Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

4-мерная визуализация морфогенеза оптической чашки рыбок данио

Published: May 26, 2021 doi: 10.3791/62155
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Human Genetics, University of Utah

Summary

Этот протокол описывает подход к маркировке in toto и многомерной визуализации раннего развития глаз рыбок данио. Мы описываем маркировку, встраивание и четырехмерную (4D) визуализацию с использованием лазерной сканирующей конфокальной микроскопии, а также соображения по оптимизации сбора наборов данных для препарирования механизмов морфогенеза оптической чашки.

Abstract

Функция зрительной системы требует установления точных тканевых и органных структур. В глазу позвоночных структурные дефекты являются распространенной причиной нарушения зрения, но механизмы морфогенеза глаза все еще плохо изучены. Основная организация эмбрионального глаза сохраняется во всех позвоночных, поэтому живая визуализация эмбрионов рыбок данио стала мощным подходом для непосредственного наблюдения за развитием глаз в режиме реального времени в нормальных и патологических условиях. Динамические клеточные процессы, включая движения, морфологию, взаимодействия, деление и смерть, могут быть визуализированы в эмбрионе. Разработаны методы равномерной маркировки субклеточных структур и конфокальной микроскопии раннего развития глаз у рыбок данио. Этот протокол описывает метод генерации закрытой мРНК для инъекции в 1-клеточный эмбрион рыбки данио, установки эмбрионов на стадии зрительного везикулы (~ 12 часов после оплодотворения, hpf) и выполнения многомерной таймлапсной визуализации морфогенеза оптической чашечки на лазерном сканируемом конфокальном микроскопе, так что несколько наборов данных приобретаются последовательно в одном сеансе визуализации. Такой подход дает данные, которые могут быть использованы для различных целей, включая отслеживание клеток, измерения объема, трехмерный (3D) рендеринг и визуализацию. Наши подходы позволяют нам точно определить клеточные и молекулярные механизмы, стимулирующие развитие оптической чашки, как в условиях дикого типа, так и в условиях генетического мутанта. Эти методы могут быть использованы непосредственно другими группами или адаптированы для визуализации многих дополнительных аспектов развития глаз рыбок данио.

Introduction

Развитие глаз позвоночных начинается с возникновения или уклонения зрительных везикул из проспективного нейроэпителия мозга. Затем зрительные везикулы претерпевают ряд изменений формы тканей, удлиняются, а затем инвагинируются для создания оптической чашки. В оптической чашке нервная сетчатка и пигментный эпителий сетчатки, полученные из нейроэпителия, обертывают зарождающуюся линзу, которая получена из поверхностной эктодермы. Весь процесс требует сложной серии клеточных и тканевых движений и молекулярной сигнализации, скоординированной между популяциями нейроэпителия, эктодермы и мезенхимальных клеток. Эти первоначальные события устанавливают основную структуру глаза, а более поздние этапы развития глаза, включая формирование радужной оболочки и роговицы, являются разработками ранней организации. Нарушения раннего развития глаз и морфогенеза лежат в основе многочисленных нарушений зрения у людей, включая анофтальмию, микрофтальмию и колобому. Раскрытие клеточных и молекулярных механизмов, управляющих морфогенезом оптической чашечки, имеет решающее значение для дальнейшего понимания развития зрительной системы и патологических состояний, которые возникают, когда эти процессы идут наперекосяк.

Наше понимание развития и морфогенеза глаз позвоночных возникло из огромного количества работ, охватывающих классические гистологические исследования до эмбриологических и генетических подходов в различных модельных организмах, включая мышь, цыпленка, лягушку ирыбу 1,2,3,4,5. В то время как эта работа установила молекулярные механизмы, которые регулируют раннее развитие глаз, исторически существует плохое понимание морфогенеза глаза: появление его 3D-структуры. Основная часть этих результатов была получена из визуализации секционированных эмбрионов в дискретных временных точках. Хотя этого достаточно, чтобы обеспечить представление о морфологии ткани в 2 измерениях, морфогенез является динамичным, 3D-процессом. Чтобы определить, как форма ткани изменяется в 3 измерениях с течением времени, как ведут себя отдельные клетки и как это поведение способствует изменениям в форме 3D-ткани, необходимы различные подходы.

Одним из решений для устранения этого значительного пробела в знаниях является живая визуализация, которая позволяет динамически наблюдать за клетками и тканями в режиме реального времени, когда орган принимает форму. К сожалению, это неосуществимо во многих модельных организмах из-за ограничений эмбрионального развития. Например, эмбрионы мышей и цыплят (развивающиеся в утробе матери или в яичной скорлупе) нелегко доступны, и многие живые эмбрионы не являются оптически прозрачными, вызывая значительное рассеяние света и ограничивая глубину, на которую могут быть получены изображения. Рыбки данио, с внешним развитием и прозрачными эмбрионами, предоставляют уникальную возможность проводить живую визуализацию морфогенеза глаза6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19. Также доступны обширные трансгенные и мутантные линии, а также инструменты для генерации новых трансгенов и мутантов20,21,22,23,24. Кроме того, морфогенез зрительной чашки происходит быстро у рыбок данио, в течение 12 часов (12-24 часа после оплодотворения, hpf), что делает возможным визуализацию всего процесса.

Усилия по визуализации в реальном времени были ускоряются расширением и оптимизацией семейства флуоресцентных белков, которые позволяют генетически кодировать жизненно важную маркировку субклеточных структур, а также улучшениями и инновациями в методах микроскопии. Протокол, описанный здесь, использует лазерную сканирующую конфокальную микроскопию, а не другие современные подходы к визуализации эмбриогенеза рыбок данио, включая конфокальную микроскопию вращающегося диска, селективную микроскопию плоскостного освещения (SPIM и ее варианты) и другие более специализированные методы микроскопии. Для развивающегося глаза рыбки данио мы обнаружили, что конфокальной микроскопии вращающегося диска было недостаточно для визуализации глубже в ткани. Хотя SPIM может похвастаться чрезвычайно быстрым временем обработки изображений и становится все более широко используемым, обработка больших наборов данных для визуализации и анализа остается проблемой. Напротив, лазерная сканирующая конфокальная микроскопия легко доступна, особенно для людей, не имеющих опыта в сборке оптического оборудования. Мы надеемся, что широкая доступность лазерной сканирующей конфокальной микроскопии сделает наш протокол полезным для многих лабораторий.

Здесь мы описываем наш метод захвата 4D-наборов данных морфогенеза оптической чашки, используя in toto маркировку эмбриона для мембран и хроматина, и лазерный сканирующий конфокальный микроскоп для получения изображения (схематизировано на рисунке 1). Флуоресцентные белки, используемые здесь (EGFP-CAAX и H2A. F/Z-mCherry) были выбраны для обеспечения маркировки тканей с разрешением одной клетки. Мы используем наборы данных, сгенерированные с помощью этого протокола, для различных функций анализа и визуализации изображений. Этот протокол может быть легко адаптирован, если желательны другие субклеточные структуры. Для визуализации формы клетки была выбрана маркировка плазматической мембраны: мы используем EGFP-CAAX, в которой последние 21 аминокислота H-ras, служащая последовательностью сигналов пренилирования, сливается с С-концем EGFP13. Другие флуоресцентные белки, нацеленные на плазматическую мембрану (например, трансмембранное слияние или миристоилированные), вероятно, будут работать так же хорошо. Чтобы пометить ядра, мы выбрали H2A. F/Z-mCherry, в котором mCherry сливается с гистоновым белком13. Это гарантирует, что деление клеток, включая ориентацию митотического веретенника, легко визуализируется.

При любом подходе к визуализации в реальном времени необходимо учитывать компромиссы между увеличением скорости изображения при максимизации отношения сигнал-шум, осевого разрешения и сохранения образца. Мы оптимизировали наши методы, чтобы максимизировать качество изображения и количество эмбрионов, которые могут быть изображены за один прогону. Часто цель состоит в том, чтобы изобразить морфогенез оптической чашечки у гомозиготного мутантного эмбриона, который может быть фенотипически неотличим от дикого типа в начале морфогенеза оптической чашечки и потомства гетерозиготного скрещивания (25% эмбрионов являются желаемым генотипом). Оптимизируя, а затем мультиплексируя получение изображения, повышается вероятность захвата набора данных гомозиготного мутантного эмбриона.

Временное разрешение или частота получения объемных данных (Z-стеков) является ключевым аспектом таймлапс-визуализации. В зависимости от назначения таких наборов данных существуют различные требования к скорости. Первоначально этот протокол был разработан для ручного отслеживания 4D-клеток. Отслеживание отдельных клеток в равномерно меченной ткани требует достаточно высокого временного разрешения, чтобы обеспечить уверенность в том, что какая-либо одна клетка непрерывно отслеживается с течением времени. Мы обнаружили, что Z-стеки морфогенеза зрительной чашки рыбок данио должны приобретаться не реже чем каждые 3,1 мин в течение 12 ч; Здесь мы оптимизировали наше приобретение на лазерном сканируруемом конфокальном микроскопе таким образом, что мы можем получать Z-стеки из 4-5 эмбрионов каждые 2,5 мин.

Установление размера Z-шага было решающим шагом в оптимизации протокола: для 3D-рендеринга и визуализации идеальны изотропные данные, в которых размер Z-шага равен размеру пикселя XY. На самом деле, чрезвычайно трудно получить такие данные таймлапса с живыми образцами, учитывая ограничения со временем визуализации и фотоотбеливанием. Поэтому определение адекватного размера Z-шага важно для рендеринга и визуализации потребностей эксперимента, и, в частности, для максимизации осевой информации при сохранении скорости и предотвращении фотоотбеливания необходимо соотношение X:Y:Z. Для этого протокола установленное соотношение вокселя составляло 1:1:3,5 (0,6 мкм x 0,6 мкм x 2,1 мкм Z-шаговый размер с использованием 40-кратного объектива погружения в воду на большое рабочее расстояние). При получении Z-глубины 130-140 мкм это дает объемные данные с подходящим временным разрешением и небольшим фотоотбеливанием.

Как обсуждалось выше, этот протокол является специфическим для 4D-визуализации морфогенеза оптической чашки рыбок данио, с использованием эмбрионов в toto, помеченных для плазматической мембраны и хроматина, а также лазерного сканирующего конфокального микроскопа. Приведенный ниже протокол может быть легко адаптирован для различных экспериментов и потребностей. Во-первых, в отношении субклеточных структур можно визуазировать любую структуру, для которой существует маркер живой клетки. Далее, хотя основное внимание здесь уделяется исключительно морфогенезу оптической чашечки, таймлапсная визуализация может быть адаптирована для других стадий развития глаза, например, нейрогенеза25,26, 27,28, 29,30,31,32,33. Для визуализации более позднего развития может потребоваться рассмотреть иммобилизацию эмбриона (поскольку спонтанная мышечная активность начинается около 24 л.с.ф.), пигментацию (которая начинает проявляться около 24 л.с.ф.), размер ткани (глаз значительно увеличивается в объеме во время нейрогенеза) и скорость визуализации (которая должна быть скорректирована в зависимости от скорости интересующего процесса). Всеми этими соображениями можно легко управлять. Протокол достаточно гибкий; В дополнение к деталям конкретного протокола здесь, есть общие принципы, которые помогут тем, кто заинтересован в живой визуализации других аспектов развития глаз.

Protocol

Все методы, описанные здесь с использованием рыбок данио, охватываются протоколом доктора Кристен Кван для животных «Клеточные и молекулярные механизмы развития зрительных систем у рыбок данио» и одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию (IACUC) Университета штата Юта.

1. Замкнунный синтез РНК

  1. Сгенерируйте шаблон ДНК для транскрипции in vitro.
    1. Линеаризация шаблона ДНК путем переваривания 10 мкг ДНК в объеме 100 мкл реакционной смеси. Типичная реакция собирается следующим образом: переварить 10 мкг ДНК с помощью 3 мкл фермента и 10 мкл буфера, довести объем реакции до 100 мкл водой.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Типичным шаблоном для дайджеста является вектор pCS2, например, pCS2-EGFP-CAAX или pCS2FA-H2A.F/Z-mCherry для мембранной и хроматиновой маркировки, описанной здесь. В этом случае плазмидные ДНК перевариваются с помощью фермента NotI. Пользователи должны быть осторожны со звездной активностью; в этом случае рекомендуется и коммерчески доступен высокоточный фермент.
    2. Инкубируют реакцию при 37 °C в течение ночи, чтобы гарантировать, что ДНК переваривается до завершения.
    3. Очистите рестрикционный дайджест с помощью комплекта для очистки ПЦР в соответствии с протоколом производителя. Элюдировали ДНК с помощью 30 мкл ddH2O. Храните линеаризированную ДНК при -20 °C и используйте по мере необходимости.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Количество перевариваемой ДНК и объем элюирования дают приблизительно 0,3 мкг/мкл; этого достаточно для ~5 раундов транскрипции in vitro, каждый раунд с использованием ~2 мкг ДНК в качестве шаблона.
  2. In vitro транскрибируют закрытую РНК с помощью набора транскрипции in vitro. Для шаблонов pCS2 (как описано здесь) используйте комплект SP6.
    1. Соберите реакцию транскрипции in vitro следующим образом: переварите 2 мкг шаблона ДНК или до 6 мкл с 2 мкл 10-кратного реакционного буфера, 10 мкл 2x рибонуклеотидной смеси и 2 мкл 10x enzyme Mix.
    2. Инкубировать при 37 °C в течение 2-4 ч или дольше (более длительное время приведет к большему выходу). При желании 1 мкл Enzyme Mix может быть дополнен в середине инкубационного периода.
    3. Переваривайте шаблон ДНК, добавляя 1 мкл ДНКазы, не менее РНКазы, и инкубируя в течение 15 мин при 37 °C.
  3. Очистите закрытую РНК с помощью комплекта для очистки РНК в соответствии с протоколом производителя (см. Таблицу материалов). Элют со 100 мкл Н2Обез РНКазы.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Добавление β-меркаптоэтанола не является необходимым для этого применения. Хотя метод, описанный в этом протоколе, прост, альтернативные реагенты также могут быть использованы для очистки РНК.
  4. Осаждают РНК.
    1. Добавьте 10 мкл 3 M RNase-free NaOAc и 2,5 объема (~275 мкл) ледяного РНКазы-свободного 100% EtOH к элюированной РНК.
    2. Инкубируют реакцию при -20 °C в течение 15-30 мин. Вращайтесь в течение 15 мин на высокой скорости при 4 °C до гранулирования РНК.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Гранула должна быть видна на стенке трубки. Полезно отметить, как труба выравнивается в центрифуге на этом этапе, чтобы предсказать, где гранула должна быть в конце спина.
    3. Удалите EtOH осторожно с помощью шприца, стараясь избегать нагревания, пересыхания или смещения гранул. Повторно суспендировать гранулу в 20 мкл Н2Обез РНКазы.
    4. Проверьте РНК, чтобы убедиться, что синтез будет успешным. Используйте 1 мкл для анализа концентрации на спектрофотометре и запустите 0,5 мкл на 1% агарозном геле, чтобы проверить наличие одной или двух дискретных полос, а не низкомолекулярного мазка. Выход реакции транскрипции in vitro должен составлять ~1 мкг/мкл.
    5. Аликвот и хранят РНК при -20 °C или -80 °C. РНК не разбавляют до непосредственно перед инъекциями.

2. Микроинъекция 1-клеточных эмбрионов рыбок данио

ПРИМЕЧАНИЕ: Вводят 200-300 пг на РНК для получения повсеместной экспрессии хроматина и клеточных мембран во время морфогенеза оптической чашки. Готовят 5-10 мкл разбавления РНК и загружают 2,5-5 мкл/иглу; планируйте дополнительное в случае, если игла сломается.

  1. Предварительные препараты для инъекций.
    1. Подготовьте форму для литья под давлением, чтобы облегчить выравнивание и ориентацию 1-клеточных эмбрионов для микроинъекции. Растопить 2% агарозы в Е3 (стандартная эмбриональную среду) и вылить в чашку Петри. Осторожно всплывайте литьевую форму (см. Таблицу материалов)на верхней части горячей агарозы, чтобы создать отпечаток желобов в агарозе по мере ее затвердевания. Как только агароза затвердеет, удалите форму для литья под давлением.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Посуда для литья под давлением может использоваться в течение нескольких месяцев; накрыть крышкой E3 и хранить при 4 °C, когда они не используются.
    2. Потяните микроинъекцию игл. Потяните стеклянные капилляры на длинный конус, чтобы сделать микроинъекцию игл с помощью игольчатого съемника. Запрограммировать машину в конкретных целях в рамках типа используемых капилляров. Для боросиликатных капилляров размером 1,0 х 0,78 мм используют следующую программу: тепло = 546 °C, тяга = 130, скорость = 70, время = 90(рисунок 2F). Храните иглы в чашке Петри и закрепите ее лепной глиной.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Рецепт вытягивания будет варьироваться в зависимости от машины и нити накаливания, и новые нити накалиброваны всегда должны быть откалиброваны. Каждый раунд вытягивания производит две иглы(рисунок 2G); сделайте это несколько раз, чтобы произвести достаточное количество игл в случае случайных разрывов и будущих экспериментов.
    3. Разбавить закрытую РНК для инъекций. Разбавляют как EGFP-CAAX, так и H2A-mCherry РНК до концентрации 200-300 нг/мкл с использованиемН2Обез РНКазы и 1 мкл фенол-красного в общем объеме 5 мкл (конечная концентрация фенол-красного составляет 0,1%). Проведите смесью и ненадолго вращайте вниз, чтобы собрать общий объем. Держите разбавленные РНК на льду перед инъекцией.
  2. Инъекция 1-клеточных эмбрионов
    1. Как только рыба начнет размножаться, подождите ~ 15-20 минут, чтобы убедиться, что яйца оплодотворяются. За это время перегружайте иглу 2,5-5 мкл разбавления РНК с помощью наконечников микрозагрузчиков P10 и P10.
    2. Используя пиконъектор, откалибруйте иглу с помощью окуляра (также достаточно калибровочного слайда микрометра) для измерения объема капли (объем сферы = (4/3) * pi * радиус^3). Отрегулируйте время и давление впрыска таким образом, чтобы объем впрыска составлял 1 нЛ(рисунок 2I).
    3. С помощью ролика/передаточной пипетки осторожно загрузите яйца в форму для литья под давлением(рисунок 2J). Если это полезно, используйте щипцы, чтобы свернуть эмбрионы таким образом, чтобы одна клетка была видна либо до, либо во время инъекции. Пользователь предпочитает использовать микроманипулятор.
    4. Вводите эмбрионы на 1-клеточной стадии, нацеливаясь на клетку, а не на желток(рисунок 2M). Это обеспечит равномерную маркировку развивающегося эмбриона.
  3. Вырастите эмбрионы до нужной стадии (до 12 л.с.ф., согласно стандартной постановке34). Введенные эмбрионы будут иметь задержку развития, поэтому поднимите их при несколько более высокой температуре (29,0-29,5 °C), чтобы накормить время. Во второй половине дня проверьте эмбрионы и удалите те, которые мертвы, чтобы сохранить здоровье кладки.

3. Установка оптических эмбрионов рыбок данио стадии везикул для визуализации таймлапса

  1. Перед установкой приготовьте 1,6% низкоплавкой агарозы в Е3. При планировании нескольких экспериментов по визуализации приготовьте ~ 20 мл агарозы с низким содержанием расплава и храните при комнатной температуре. В день монтажа эмбриона расплавите его, чтобы получить свежую аликвоту (1-5 мл) в трубке, которую можно поместить в тепловой блок с температурой 42 °C перед установкой.
  2. Скрининг эмбрионов для успешной инъекции и общей яркости флуоресценции с помощью флуоресцентного микроскопа перед установкой. Идеальный образец будет иметь сильную флуоресценцию EGFP и mCherry и находиться на правильной стадии развития(рисунок 3B - B'').
    1. Скрининг эмбрионов с помощью флуоресцентного микроскопа. Выберите эмбрионы, которые сильно экспрессируют флуоресценцию EGFP и mCherry для монтажа.
    2. Отбираем эмбрионы с 11 л.с. Граф сомитов для правильной стадии эмбрионов34; при 11 л.с.ф. должно быть 3 сомита, а к 12 л.с. — 6 сомитов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: При установке эмбрионов до 12 л.с. (при 11 л.с.ф.) образцы будут соответствующим образом поставлены на 12 л.с.ф.
  3. Дехорионат эмбрионов перед установкой. Делайте это либо вручную с тонкими щипцами, либо химически с использованием проназы (2 мг/мл). Для эмбрионов такого молодого возраста важно, чтобы дехорионация выполнялась в чашке, покрытой агаром, и чтобы эмбрионы не контактировали с границей раздела воздух-вода.
  4. Используя стеклянную роликовую пипетку, всасывайте эмбрион и выбрасывайте как можно больше E3 так, чтобы эмбрион сидел на кончике стеклянной пипетки Пастера.
  5. Опустите эмбрион в трубку агарозы из теплового блока. Дайте ему погрузиться в агарозу на несколько секунд, затем всасывайте сначала немного агарозы, а затем эмбрион, убедившись, что эмбрион остается на кончике пипетки(рисунок 3C - C').
  6. Поместите стеклянную тарелку для визуализации под рассекающий прицел. Выталкнуть эмбрион и агарозу в каплю агарозы в стеклянной посуде. Используйте щипцы, чтобы очень быстро сориентироваться, так, чтобы эмбрион находился дорсально внизу (верхняя часть головы на стеклянном дне). Дайте капле агарозы затвердеть(Рисунок 3D - D'). Этот шаг нужно делать быстро, но осторожно, так как эмбрионы на этой стадии хрупкие. Поврежденные эмбрионы не выдерживают процесса визуализации замедленной съемки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Важно последовательно ориентировать все эмбрионы для этого эксперимента. При выполнении таймлапса эмбрионы должны помещаться в назначенное поле зрения, сохраняя при этом дополнительное пространство для роста зрительного везикулы. Оптимальной ориентацией является выравнивание передне-задней оси всех эмбрионов «вертикально» или вдоль 12 и 6 часов на циферблате часов(рисунок 3G).
  7. Установите между 10-12 эмбрионами, что более чем в два раза больше, чем будет изображено, так что лучшие образцы могут быть выбраны после оценки на конфокальном(рисунок 3E - E'). Образцы будут оцениваться на возраст, однородность флуоресцентной маркировки и точность ориентации монтажа.
  8. После монтажа эмбрионов пипетку больше агарозы полностью покрывают дно блюда, тем самым замещая все отдельные капли агарозы в один большой агарозный диск(рисунок 3F - F'). Достаточное количество агарозы позволит гарантировать, что отдельные капли эмбриона или весь диск не поднимутся со дна тарелки и не уплывут из поля зрения.
  9. После затвердевания наложайте агарозу на E3, чтобы сохранить образцы гидратированными в течение всего эксперимента по визуализации замедленного действия (проблема в зависимости от влажности здания и окружающей среды).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Трикаин не является необходимым для этих конкретных экспериментов по визуализации таймлапса, так как эти эмбрионы достаточно молоды; однако при желании и при работе с более старыми стадиями эмбрионов трицин можно добавлять в саму агарозу и накладывать в среду.
  10. На бумаге нарисуйте карту эмбрионов для удобства использования во время таймлапса. Это имеет решающее значение для последующей связывания позиции с генотипом каждого образца.

4. Многопозиционный конфокальный таймлапс с лазерным сканирующим конфокальным микроскопом

ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол визуализации таймлапса был разработан для использования с лазерным сканирующим конфокальным микроскопом, оснащенным программным обеспечением производителя (см. Таблицу материалов). Эта система оснащена пьезо-Z-каскадным устройством, позволяющим быстро получать Z-стеки. Лазерные линии, используемые в этом протоколе, представляют собой 488-нм аргон-ионный лазер и DPSS 561 нм лазер. Лазер 561 нм хорошо подходит для визуализации флуорофора mCherry: он достаточно близок к пику возбуждения mCherry (587 нм) и хорошо питается.

  1. Настройте конфокаль.
    1. Включите конфокаль и войдите в настольное пк.
    2. Установите пьезо-Z-сценическуювставку (рисунок 4B),затем запустите программное обеспечение для сбора.
    3. В программном обеспечении в режиме Acquisition включите лазеры 488 и 561 с помощью раскрывающегося меню(рисунок 4F). Лазерам для разогрева занимает несколько минут, поэтому этот шаг выполняется рано, чтобы сэкономить время.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Параметры получения следующие: Установите флажки Z-стек, Временные рядыи Положение. Установите для параметра Размер кадра значение 512 (X) x 384 (Y), для параметра Scan Speed (скорость сканирования) для 9, для режима сканирования для двунаправленного, для масштабирования до 0,7, для Pinhole до 60,2 (1,63 airy Units ~= 1,6 мкм секции) и Z-интервал до 2,1 мкм. Это даст размер изображения 303,6 мкм x 227,7 мкм и размер пикселя 0,59 мкм. Лазеры 488 и 561 должны быть проверены и отнесены к одному и тому же треку; дальность обнаружения EGFP составляет 494-545 нм, а дальность обнаружения mCherry - 598-679(рисунок 4F).
    4. Обильно обильно покрывайте дно стеклянной посуды погружной средой, соответствующей показателю преломления воды, стараясь избегать пузырьков воздуха(рисунок 4С). Выберите 40-кратный водный объектив и нанесите небольшую каплю погружной среды на цель(рисунок 4D). Закрепите стеклянную тарелку в сценической вставке, нанесите E3, чтобы сохранить эмбрионы влажными в течение ночи, затем используйте моделирную глину, чтобы запечатать пластиковую крышку над чашкой(рисунок 4E). Поднимите цель, чтобы вступить в контакт с блюдом.
  2. Отсыпьте образцы и подготовьтесь к таймлапсу.
    1. Переключитесь с вкладки «Приобретение» на вкладку «Найти» и нажмите на символ лампочки, чтобы включить проходящий свет. С помощью проходящего света найдите первый образец с помощью джойстика: на глаз сначала переместите образец в луч света, затем используйте окуляры к центру и сосредоточьтесь на зрительном везикуле.
    2. Вернитесь на вкладку Приобретение. Убедитесь, что установлены флажки Z-стек, Временные ряды и Позиции, а лазеры разогреты для использования.
    3. Установите размер кадра 512 (X) x 384 (Y), скорость сканирования — 9, режим сканирования — двунаправленный и установите масштаб на 0,7.
    4. Под заголовком Каналы начните с назначения лазеров 488 и 561 power 2.0 и Gain 550 (это можно настроить позже). Установите точечный отверстие в 60,2 (1,63 воздушных единиц ~ = 1,6 мкм секции).
    5. Начните сканирование с помощью кнопки Непрерывный. С помощью ручки тонкой фокусировки найдите образец по оси Z и поместите ось X-Y в кадр. Остановите сканирование.
    6. Под заголовком Позиции нажмите кнопку Добавить, чтобы сохранить информацию XYZ на первом образце(рисунок 4F). Делайте это только для того, чтобы образцы были замедлены. Подбирайте образцы для их сильной флуоресценции и оптимального монтажа.
    7. Перейдите на вкладку Поиск, перейдите к следующему образцу и повторите шаги 4.2.5-4.2.6, выбирая выборку образцов.
  3. Завершите выборку позиций, назначьте z-диапазон, а затем запустите таймлапс. После того, как все образцы выбраны (можно изобразить 4-5 образцов в течение 2,5-минутного общего временного интервала) и позиции сохранены, просмотрите каждый образец и отрегулируйте положение XYZ в кадре просмотра.
    1. Выделите первую позицию и нажмите «Переместить в». Во время непрерывного сканирования выровняйте зрительный везикул в кадре. Оставьте достаточно места в передней и дистальной областях относительно зрительного везикулы и головного мозга.
    2. Затем назначьте первый и последний Z-фрагменты, выбрав Установить первый и Установить последний при перемещении по Z-направлению с помощью тонкой ручки фокусировки. Поддерживайте общее количество срезов ~ 63, так как это будет соответствовать росту оптической чашки. Обеспечьте дополнительное пространство на вентральной стороне зрительного везикла, чтобы обеспечить пространство для роста.
    3. После установки первого и последнего Z-срезов нажмите кнопку C, чтобы переместиться в центр Z-стека. Отрегулируйте мощность и усиление лазера для обоих лазеров; если возможно, держите мощность лазера ниже 5 и используйте более высокий коэффициент усиления, если это необходимо. Остановите сканирование. Обновите информацию о позиции, нажав кнопку Обновить.
    4. Перейдите на следующую позицию, нажав на позицию 2. Повторите шаги 4.3.1-4.3.3 для каждой назначенной должности. Мощность и коэффициент усиления лазера должны быть установлены таким образом, чтобы все образцы были достаточно освещены.
    5. После завершения работы над информацией о положении и настройками лазера назначьте параметры временных рядов. Под заголовком Временные ряды присвойте интервал времени 2,5 мин, а циклам 300(рисунок 4F). Количество циклов рассчитывается таким образом, что таймлапс проходит стадию 24 л.с., когда разработка оптической чашки завершена.
    6. Чтобы начать таймлапс, нажмите кнопку Пуск. Контролируйте первый полный цикл: используйте таймер, чтобы убедиться, что один полный цикл (визуализация всех позиций) составляет менее 2,5 минут, и убедитесь, что каждая позиция выглядит правильно. Микроскоп работает независимо в течение ночи и не нуждается в мониторинге.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Хотя конфокальная комната контролируется температурой, температура в помещении составляет 20-25 °C. При работающем оборудовании и лазерном сканировании температура на сцене, по-видимому, ближе к 28,5 ° C, поскольку эмбриональное развитие протекает с этой ожидаемой скоростью, визуально анализируемой с помощью морфологических ориентиров.
    7. При этих настройках таймлапс продлится 12,5 ч. Сохраните файл после завершения таймлапса. Он будет большим (~ 40 ГБ) и может быть разделен на отдельные позиции после его сохранения с помощью программного обеспечения для приобретения.

Representative Results

Инъекция флуоресцентных РНК позволяет проводить субклеточную маркировку
РНК, которые помечают плазматическую мембрану клетки и гистоны, вводятся для того, чтобы захватить отдельные морфологии и движения клеток, которые лежат в основе морфогенеза оптической чашки. На рисунке 2 показан каждый этап процесса микроинъектирования эмбрионов рыбок данио на 1-клеточной стадии. Вкратце, рыбки данио спариваются(рисунок 2E),а эмбрионы собираются и загружаются в форму для литья под давлением(рисунок 2J). Микроинъекционный иглу засыпают обратно(рисунок 2H),а эмбрионы вводят непосредственно в одиночную клетку(Рисунок 2K-M),что необходимо для получения равномерной маркировки(Рисунок 2M, Рисунок 4I-I''',Фильм1). В дополнение к равномерной маркировке наблюдается устойчивая флуоресценция и развитие протекает невозмутимо(рисунок 3B-B'').

Эффективное крепление имеет важное значение для замедленной съемки OCM от 12до24 л.с.
Чтобы получить изображение морфогенеза оптической чашки, который происходит в течение длительного периода времени, важно как выбрать идеальные эмбрионы, так и правильно позиционировать каждый образец при встраивание. На рисунке 3 показан подробный отчет об успешном монтаже эмбрионов мощностью 11 л.с.ф. Введенные эмбрионы сначала проверяются на достаточную флуоресценцию(рисунок 3B',B'',F'',F'''). Отдельные эмбрионы погружают в агарозу(Рисунок 3C,C')и устанавливают дорсально в отдельную каплю агарозы(Рисунок 3D,D'). Все образцы смонтированы в коллективный диск агарозы(рисунок 3E-F'). Когда эмбрионы поставлены правильно, достаточно флуоресцентны и адекватно установлены(рисунок 3G),образцы будут оставаться в кадре изображения в течение таймлапса, позволяя визуализировать весь орган(рисунок 4G-G'',I-I''',фильм1). Неспособность выполнить любой из этих шагов приведет к смонтированию эмбриона, который не является оптимальным образцом для визуализации замедленной съемки. Малейшее изменение степени вращения окажет существенное влияние на направление роста эмбриона во время таймлапса. Неоптимальные вращения показаны на рисунке 3,включая эмбрион, который чрезмерно вращается(рисунок 3I),что приведет к более заднему таймлапсу, и эмбрион, который недостаточно вращается(рисунок 3J),в котором может наблюдаться только самая передняя ткань. В дополнение к правильному вращению во время монтажа, образцы, которые монтируются относительно ориентации кадра, с большей вероятностью дают успешный таймлапс(рисунок 4G-G'',I-I''',фильм1). Оптимальными образцами являются те, которые ориентированы вертикально на тарелке, с передне-задней осью на линии 12 и 6 часов на циферблате часов(рисунок 3G). Неоптимальные образцы - это те, которые не ориентированы на эту ось, например, горизонтальные или диагональные(рисунок 3H). Эти образцы будут вырастать из кадра изображения по мере замедления и не могут быть использованы для дальнейшего анализа(рисунок 4H-H'',J-J''').

Получение набора данных timelapse, подходящего для будущего анализа
Эмбрионы, которые точно введены, подняты и установлены, сделают успешными конфокальные образцы изображений. На рисунке 4 показан оптимальный образец для таймлапса: есть даже флуоресценция, а образец составляет 12 л.с. Z-стек для визуализации назначается таким образом, что первый срез является просто дорсальным к зрительному везикулу, в то время как последний срез оставляет несколько срезов за вентральной границей зрительного везикулы мощностью 12 л.с.(Рисунок 4G-G''). Это смещение в сторону вентральной стороны обеспечивает избыточное пространство для роста тканей в вентральном направлении. Эти факторы, когда они встречаются, приводят к оптимальному таймлапсу(рисунок 4I-I''', фильм1). Неоптимальный образец имеет мозаичную или тусклую флуоресценцию, уже развился после 12 л.с. (когда идет морфогенез оптической чашечки) или плохо расположен в Z-стеке или кадре XY(рисунок 4H-H''). Когда эти критерии не выполняются, таймлапс больше не будет захватывать весь 3D-объем ткани по мере ее развития и не может быть использован для дальнейшего анализа(рисунок 4J-J''').

Figure 1
Рисунок 1:Рабочий процесс 4D-таймлапс-визуализации морфогенеза зрительной чашки рыбок данио. (A) Чтобы флуоресцентно маркировать субклеточные структуры, представляющие интерес, синтезировать соответствующие закрытые мРНК. (B) Микроинъекцию мРНК в эмбрионы рыбок данио на 1-клеточной стадии. (C)Эмбрионы устанавливаются дорсально или головой вниз для перевернутого конфокального микроскопа на стадии зрительного везикулы, ~ 11 ч после оплодотворения или 3 стадии сомита. (D)Несколько эмбрионов могут быть последовательно изображены во время одного сеанса визуализации таймлапса. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 2
Рисунок 2:Визуальное руководство по микроинъекции 1-клеточных эмбрионов рыбок данио. (A) Предметы для включения в инъекционный набор (по часовой стрелке): коробка среднего размера, которая может вместить весь комплект с одноразовыми нитриловыми перчатками; блюдо, содержащее микроинъекцию игл; щипцы; аликвота минерального масла и разрезанные квадраты парапленки; микрозагрузочные наконечники; разбавленные РНК на льду; агарозная литье под давлением; маркер; ролик/передаточная пипетка; и пипетка P10. (B) Микроинъекция: рассекающий микроскоп рядом с пикоинжектором, который подключен к внешнему источнику сжатого газа. Ножная педаль и микроманипулятор прикреплены к пикоинжектору. Микроманипулятор оснащен игольчатым держателем и расположен на месте над ступенькой микроскопа. (C)Форма для литья агарозы, содержащая шесть рядов канавок с углом 90 градусов с одной стороны и углом 45 градусов с другой стороны. (D) Передняя панель пико-инжектора. Индикатор давления считывает 7,8 PSI; это можно настроить с помощью ручки с надписью Pinject. Внизу есть кнопки, чтобы вручную вызвать давление для инъекции, изменить время инъекции или очистить, заполнить или удерживать жидкость в игле. Время впрыски устанавливается на 08 (эквивалентно 8 x 10 мс). Выходной шланг подключается квыходу P и прикрепляется к инъекционной игле. Переключатель источника измерителя давления установлен на Pинжектор при установке давления впрыска, и его можно переключить набаланс P для регулировки базального давления, приложенного к игле, когда инъекции не производятся. Регуляторбаланса P находится рядом с регуляторомвпрыскивания P. Кнопка питания горит, указывая на то, что устройство включено. Взрослыерыбки данио спариваются в небольших резервуарах для размножения, которые содержат гнездовой резервуар с сетчатым дном, которое отделяет взрослых рыб от оплодотворенных яиц и позволяет легко размножаться. Уровень воды понижается, чтобы имитировать условия мелководья, а разделители резервуаров удаляются, чтобы инициировать брачное поведение. (F)Передняя панель съемника микропипетки (иглы): содержит дисплей, который показывает конкретные условия, используемые для вытягивания игл. Значение давления P = 500, за которым следуют последняя дата и время редактирования программы, номер программы: HEAT = 546, PULL = 130, VEL = 70 и TIME = 90. (G) Один стеклянный капилляр вставляется в съемник микропипетки (иглы) и закрепляется на месте. Каждый запрограммированный пробег приводит к двум длинным конусным иглам (красные наконечники стрел). (H)Разбавление РНК обратно загружается в иглу; фенольный красный краситель позволяет легко визуализировать раствор. (I)После разрыва кончика иглы болюс РНК измеряется с помощью окулярной прицели на рассекающей области. Для этого стереомикроскопа при 30-кратном общем увеличении 6 хэш-меток равно 1 нЛ громкости. (J) Оплодотворенные яйца загружаются в агарозную форму для литья под давлением и распределяются вдоль желобов формы с помощью роликовой пипетки. (K) Форма для инъекций, содержащая эмбрионы одноклеточной стадии, позиционируется под микроскопом, и эмбрионы вводятся последовательно. (L)Инъекционная игла вводится в каждый эмбрион, нацеленный на одну клетку. (M) Оказавшись в клетке, ножная педаль используется для запуска регулируемого количества давления и высвобождения 1 нЛ РНК в клетку эмбриона (как визуализируется феноловым красным). Шкала стержней: I = 0,1 мм; L, M = 0,5 мм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 3
Рисунок 3:Наглядное руководство по монтажу эмбрионов для визуализации. (А)Монтажная установка (слева направо): тепловой блок, запрограммированный на 42 °C, нагревательные трубки из низкоплавкой агарозы; роликовая пипетка; пара щипцов; блюдо, покрытое агарозой, содержащее дехорионированные эмбрионы; и рассекающий стереомикроскоп, подключенный к металлогалогенной люминесцентной лампе. (B,B',B'') Эмбрион мощностью 11 л.с.ф., в который вводят мРНК EGFP-CAAX и мРНК mCherry-H2A, показанные под ярким полем, флуоресценцией GFP и флуоресценцией mCherry соответственно. (С,С') Стеклянная пастерная пипетка, содержащая агарозу и эмбрион, сидящий в наконечнике; C' — увеличенное представление. (D,D') Один эмбрион, вмонтированный в каплю низкоплавкой агарозы на стеклянной тарелке, видимой как со сцены микроскопа, так и через окуляры микроскопа. (E,E') 12 эмбрионов, установленных в отдельных каплях низкоплавкой агарозы на стеклянной тарелке с дном, видимых как со сцены микроскопа, так и через окуляры микроскопа. (F,F',F'',F''') Все смонтированные эмбрионы накладываются полным слоем агарозы для заполнения дна тарелки, видимой как со сцены микроскопа, так и с окуляров микроскопа, показанных в ярком поле; Ф'' Флуоресценция GFP; и флуоресценция F''' mCherry. (G)Оптимальный образец при 12 л.с.ф. установлен дорсально и ориентирован вертикально на одной линии с 12 и 6 часами с обеими оптическими везикулами в одной плоскости. (H)Неоптимальный образец: хотя установленные дорсально и оптические везикулы находятся в плоскости друг с другом, этот образец ориентирован на диагональную ось и будет расти из размера кадра по мере развития. (I)Неоптимальный образец: этот образец чрезмерно повернут и не является дорсальным креплением, в результате чего передняя часть зрительного везикулы не будет захвачена во время таймлапса. (J) Неоптимальный образец: этот образец недостаточно повернут и не является дорсальным креплением, в результате чего задняя часть зрительного везикулы не будет захвачена во время таймлапса. Пунктирные линии обозначают каждое зрительное везикуло. Шкала стержней: B = 0,1 мм; D' = 1,5 мм; E', F' = 2,5 мм; G = 0,1 мм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 4
Рисунок 4: Настройка таймлапса с несколькими позициями и потенциальных результатов. (A) Лазерный сканирующий конфокальный микроскоп. (B) Пьезо-Z-ступеньная вставка. (C) Дно стеклянной нижней чашки, содержащей эмбрионы, встроенные в агарозу, покрыто иммерсионной средой, соответствующей показательу преломления воды. (D) Капля погружной среды помещается на объектив 40x W (большое рабочее расстояние). (E) Блюдо удерживается на месте с помощью сценической вставки, Е3 добавляется поверх слоя агарозы, а крышка закрепляется пластиной глиной. (F) Настройки программного обеспечения для сбора данных: нужные лазерные линии включены в раскрывающемся меню. Для эмбрионов, которым вводят РНК EGFP-CAAX и РНК H2A-mCherry, включены лазеры Аргон и DPSS 561-10. Красная подсветка указывает на то, что аргоновой лазер нагревается. Чтобы найти образец над объективом, проходящий свет включается через панель управления микроскопом. И EGFP, и mCherry назначаются на трек 1 (для одновременной визуализации), и диапазон каждого детектора устанавливается. Здесь диапазон EGFP установлен на 494-545 нм, а диапазон mCherry установлен на 598-679 нм. Под Каналами меню, мощность лазера может быть установлена. После того, как лазеры прогрелись, мощность может быть увеличена до 5,0, а коэффициент усиления (мастер) может быть отрегулирован. Точечный отверстие установлено на уровне 60,2, что равно 1,63 воздушным единицам или сечению 1,6 мкм. Под Приобретение , размер кадра установлен на 512 x 384, скорость сканирования - 9,0, усреднение - двунаправленное, а масштаб - 0,7. Под Z-стек меню, первая и последняя позиция по оси Z устанавливаются во время сканирования конфокала. Интервал (размер шага) устанавливается равным 2,1 мкм. При выборе первой и последней Z-позиции обычно сохраняется стандартное количество в 63 слайса; это приспосабливается к общему росту глаза. Выбрана опция "использовать пьезо". Под Позиции , каждая выбранная позиция указана, включая присвоенный номер и позицию X, Y и Z. Есть дополнительные кнопки для управления количеством эмбрионов (отдельные позиции) на изображении, включая добавление, обновление или удаление. Под Временной ряд , цикл установлен на 300 (количество Z-стеков, которые будут получены), а интервал (шаг времени) установлен на 2,5 мин. После завершения настройки получение таймлапса инициируется нажатием кнопки start. Программное обеспечение покажет срез Z-стека, цикл и положение, которое в настоящее время сканируется. Когда таймлапс завершен, файл сохраняется, щелкнув значок дискеты в Изображения и документы панель. (G-J) Клеточные мембраны (green) маркируются EGFP-CAAX и клеточными ядрами (хроматин, magenta) маркируются ННК H2A-mCherry. (G,G',G'') Пример установки первого и последнего Z-среза для оптимально смонтированного образца. Первый Z-срез (на дорсальной стороне) происходит за счет дорсальной эктодермы, в то время как последний Z-срез (на вентральной стороне) находится значительно ниже зрительного везикулы, чтобы приспособиться к его росту в вентральном направлении. (H,H',H'') Пример установки первого и последнего Z-среза неоптимального образца. Образец имеет слабую флуоресценцию mCherry и установлен по диагонали, так что развивающаяся оптическая чашка вряд ли останется в кадре на время таймлапса. (Я, Я, Я, Я) Пример таймлапса из оптимальной выборки. Односрезовые изображения из середины Z-стека берутся из всего объема 63 фрагментов в 4 временных точках (значение T). Br, мозг; NR, нервная сетчатка; РПЭ, пигментированный эпителий сетчатки; Ле, объектив. (J,J',J'',J''') Пример таймлапса из неоптимальной выборки. В этом случае образец выезжал из Z-плоскости и захватывалась только косая часть передней оптической чашечки. Шкала стержней: G, I = 50 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Фильм 1: Замедление морфогенеза оптической чашечки у оптимального эмбриона дикого типа. Дорсальный вид эмбриона дикого типа, который помечен EGFP-CAAX (плазматические мембраны, зеленый)и H2A. F/Z-mCherry (хроматин, пурпурный). Таймлапс составляет ~ 12-24 л.с. и содержит один конфокальный раздел из всего набора данных 4D. Временной интервал между z-стеками составляет 2,5 мин и отображается на уровне 22,5 кадров в секунду. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот фильм.

Discussion

Здесь мы описываем протокол для маркировки in toto и 4D-визуализации таймлапса морфогенеза оптической чашки. Мы проходим через процесс генерации закрытой РНК, кодирующей флуоресцентные белки, для маркировки различных субклеточных компартментов; инъекции 1-клеточных эмбрионов рыбок данио; встраивание 11 эмбрионов HPF в агарозу для мультиплексированной визуализации; и получение 4D-наборов данных нескольких эмбрионов на время морфогенеза оптической чашки (12–24 л.с.ф.).

С помощью этих наборов данных с большим количеством информации можно ответить на множество вопросов. 4D-данные могут быть визуализированы и количественно проанализированы различными способами. Хотя это выходит за рамки этого протокола, мы включаем здесь некоторые из наших целей и стандартных приложений в качестве примера типов вещей, которые могут быть достигнуты. Конечно, методы количественного анализа изображений постоянно разрабатываются, и могут использоваться как коммерчески доступные, так и специально созданные инструменты. Если кто-то не использовал такие методы раньше, он должен быть готов проработать некоторую оптимизацию, чтобы убедиться, что полученные наборы данных адекватны для количественного анализа.

Визуализация и количественная оценка наборов данных 4D может быть сложной задачей из-за размера файлов. Программное обеспечение для сбора может использоваться для разделения наборов данных на отдельные эмбрионы, а ImageJ / Fiji может использоваться для преобразования конфокальных файлов из коммерческих форматов в более стандартные стеки tif, в которых каждая точка времени сохраняется как отдельный файл. Это уменьшит размеры файлов и стандартизирует форматы файлов. Отдельные оптические секции от каждой точки времени могут быть собраны в виде 2D (XY) таймлапса с использованием ImageJ / Fiji, что обеспечивает быструю 2D-визуализацию и оценку данных. Фильм 1 является примером именно этого: один оптический срез с течением времени, собранный как таймлапс оптимального образца, показанного на рисунке 4I–I'''. Оттуда, для 3D и 4D визуализации, мы обычно используем FluoRender35,36, который находится в свободном доступе, но имеет конкретные требования к видеокарте. С помощью FluoRender можно поворачивать 3D-визуализированные данные по любой оси, визуализировать набор данных в 4D с течением времени, генерировать вырезы в любой плоскости и сохранять повороты и визуализации в виде фильма или серии изображений tif.

С точки зрения количественного анализа, есть множество вопросов, на которые нужно ответить. Мы разработали собственное программное обеспечение, чтобы помочь нашим собственным конкретным целям понимания поведения клеток, лежащего в основе морфогенеза оптической чашки. Наша программа, LongTracker, использует ядерный сигнал в качестве прокси для позиции для отслеживания ячеек13. С помощью этих данных мы можем определить, когда, где и как движутся клетки; как быстро и как далеко движутся клетки; и как часто клетки делятся. В дополнение к нашему собственному программному обеспечению, существует несколько коммерчески доступных и изготовленных на заказ вариантов отслеживания 4D-клеток. Мы также разработали программу LongAxis для проведения сегментации клеток и количественной оценки формы и организации клеток в нейронной сетчатке37. Однако наборы данных, вводимые в LongAxis, представляют собой одиночные Z-стеки, взятые с высоким разрешением. Постоянной проблемой является создание наборов данных таймлапса с достаточно высоким разрешением, чтобы клетки можно было сегментировать с уверенностью, а их морфологию экстраполировать. Одной из альтернатив является мозаичная (разреженная) маркировка с использованием фотоконвертируемого флуорофора, такого как Kaede, для прямой визуализации формы клеток, как мы и другие проводили в развивающемся глазу8,11,13. Это упрощает задачу сегментации клеток, а форма и размер клеток могут быть легко количественно определены с помощью 3D-рендеринга в FluoRender.

Каждый шаг этого протокола был оптимизирован специально для наших целей. Специфика этого протокола приводит к нескольким ограничениям: протокол, как написано, не оптимизирован для визуализации других аспектов развития глаз рыбок данио (таких как нейрогенез сетчатки), других глазных структур, других стадий развития или других субклеточных компартментов. Ориентация внедрения, скорость визуализации и метки — все это предназначено для того, чтобы мы могли ответить на наши биологические вопросы. Например, для того, чтобы изобразить нейрогенез сетчатки, дорсальная ориентация эмбриона, описанная здесь, может не позволять визуализировать конкретные особенности, представляющие интерес, и скорость визуализации может быть не подходящей. Многие аспекты протокола могут быть адаптированы и изменены для различных потребностей, в зависимости от конкретных интересов и целей. Во-первых, использование инъекций РНК делает процесс маркировки очень гибким. Флуоресцентные конструкции слияния белков могут быть использованы для маркировки субклеточных структур, представляющих интерес, а количество инъекций РНК может быть изменено для оптимизации маркировки. Основываясь на нашей работе с фотоконвертируемым флуорофором Kaede, инъекции РНК, по-видимому, поддерживают всплеск трансляции, который заканчивается на 12 л.с.11,13. Высокие уровни экспрессии флуоресцентного белка от инъекции РНК могут бороться с фотоотбеливанием, но такой подход не поддерживает устойчивую экспрессию интересующей флуоресцентной метки. Если необходима устойчивая экспрессия, например, при визуализации эмбрионов на более поздних стадиях, трансгенные линии являются вариантом, а построение новых линий у рыбок данио является простым24.

Далее протокол может быть адаптирован для более поздних стадий разработки. Поскольку пигмент может препятствовать визуализации на более поздних стадиях, эмбрионы можно лечить фенилтиомочевиной (ПТУ) для ингибирования образования пигмента, или можно использовать генетические мутанты для синтеза пигмента. Чтобы предотвратить подергивание эмбриона, трикаин может быть добавлен к растворам наложения агарозы и эмбриональной среды, а процент агарозы может быть скорректирован по мере необходимости. По мере роста глаза может потребоваться изменение ориентации крепления; здесь мы монтируем эмбрионы дорсально, но на более поздних стадиях может иметь смысл монтировать латерально или с передней частью, в зависимости от интересующей структуры. Поскольку различные процессы происходят в разных пространственных и временных масштабах, можно также оптимизировать Z-шаг и временной шаг получения изображения. Эти особенности действительно могут быть определены только эмпирически для потребностей каждой лаборатории.

Наконец, этот протокол был разработан специально для лазерного сканирующего конфокального микроскопа, с эмбрионами, встроенными в относительно высокий процент агарозы на ранней стадии развития глаз. Если кто-то проводит визуализацию в разное время или в разных местах во время развития глаз, этот протокол необходимо будет адаптировать для интересуя. В настоящее время возможно множество различных подходов к визуализации, причем другие разрабатываются оптическими инженерами. Каждый подход приносит свой собственный набор проблем, от различных способов встраивания и монтирования эмбрионов для визуализации, до различных размеров файлов и форматов. Мы излагаем соображения во введении, чтобы направлять процесс оптимизации, в котором максимальное пространственное и временное разрешение сбалансировано с фотоотбеливанием, фототоксичностью и огромными размерами файлов. Мы надеемся, что эти общие принципы, в дополнение к практической информации, описанной выше, помогут другим в создании подходов к визуализации таймлапса для изучения многих открытых вопросов в развитии глаз.

Disclosures

Авторам нечего раскрывать.

Acknowledgments

Мы благодарны бывшим и нынешним членам Kwan Lab за работу над подходами к таймлапсу и обсуждения этого протокола. Эта работа была поддержана NIH (R01 EY025378 и R01 EY025780 для KMK; F31 EY030758 в SL; и T32 GM007464 в MAC).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Delta TPG Dish 0.17mm clear Bioptechs 0420041500C coverglass bottom for optical compatibility
Disposable Pasteur Pipettes VWR 14672-608 overall length 14.6 cm (53/4")
Dumont #5, #55, or #5SF Forceps Fine Science Tools 11254-20 For style #5: straight tip, 0.05 x 0.01 mm tip, inox, 11 cm long
Flaming/Brown Micropipette Puller Sutter P-97
Immersol W Carl Zeiss Microscopy 4449690000000 immersion fluid for water-emission objectives, halogen-free, low fluorescence
Microinjection Mold Adaptive Science Tools TU-1 Six ramps, one 90 degree and one 45 degree beveled side.
Microloader Tips Eppendorf 930001007 Microloader, tip for filling glass microcapillaries, 0.5 – 20 µL
mMessage mMachine SP6 Transcription Kit Invitrogen AM1340 contains SP6 Enzyme Mix, 10X Reaction Buffer, 2XNTP⁄CAP Solution, GTP Solution, pTRI-Xef, TURBO DNase, Ammonium Acetate Stop Solution, Lithium Chloride Precipitation Solution, and Gel Loading Buffer and are all stored at –20°C. Nuclease-free Water may be stored at any temperature.
Nikon SMZ645 Stereo Microscope Nikon SMZ645 used for injecting embryos (see Fig. 2B)
NotI-HF enzyme NEB R3189S comes with Gel Loading Dye, Purple (6X)
NuSieve GTG Agarose Lonza 50081 fine resolution, low melt agarose
Objective LD "C-Apochromat" 40x/1.1 W Korr M27 Carl Zeiss Microscopy 421867-9970-000
Olympus SZX16 Stereo Microscope Olympus SZX2-ZB16 used for screening, embedding embryos (see Fig. 3A)
Phenol red solution Sigma-Aldrich P0290 0.5% in DPBS, sterile filtered, endotoxin tested, cell culture tested
Pico-liter Microinjector Harvard Apparatus PLI-100 Femtoliter to microliter injections; digital readouts for injection count, time, and pressure; contains 5 pressures including inject, balance, clear, fill, and hold
Pipette Pump Pipettor SP Bel-Art F37898 fits a disposable pasteur pipette, contains thumbwheel on side for aspirating or dispensing and plunger for quick emptying
Premium Thin Wall Borosilicate Glass Capillaries Warner Instruments G100T-4 1.0 x 0.78 mm
QIAquick PCR Purification Kit Qiagen 28106 contains QIAquick Spin Columns, Buffers, Collection Tubes (2 ml)
RNase-free H2O Invitrogen AM9906 DNase-Free, Molecular Biology Grade, RNase-Free
RNeasy Mini Kit Qiagen 74104 contains RNeasy Mini Spin Columns, Collection Tubes (1.5 ml and 2 ml), RNase-free Reagents and Buffers
Stage Attachment Z PIEZO WSB 500 Carl Zeiss Microscopy 432339-9000-000
Stage Insert Z PIEZO WSB Universal Carl Zeiss Microscopy 432339-9030-000
Zeiss LSM 880 with Airyscan Carl Zeiss Microscopy N/A inverted Axio Observer microscope
Zen Black 2.3 SP1 software Carl Zeiss Microscopy N/A Zeiss Efficient Navigation (ZEN) controls all light microscope systems from Zeiss

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Adler, R., Canto-Soler, M. V. Molecular mechanisms of optic vesicle development: complexities, ambiguities and controversies. Developmental Biology. 305 (1), 1-13 (2007).
  2. Chow, R. L., Lang, R. A. Early eye development in vertebrates. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 17, 255-296 (2001).
  3. Fuhrmann, S. Eye morphogenesis and patterning of the optic vesicle. Current Topics in Developmental Biology. 93, 61-84 (2010).
  4. Martinez-Morales, J. R., Wittbrodt, J. Shaping the vertebrate eye. Current Opinion in Genetics and Development. 19 (5), 511-517 (2009).
  5. Yang, X. J. Roles of cell-extrinsic growth factors in vertebrate eye pattern formation and retinogenesis. Seminars in Cell & Developmental Biology. 15 (1), 91-103 (2004).
  6. Bogdanovic, O., et al. Numb/Numbl-Opo antagonism controls retinal epithelium morphogenesis by regulating integrin endocytosis. Developmental Cell. 23 (4), 782-795 (2012).
  7. Bryan, C. D., Casey, M. A., Pfeiffer, R. L., Jones, B. W., Kwan, K. M. Optic cup morphogenesis requires neural crest-mediated basement membrane assembly. Development. 147 (4), (2020).
  8. Bryan, C. D., Chien, C. B., Kwan, K. M. Loss of laminin alpha 1 results in multiple structural defects and divergent effects on adhesion during vertebrate optic cup morphogenesis. Developmental Biology. 416 (2), 324-337 (2016).
  9. Cavodeassi, F., Ivanovitch, K., Wilson, S. W. Eph/Ephrin signalling maintains eye field segregation from adjacent neural plate territories during forebrain morphogenesis. Development. 140 (20), 4193-4202 (2013).
  10. England, S. J., Blanchard, G. B., Mahadevan, L., Adams, R. J. A dynamic fate map of the forebrain shows how vertebrate eyes form and explains two causes of cyclopia. Development. 133 (23), 4613-4617 (2006).
  11. Gordon, H. B., et al. Hedgehog signaling regulates cell motility and optic fissure and stalk formation during vertebrate eye morphogenesis. Development. 145 (22), (2018).
  12. Ivanovitch, K., Cavodeassi, F., Wilson, S. W. Precocious acquisition of neuroepithelial character in the eye field underlies the onset of eye morphogenesis. Developmental Cell. 27 (3), 293-305 (2013).
  13. Kwan, K. M., et al. A complex choreography of cell movements shapes the vertebrate eye. Development. 139 (2), 359-372 (2012).
  14. Martinez-Morales, J. R., et al. Ojoplano-mediated basal constriction is essential for optic cup morphogenesis. Development. 136 (13), 2165-2175 (2009).
  15. Miesfeld, J. B., et al. Yap and Taz regulate retinal pigment epithelial cell fate. Development. 142 (17), 3021-3032 (2015).
  16. Nicolas-Perez, M., et al. Analysis of cellular behavior and cytoskeletal dynamics reveal a constriction mechanism driving optic cup morphogenesis. eLife. 5, (2016).
  17. Picker, A., et al. Dynamic coupling of pattern formation and morphogenesis in the developing vertebrate retina. PLoS Biology. 7 (10), e1000214 (2009).
  18. Rembold, M., Loosli, F., Adams, R. J., Wittbrodt, J. Individual cell migration serves as the driving force for optic vesicle evagination. Science. 313 (5790), 1130-1134 (2006).
  19. Sidhaye, J., Norden, C. Concerted action of neuroepithelial basal shrinkage and active epithelial migration ensures efficient optic cup morphogenesis. eLife. 6, (2017).
  20. Driever, W., et al. A genetic screen for mutations affecting embryogenesis in zebrafish. Development. 123, 37-46 (1996).
  21. Haffter, P., et al. The identification of genes with unique and essential functions in the development of the zebrafish, Danio rerio. Development. 123, 1-36 (1996).
  22. Nusslein-Volhard, C. The zebrafish issue of Development. Development. 139 (22), 4099-4103 (2012).
  23. Hoshijima, K., et al. Highly efficient CRISPR-Cas9-based methods for generating deletion mutations and F0 embryos that lack gene function in zebrafish. Developmental Cell. 51 (5), 645-657 (2019).
  24. Kwan, K. M., et al. The Tol2kit: a multisite gateway-based construction kit for Tol2 transposon transgenesis constructs. Developmental Dynamics. 236 (11), 3088-3099 (2007).
  25. Almeida, A. D., et al. Spectrum of Fates: a new approach to the study of the developing zebrafish retina. Development. 141 (9), 1971-1980 (2014).
  26. Baye, L. M., Link, B. A. Interkinetic nuclear migration and the selection of neurogenic cell divisions during vertebrate retinogenesis. The Journal of Neuroscience. 27 (38), 10143-10152 (2007).
  27. Clark, B. S., et al. Loss of Llgl1 in retinal neuroepithelia reveals links between apical domain size, Notch activity and neurogenesis. Development. 139 (9), 1599-1610 (2012).
  28. Das, T., Payer, B., Cayouette, M., Harris, W. A. In vivo time-lapse imaging of cell divisions during neurogenesis in the developing zebrafish retina. Neuron. 37 (4), 597-609 (2003).
  29. Kay, J. N., et al. Transient requirement for ganglion cells during assembly of retinal synaptic layers. Development. 131 (6), 1331-1342 (2004).
  30. Norden, C., Young, S., Link, B. A., Harris, W. A. Actomyosin is the main driver of interkinetic nuclear migration in the retina. Cell. 138 (6), 1195-1208 (2009).
  31. Suzuki, S. C., et al. Cone photoreceptor types in zebrafish are generated by symmetric terminal divisions of dedicated precursors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (37), 15109-15114 (2013).
  32. Wan, Y., et al. The ciliary marginal zone of the zebrafish retina: clonal and time-lapse analysis of a continuously growing tissue. Development. 143 (7), 1099-1107 (2016).
  33. Yoshimatsu, T., et al. Presynaptic partner selection during retinal circuit reassembly varies with timing of neuronal regeneration in vivo. Nature Communications. 7, 10590 (2016).
  34. Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Developmental Dynamics. 203 (3), 253-310 (1995).
  35. Wan, Y., Otsuna, H., Chien, C. B., Hansen, C. An interactive visualization tool for multi-channel confocal microscopy data in neurobiology research. IEEE Transactions on Visualization and Computer Graphics. 15 (6), 1489-1496 (2009).
  36. Wan, Y., Otsuna, H., Chien, C. B., Hansen, C. FluoRender: an application of 2D image space methods for 3D and 4D confocal microscopy data visualization in neurobiology research. IEEE Pacific Visualization Symposium. , 201-208 (2012).
  37. Carney, K. R., Bryan, C. D., Gordon, H. B., Kwan, K. M. LongAxis: a MATLAB-based program for 3D quantitative analysis of epithelial cell shape and orientation. Developmental Biology. 458 (1), 1-11 (2020).

Tags

Неврология Выпуск 171 визуализация микроскопия таймлапс морфогенез зрительное везикуло оптическая чашка развитие рыбка данио глаз сетчатка
4-мерная визуализация морфогенеза оптической чашки рыбок данио
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lusk, S., Casey, M. A., Kwan, K. M.… More

Lusk, S., Casey, M. A., Kwan, K. M. 4-Dimensional Imaging of Zebrafish Optic Cup Morphogenesis. J. Vis. Exp. (171), e62155, doi:10.3791/62155 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter