til grunn for morfogenese i optikken. Vårt program, LongTracker, bruker atomsignalet som proxy for posisjon til å spore cellene13. Med disse dataene kan vi bestemme når, hvor og hvordan celler beveger seg; hvor raskt og hvor langt celler beveger seg; og hvor ofte celler deler seg. I tillegg til vår egen programvare er det flere kommersielt tilgjengelige og spesialbygde alternativer for 4D-cellesporing. Vi har også utviklet programmet LongAxis for å utføre cellesegmentering og kvantifisere celleform og organisering i nevral netthinnen37. Datasettene som legges inn i LongAxis, er imidlertid enkle Z-stabler, tatt med høy oppløsning. En vedvarende utfordring har vært å generere tidsforløpsdatasett med høy nok oppløsning til at celler kan segmenteres med selvtillit og deres morfologi ekstrapolert. Et alternativ er mosaikk (sparsom) merking ved hjelp av en fotokonvertibel fluorofor som Kaede for direkte visualisering av celleform, som vi og andre har utført i det utviklende øyet8,11,13. Dette forenkler cellesegmenteringsproblemet, og celleform og -størrelse kan enkelt kvantifiseres gjennom 3D-gjengivelse i FluoRender.

Hvert trinn i denne protokollen ble optimalisert spesielt for våre formål. Spesifisiteten til denne protokollen resulterer i flere begrensninger: protokollen, som skrevet, er ikke optimalisert for avbildning av andre aspekter ved sebrafisk øyeutvikling (for eksempel retinal neurogenesis), andre øyestrukturer, andre utviklingsstadier eller andre subcellulære rom. Orienteringen av innebygging, hastigheten på avbildning og etikettene er alle designet for å tillate oss å svare på våre biologiske spørsmål. For å bilde retinal neurogenese, for eksempel, dorsal orientering av embryoet som beskrevet her kan ikke tillate visualisering av spesifikke egenskaper av interesse, og hastigheten på avbildning kan ikke være hensiktsmessig. Mange aspekter av protokollen kan tilpasses og modifiseres for en rekke behov, avhengig av ens spesifikke interesser og mål. For det første, ved hjelp av RNA-injeksjoner, gjør merkeprosessen veldig fleksibel. Fluorescerende proteinfusjonskonstruksjoner kan brukes til å merke subcellulære strukturer av interesse, og RNA-injeksjonsmengden kan varieres for å optimalisere merkingen. Basert på vårt arbeid med den fotokonvertible fluorofor kaede, ser RNA injeksjoner ut til å støtte et utbrudd av oversettelse som er over med 12 hpf11,13. Høye nivåer av fluorescerende proteinuttrykk fra RNA-injeksjon kan bekjempe fotobleking, men en slik tilnærming støtter ikke vedvarende uttrykk for den fluorescerende interesseetiketten. Hvis vedvarende uttrykk er nødvendig, for eksempel når du ser på embryoer på senere stadier, er transgene linjer et alternativ, og å konstruere nye linjer i sebrafisk er grei24.

Deretter kan protokollen tilpasses for senere utviklingsstadier. Fordi pigment kan hindre avbildning på senere stadier, kan embryoer behandles med fenylthiourea (PTU) for å hemme pigmentdannelse, eller genetiske mutanter for pigmentsyntese kan brukes. For å forhindre embryorykninger kan trikain legges til agarose- og embryomedieoverleggsløsningene, og prosentandelen agarose kan justeres etter behov. Etter hvert som øyet vokser, kan det være nødvendig å endre monteringsretningen; her monterer vi embryoer dorsalt, men på senere stadier kan det være mer fornuftig å montere lateralt eller fremre, avhengig av strukturen av interesse. Fordi forskjellige prosesser forekommer over forskjellige romlige og tidsmessige skalaer, kan man også optimalisere Z-trinn og tidstrinn for bildeanskaffelse. Disse funksjonene kan egentlig bare bestemmes empirisk for hvert laboratoriums behov.

Til slutt ble denne protokollen utviklet spesielt for en laserskanning konfokal mikroskop, med embryoer innebygd i en relativt høy prosentandel av agarose på et tidlig stadium av øyeutvikling. Hvis man er avbildning på forskjellige tidspunkter eller forskjellige steder under øyeutvikling, må denne protokollen tilpasses for interesseprosessen. Mange forskjellige bildemetoder er for tiden mulige, og flere utvikles av optiske ingeniører. Hver tilnærming bringer sitt eget sett med utfordringer, fra forskjellige måter å legge inn og montere embryoer for avbildning, til forskjellige filstørrelser og formater. Vi skisserer hensyn i introduksjonen for å veilede optimaliseringsprosessen, der maksimal romlig og tidsmessig oppløsning er balansert med fotobleaching, fototoksisitet og enorme filstørrelser. Vi håper at disse generelle prinsippene, i tillegg til den praktiske informasjonen beskrevet ovenfor, vil hjelpe andre med å etablere tidsforløpavbildningsmetoder for å studere de mange åpne spørsmålene i øyeutvikling.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Vi er takknemlige overfor tidligere og nåværende medlemmer av Kwan Lab for arbeid med timelapse tilnærminger og diskusjoner av denne protokollen. Dette arbeidet ble støttet av NIH (R01 EY025378 og R01 EY025780 til KMK; F31 EY030758 til SL; og T32 GM007464 til MAC).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Delta TPG Dish 0.17mm clear Bioptechs 0420041500C coverglass bottom for optical compatibility
Disposable Pasteur Pipettes VWR 14672-608 overall length 14.6 cm (53/4")
Dumont #5, #55, or #5SF Forceps Fine Science Tools 11254-20 For style #5: straight tip, 0.05 x 0.01 mm tip, inox, 11 cm long
Flaming/Brown Micropipette Puller Sutter P-97
Immersol W Carl Zeiss Microscopy 4449690000000 immersion fluid for water-emission objectives, halogen-free, low fluorescence
Microinjection Mold Adaptive Science Tools TU-1 Six ramps, one 90 degree and one 45 degree beveled side.
Microloader Tips Eppendorf 930001007 Microloader, tip for filling glass microcapillaries, 0.5 – 20 µL
mMessage mMachine SP6 Transcription Kit Invitrogen AM1340 contains SP6 Enzyme Mix, 10X Reaction Buffer, 2XNTP⁄CAP Solution, GTP Solution, pTRI-Xef, TURBO DNase, Ammonium Acetate Stop Solution, Lithium Chloride Precipitation Solution, and Gel Loading Buffer and are all stored at –20°C. Nuclease-free Water may be stored at any temperature.
Nikon SMZ645 Stereo Microscope Nikon SMZ645 used for injecting embryos (see Fig. 2B)
NotI-HF enzyme NEB R3189S comes with Gel Loading Dye, Purple (6X)
NuSieve GTG Agarose Lonza 50081 fine resolution, low melt agarose
Objective LD "C-Apochromat" 40x/1.1 W Korr M27 Carl Zeiss Microscopy 421867-9970-000
Olympus SZX16 Stereo Microscope Olympus SZX2-ZB16 used for screening, embedding embryos (see Fig. 3A)
Phenol red solution Sigma-Aldrich P0290 0.5% in DPBS, sterile filtered, endotoxin tested, cell culture tested
Pico-liter Microinjector Harvard Apparatus PLI-100 Femtoliter to microliter injections; digital readouts for injection count, time, and pressure; contains 5 pressures including inject, balance, clear, fill, and hold
Pipette Pump Pipettor SP Bel-Art F37898 fits a disposable pasteur pipette, contains thumbwheel on side for aspirating or dispensing and plunger for quick emptying
Premium Thin Wall Borosilicate Glass Capillaries Warner Instruments G100T-4 1.0 x 0.78 mm
QIAquick PCR Purification Kit Qiagen 28106 contains QIAquick Spin Columns, Buffers, Collection Tubes (2 ml)
RNase-free H2O Invitrogen AM9906 DNase-Free, Molecular Biology Grade, RNase-Free
RNeasy Mini Kit Qiagen 74104 contains RNeasy Mini Spin Columns, Collection Tubes (1.5 ml and 2 ml), RNase-free Reagents and Buffers
Stage Attachment Z PIEZO WSB 500 Carl Zeiss Microscopy 432339-9000-000
Stage Insert Z PIEZO WSB Universal Carl Zeiss Microscopy 432339-9030-000
Zeiss LSM 880 with Airyscan Carl Zeiss Microscopy N/A inverted Axio Observer microscope
Zen Black 2.3 SP1 software Carl Zeiss Microscopy N/A Zeiss Efficient Navigation (ZEN) controls all light microscope systems from Zeiss

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Adler, R., Canto-Soler, M. V. Molecular mechanisms of optic vesicle development: complexities, ambiguities and controversies. Developmental Biology. 305 (1), 1-13 (2007).
  2. Chow, R. L., Lang, R. A. Early eye development in vertebrates. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 17, 255-296 (2001).
  3. Fuhrmann, S. Eye morphogenesis and patterning of the optic vesicle. Current Topics in Developmental Biology. 93, 61-84 (2010).
  4. Martinez-Morales, J. R., Wittbrodt, J. Shaping the vertebrate eye. Current Opinion in Genetics and Development. 19 (5), 511-517 (2009).
  5. Yang, X. J. Roles of cell-extrinsic growth factors in vertebrate eye pattern formation and retinogenesis. Seminars in Cell & Developmental Biology. 15 (1), 91-103 (2004).
  6. Bogdanovic, O., et al. Numb/Numbl-Opo antagonism controls retinal epithelium morphogenesis by regulating integrin endocytosis. Developmental Cell. 23 (4), 782-795 (2012).
  7. Bryan, C. D., Casey, M. A., Pfeiffer, R. L., Jones, B. W., Kwan, K. M. Optic cup morphogenesis requires neural crest-mediated basement membrane assembly. Development. 147 (4), (2020).
  8. Bryan, C. D., Chien, C. B., Kwan, K. M. Loss of laminin alpha 1 results in multiple structural defects and divergent effects on adhesion during vertebrate optic cup morphogenesis. Developmental Biology. 416 (2), 324-337 (2016).
  9. Cavodeassi, F., Ivanovitch, K., Wilson, S. W. Eph/Ephrin signalling maintains eye field segregation from adjacent neural plate territories during forebrain morphogenesis. Development. 140 (20), 4193-4202 (2013).
  10. England, S. J., Blanchard, G. B., Mahadevan, L., Adams, R. J. A dynamic fate map of the forebrain shows how vertebrate eyes form and explains two causes of cyclopia. Development. 133 (23), 4613-4617 (2006).
  11. Gordon, H. B., et al. Hedgehog signaling regulates cell motility and optic fissure and stalk formation during vertebrate eye morphogenesis. Development. 145 (22), (2018).
  12. Ivanovitch, K., Cavodeassi, F., Wilson, S. W. Precocious acquisition of neuroepithelial character in the eye field underlies the onset of eye morphogenesis. Developmental Cell. 27 (3), 293-305 (2013).
  13. Kwan, K. M., et al. A complex choreography of cell movements shapes the vertebrate eye. Development. 139 (2), 359-372 (2012).
  14. Martinez-Morales, J. R., et al. Ojoplano-mediated basal constriction is essential for optic cup morphogenesis. Development. 136 (13), 2165-2175 (2009).
  15. Miesfeld, J. B., et al. Yap and Taz regulate retinal pigment epithelial cell fate. Development. 142 (17), 3021-3032 (2015).
  16. Nicolas-Perez, M., et al. Analysis of cellular behavior and cytoskeletal dynamics reveal a constriction mechanism driving optic cup morphogenesis. eLife. 5, (2016).
  17. Picker, A., et al. Dynamic coupling of pattern formation and morphogenesis in the developing vertebrate retina. PLoS Biology. 7 (10), e1000214 (2009).
  18. Rembold, M., Loosli, F., Adams, R. J., Wittbrodt, J. Individual cell migration serves as the driving force for optic vesicle evagination. Science. 313 (5790), 1130-1134 (2006).
  19. Sidhaye, J., Norden, C. Concerted action of neuroepithelial basal shrinkage and active epithelial migration ensures efficient optic cup morphogenesis. eLife. 6, (2017).
  20. Driever, W., et al. A genetic screen for mutations affecting embryogenesis in zebrafish. Development. 123, 37-46 (1996).
  21. Haffter, P., et al. The identification of genes with unique and essential functions in the development of the zebrafish, Danio rerio. Development. 123, 1-36 (1996).
  22. Nusslein-Volhard, C. The zebrafish issue of Development. Development. 139 (22), 4099-4103 (2012).
  23. Hoshijima, K., et al. Highly efficient CRISPR-Cas9-based methods for generating deletion mutations and F0 embryos that lack gene function in zebrafish. Developmental Cell. 51 (5), 645-657 (2019).
  24. Kwan, K. M., et al. The Tol2kit: a multisite gateway-based construction kit for Tol2 transposon transgenesis constructs. Developmental Dynamics. 236 (11), 3088-3099 (2007).
  25. Almeida, A. D., et al. Spectrum of Fates: a new approach to the study of the developing zebrafish retina. Development. 141 (9), 1971-1980 (2014).
  26. Baye, L. M., Link, B. A. Interkinetic nuclear migration and the selection of neurogenic cell divisions during vertebrate retinogenesis. The Journal of Neuroscience. 27 (38), 10143-10152 (2007).
  27. Clark, B. S., et al. Loss of Llgl1 in retinal neuroepithelia reveals links between apical domain size, Notch activity and neurogenesis. Development. 139 (9), 1599-1610 (2012).
  28. Das, T., Payer, B., Cayouette, M., Harris, W. A. In vivo time-lapse imaging of cell divisions during neurogenesis in the developing zebrafish retina. Neuron. 37 (4), 597-609 (2003).
  29. Kay, J. N., et al. Transient requirement for ganglion cells during assembly of retinal synaptic layers. Development. 131 (6), 1331-1342 (2004).
  30. Norden, C., Young, S., Link, B. A., Harris, W. A. Actomyosin is the main driver of interkinetic nuclear migration in the retina. Cell. 138 (6), 1195-1208 (2009).
  31. Suzuki, S. C., et al. Cone photoreceptor types in zebrafish are generated by symmetric terminal divisions of dedicated precursors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (37), 15109-15114 (2013).
  32. Wan, Y., et al. The ciliary marginal zone of the zebrafish retina: clonal and time-lapse analysis of a continuously growing tissue. Development. 143 (7), 1099-1107 (2016).
  33. Yoshimatsu, T., et al. Presynaptic partner selection during retinal circuit reassembly varies with timing of neuronal regeneration in vivo. Nature Communications. 7, 10590 (2016).
  34. Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Developmental Dynamics. 203 (3), 253-310 (1995).
  35. Wan, Y., Otsuna, H., Chien, C. B., Hansen, C. An interactive visualization tool for multi-channel confocal microscopy data in neurobiology research. IEEE Transactions on Visualization and Computer Graphics. 15 (6), 1489-1496 (2009).
  36. Wan, Y., Otsuna, H., Chien, C. B., Hansen, C. FluoRender: an application of 2D image space methods for 3D and 4D confocal microscopy data visualization in neurobiology research. IEEE Pacific Visualization Symposium. , 201-208 (2012).
  37. Carney, K. R., Bryan, C. D., Gordon, H. B., Kwan, K. M. LongAxis: a MATLAB-based program for 3D quantitative analysis of epithelial cell shape and orientation. Developmental Biology. 458 (1), 1-11 (2020).

Tags

Nevrovitenskap Utgave 171 avbildning mikroskopi timelapse morfogenese optisk vesicle optisk kopp utvikling sebrafisk øye netthinne
4-dimensjonal bildebehandling av sebrafiskoptisk kopp morfogenese
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lusk, S., Casey, M. A., Kwan, K. M.… More

Lusk, S., Casey, M. A., Kwan, K. M. 4-Dimensional Imaging of Zebrafish Optic Cup Morphogenesis. J. Vis. Exp. (171), e62155, doi:10.3791/62155 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter