Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

4-dimensionell avbildning av Zebrafish Optic Cup Morphogenesis

Published: May 26, 2021 doi: 10.3791/62155
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Human Genetics, University of Utah

Summary

Detta protokoll beskriver en metod för in toto märkning och flerdimensionell bildframställning av zebrafisk tidiga ögon utveckling. Vi beskriver märkning, inbäddning och fyrdimensionell (4D) bildbehandling med laser scanning confocal mikroskopi och överväganden för att optimera förvärv av data uppsättningar för dissekering mekanismer för optik kopp morfogenes.

Abstract

Visuell systemfunktion kräver inrättandet av exakta vävnads- och organstrukturer. I ryggradsdjur ögat, strukturella defekter är en vanlig orsak till synnedsättning, men mekanismer för ögat morfogenes är fortfarande dåligt förstådda. Den grundläggande organisationen av det embryonala ögat bevaras i hela ryggradsdjur, så levande avbildning av zebrafiskembryon har blivit ett kraftfullt tillvägagångssätt för att direkt observera ögonutveckling i realtid under normala och patologiska förhållanden. Dynamiska cellprocesser inklusive rörelser, morfologier, interaktioner, delning och död kan visualiseras i embryot. Vi har utvecklat metoder för enhetlig märkning av subcellulära strukturer och timelapse confocal mikroskopi av tidig ögonutveckling i zebrafisk. Detta protokoll beskriver metoden att generera kapsejsat mRNA för injektion i 1-cells zebrafiskembryon, montera embryon i optiskt vesikelstadium (~ 12 timmar efter befruktning, hpf) och utföra flerdimensionell timelapse imaging av optik kopp morfogenes på en laser scanning confocal mikroskop, så att flera datamängder förvärvas sekventiellt i samma bildbehandling session. En sådan metod ger data som kan användas för en mängd olika ändamål, inklusive cellspårning, volymmätningar, tredimensionell (3D) rendering och visualisering. Våra metoder gör det möjligt för oss att fastställa de cellulära och molekylära mekanismerna som driver utvecklingen av optiska koppar, både i vilda och genetiska mutantförhållanden. Dessa metoder kan användas direkt av andra grupper eller anpassas för att visualisera många ytterligare aspekter av zebrafiskens ögonutveckling.

Introduction

Ryggradsdjur ögonutveckling börjar med uppkomsten, eller evagination, av de optiska blåsorna från den prospektiva hjärnan neuroepithelium. De optiska blåsorna genomgår sedan en serie vävnadsformförändringar, långsträckning och sedan invaginating för att generera optikkoppen. I den optiska koppen, neurala näthinnan och retinal pigment epitel, båda härrör från neuroepithelium, omskansa den gryende linsen, som härrör från ytan ectoderm. Hela processen kräver en komplex serie cell- och vävnadsrörelser och molekylär signalering, samordnad mellan neuroepithelium, ektoderm och mesenkymala cellpopulationer. Dessa inledande händelser etablerar den grundläggande strukturen i ögat, och senare steg av ögonutveckling, inklusive iris och hornhinnans bildande, är utarbetanden på tidig organisation. Störningar i tidig ögonutveckling och morfogenes ligger till grund för många synnedsättningsförhållanden hos människor, inklusive anophthalmia, mikroftalmi och koloboma. Att låsa upp de cellulära och molekylära mekanismerna som styr optikkoppsmorfos är avgörande för att ytterligare förstå visuell systemutveckling och de patologiska förhållanden som uppstår när dessa processer går snett.

Vår förståelse av ryggradsdjur ögonutveckling och morfogenes uppstod från en enorm mängd arbete som spänner över klassiska histologiska studier till embryologiska och genetiska metoder i en mängd olika modellorganismer inklusive mus, kyckling, groda och fisk1,2,3,4,5. Medan denna arbetskropp etablerade molekylära mekanismer som reglerar tidig ögonutveckling, finns det historiskt en dålig förståelse för ögats morfogenes: framväxten av dess 3D-struktur. Huvuddelen av dessa fynd har kommit från bildbehandling sektionerade embryon vid diskreta tidpunkter. Medan detta är tillräckligt för att ge en bild av vävnad morfologi i 2 dimensioner, morfogenes är en dynamisk, 3D process. För att bestämma hur vävnadens form förändras i 3 dimensioner över tid, hur enstaka celler beter sig och hur dessa beteenden bidrar till förändringar i 3D-vävnadsformen är olika metoder nödvändiga.

En lösning för att ta itu med denna betydande kunskapslucka är levande avbildning, vilket möjliggör dynamisk observation av celler och vävnader i realtid när organet tar form. Tyvärr är detta inte lätt genomförbart i många modellorganismer på grund av begränsningarna i embryonal utveckling. Till exempel är mus- och kycklingembryon (som utvecklas in utero eller inom ett äggskal) inte lätta att komma åt, och många levande embryon är inte optiskt transparenta, vilket orsakar betydande ljusspridning och begränsar djupet till vilket bilder kan förvärvas. Zebrafisk, med extern utveckling och transparenta embryon, ger en unik möjlighet att utföra levande avbildning av ögonmorfogenes6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19. Det finns gott om transgena och mutanta linjer, liksom verktyg för att generera nya transgener och mutanter20,21,22,23,24. Vidare uppstår optik kopp morfodrar snabbt i zebrafisk, över en 12 h tidsram (12-24 timmar efter befruktning, hpf), vilket gör avbildning av hela processen genomförbar.

Live imaging ansträngningar har påskyndats genom expansion och optimering av familjen fluorescerande proteiner, som möjliggör genetiskt kodad vital märkning av subcellulära strukturer, liksom förbättringar och innovationer till mikroskopimetoder. Protokollet som beskrivs här använder laser scanning confocal mikroskopi, snarare än andra nuvarande metoder för att avbilda zebrafisk embryogenes, inklusive spinning disk confocal mikroskopi, selektiv plan belysning mikroskopi (SPIM och dess varianter) och andra mer specialiserade mikroskopi metoder. För det utvecklande zebrafiskögat fann vi att spinnskiva konfokal mikroskopi inte var tillräckligt för avbildning djupare i vävnaden. Även om SPIM har en extremt snabb bildtid och blir allt vanligare, är hanteringen av de stora datamängderna för visualisering och analys fortfarande en utmaning. Däremot är laserskanning konfokal mikroskopi lättillgänglig, särskilt för individer som saknar expertis för att montera optisk hårdvara. Vi hoppas att den stora tillgängligheten av laserskanning konfokal mikroskopi kommer att göra vårt protokoll användbart för många laboratorier.

Här beskriver vi vår metod för att fånga 4D-datamängder av optikkoppsmorfogenes, med hjälp av in toto-märkning av embryot för membran och kromatin, och ett laserskanningskonfokalt mikroskop för bildförvärv (schematiserat i figur 1). Fluorescerande proteiner som används här (EGFP-CAAX och H2A. F/Z-mCherry) valdes för att ge vävnadsmärkning med encellsupplösning. Vi använder data uppsättningar som genereras med det här protokollet för en mängd olika bild analys och visualiserings funktioner. Detta protokoll kan enkelt anpassas om andra subcellulära strukturer önskas. Plasmamembranmärkning valdes för visualisering av cellform: vi använder EGFP-CAAX, där de sista 21 aminosyrorna i H-ras, som fungerar som en prenylationssignalsekvens, smälts till C-ändstationen i EGFP13. Andra plasmamembran riktade fluorescerande proteiner (t.ex. transmembranfusion eller myristoylated) kommer sannolikt att fungera lika bra. För att markera atomkärnor valde vi H2A. F/Z-mCherry, där mCherry smälts till ett histonprotein13. Detta säkerställer att celldelning, inklusive mitotisk spindelorientering, enkelt visualiseras.

Med alla live-avbildnings tillvägagångssätt måste man överväga kompromisser mellan att öka bildhastigheten samtidigt som man maximerar signal-till-brus-förhållandet, axiell upplösning och prov bevarande. Vi har optimerat våra metoder för att maximera bildkvaliteten och antalet embryon som kan avbildas på ett enda sätt. Ofta är målet att avbilda optisk kopp morfogenes i ett homozygous mutant embryo, som kan vara fenotypiskt oskiljbara från vild typ vid uppkomsten av optik kopp morfogenes och avkomman till en heterozygous incross (25% av embryona är önskad genotyp). Genom att optimera, och sedan multiplexera bildförvärv, finns det en ökad sannolikhet att fånga en datauppsättning av ett homozygous mutant embryo.

Temporal upplösning, eller hur ofta volym data (Z-stackar) förvärvas, är en viktig aspekt av timelapse imaging. Beroende på syftet med sådana datamängder finns det olika krav på hastighet. Ursprungligen utvecklades detta protokoll för manuell 4D-cellspårning. Spårning av enskilda celler i en enhetligt märkt vävnad kräver tillräckligt hög temporal upplösning för att ge förtroende för att en cell kontinuerligt spåras över tiden. Vi fann att Z-staplar av zebrafiskoptisk kopp morphogenesis måste förvärvas minst var 3,1 min över 12 h; här har vi optimerat vårt förvärv på ett laserskanningskonfokalt mikroskop så att vi kan förvärva Z-staplar på 4-5 embryon var 2,5 minut.

Att fastställa Z-stegstorlek var ett avgörande steg i protokolloptimering: för 3D-rendering och visualisering är isotropa data idealiska, där Z-stegstorleken är lika med XY-pixeldimensionen. I verkligheten är det extremt svårt att få sådana timelapse-data med levande prover, med tanke på begränsningar med bildtid och fotoblekning. Därför är det viktigt att bestämma tillräcklig Z-stegstorlek för experimentets återgivnings- och visualiseringsbehov, och specifikt vad X:Y:Z voxel-förhållande behövs för att maximera axiell information samtidigt som hastigheten bibehålls och fotografering förhindras. För detta protokoll var voxelförhållandet fastställt 1:1:3.5 (0,6 μm x 0,6 μm x 2,1 μm Z-stegstorlek med hjälp av ett 40x långdistansvattensänkningsmål). Vid förvärv av ett Z-djup på 130-140 μm ger detta volymdata med lämplig temporal upplösning och liten fotoblekning.

Som diskuterats ovan är detta protokoll specifikt för 4D imaging av zebrafish optik kopp morfogenes, med embryon i toto märkta för plasma membran och kromatin, och en laser scanning confocal mikroskop. Protokollet nedan kan enkelt anpassas för en mängd olika experiment och behov. För det första, när det gäller subcellulära strukturer, kan alla strukturer för vilka det finns en levande cellmarkör avbildas. Därefter, även om fokus här uteslutande ligger på optik kopp morphogenesis, kan timelapse imaging anpassas för andra stadier av ögonutveckling, till exempel neurogenes25,26,27,28,29,30,31,32,33. För avbildning senare utveckling kan man behöva överväga embryo immobilisering (som spontan muskelaktivitet börjar runt 24 hpf), pigmentering (som börjar dyka upp runt 24 hpf), vävnadsstorlek (ögat växer betydligt i volym under neurogenes) och bildhastighet (som bör justeras beroende på hastigheten i processen av intresse). Alla dessa överväganden kan lätt hanteras. Protokollet är ganska flexibelt. Förutom detaljerna i det specifika protokollet här finns det allmänna principer som kommer att hjälpa dem som är intresserade av live imaging andra aspekter av ögonutveckling.

Protocol

Alla metoder som beskrivs här med zebrafisk omfattas av Dr. Kristen Kwans djurprotokoll, "Cellular and Molecular Mechanisms of Visual System Development in Zebrafish", och godkänts av Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) vid University of Utah.

1. Begränsad RNA-syntes

  1. Generera DNA-mallen för in vitro-transkription.
    1. Linjärisera DNA-mallen genom att smälta 10 μg DNA i 100 μL volym av reaktionsblandningen. En typisk reaktion monteras enligt följande: smält 10 μg DNA med 3 μL enzym och 10 μL buffert, för reaktionsvolymen till 100 μL med vatten.
      OBS: En typisk mall för smälta är en pCS2 vektor, till exempel pCS2-EGFP-CAAX eller pCS2FA-H2A.F/Z-mCherry för membranet och kromatin märkning beskrivs här. I detta fall smälts de plasmid DNAs var och en med enzymet NotI. Användare bör vara försiktiga med stjärnaktivitet; I detta fall rekommenderas ett enzym med hög återgivning och är kommersiellt tillgängligt.
    2. Inkubera reaktionen vid 37 °C över natten för att säkerställa att DNA:t smälts till färdigställande.
    3. Rengör begränsningssammanfattningen med hjälp av ett PCR-reningskit enligt tillverkarens protokoll. Eluera DNA:t med 30 μL ddH2O. Förvara det linjäriserade DNA:t vid -20 °C och använd vid behov.
      OBS: Mängden DNA som smälts och elueringsvolymen ger cirka 0,3 μg/μL; Detta är tillräckligt för ~ 5 rundor in vitro transkription, varje runda med ~ 2 μg DNA som mall.
  2. In vitro transkribering begränsad RNA med hjälp av en in vitro transkription kit. För pCS2-mallar (enligt beskrivningen här) använder du ett SP6-kit.
    1. Montera transkriptionsreaktionen in vitro enligt följande: Smält 2 μg DNA-mall eller upp till 6 μL med 2 μL 10x reaktionsbuffert, 10 μL 2x ribonukleotidblandning och 2 μL 10x enzymblandning.
    2. Inkubera vid 37 °C i 2-4 timmar eller längre (längre tider leder till högre utbyte). Om så önskas kan 1 μL enzymblandning kompletteras halvvägs genom inkubationstiden.
    3. Smält DNA-mallen genom att lägga till 1 μL RNase-fri DNase och inkubera i 15 minuter vid 37 °C.
  3. Rena det kapsejsade RNA med hjälp av ett RNA-reningskit enligt tillverkarens protokoll (se Materialförteckning ). Elute med 100 μL RNase-fritt H2O.
    OBS: Tillsats av β-mercaptoethanol är inte nödvändigt för denna applikation. Medan metoden som beskrivs i detta protokoll är enkel, kan alternativa reagenser också användas för att rena RNA.
  4. Fäll ut RNA.
    1. Tillsätt 10 μL 3 M RNase-fria NaOAc- och 2,5 volymer (~275 μL) iskallt RNase-fritt 100% EtOH till det eluterade RNA.
    2. Inkubera reaktionen vid -20 °C i 15-30 min. Snurra i 15 min vid hög hastighet vid 4 °C för att pelleta RNA.
      OBS: Pelleten ska vara synlig mot rörväggen. Det är bra att notera hur röret är justerat i centrifugen i detta steg, för att förutsäga var pelleten ska vara i slutet av snurret.
    3. Ta försiktigt bort EtOH med en spruta, var noga med att undvika uppvärmning, övertorkning eller lossning av pelleten. Återanvänd pelleten i 20 μL RNase-fri H2O.
    4. Kontrollera RNA för att säkerställa att syntesen lyckas. Använd 1 μL för att analysera koncentrationen på en spektrofotometer och kör 0,5 μL på en 1% agarosgel för att kontrollera om det finns ett eller två diskreta band, snarare än ett utstryk med låg molekylvikt. Utbytet av in vitro-transkriptionsreaktionen bör vara ~ 1 μg / μL.
    5. Aliquot och lagra RNA vid -20 °C eller -80 °C. RNA späds inte ut förrän omedelbart före injektioner.

2. Mikroinjektion av 1-cells zebrafiskembryon

OBS: Injicera 200-300 pg per RNA för att erhålla allestädes närvarande uttryck av kromatin och cellmembran i hela optik kopp morfogenes. Förbered 5-10 μL av RNA-utspädningen och ladda 2,5-5 μL/nål; planera för extra om nålen går sönder.

  1. Förskottspreparat för injektioner.
    1. Förbered en formsprutningsform för att underlätta justering och orientering av 1-cellsembryon för mikroinjektion. Smält 2% agaros i E3 (standard embryo medium) och häll i en Petri-skål. Flyta försiktigt formsprutningen (se Materialförteckningen)ovanpå den heta agarosen för att generera trågets avtryck i agarosen när den stelnar. När agarosen stelnat, ta bort formsprutningen.
      OBS: Formsprutningsrätter kan användas i flera månader; på E3 och förvaras vid 4 °C när den inte används.
    2. Dra mikroinjektionsnålar. Dra glasöverdrag till en lång avsmalning för att göra mikroinjektionsnålar med hjälp av en nåldragmaskin. Programmera maskinen som är specifik för den typ av kapillärer som används. För 1,0 x 0,78 mm borosilikat kapillärer använd följande program: värme = 546 °C, dra = 130, hastighet = 70, tid = 90 (Bild 2F). Förvara nålarna i en petriskål och säkra den med modelleringslera.
      OBS: Dragreceptet varierar beroende på maskin och glödtråd, och nya filament bör alltid kalibreras. Varje dragrunda producerar två nålar (figur 2G). gör detta flera gånger för att producera tillräckligt med nålar vid oavsiktliga brott och framtida experiment.
    3. Späd ut det kapade RNA:et för injektion. Späd både EGFP-CAAX och H2A-mCherry RNAs till 200-300 ng/μL koncentration med RNase-fri H2O och 1 μL fenolrött i en total volym av 5 μL (slutlig koncentration av fenolrött är 0, 1%). Snärta blandningen och snurra kort ner för att samla den totala volymen. Håll det utspädda RNA på is innan du injicerar.
  2. Injektion av 1-cells embryon
    1. När fisken börjar uppfödas, låt ~ 15-20 min för att säkerställa att äggen blir befruktade. Under denna tid, ladda nålen med 2,5-5 μL av RNA-utspädningen med hjälp av en P10- och P10-mikrolastarspets.
    2. Använd en picoinjector och kalibrera nålen med hjälp av en okularriktare (en mikrometerkalibreringsbild är också tillräcklig) för att mäta droppens volym (volym på en sfär = (4/3) * pi * radie^3). Justera injektionstiden och trycket så att injektionsvolymen är 1 nL (figur 2I).
    3. Ladda försiktigt ägg i formsprutningen med en rull-/överföringspipett (figur 2J). Om det är till hjälp, använd tång för att rulla embryon så att den enda cellen är synlig, antingen före eller under injektionen. Det är användarens preferens att använda en mikromanipulator.
    4. Injicera embryon i 1-cellsstadiet, rikta in sig på cellen och inte äggulan (figur 2M). Detta kommer att säkerställa en enhetlig märkning av det framväxande embryot.
  3. Höj embryon till önskat stadium (före 12 hpf, enligt standard iscensättning34). Injicerade embryon kommer att ha en fördröjd utveckling, så höj dem vid en något högre temperatur (29,0-29,5 °C) för att ta igen tid. Under eftermiddagen, kontrollera embryona och ta bort de som är döda för att bevara kopplingens hälsa.

3. Montering av optiska blåsor steg zebrafisk embryon för timelapse imaging

  1. Före montering, förbered 1,6% lågsmält agarosa i E3. Om du planerar flera bildexperiment, förbered ~ 20 ml lågsmält agarosa och lagra vid rumstemperatur. På dagen för embryomontering, smält detta för att generera en färsk alikvot (1-5 ml) i ett rör som kan placeras i ett 42 °C värmeblock före montering.
  2. Screenembryon för lyckad injektion och total ljusstyrka i fluorescens med hjälp av ett fluorescensmikroskop före montering. Ett idealiskt urval kommer att ha en stark EGFP- och mCherry-fluorescens och vara i rätt utvecklingsstadium (figur 3B - B').
    1. Screena embryon med hjälp av ett fluorescensmikroskop. Välj embryon som starkt uttrycker både EGFP och mCherry fluorescens för montering.
    2. Välj embryon som är 11 hpf. Räkna somiter för att korrekt iscensätta embryona34; vid 11 hpf ska det finnas 3 somiter, och vid 12 hkf finns det 6 somiter.
      OBS: Genom att montera embryon före 12 hkf (vid 11 hkf) kommer proverna att iscensättas på lämpligt sätt vid 12 hpf när timelapse börjar.
  3. Dechorionate embryon före montering. Gör detta antingen manuellt med fina tångar eller kemiskt med pronas (2 mg/ml). Med embryon så unga är det viktigt att dechorionation utförs inom en agarbelagd maträtt och att embryon inte kommer i kontakt med luft-vattengränssnittet.
  4. Använd en glasrullpipett, sug upp ett embryo och mata ut så mycket E3 som möjligt så att embryot sitter på spetsen av glasets Pasteur-pipett.
  5. Släpp embryot i agarosaröret från värmeblocket. Låt det sjunka ner i agarosen i några sekunder, sug sedan upp lite agarosa först och sedan embryot och se till att embryot förblir vid pipettens spets (Figur 3C - C ').
  6. Placera en skål med glasbotten för avbildning under ett dissekeringsomfång. Mata ut embryot och agarosen i en agarose droppe i glasbotten skålen. Använd tång för att mycket snabbt orientera, så att embryot är dorsala ner (toppen av huvudet på glasbotten). Låt agarose droppen härda (Figur 3D - D'). Detta steg måste ske snabbt, men noggrant, eftersom embryona i detta skede är bräckliga. Skadade embryon överlever inte timelapse-avbildningsprocessen.
    OBS: Det är viktigt att orientera alla embryon konsekvent för detta experiment. Vid utförandet av timelapse måste embryona passa inom det tilldelade synfältet samtidigt som ytterligare utrymme för den optiska vesikeln kan växa in i. En optimal orientering är att rikta in den främre bakre axeln hos alla embryon "vertikalt" eller längs klockan 12 och 6 på en urtavla (figur 3G).
  7. Montera mellan 10-12 embryon, vilket är mer än dubbelt så många som kommer att avbildas, så att de bästa proverna kan väljas när de har utvärderats på konfokalen (figur 3E - E '). Proverna kommer att utvärderas för ålder, enhetlighet i fluorescerande märkning och precision i monteringsorienteringen.
  8. Efter montering av embryona, pipett mer agarose för att helt täcka botten av skålen, vilket omsluter alla separata agarose droppar i en enda stor agarose skiva (Figur 3F - F '). En tillräcklig mängd agarose kommer att säkerställa att de enskilda embryodroppar eller hela skivan inte lyfter upp från botten av skålen och flyter ur sikte.
  9. När de härdats, överlägg agarosen med E3 för att hålla proverna hydratiserade under tidslapse-avbildningsexperimentet (ett problem beroende på byggnadens fuktighet och i miljön).
    OBS: Trikain är inte nödvändigt för dessa specifika timelapse imaging experiment, eftersom dessa embryon är tillräckligt unga; Men om så önskas, och om man arbetar med äldre stadier av embryon, kan trikain läggas till själva agaroset och överlagrad i media.
  10. Rita på papper en karta över embryona för enkel referens under timelapse-uppsättningen. Detta är avgörande för att senare associera positionen med genotypen för varje prov.

4. Flera positioner konfokal tidslapse med ett laserskanningskonfokalt mikroskop

OBS: Detta timelapse-bildprotokoll utformades för att användas med ett konfokalt mikroskop för laserskanning utrustat med tillverkarens programvara (se Materialförteckning ). Detta system är utrustat med en piezo Z-stegenhet som möjliggör snabb förvärv av Z-staplar. Laserlinjerna som används i detta protokoll är en 488 nm Argon jonlaser och en DPSS 561 nm laser. 561 nm lasern är väl lämpad för avbildning av mCherry fluoror: den är tillräckligt nära toppen av mCherry excitation (587 nm) och väldriven.

  1. Ställ in konfokalen.
    1. Sätt på konfokalen och logga in på den stationära datorn.
    2. Installera piezo Z-steginsatsen (Bild 4B), starta sedan förvärvsprogrammet.
    3. I programvaran i förvärvsläge aktiverar du lasern 488 och 561 med hjälp av rullgardinsmenyn (Bild 4F). Lasrarna tar flera minuter att värma upp, så det här steget utförs tidigt för att spara tid.
      OBS: Förvärvsparametrarna är följande: Markera rutorna Z-stack, Time Series och Position. Ställ in bildstorleken på 512 (X) x 384 (Y), skanningshastigheten till 9, skanna läget till dubbelriktat, Zooma till 0,7, Pinhole till 60,2 (1,63 luftiga enheter ~= 1,6 μm-sektion) och Z-intervall till 2,1 μm. Detta ger en bildstorlek på 303,6 μm x 227,7 μm och pixelstorleken 0,59 μm. Lasern 488 och 561 ska kontrolleras och tilldelas samma spår. EGFP-detektionsområdet är 494-545 nm och mCherry-detektionsområdet är 598-679 (figur 4F).
    4. Täck glasfatets botten med nedsänkningsmedium som matchar vattnets brytningsindex och var noga med att undvika luftbubblor (figur 4C). Välj 40x vattenmålet och applicera en liten droppe nedsänkningsmedium på målet (figur 4D). Fäst den glasbottnade skålen i sceninsatsen, applicera E3 för att hålla embryona fuktiga över natten och använd sedan modelleringslera för att försegla plastlocket över skålen (Figur 4E). Höj målet att få kontakt med skålen.
  2. Screena exempel och förbered för timelapse.
    1. Växla från fliken Anskaffning till fliken Leta reda på och klicka på glödlampans symbol för att tända överfört ljus. Med det överförda ljuset, placera det första provet med joysticken: genom ögat, flytta först provet till ljusstrålen, använd sedan okularen i mitten och fokusera på en optisk blåsor.
    2. Återgå till fliken Förvärv. Kontrollera att rutorna Z-stack, Time Seriesoch Positions är markerade och att lasern värms upp för användning.
    3. Ställ in bildstorleken på 512 (X) x 384 (Y), skanna hastighet till 9, skanna läge till dubbelriktat och ställ in Zoom på 0,7.
    4. Under rubriken Kanaler börjar du med att tilldela lasern 488 och 561 till Power 2.0 och Gain 550 (detta kan justeras senare). Ställ in pinhole på 60,2 (1,63 luftiga enheter ~= 1,6 μm sektion).
    5. Börja skanna med knappen Kontinuerlig. Med den fina fokusratten letar du reda på provet i Z-axeln och placerar X-Y-axeln i bildruta. Sluta skanna.
    6. Klicka på Lägg till under rubriken Positioner för att spara XYZ-informationen i det första exemplet (bild 4F). Gör detta endast för att prover ska tidslapsed. Välj prover för deras starka fluorescens och optimala montering.
    7. Växla till fliken Leta reda, gå till nästa exempel och upprepa steg 4.2.5-4.2.6, var selektiv när det gäller att välja prover.
  3. Slutför exempelpositioner, tilldela z-intervall och starta sedan timelapse. När alla exempel har valts ut (det är möjligt att avbilda 4-5 prover inom det totala tidsintervallet på 2,5 minuter) och positionerna har sparats går du igenom varje prov och justerar XYZ-positionen inom visningsramen.
    1. Markera den första positionen och klicka på Flytta till. Under kontinuerlig skanning, rada upp den optiska keln i ramen. Lämna gott om utrymme i de främre och distala regionerna i förhållande till den optiska blåseln och hjärnan.
    2. Tilldela sedan de första och sista Z-segmenten genom att välja Ange först och Ange sist medan du går genom Z-riktningen med den fina fokusratten. Behåll ett totalt segmentnummer på ~ 63, eftersom detta kommer att rymma tillväxten av optikkoppen. Ge extra utrymme på den ventrala sidan av den optiska blåsglassen för att ge utrymme för tillväxt.
    3. När de första och sista Z-segmenten har ställts in klickar du på C-knappen för att flytta till mitten av Z-stacken. Justera laserkraft och förstärkning för båda lasrarna; Om möjligt, håll lasereffekten under 5 och använd vid behov en högre förstärkning. Sluta skanna. Uppdatera positionsinformationen genom att klicka på Uppdatera.
    4. Flytta till nästa position genom att klicka på Position 2. Upprepa steg 4.3.1-4.3.3 för varje tilldelad position. Lasereffekten och förstärkningen bör ställas in så att alla prover är tillräckligt upplysta.
    5. När både positionsinformation och laserinställningar är slutförd tilldelar du time series-inställningar. Under rubriken Tidsserie tilldelar du Tidsintervallet till 2,5 min och Cykler till 300 (bild 4F). Antalet cykler beräknas så att timelapse fortsätter förbi 24 hpf-stadiet, när optikkoppsutvecklingen är klar.
    6. Om du vill börja tidslapse klickar du på Start. Övervaka den första hela cykeln: Använd en timer för att säkerställa att en komplett cykel (avbildning av alla positioner) är mindre än 2,5 min och kontrollera att varje position ser korrekt ut. Mikroskopet körs självständigt över natten och behöver inte övervakas.
      OBS: Även om konfokalrummet är temperaturkontrollerat är rumstemperaturen 20-25 °C. Med utrustningen igång och laserskanningen verkar temperaturen på scenen vara närmare 28,5 °C, eftersom embryonal utveckling fortskrider i denna förväntade takt, som analyseras visuellt med morfologiska landmärken.
    7. Med dessa inställningar kommer timelapse att vara 12,5 timmar. Spara filen när tidslapse är klar. Den kommer att vara stor (~ 40 GB) och kan delas upp i enskilda positioner efter att den sparats med hjälp av förvärvsprogramvaran.

Representative Results

Injektion av fluorescerande RNAs möjliggör subcellulär märkning
RNAs som märker cellens plasmamembran och histoner injiceras för att fånga de enskilda cellmorfologier och rörelser som ligger till grund för optikkoppens morfogenes. Figur 2 visar varje steg i processen att mikroinjektera zebrafiskembryon i 1-cellsstadiet. Kort sagt paras zebrafisk (figur 2E), och embryon samlas in och laddas i formsprutningsformen (Figur 2J). En mikroinjektionsnål fylls på igen (figur 2H), och embryon injiceras direkt i den enda cellen (figur 2K-M), vilket är nödvändigt för att erhålla enhetlig märkning (figur 2M, figur 4I-I''', Film1). Förutom enhetlig märkning observeras robust fluorescens och utvecklingen fortsätter ostört (figur 3B-B').

Effektiv montering är nödvändig för timelapse imaging OCM från 12-24 hkf
För att avbilda optisk kopp morphogenesis, som förekommer under en längre tid, är det viktigt att både välja ideala embryon och korrekt placera varje prov medan du bäddar in. Figur 3 visar en detaljerad redogörelse för framgångsrik montering av 11 hpf embryon. Injicerade embryon screenas först för tillräcklig fluorescens (figur 3B',B'',F'',F''"). Enskilda embryon är nedsänkta i agaros(figur 3C,C)och monteras dorsally i en individuell droppe agarosa(figur 3D,D). Alla prover är monterade i en kollektiv skiva med agarosa(figur 3E-F). När embryona är korrekt iscensatta, tillräckligt fluorescerande och tillräckligt monterade (figur 3G) kommer proverna att stanna kvar i bildramen under tidslapse så att hela organet kan avbildas (figur 4G-G',I-I''', Movie1). Underlåtenhet att utföra något av dessa steg kommer att resultera i ett monterat embryo som inte är ett optimalt prov för timelapse imaging. Minsta variation i rotationsgraden kommer att ha en dramatisk effekt på embryotillväxtens riktning under tidslapsen. Suboptimala rotationer visas i figur 3, inklusive ett embryo som är överroterat (figur 3I), vilket resulterar i en mer bakre timelapse, och ett embryo som är underroterat (figur 3J) där endast den mest främre vävnaden kan observeras. Förutom korrekt rotation under monteringen är prover som är monterade med avseende på ramens orientering mer benägna att ge en lyckad timelapse(figur 4G-G'',I-I''', Movie1). Optimala prover är de som är vertikalt inriktade på skålen, med den främre bakre axeln i linje med klockan 12 och 6 på en urtavla (Figur 3G). Suboptimala prover är de som inte är inriktade på denna axel,t.ex. Dessa prover kommer att växa ur bildramen när tidslapse fortskrider och kan inte användas för vidare analys (figur 4H-H'', J-J'').

Skaffa en timelapse-datauppsättning som är lämplig för framtida analys
Embryon som injiceras, lyfts upp och monteras korrekt kommer att göra för framgångsrika konfokala bildprover. Figur 4 visar ett optimalt prov för timelapse: det finns till och med fluorescens, och provet är 12 hpf. Z-stapeln för avbildning tilldelas så att den första skivan bara är dorsal till den optiska vesikeln, medan den sista skivan lämnar flera skivor utanför ventralgränsen för den 12 hks optiska vesikeln (Figur 4G-G'). Denna bias mot ventrala sidan ger överskott utrymme för vävnad tillväxt i ventral riktning. Dessa faktorer, när de uppfylls, resulterar i en optimal timelapse(figur 4I-I''', Movie1). Ett suboptimalt prov har mosaik eller dim fluorescens, har redan utvecklats förbi 12 hpf (när optisk kopp morphogenesis är på väg), eller är dåligt placerad i Z-stacken eller XY-ramen (Figur 4H-H'). När dessa kriterier inte uppfylls kommer tidslapsen inte längre att fånga hela vävnadens 3D-volym när den utvecklas och kan inte användas för vidare analys (figur 4J-J'').

Figure 1
Figur 1: Arbetsflöde för 4D-timelapse-avbildning av zebrafiskoptisk kopp morfogenes. (A) För att fluorescerande märka subcellulära strukturer av intresse, syntetisera lämpliga mRNAs. B)Mikroinject mRNA(er) i zebrafiskembryon i 1-cellsstadiet. C)Embryon monteras dorsalt eller med huvudet nedåt för ett inverterat konfokalt mikroskop i optiskt blåsningsstadium, ~11 h efter befruktning eller 3 somitsteg. (D) Flera embryon kan avbildas sekventiellt under en enda timelapse-bildbehandling. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Figure 2
Figur 2:En visuell guide för mikroinjecting av 1-cells zebrafiskembryon. (A) Föremål som ska inkluderas i ett injektionskit (medurs): medelstor låda som kan hålla hela satsen med engångsnitrilhandskar; En skål som innehåller mikroinjektionsnålar. tång. en alikvot mineralolja och uppskurna rutor av parafilm; Tips för mikrolastning. utspädd RNA på is; agarose formsprutning; markör, rull-/överföringspipett; och P10 pipett. B)Mikroinjektionsuppsättning: ett dissekerande mikroskop bredvid en picoinjektor som är ansluten till en extern komprimerad gaskälla. En fotpedal och mikromanipulator är fästa på picoinjektorn. Mikromanipulatorn är utrustad med en nålhållare och placerad ovanför mikroskopstadiet. C)En agarosinjektionsform som innehåller sex rader spår med 90 graders vinkel på ena sidan och en 45-graders vinkel på den andra sidan. D)Pico-injektorns frontpanel. Tryckdisplayen läser 7,8 PSI; detta kan justeras med ratten märkt Pinjicera. Under finns tryckknappar för att manuellt utlösa tryck att injicera, ändra injektionstiden eller för att rensa, fylla eller hålla vätskan i nålen. Injiceringstiden är inställd på 08 (motsvarande 8 x 10 msec). En utgångsslang ansluts till Put och är fastsatt på injektionsnålen. Tryckmätarens källbrytare är inställd påP-injicering när injektionstrycket ställs in, och det kan växlas tillP-balans för att justera basaltrycket som appliceras på nålen när injektioner inte görs. P-balansregulatorn är bredvidP-injektoren. Strömbrytaren tänds för att indikera att maskinen är påst. (E)Vuxna zebrafiskar paras ihop i små avelstankar som innehåller en kapslad tank med en nätbotten som skiljer vuxen fisk från befruktade ägg och möjliggör enkel insamling. Vattennivån sänks för att efterlikna grunda vattenförhållanden och tankavdelare avlägsnas för att initiera parningsbeteende. (F) Mikropipette (nål) puller frontpanel: innehåller en display som visar de specifika förhållanden som används för att dra nålar. Tryckinställningen är P = 500, följt av sista datum och tid då programmet redigerades, programnumret, HEAT = 546, PULL = 130, VEL = 70 och TIME = 90. G)Ett kapillärglas i mikropipette (nål)pullern och säkras på plats. Varje programmerad dragkörning resulterar i två långa avsmalnande nålar (röda pilspetsar). H)RNA-utspädningen laddas tillbaka till en nål. fenolrött färgämne möjliggör enkel visualisering av lösningen. (I) Efter att ha brutit nålens spets mäts RNA: s bolus med hjälp av en okular riktmedel på dissekeringsomfånget. För detta stereomikroskop är 6 hash-märken vid 30x total förstoring lika med 1 nL volym. (J) Befruktade ägg lastas i agarose formsprutformningen och fördelas längs formens tråg med hjälp av en rullpipett. K)Formsprutningen som innehåller embryon i encellssteg placeras under mikroskopet och embryon injiceras sekventiellt. (L) Injektionsnålen sätts in i varje embryo som är riktat mot den enda cellen. (M) Väl i cellen används fotpedalen för att utlösa en reglerad mängd tryck och frisättning av 1 nL RNA i embryots cell (som visualiserats med fenolrött). Skalstänger: I = 0,1 mm; L, M = 0,5 mm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3:En visuell guide för montering av embryon för avbildning. (A) Montering (från vänster till höger): ett värmeblock programmerat till 42 °C, värmerör med lågsmält agarosa. En rullpipett. ett par tångar; En agarosabelagd maträtt som innehåller dekhorionerade embryon. och ett dissekerande stereomikroskop anslutet till en metallhalogenlysrör. (B,B',B'') Ett embryo på 11 hpf injicerat med EGFP-CAAX mRNA och mCherry-H2A mRNA, visas under brightfield, GFP fluorescens respektive mCherry fluorescens. C,C') En glaspastatörspipett som innehåller agarose och ett embryo som sitter i spetsen; C' är en förstorad vy. Jagvill inte att det ska bli så här. Ett embryo monterat i en droppe lågsmält agarosa på en glasbottnad skål, sett både från mikroskopets stadium och genom mikroskopets okular. (E,E') 12 embryon monterade i enskilda droppar av lågsmält agarosa på en glasbottnad skål, sett både från mikroskopets stadium och genom mikroskopets okular. (F,F',F'', F''') Alla monterade embryon är överlagrad med ett komplett lager av agarose för att fylla botten av skålen, sett både från mikroskopets stadium och från mikroskopets okular som visas i ljust fält; F'' GFP fluorescens; och F''mCherry fluorescens. (G) Ett optimalt prov på 12 hkf monteras dorsalt och orienteras vertikalt i linje med klockan 12 och 6 med båda optiska blåsor i samma plan. (H) Ett suboptimalt prov: även om monterade dorsal- och optiska blåsor är i plan med varandra, är detta prov inriktat på en diagonal axel och kommer att växa ur ramstorleken när utvecklingen fortskrider. (I) Ett suboptimalt prov: detta prov är överroterat och inte ett dorsalfäste, vilket leder till att den främre delen av den optiska vesikeln inte fångas upp i tidslapsen. J)Ett suboptimalt prov: detta prov är underroterat och inte ett dorsalfäste, vilket leder till att den bakre delen av den optiska vesikeln inte fångas upp i tidslapse. Prickade linjer indikerar varje optisk blåsor. Skalstänger: B = 0,1 mm; D' = 1,5 mm; E', F' = 2,5 mm. G = 0,1 mm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4: Ställa in en tidslapse för flera positioner och potentiella resultat. (A) Laserskanning konfokal mikroskop. (B) Piezo Z-steginsats. (C) Botten av en bottenskål i glas som innehåller embryon inbäddade i agarosa är belagd med nedsänkningsmedium som matchar vattenbrytningsindexet. (D) En droppe nedsänkningsmedium placeras på 40x W-målet (långt arbetsavstånd). (E) Skålen hålls på plats med sceninsatsen, E3 tillsätts ovanpå agarosaskiktet och locket säkras med modelleringslera. (F) Inställningar för förvärvsprogram: Önskade laserlinjer aktiveras från rullgardinsmenyn. För embryon som injiceras med EGFP-CAAX RNA och H2A-mCherry RNA är Argon- och DPSS 561-10-lasrarna påslagna. Den röda markeringen indikerar att Argon-lasern värms upp. För att lokalisera provet över målet tänds det överförda ljuset genom mikroskopets kontrollpanel. Både EGFP och mCherry tilldelas spår 1 (för samtidig avbildning) och räckvidden för varje detektor är inställd. Här är EGFP-intervallet inställt på 494-545 nm, och mCherry-intervallet är inställt på 598-679 nm. Under Kanaler kan lasereffekt ställas in. När lasrarna har värmts upp kan strömmen ökas upp till 5,0 och förstärkning (master) kan justeras. Pinhole är inställd på 60,2, vilket motsvarar 1,63 luftiga enheter eller 1,6 μm sektion. Under Förvärv är bildrutestorleken inställd på 512 x 384, skanningshastigheten är 9,0, i genomsnitt dubbelriktad och zoomningen är inställd på 0,7. Under Z-stack den första och sista positionen i Z-axeln ställs in medan konfokalen skannas. Intervallet (stegstorleken) är inställt på 2,1 μm. När du väljer första och sista Z-position bibehålls i allmänhet ett standardnummer på 63 segment. detta tillgodoser ögats totala tillväxt. Alternativet "använd piezo" är markerat. Under Positioner visas varje vald position inklusive ett tilldelat nummer och X-, Y- och Z-position. Det finns ytterligare knappar för att styra antalet embryon (separata positioner) till bilden, inklusive lägg till, uppdatera eller ta bort. Under Tidsserie är cykeln inställd på 300 (antalet Z-staplar som ska förvärvas) och intervallet (tidssteget) är inställt på 2,5 min. När inställningarna är slutförda initieras timelapse-förvärv genom att trycka på start. Programvaran visar segmentet av Z-stacken, cykeln och positionen som för närvarande skannar. När timelapse är klar sparas filen genom att klicka på diskettikonen i Bilder och dokument panel. (G-J) Cellmembran (green) är märkta med EGFP-CAAX och cellkärnor (kromatin, magenta) är märkta med H2A-mCherry RNAs. (G,G',G'') Ett exempel på hur du ställer in den första och sista Z-sektorn för ett optimalt monterat prov. Den första Z-skivan (på den dorsala sidan) kommer på bekostnad av dorsala ectoderm, medan den sista Z-skivan (vid ventralsidan) ligger långt under den optiska vesikeln, för att rymma dess tillväxt i ventral riktning. (H,H',H'') Ett exempel på hur du ställer in den första och sista Z-sektorn i ett suboptimalt prov. Provet har svag mCherry fluorescens och det är monterat diagonalt, så att den utvecklande optiska koppen sannolikt inte kommer att stanna i ramen under tiden. (Jag, jag', jag''') Ett exempel på ett timelapse från ett optimalt prov. Bilder med ett segment från mitten av Z-stacken är tagna från hela volymen på 63 segment vid 4 tidpunkter (T-värde). Br, hjärna; NR, neural näthinna; RPE, retinalpigmenterat epitel; Le, linsen. (J,J',J'', J''') Ett exempel på ett tidsfall från ett suboptimalt prov. I det här fallet flyttade provet ut ur Z-planet och endast en sned del av den främre optiska koppen fångades. Skalstänger: G, I = 50 μm. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Film 1: Timelapse av optik kopp morfogenes i en optimal vild typ embryo. En dorsal vy över ett vildtypsembryon som är märkt med EGFP-CAAX (plasmamembran, grönt)och H2A. F/Z-mCherry (kromatin, magenta). Timelapse är från ~12-24 hpf och innehåller ett enda konfokalt avsnitt från en hel 4D-datauppsättning. Tidsintervallet är 2,5 min mellan z-staplarna och visas med 22,5 bildrutor per sekund. Klicka här för att ladda ner den här filmen.

Discussion

Här beskriver vi ett protokoll för in toto märkning och 4D timelapse imaging av optik kopp morfogenes. Vi går igenom processen att generera kapade RNA-kodning fluorescerande proteiner för att markera olika subcellulära fack; Injicera zebrafisk 1-cells embryon; Inbäddning av 11 hpf embryon i agarose för multiplexerad avbildning; och förvärva 4D-datamängder av flera embryon under den tid som optikkoppsmorfogenes (12–24 hpf) är under lång tid.

En myriad av frågor kan besvaras med dessa informationstäta datamängder. 4D-data kan visualiseras och kvantitativt analyseras på olika sätt. Även om vi inte omfattas av detta protokoll inkluderar vi här några av våra mål och standardapplikationer som ett exempel på vilka typer av saker som kan uppnås. Naturligtvis utvecklas ständigt kvantitativa bildanalysmetoder, och både kommersiellt tillgängliga och specialbyggda verktyg kan användas. Om man inte har använt sådana metoder tidigare bör man vara beredd att arbeta igenom viss optimering för att säkerställa att de förvärvade datamängderna är tillräckliga för den kvantitativa analysmetoden.

Att visualisera och kvantitativt utvärdera 4D-datauppsättningarna kan vara utmanande på grund av filernas storlek. Förvärvsprogramvaran kan användas för att dela upp datamängderna i enskilda embryon, och ImageJ/Fiji kan användas för att konvertera konfokala filer från kommersiella format till mer standard tif-staplar, där varje tidspunkt sparas som en separat fil. Detta minskar filstorlekarna och standardiserar filformaten. Enskilda optiska sektioner från varje tidspunkt kan monteras som en 2D-tidslapse (XY) med ImageJ/Fiji, vilket möjliggör snabb 2D-visualisering och utvärdering av data. Film 1 är ett exempel på just detta: ett enda optiskt avsnitt över tid monterat som ett tidsfall av det optimala provet som visas i figur 4I–I'''. Därifrån, för 3D- och 4D-visualisering, använder vi vanligtvis FluoRender35,36, som är fritt tillgänglig men har specifika grafikkortskrav. Med FluoRender kan man rotera 3D-renderade data i vilken axel som helst, visualisera datauppsättningen i 4D över tid, generera utskärningar i val av plan och spara rotationer och visualiseringar som en film eller serie tif-bilder.

När det gäller kvantitativ analys finns det många frågor att besvara. Vi har utvecklat programvara internt för att hjälpa våra egna specifika mål att förstå cellbeteenden som ligger till grund för optikkoppsmorfogenes. Vårt program, LongTracker, använder kärnsignalen som proxy för position för att spåra celler13. Med dessa data kan vi bestämma när, var och hur celler rör sig. hur snabbt och hur långt cellerna rör sig; och hur ofta celler delar sig. Förutom vår egen programvara finns det flera kommersiellt tillgängliga och specialbyggda alternativ för 4D-cellspårning. Vi har också utvecklat programmet LongAxis för att utföra cellsegmentering och kvantifiera cellform och organisation inom neurala näthinnan37. Datamängderna som matas in i LongAxis är dock enstaka Z-staplar, tagna med hög upplösning. En beständig utmaning har genererat timelapse-data uppsättningar med tillräckligt hög upplösning för att celler kan segmenteras med förtroende och deras morfologi extrapoleras. Ett alternativ är mosaik (sparse) märkning med hjälp av en fotokonverterbar fluorfor som Kaede för direkt visualisering av cellform, som vi och andra har utfört i det utvecklande ögat8,11,13. Detta förenklar cellsegmenteringsproblemet och cellform och storlek kan lätt kvantifieras genom 3D-rendering i FluoRender.

Varje steg i detta protokoll optimerades specifikt för våra ändamål. Specificiteten i detta protokoll resulterar i flera begränsningar: protokollet, som det är skrivet, är inte optimerat för avbildning av andra aspekter av zebrafiskens ögonutveckling (såsom retinal neurogenes), andra ögonstrukturer, andra utvecklingsstadier eller andra subcellulära fack. Inbäddningens inriktning, bildhastigheten och etiketterna är alla utformade så att vi kan svara på våra biologiska frågor. För att till exempel avbilda näthinneneurogenes kan embryots dorsala orientering enligt beskrivningen här inte möjliggöra visualisering av specifika egenskaper av intresse, och avbildningshastigheten kanske inte är lämplig. Många aspekter av protokollet kan anpassas och ändras för en mängd olika behov, beroende på ens specifika intressen och mål. För det första, med hjälp av RNA injektioner gör märkningsprocessen mycket flexibel. Fluorescerande proteinfusionskonstruktioner kan användas för att märka subcellulära strukturer av intresse, och RNA-injektionsmängden kan varieras för att optimera märkningen. Baserat på vårt arbete med den fotokonverterbara fluorforen Kaede verkar RNA-injektioner stödja en burst av översättning som är över med 12 hpf11,13. Höga nivåer av fluorescerande proteinuttryck från RNA injektion kan bekämpa fotobleaching, men ett sådant tillvägagångssätt stöder inte ihållande uttryck för fluorescerande etiketten av intresse. Om varaktiga uttryck är nödvändiga, till exempel när man avbildar embryon i senare skeden, är transgena linjer ett alternativ, och att konstruera nya linjer i zebrafisk är enkelt24.

Därefter kan protokollet anpassas för senare utvecklingsstadier. Eftersom pigment kan hindra avbildning i senare skeden kan embryon behandlas med fenyletylthiourea (PTU) för att hämma pigmentbildning, eller genetiska mutanter för pigmentsyntes kan användas. För att förhindra embryoryckningar kan trikain läggas till agaros- och embryomedieöverläggslösningarna, och procenta agaros kan justeras vid behov. När ögat växer kan det vara nödvändigt att ändra monteringsorienteringen; här monterar vi embryon dorsally, men i senare skeden kan det vara mer meningsfullt att montera i lydnad eller främre, beroende på intressestrukturen. Eftersom olika processer sker över olika rumsliga och temporala skalor kan man också optimera Z-steget och tidssteget för bildförvärv. Dessa funktioner kan egentligen bara bestämmas empiriskt för varje labbs behov.

Slutligen utvecklades detta protokoll specifikt för en laser scanning confocal mikroskop, med embryon inbäddade i en relativt hög andel agarose i ett tidigt skede av ögonutveckling. Om man avbildar vid olika tidpunkter eller olika platser under ögonutveckling måste detta protokoll anpassas för den process som är av intresse. Många olika bildmetoder är för närvarande möjliga, och fler utvecklas av optiska ingenjörer. Varje metod medför sin egen uppsättning utmaningar, från olika sätt att bädda in och montera embryon för avbildning, till olika filstorlekar och format. Vi beskriver överväganden i introduktionen för att vägleda optimeringsprocessen, där maximal rumslig och temporal upplösning balanseras med fotobleaching, fototoxicitet och enorma filstorlekar. Vi hoppas att dessa allmänna principer, utöver den praktiska information som beskrivs ovan, kommer att hjälpa andra att etablera timelapse imaging-metoder för att studera de många öppna frågorna i ögonutvecklingen.

Disclosures

Författarna har inget att avslöja.

Acknowledgments

Vi är tacksamma mot tidigare och nuvarande medlemmar av Kwan Lab för arbetet med timelapse-metoder och diskussioner om detta protokoll. Detta arbete stöddes av NIH (R01 EY025378 och R01 EY025780 till KMK; F31 EY030758 till SL; och T32 GM007464 till MAC).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Delta TPG Dish 0.17mm clear Bioptechs 0420041500C coverglass bottom for optical compatibility
Disposable Pasteur Pipettes VWR 14672-608 overall length 14.6 cm (53/4")
Dumont #5, #55, or #5SF Forceps Fine Science Tools 11254-20 For style #5: straight tip, 0.05 x 0.01 mm tip, inox, 11 cm long
Flaming/Brown Micropipette Puller Sutter P-97
Immersol W Carl Zeiss Microscopy 4449690000000 immersion fluid for water-emission objectives, halogen-free, low fluorescence
Microinjection Mold Adaptive Science Tools TU-1 Six ramps, one 90 degree and one 45 degree beveled side.
Microloader Tips Eppendorf 930001007 Microloader, tip for filling glass microcapillaries, 0.5 – 20 µL
mMessage mMachine SP6 Transcription Kit Invitrogen AM1340 contains SP6 Enzyme Mix, 10X Reaction Buffer, 2XNTP⁄CAP Solution, GTP Solution, pTRI-Xef, TURBO DNase, Ammonium Acetate Stop Solution, Lithium Chloride Precipitation Solution, and Gel Loading Buffer and are all stored at –20°C. Nuclease-free Water may be stored at any temperature.
Nikon SMZ645 Stereo Microscope Nikon SMZ645 used for injecting embryos (see Fig. 2B)
NotI-HF enzyme NEB R3189S comes with Gel Loading Dye, Purple (6X)
NuSieve GTG Agarose Lonza 50081 fine resolution, low melt agarose
Objective LD "C-Apochromat" 40x/1.1 W Korr M27 Carl Zeiss Microscopy 421867-9970-000
Olympus SZX16 Stereo Microscope Olympus SZX2-ZB16 used for screening, embedding embryos (see Fig. 3A)
Phenol red solution Sigma-Aldrich P0290 0.5% in DPBS, sterile filtered, endotoxin tested, cell culture tested
Pico-liter Microinjector Harvard Apparatus PLI-100 Femtoliter to microliter injections; digital readouts for injection count, time, and pressure; contains 5 pressures including inject, balance, clear, fill, and hold
Pipette Pump Pipettor SP Bel-Art F37898 fits a disposable pasteur pipette, contains thumbwheel on side for aspirating or dispensing and plunger for quick emptying
Premium Thin Wall Borosilicate Glass Capillaries Warner Instruments G100T-4 1.0 x 0.78 mm
QIAquick PCR Purification Kit Qiagen 28106 contains QIAquick Spin Columns, Buffers, Collection Tubes (2 ml)
RNase-free H2O Invitrogen AM9906 DNase-Free, Molecular Biology Grade, RNase-Free
RNeasy Mini Kit Qiagen 74104 contains RNeasy Mini Spin Columns, Collection Tubes (1.5 ml and 2 ml), RNase-free Reagents and Buffers
Stage Attachment Z PIEZO WSB 500 Carl Zeiss Microscopy 432339-9000-000
Stage Insert Z PIEZO WSB Universal Carl Zeiss Microscopy 432339-9030-000
Zeiss LSM 880 with Airyscan Carl Zeiss Microscopy N/A inverted Axio Observer microscope
Zen Black 2.3 SP1 software Carl Zeiss Microscopy N/A Zeiss Efficient Navigation (ZEN) controls all light microscope systems from Zeiss

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Adler, R., Canto-Soler, M. V. Molecular mechanisms of optic vesicle development: complexities, ambiguities and controversies. Developmental Biology. 305 (1), 1-13 (2007).
  2. Chow, R. L., Lang, R. A. Early eye development in vertebrates. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 17, 255-296 (2001).
  3. Fuhrmann, S. Eye morphogenesis and patterning of the optic vesicle. Current Topics in Developmental Biology. 93, 61-84 (2010).
  4. Martinez-Morales, J. R., Wittbrodt, J. Shaping the vertebrate eye. Current Opinion in Genetics and Development. 19 (5), 511-517 (2009).
  5. Yang, X. J. Roles of cell-extrinsic growth factors in vertebrate eye pattern formation and retinogenesis. Seminars in Cell & Developmental Biology. 15 (1), 91-103 (2004).
  6. Bogdanovic, O., et al. Numb/Numbl-Opo antagonism controls retinal epithelium morphogenesis by regulating integrin endocytosis. Developmental Cell. 23 (4), 782-795 (2012).
  7. Bryan, C. D., Casey, M. A., Pfeiffer, R. L., Jones, B. W., Kwan, K. M. Optic cup morphogenesis requires neural crest-mediated basement membrane assembly. Development. 147 (4), (2020).
  8. Bryan, C. D., Chien, C. B., Kwan, K. M. Loss of laminin alpha 1 results in multiple structural defects and divergent effects on adhesion during vertebrate optic cup morphogenesis. Developmental Biology. 416 (2), 324-337 (2016).
  9. Cavodeassi, F., Ivanovitch, K., Wilson, S. W. Eph/Ephrin signalling maintains eye field segregation from adjacent neural plate territories during forebrain morphogenesis. Development. 140 (20), 4193-4202 (2013).
  10. England, S. J., Blanchard, G. B., Mahadevan, L., Adams, R. J. A dynamic fate map of the forebrain shows how vertebrate eyes form and explains two causes of cyclopia. Development. 133 (23), 4613-4617 (2006).
  11. Gordon, H. B., et al. Hedgehog signaling regulates cell motility and optic fissure and stalk formation during vertebrate eye morphogenesis. Development. 145 (22), (2018).
  12. Ivanovitch, K., Cavodeassi, F., Wilson, S. W. Precocious acquisition of neuroepithelial character in the eye field underlies the onset of eye morphogenesis. Developmental Cell. 27 (3), 293-305 (2013).
  13. Kwan, K. M., et al. A complex choreography of cell movements shapes the vertebrate eye. Development. 139 (2), 359-372 (2012).
  14. Martinez-Morales, J. R., et al. Ojoplano-mediated basal constriction is essential for optic cup morphogenesis. Development. 136 (13), 2165-2175 (2009).
  15. Miesfeld, J. B., et al. Yap and Taz regulate retinal pigment epithelial cell fate. Development. 142 (17), 3021-3032 (2015).
  16. Nicolas-Perez, M., et al. Analysis of cellular behavior and cytoskeletal dynamics reveal a constriction mechanism driving optic cup morphogenesis. eLife. 5, (2016).
  17. Picker, A., et al. Dynamic coupling of pattern formation and morphogenesis in the developing vertebrate retina. PLoS Biology. 7 (10), e1000214 (2009).
  18. Rembold, M., Loosli, F., Adams, R. J., Wittbrodt, J. Individual cell migration serves as the driving force for optic vesicle evagination. Science. 313 (5790), 1130-1134 (2006).
  19. Sidhaye, J., Norden, C. Concerted action of neuroepithelial basal shrinkage and active epithelial migration ensures efficient optic cup morphogenesis. eLife. 6, (2017).
  20. Driever, W., et al. A genetic screen for mutations affecting embryogenesis in zebrafish. Development. 123, 37-46 (1996).
  21. Haffter, P., et al. The identification of genes with unique and essential functions in the development of the zebrafish, Danio rerio. Development. 123, 1-36 (1996).
  22. Nusslein-Volhard, C. The zebrafish issue of Development. Development. 139 (22), 4099-4103 (2012).
  23. Hoshijima, K., et al. Highly efficient CRISPR-Cas9-based methods for generating deletion mutations and F0 embryos that lack gene function in zebrafish. Developmental Cell. 51 (5), 645-657 (2019).
  24. Kwan, K. M., et al. The Tol2kit: a multisite gateway-based construction kit for Tol2 transposon transgenesis constructs. Developmental Dynamics. 236 (11), 3088-3099 (2007).
  25. Almeida, A. D., et al. Spectrum of Fates: a new approach to the study of the developing zebrafish retina. Development. 141 (9), 1971-1980 (2014).
  26. Baye, L. M., Link, B. A. Interkinetic nuclear migration and the selection of neurogenic cell divisions during vertebrate retinogenesis. The Journal of Neuroscience. 27 (38), 10143-10152 (2007).
  27. Clark, B. S., et al. Loss of Llgl1 in retinal neuroepithelia reveals links between apical domain size, Notch activity and neurogenesis. Development. 139 (9), 1599-1610 (2012).
  28. Das, T., Payer, B., Cayouette, M., Harris, W. A. In vivo time-lapse imaging of cell divisions during neurogenesis in the developing zebrafish retina. Neuron. 37 (4), 597-609 (2003).
  29. Kay, J. N., et al. Transient requirement for ganglion cells during assembly of retinal synaptic layers. Development. 131 (6), 1331-1342 (2004).
  30. Norden, C., Young, S., Link, B. A., Harris, W. A. Actomyosin is the main driver of interkinetic nuclear migration in the retina. Cell. 138 (6), 1195-1208 (2009).
  31. Suzuki, S. C., et al. Cone photoreceptor types in zebrafish are generated by symmetric terminal divisions of dedicated precursors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (37), 15109-15114 (2013).
  32. Wan, Y., et al. The ciliary marginal zone of the zebrafish retina: clonal and time-lapse analysis of a continuously growing tissue. Development. 143 (7), 1099-1107 (2016).
  33. Yoshimatsu, T., et al. Presynaptic partner selection during retinal circuit reassembly varies with timing of neuronal regeneration in vivo. Nature Communications. 7, 10590 (2016).
  34. Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Developmental Dynamics. 203 (3), 253-310 (1995).
  35. Wan, Y., Otsuna, H., Chien, C. B., Hansen, C. An interactive visualization tool for multi-channel confocal microscopy data in neurobiology research. IEEE Transactions on Visualization and Computer Graphics. 15 (6), 1489-1496 (2009).
  36. Wan, Y., Otsuna, H., Chien, C. B., Hansen, C. FluoRender: an application of 2D image space methods for 3D and 4D confocal microscopy data visualization in neurobiology research. IEEE Pacific Visualization Symposium. , 201-208 (2012).
  37. Carney, K. R., Bryan, C. D., Gordon, H. B., Kwan, K. M. LongAxis: a MATLAB-based program for 3D quantitative analysis of epithelial cell shape and orientation. Developmental Biology. 458 (1), 1-11 (2020).

Tags

Neurovetenskap Nummer 171 bildbehandling mikroskopi timelapse morfofilos optisk blåsor optisk kopp utveckling zebrafisk öga näthinna
4-dimensionell avbildning av Zebrafish Optic Cup Morphogenesis
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lusk, S., Casey, M. A., Kwan, K. M.… More

Lusk, S., Casey, M. A., Kwan, K. M. 4-Dimensional Imaging of Zebrafish Optic Cup Morphogenesis. J. Vis. Exp. (171), e62155, doi:10.3791/62155 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter