Summary
여기에서 우리는 살아있는, 마취 실험실 마우스의 조야성 신경절 신경절을 드러내는 방법과 각성제를 맛보기 위하여 이 뉴런의 앙상블의 반응을 측정하기 위하여 칼슘 화상 진찰을 사용하는 방법을 제시합니다, 다른 각성제를 가진 다중 예심을 허용하. 이것은 어떤 신경 세포가 어떤 tastants에 반응하는지의 깊이 비교를 허용합니다.
Abstract
지난 10 년 이내에, 유전자 로 코딩 된 칼슘 지표 (GECIs)의 발전은 생체 기능 적 이미징의 혁명을 촉진했습니다. 신경 활동에 대 한 프록시로 칼슘을 사용 하 여, 이러한 기술은 실시간으로 자극의 다양 한 큰 신경 앙상블 내에서 개별 세포의 응답을 모니터링 하는 방법을 제공. 우리 등은 이러한 기술을 적용하여 개별 조니컬트 신경절 뉴런의 반응을 이미지화하여 살아있는 마취 마우스의 혀에 적용되는 자극을 맛볼 수 있습니다. 조닐레이트 신경절은 전방 혀와 입맛을 내면에 가두는 구형 뉴런의 세포 체와 귀의 정강을 가두는 일부 세포 감각 뉴런으로 구성됩니다. GCaMP를 사용하여 개별 조개 신경절 신경전 뉴런의 맛에 자극된 반응을 이미징하는 것은 야생 형 마우스에서 이러한 뉴런의 튜닝 프로파일뿐만 아니라 유전적으로 조작 된 마우스의 표현형을 잘못 배선하는 말초 맛을 감지하는 방법에 대한 중요한 정보를 제공했습니다. 여기서 는 조폐성 신경절, GCaMP 형광 이미지 수집, 데이터 분석을 위한 초기 단계 및 문제 해결을 노출시키는 외과 적 절차를 시연합니다. 이 기술은 형질적으로 인코딩된 GCaMP 또는 AAV 매개 GCaMP 발현과 함께 사용될 수 있으며, 특정 유전 적 관심 하위 집합(즉, Cre-mediated GCaMP 발현)을 이미지하도록 수정할 수 있다. 전반적으로, 조폐성 신경절 신경의 생체 내 칼슘 이미징은 말초 구형 뉴런의 활동을 모니터링하기위한 강력한 기술이며 전통적인 전신경 코르다 tympani 녹음 또는 맛 행동 분석에 보완 적인 정보를 제공합니다.
Introduction
포유류 말초 맛 시스템의 핵심 성분은 조질성 신경절입니다. 귀의 정점을 내면으로 만드는 일부 소마토 감각 뉴런 외에도, 조닐은 전방 혀와 입맛을 내면에 가두는 구형 뉴런의 세포 체로 구성됩니다. 다른 말초 감각 뉴런과 유사하게, 조폐성 신경절 뉴런은 미각에 말초로 투사되는 긴 축삭을 가진 의사 단극성이며, 고독한1의뇌줄기 핵에 중앙으로 투사된다. 이러한 뉴런은 주로 구강2,3에서맛 자극에 반응하는 맛 수용체 세포에 의해 ATP의 방출에 의해 활성화된다. ATP는 맛 신호에 필수적인 신경 전달 물질이며, 구술 신경절 뉴런에 의해 발현된P2rx 수용체는 활성화4에 필요하다. 맛 수용체 세포가 특정 맛 양식 (달콤한, 쓴 맛, 짠, 감칠맛 또는 신맛)에 대한 특정 맛 수용체를 표현하는 것을 감안할 때, 맛 자극에 대한 구술 신경절 뉴런 반응도 좁게 조정 될 것이라고 가설되었습니다5.
전체 신경 기록은 코다 티파니와 더 큰 우수한 석유 신경이 조랑말 신경절6,7에모든 다섯 맛 양식체를 나타내는 돌풍 신호를 실시 모두 보여 주었다. 그러나, 이것은 여전히 주어진 술에 신경 응답의 특이성에 대 한 질문을 왼쪽: 맛 양식 특정 뉴런이 있는 경우, polymodal 뉴런, 또는 둘 다의 혼합물. 단일 섬유 레코딩은 개별 섬유의 활성과 화학적 민감도8,9,10에대한 자세한 정보를 제공하지만, 이 방법론은 소수의 섬유로부터 데이터를 수집하는 것으로 제한됩니다. 유사하게, 개별 쥐 의 생체 내 전기생리학적 기록에서 신경절 뉴런은 개별 뉴런11,12,13의반응에 대한 정보를 제공하지만, 여전히 인구의 활성을 잃고 동물당 상대적으로 적은 뉴런 기록을 산출한다. 개별 뉴런의 활성의 시력을 잃지 않고 신경 앙상블의 반응 패턴을 분석하기 위해 새로운 기술을 사용할 필요가 있습니다.
칼슘 이미징, 특히 GCaMP와 같은 유전자 로 인코딩 된 칼슘 지표를 사용하여이 기술적 돌파구를 제공했습니다14,15,16,17,18. GCaMP는 칼슘을 신경 활동의 대리자로 사용하여 세포 내의 칼슘 수준으로 녹색 형광을 증가시킵니다. 새로운 형태의 GCaMP는 신호 대 노이즈 비율을 개선하고, 결합 운동학을 조정하며, 특수실험(19)에적응하기 위해 지속적으로 개발되고 있다. GCaMP는 전체 신경 기록과 달리 단일 신경 해상도를 제공하며 단일 섬유 또는 단일 세포 기록과 달리 뉴런 앙상블의 반응을 동시에 측정할 수 있습니다. 조닐칼갱리아의 칼슘 이미징은 이미 야생형 마우스16,20에서이들 뉴런의 튜닝 프로파일에 대한 중요한 정보를 제공하고 있으며, 유전자 조작마우스(18)에서표현형을 잘못 배선하는 말초 맛을 확인하였다.
비보 칼슘 이미징 기술을 조닐레이트 신경절에 적용하는 한 가지 주요 어려움은 뼈 성 막판 불라 내에 캡슐화된다는 것입니다. 조폐제에 대한 광학 적 접근을 얻으려면 신경절을 그대로 유지하면서 뼈층을 제거하기 위해 섬세한 수술이 필요합니다. 그 목적을 위해, 우리는 그밖 연구원이 조닐레이트 신경절에 접근하고 생체 내 자극을 맛하기 위하여 이 뉴런의 GCaMP 중재형 반응을 심상에 접근하는 것을 돕기 위하여 이 가이드를 만들었습니다.
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Protocol
동물 프로토콜은 텍사스 샌 안토니오 대학의 기관 동물 관리 및 사용 위원회에 의해 검토및 승인되었습니다.
1. 수술 전 설정
참고: 장비의 초기 설정은 펌프 시스템, 현미경, 카메라 및 사용되는 이미징 소프트웨어에 따라 다르므로 여기에서 다루지 않습니다. 설치 지침은 장비 공급업체에서 제공하는 교육 자료를 참조하십시오. 저자가 사용하는 장비의 경우 재료 표를참조하십시오.
- 액체가 모든 차량(물)과 맛줄을 통해 흐르는지 확인합니다. 선이 막힌 경우 분리하고 물로 플러시합니다. 라인이 꼬인 경우 액체가 흐를 때까지 마사지하십시오. 액체가 큐에서 시작하고 멈추는지 확인합니다.
- 모든 라인이 차단해제된 것으로 확인되면 10s의 차량을 달리다가 모든 밸브를 닫습니다.
- 이미징 소프트웨어가 필요한 모든 변수(예: 평가판 길이, 파일 이름, 프레임 속도 등)로 준비되었는지 확인합니다. 오픈 소스 이미지 수집 소프트웨어 패키지인 μManager를 사용하여 초당 프레임에 대해 노출 시간라벨이 표시된 필드에 200ms를 입력하고, binning에서 x2를 선택하고 라이브로 표시된 버튼을 누릅니다. 동영상이 시작되면 왼쪽의 단추를 ROI라고표시합니다. 그러면 512x512 의 시야필드가 생성됩니다.
2. 동물을 마취하고 고정
참고: 다음 프로토콜은 18-35g의 성용 마우스에 최적화된 말단 절차입니다. 10주에서 12주 사이의 동물과 함께 사용하는 것이 좋습니다. Snap25-GCaMP6s와 같은 유전자 인코딩된 칼슘 지표(GECIs) 또는 바이러스 성 GECI로 고정증주입된 동물과 함께 사용될 수 있다. 장갑, 실험실 코트 및 얼굴 마스크는 프로토콜 전체를 착용해야합니다.
- 스크러프 동물과 케타민 (100 mg/kg) 및 자일라진 (10 mg/kg)의 관면 주사를 수행합니다. 계속하기 전에 발가락 핀치를 통해 마취의 깊이를 평가합니다.
- 머리 의 상단을 면도 목의 전면에 수술 영역을 amd.
- 가열 패드를 켜고 패드에 경향이 동물을 배치합니다.
- 눈의 건조를 피하기 위해 동물의 눈에 연고를 적용합니다.
- 동물의 두개골을 드러내기 위해 머리 의 중간에 절개 (~1cm)를 만듭니다. 맨뼈에 접근할 수 있도록 멸균 면봉을 사용하여 결합 조직을 제거합니다. 면 팁 어플리케이터를 사용하여 두개골이 건조하도록 합니다.
- 두개골에 수의사 유대를 적용합니다. 노출된 두개골을 덮으십시오. 접착제가 마르기를 기다립니다.
- 페트리 접시 뚜껑에 치과 시멘트 층을 혼합하고 두개골에 바이드시면 섞어 바에 발라주세요. 2.5 단계에서 사용되는 면 팁 어플리케이터의 백 엔드는이 과정에 잘 작동합니다. 치과 시멘트 위에 헤드 포스트를 놓고 두개골에 헤드 포스트를 끼우기 위해 두 번째 치과 시멘트 층을 적용하십시오.
- 치과 시멘트가 건조하고 단단할 때까지 앉게 하십시오. 면 팁 어플리케이터를 반으로 부수고 뾰족한 끝을 사용하여 치과 시멘트를 찌르고 테스트합니다. 치과 시멘트가 찌르지 않도록 굴복하지 않으면 동물이 척추 위치로 전환될 수 있다.
3. 기관 절제술
- 수술 전 스크럽을 수술 부위에 바르습니다. 스크럽 후, 흉골에서 턱까지 목구멍의 피부에 중간 개절 ~ 2cm를 만듭니다.
- 피부와 상악선 이하의 땀샘을 완전히 드러내십시오.
- 분리 근막에서 솔기를 찾아 무딘 해부로 분리하고, 열린 철회.
- 폴리에틸렌 튜브(I.D.0.86 mm, O.D. 1.27 mm)에 들어갈 수 있을 만큼 큰 기관 상단의 개구부를 조심스럽게 잘라냅니다. 기관지의 직경을 통해 절반 이상을 자르지 마십시오. 폐쪽으로 기관체에 튜브를 삽입합니다.
- 재배치 리트랙터는 paratracheal 근육을 방출하고 하위 땀샘을 철회합니다.
- 접착제 는 수의학 접착제의 최소한의 욕조위에 함께 근육 (그림 1A참조).
4. 타일파닉 불라를 열어
- 원하는 디거스트 근육(왼쪽 또는 오른쪽)을 부드럽게 애타게 하고 결합 조직을 분리합니다. 근육의 앞쪽 끝에서 잘라 혈관을 피하고, 타공 황소가 지울 때까지 후방으로 다시 당깁니다.
- 고리 투박 불라를 들어 올리기 위해 머리를 약간 기울입니다. 경동맥 전방의 가지를 디거스트릭 근육의 후방 삽입 지점으로 찾습니다. 정토닉 불라의 볼록한 구조에 대한이 혈관에 단지 후방을 느낀다.
- 이 위치에서 근육의 솔기를 찾습니다(그림 1B참조). 미세 한 집게의 두 세트를 사용 하 여, 정강이 황소의 뼈가 볼 때까지 솔기에 무딘 해부. 리트랙터를 사용하여 타막 불라의 선명한 시야를 유지하십시오.
- 불라에서 후방으로 앞쪽으로 달리는 솔기를 찾습니다(그림 1C참조). 외과 프로브를 사용하여이 솔기의 중앙에 뼈에 구멍을 찌르습니다. 미세 한 끝 가위 세트를 사용하여 뼈의 원형 영역을 자르고 혈관 앞쪽, 후방 및 황소 아래 깊은 혈관을 자르지 않도록주의하십시오.
5. 천재성 노출
- 이 구멍 안에는 뼈의 볼록한 비트가 있으며, 이것은 달팽이관입니다. 달팽이관에 전방은 근육, 텐서 티파니 (그림 1D참조)입니다. 스프링 가위를 사용하여 텐서 티파니를 자르고 제거합니다.
- 발가락 핀치를 수행합니다. 동물이 반응하는 경우, 케타민 / 자일라진 혼합물 아타1/3 주사위를 배설하십시오.
- 관개 액과 흡입 선을 준비합니다. 외과 프로브를 사용하여 달팽이관 추진에 구멍을 뚫습니다. 즉시 흘러 나오는 액체를 관개하고 흡입으로 제거합니다. 이 액체는 이 시점부터 다소 연속적으로 흐르며 주기적으로 해결해야 합니다.
- 달팽이관의 구멍을 확대합니다. 달팽이관을 후면과 측면 가장자리로 둘러싸고 있는 혈관을 돌봐.
- 마우스의 머리를 앞으로 기울이세요. 달팽이관 아래에 현세적 뼈의 구멍을 찾습니다(그림 1E참조). 이 구멍에 능선 전방의 주의, 이 능선은 일곱 번째 신경 위에 직접 앉아.
- 수술 프로브를 구멍에 삽입하고 세일한 뼈를 조심스럽게 들어 올려 일곱 번째 신경을 노출시다(그림 1F참조). 일곱 번째 신경의 얼마나 많은 것이 보이는지, 그리고 조니큐레이트가 완전히 드러지지 않는 경우에, 동물의 머리를 뒤로 기울이고 신경에 전방에서 뼈를 당기려고 시도하십시오.
- 신경절이 아직 완전히 보이지 않으면 아래에서 더 많은 뼈를 끌어당깁니다. 이렇게 하면 뼈 아래에 프로브를 두지 않도록 주의하십시오.
도 1: 조랑말 신경절의 외과 적 노출. (A)마우스 목 구멍의 이미지 사후 기관 절제술. 화살표는 그림의 나머지 부분에서 탐구 수술 영역에 누워 디거스 근육을 가리키고있다. (B)이전에 표시된 디거스강 근육 하에서 영역의 이미지. 화살표는 무딘 해부에 대한 근육의 솔기를 나타냅니다. (C)정폭성 불라의 이미지. 화살표는 수술 프로브와 함께 부서뼈의 솔기를 나타냅니다. (D)황소를 연 후 수술 부위의 이미지. 왼쪽 아래 화살표는 달팽이관, 상부 화살표가 텐서 티파니를 가리킵니다. 박스 라인(E)및(F)의영역을 나타냅니다. (E)달팽이관 후 수술 부위의 이미지가 끊어지고 내용물제거. 백색 화살표는 프로토콜 단계 5.6에서 참조된 수술 프로브를 배치할 위치를 나타냅니다. (F)노출된 조개 신경절의 이미지. 화살표는 일곱 번째 신경의 몸을 나타내고, 돌진삼각형은 조랑말 신경절을 둘러싸고 있다. 패널 A-B, 배율 = 5mm. 패널 C-F, 배율 = 1mm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
6. 태스탄 패널 실행
- 흡입을 사용하여 조니쿨레이트 위로 액체를 제거하십시오. 선택적으로 흡수점을 배치하여 현미경 탐색을 통해 침투를 완화하고 도움을 줍니다.
- 동물을 현미경 아래에 흡수 패드에 놓습니다. 조랑말 신경절을 찾습니다: 유용한 랜드마크에는 불라에 남아 있는 구멍, 현세골의 구멍 및 일곱 번째 신경이 포함됩니다. EPIfluorescence 범위에 FITC/GFP 필터를 사용하여 개별 GCaMP 표현 geniculate 신경절 신경절 뉴런을 확인하십시오. 10x 목표(작업 거리 10mm)는 개별 셀의 활성을 추적하기에 충분한 해상도를 제공하지만 20배 목표(작업 거리 12mm)도 사용할 수 있습니다.
- 동물의 입에 태액 라인을 위해 분주 바늘을 단단히 놓습니다. 페트리 접시를 동물의 입 아래에 놓고 액체를 잡습니다.
- 카메라가 현미경의 시야를 보고 있는지 확인합니다. 비디오 녹화의 시작을 맛있는 프레젠테이션의 시작과 동기화합니다.
- 녹화 하는 동안 응답, 드리프트 및 seepage에 대 한 라이브 피드를 시청 합니다.
- 투명도가 생기면, 조니큐레이트의 시야가 명확하고 반복될 때까지 액체를 흡입한다. 드리프트가 발생하면 헤드 포스트의 모든 부분이 단단히 조여있는지 확인합니다. 응답이 발생하지 않으면 액체가 흐르고 현미경과 카메라가 시야를 가리는 것이 없는 적절한 위치에 초점을 맞추고 있는지 확인합니다.
- 원하는 비디오 수가 얻을 때까지 반복합니다. 리트랙터를 부드럽게 완화한 다음 반대편에서 3-6단계를 반복합니다.
- 원하는 모든 간질에 대해 원하는 비디오를 얻은 후 자궁 경부 탈구를 통해 동물을 안락사시하십시오.
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Representative Results
프로토콜에 따라, 형질전환 Snap25-GCaMP6s 동물은 진정되고, 조네이큐레이트 간리아가 노출되고, 비디오가 녹화되는 동안 태액을 혀에 적용했다. 실험의 목적은 각 세포에서 어떤 술관이 반응을 유도하는지 정의하는 것이었습니다. 태스트(30mM AceK, 5m키닌, 60mM NaCl, 50mM IMP + 1mM MPG, 50mM 양연산)18은 DI 수에 용해되어 DI 수의 13s로 분리된 2s에 혀에 적용되었다.
도 2: 생체내 GCaMP6s 이미징에서 사용하는 술관에 대한 조향성 신경절 뉴런의 반응. (A)스냅25-GCaMP6s 의 조질성 신경절의 에피플루오에센트 이미지는 물이 혀에 퍼지면서 기준기 동안 형질성 마우스의 형광성 마우스를 배반한다. 대선은 조일컬트 신경절의 대략적인 경계를 나타냅니다. 일곱 번째 두개골 신경은 그러한 것으로 표시됩니다. (B)동일한 신경절의 스냅샷(A)은 달콤한 태스트(AceK 30 mMM)로 마우스의 혀에 적용됩니다. 여러 개별 뉴런이 형광 강도가 증가합니다. 대시 라인 박스(C)끝에 사용되는 달콤한 응답 셀을 나타냅니다. (C)GCaMP6s의 진폭을 나타내는 5개의 뉴런으로부터의 추적은 달콤한(30mM 아세술람 K), 쓴(5mM 퀴닌)으로 구성된 술관 패널에 대한 응답으로 형광을 중재하였다. 짠 (60 mM NaCl); 감칠맛 (50 mM 모노포타슘 글루타민산염 및 1mM 이노신 모노인산염); 신맛 (50 mM 구연산). 컬러 바는 실험의 시간 과정 동안 자극의 배치 및 지속 시간(2 s)을 표시합니다. 이러한 대표적인 데이터에는 감칠맛에 대한 응답이 포함되지 않습니다. 개별 뉴런은 일반적으로 쓴 자극과 신 자극 (바닥 추적) 16,18,20모두에 반응한다. 패널 A-B, 배율 = 5mm. 패널 C, 수평 축척 막대는 6.5초를 나타내며, 수직 스케일 바는 4% dF/F의 임계값을 나타내며, 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 2에서볼 수 있듯이, 혀에 적용된 맛 자극은 GCaMP 형광의 급격한 일시적인 증가를 초래하여 반응하는 뉴런 중 밝기의 눈에 띄는 변화를 야기한다. 이 비디오는 다양한 소프트웨어 패키지로 분석하여 개별 관심 영역(예: 개별 뉴런)의 시간에 따른 기준선(dF/F)에 대한 형광의 변화를 표시하는 흔적을 생성하여 각 셀의 반응을 태목 패널에 표시할 수 있다. 성공적인 수술에서, Snap25-GCaMP6s 형질 전환선에서, 단일 신경절/ 시야 내에서 20-40 뉴런의 반응을 보는 것이 일반적입니다. 이는 사용된 형질전환선또는 AAV-GCaMP가 대신 사용되는 경우에 따라 변경될 수 있습니다. 기준선 형광은 GCaMP의 발현 수준 및 수술 중 세포에 대한 손상 가능성을 포함한 여러 요인에 의해 영향을 받을 수 있습니다. 임계값 수준(일반적으로 df/f > 평균 소음보다 3배 이상 높은 형광 강도의 변화)20,21은 긍정적인 반응으로 간주됩니다.
자극 전달의 타이밍을 결정하기 위해 액체가 라인을 통과하는 데 걸리는 시간을 측정하여 유체 변화가 실제로 혀에 닿는 시기를 알아야 합니다. 이 지연을 줄이려면 적당한 유량(5-10ml/min)과 구강 내 구혈 매니폴드로 이어지는 짧은 튜브 길이를 사용하십시오. 전형적으로, 여기에 설명된 자극으로, 태슬을 혀에 적용한 직후에 형광이 시작되고, 술이 멈추고 구강이 차량 용액으로 세척된 직후에 퇴색하기 시작합니다. 알 수 없는 자극으로 작업 할 때 이미지의 전반적인 변화를 비교 하기 위해 뉴런응답 하지 않고 영역의 형광변화를 관찰 하는 것이 도움이 될 수 있습니다.
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Discussion
이 작품은 조폐성 신경절을 외과적으로 노출하고 GCaMP6s로 뉴런의 활동을 시각적으로 기록하는 단계별 프로토콜을 설명합니다. 이 절차는 몇 가지 주목할 만한 예외를 제외하고 이전에 설명된17과매우 유사합니다. 첫째, 헤드 포스트를 사용하면 수술 중 헤드 포지셔닝을 쉽게 조정할 수 있습니다. 둘째, 자극 전달에 관해서는, 우와 드보리안치코프의 접근법은 식도튜브(17)를통해 맛 자극을 흐르는 반면, 이 프로토콜은 디스펜싱 바늘로 입안으로 직접 액체를 전달한다. 두 방법 중 어느 방법으로든 곰팡이 형태와 성골 미각을 자극하여 조낭 신경절 뉴런 반응을 성공적으로 불러 일으킬 수 있습니다.
명확한 이미징 필드를 유지하는 것에 대한 참고 사항: 달팽이를 부러뜨린 후, 조랑말 신경절 을 직접 통해 공동 의 유체의 지속적인 침투가있을 것입니다. 출혈이 조랑말 신경절을 가릴 가능성도 있습니다. 소량의 시페이지가 이미징을 예방하기에 충분하지 않을 수 있지만 소량의 혈액조차도 신경통을 완전히 가려질 수 있습니다. 이러한 문제는 몇 가지 방법으로 해결할 수 있습니다. 첫째, 시페이지가 비교적 사소한 경우, 시험 사이에 무딘 분배 바늘이 장착된 흡입 선을 사용하여 제거할 수 있다. 또는, 액체는 또한 7번째 신경에 흡수점 후방 또는 측면을 신중하게 배치하여 필드에서 멀리 사악해질 수 있다. 흐름이 특히 나쁜 경우, 이미징 중에 캐비티에 흡입을 적용해야 할 수도 있습니다. 신중하게 배치된 흡입 선은 측면 위치에 적용되는 동안 신경리아를 깨끗하게 유지할 수 있으므로 이미징 중에 신경망이 가리는 것을 방지할 수 있습니다.
이미징 자체는 다양한 형태의 현미경 설정을 사용하여 달성할 수 있으며, 각 기에는 이러한 장점과 한계가 있습니다. 상피성범위(18,21)를사용하는 경우, 더 많은 피상적 뉴런을 이미지화할 수 있다. epifluorescence 화상 진찰을 가진 또 다른 문제점은 더 깊은 세포에서 신호가 배경 형광의 변화로 나올 것이라는 것입니다 (초점 빛에서) 그래서 ROI에 있는 그밖 세포에서 형광 변경을 픽업하지 않는 분석에 주의하십시오. 특히 조랑말 간질과 같은 얇은 구조의 경우 이러한 문제가 문제가 되지 않을 수 있습니다. 2-광자16 또는 공초점20 현미경의 사용은 잠재적으로 더 깊은 층에 있는 화상 진찰 세포를 허용할 수 있습니다.
몇 가지 중요한 단계와 일반적인 문제를 해결하는 방법을 강조하는 것이 중요합니다. 첫째, 사용된 소프트웨어에 따라 분석이 상당히 달라질 것이라는 점에 유의해야 합니다. 오픈 소스 소프트웨어인 ImageJ는 예비 분석에 충분한 도구를 제공합니다. 먼저, 이미지 안정기플러그인(22)을사용하여 작은 모션 아티팩트를 제거하고, 다음은 ImageJ를 사용하여 기준형형(dF/F)으로 나눈 형광의 변화를 계산한다. 이것은 ImageJ23에대한 많은 오픈 소스 매크로 중 하나를 사용하여 수행 할 수 있으며 참조 된 매크로는 자세한 설치 메모를 제공합니다. 다른 매크로의 경우 해당 문서를 참조하십시오. dF/F를 수정한 후 이미지 스택 하단의 전방 및 역 버튼을 사용하여 자극에 대한 셀 응답을 관찰합니다. 도구 표시줄의 올가미 도구를 사용하여 형광 세포를 개별적으로 선택합니다. 셀 사용 이미지를 선택한 후 이미지 | 스택 | 플롯 Z 축. 이렇게 하면 응답 프로필을 확인하고 각 관심 지역(ROI)의 시간 관련 이벤트를 분석하기에 충분한 정보를 제공합니다. 고급 분석은 오랫동안 Matlab, R 등의 사용자 지정 스크립트 도메인이었습니다. 그러나, 칼슘 이미징의 인기는 점차 CaImAn, EZCalcium, 및24,25를포함하여 분석을 위한 다중 오픈 소스 자원의 개발로 이끌어 왔습니다.
칼슘 이미징은 단일 뉴런 해상도로 신경 앙상블의 활동을 검사하기위한 강력한 도구입니다. 조일큐레이트 신경절의 작은 크기 때문에 이 프로토콜은 전체 신경절이 단일 필드 내에서 시각화될 수 있기 때문에 특히 강력합니다. 그러나 이 기술에는 몇 가지 제한이 있습니다. 모든 칼슘 이미징 실험에 일반적인 제한 이외에, 여기에서 기술된 외과 접근은 침략적이고 마취의 밑에 수행되어야 합니다. 이것은 말단 절차입니다 - 동물은 화상 진찰 후에 즉시 안락사되어야 합니다. 따라서 이 외과 적 접근법은 깨어 / 행동 녹음에 적합하지 않습니다.
지난 몇 년 동안, 연구원은 조랑말 신경절의 뉴런의 응답 프로필을 연구하기 위해이 기술을 사용16,20,18. 최근 연구는 ganglia 내의 하위 집단을 조작하는 데 사용할 수있는 잠재적 인 유전 마커에 초점을 맞추고 있으며 트랜스 제닉 Cre 드라이버 라인과 Cre 의존GCaMP가 이 집단(26)의응답 프로파일을 식별하는 데 어떻게 사용될 수 있는지 보여주었습니다. 다른 작업은 먼저 면역 히스트토화학 또는 시투혼성화(27)에서사용될 술관에 의해 활성화된 세포를 식별한 다음, 파-mCherry와 같은 사진 활성화 단백질을 가진 GCaMP를 사용할 수 있다. 또한 CaMPARI와 같은 칼슘 의존형 사진 컨버터블 단백질을 동일한 효과로 활용하는 동시에 여기에 기재된 것과 매우 유사한 실험 방법을 사용하는 것이 가능할 수있다. 특정 질문과 실험에 관계없이 칼슘 이미징은 여러 가지 활동에 종사하는 뉴런의 반응 프로파일을 탐색할 수 있는 강력한 도구를 제공하며, 맛 시스템을 탐색하는 데 유용성은 시작에 불과합니다.
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Disclosures
저자는 보고할 이해 상충이 없습니다.
Acknowledgments
저자는 마우스 축산에 대한 S. 후마윤에게 감사드립니다. 이 작업에 대한 자금은 UTSA의 뇌 건강 컨소시엄 대학원 및 박사 후 종자 보조금 (B.E.F.) 및 NIH-SC2-GM130411에서 L.J.M부분적으로 제공되었습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 x #5 Inox Forceps | Fine Science Tools | NC9792102 | |
| 1ml Syringe with luer lock | Fisher Scientific | 14-823-30 | |
| 2 x #3 Inox Forceps | Fine Science Tools | M3S 11200-10 | |
| 27 Gauge Blunt Dispensing Needle | Fisher Scientific | NC1372532 | |
| 3M Vetbond | Fisher Scientific | NC0398332 | |
| 4-40 Machine Screw Hex Nuts | Fastenere | 3SNMS004C | |
| 4-40 Socket Head Cap Screw | Fastenere | 3SSCS04C004 | |
| Absorbent Points | Fisher Scientific | 50-930-668 | |
| Acesulfame K | Fisher Scientific | A149025G | |
| Artificial Tears | Akorn | 59399-162-35 | |
| BD Allergist Trays with Permanently Attached Needle | Fisher Scientific | 14-829-6D | |
| Blunt Retractors | FST | 18200-09 | |
| Breadboard | Thor Labs | MB8 | |
| Citric Acid | Fisher Scientific | A95-3 | |
| Cohan-Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15000-02 | |
| Contemporary Ortho-Jet Liquid | Lang | 1504 | |
| Contemporary Ortho-Jet Powder | Lang | 1520 | |
| Cotton Tipped Applicators | Fisher | 19-062-616 | |
| Custom Head Post Holder | eMachineShop | See attached file 202410.ems | |
| Custom Metal Head Post | eMachineShop | See attached file 202406.ems | |
| DC Temperature Controller | FHC | 40-90-8D | |
| Digital Camera, sCMOS OrcaFlash4 Microscope Mounted | Hamamatsu | C13440 | |
| Disection Scope | Leica | M80 | |
| Hair Clippers | Kent Scientific | CL7300-Kit | |
| IMP | Fisher Scientific | AAJ6195906 | |
| Ketamine | Ketaved | NDC 50989-996-06 | |
| LED Cold Light Source | Leica Mcrosystems | KL300LED | |
| Luer Lock 1/16" Tubing Adapters | Fisher | 01-000-116 | |
| Microscope | Olympus | BX51WI | |
| Mini-series Optical Posts | Thorlabs | MS2R | |
| MPG | Fisher Scientific | AAA1723230 | |
| MXC-2.5 Rotatable probe Clamp | Siskiyou | 14030000E | |
| NaCl | Fisher Scientific | 50-947-346 | |
| petri dishes | Fisher Scientific | FB0875713A | |
| Pressurized air | Airgas | AI Z300 | |
| Quinine | Fisher Scientific | AC163720050 | |
| Self Sticking Labeling Tape | Fisher Scientific | 159015R | |
| Silicone Pinch Valve Tubing 1/32" x 1/16" o.d. (per foot) | Automate Scientific | 05-14 | |
| Sola SM Light Engine | Lumencor | ||
| Snap25-2A-GCaMP6s-D | JAX | 025111 | |
| Student Fine Scissors | Fine Science Tools | 91460-11 | |
| Surgical Probe | Roboz Surgical Store | RS-6067 | |
| Surgical Probe Holder | Roboz Surgical Store | RS-6061 | |
| Thread | Gütermann | 02776 | |
| BD Intramedic Tubing | Fisher Scientific | 22-046941 | |
| Two Stage Gas Regulator | Airgas | Y12FM244B580-AG | |
| Tygon vinyl tubing - 1/16" | Automate Scientific | 05-11 | |
| Valvelink8.2 digital/manual controller | Automate Scientific | 01-18 | |
| Valvelink8.2 Pinch Valve Perfusion System | Automate Scientific | 17-pp-54 | |
| Xylazine | Anased | NADA# 139-236 |
References
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