Summary
Här presenterar vi hur man exponerar geniculate ganglion av en levande, bedövad laboratoriemus och hur man använder kalciumavbildning för att mäta svaren från ensembler av dessa nervceller för att smaka stimuli, vilket möjliggör flera prövningar med olika stimulantia. Detta möjliggör djupgående jämförelser av vilka neuroner som svarar på vilka tastants.
Abstract
Under de senaste tio åren har framsteg inom genetiskt kodade kalciumindikatorer (GECIs) främjat en revolution inom in vivo funktionell avbildning. Med kalcium som proxy för neuronal aktivitet ger dessa tekniker ett sätt att övervaka svaren från enskilda celler inom stora neuronala ensembler på en mängd olika stimuli i realtid. Vi, och andra, har tillämpat dessa tekniker för att avbilda svaren från enskilda geniculate ganglion nervceller för att smaka stimuli tillämpas på tungorna hos levande sövd möss. Den geniculate ganglion består av cellkroppar av gustatory nervceller innervating främre tungan och gommen samt några somatosensory nervceller innervating pinna örat. Imaging de smak-framkallade svaren av enskilda geniculate ganglion nervceller med GCaMP har gett viktig information om justering profiler av dessa nervceller i vilda typer möss samt ett sätt att upptäcka perifer smak miswiring fenotyper i genetiskt manipulerade möss. Här demonstrerar vi det kirurgiska ingreppet för att exponera geniculate ganglion, GCaMP fluorescens bild förvärv, inledande steg för data analys och felsökning. Denna teknik kan användas med transgeniskt kodad GCaMP, eller med AAV-medierad GCaMP-uttryck, och kan ändras för att avbilda vissa genetiska undergrupper av intresse (dvs. Cre-medierat GCaMP-uttryck). Sammantaget är in vivo kalcium imaging av geniculate ganglion nervceller en kraftfull teknik för att övervaka aktiviteten i perifera gustatory nervceller och ger kompletterande information till mer traditionella hela nerv chorda tympani inspelningar eller smak beteende analyser.
Introduction
En viktig komponent i däggdjurens perifera smaksystem är den geniculate ganglion. Förutom vissa somatosensory nervceller som innervate toppen av örat, består geniculatet av cellkropparna av gustatory nervceller innervating den främre tungan och gommen. I likhet med andra perifera sensoriska nervceller är de geniculate ganglion nervcellerna pseudo-unipolar med en lång axon som projicerar perifert till smaklökarna, och centralt till hjärnstammen kärnan i det ensamma systemet1. Dessa nervceller aktiveras främst genom frisättning av ATP av smakreceptorceller som svarar på smakstimuli i munhålan2,3. ATP är en viktig signalsubstans för smaksignalering, och P2rx-receptorer uttryckta av gustatory ganglion nervceller är nödvändiga för deras aktivering4. Med tanke på att smakreceptorceller uttrycker specifika smakreceptorer för en viss smakmodalitet (söt, bitter, salt, umami eller sur), har det varit hypotesen att gustatory ganglion neuron svar på smak stimuli också skulle vara snävt trimmade5.
Hela nervinspelningar har visat både chorda tympani och de större överlägsna petrosala nerverna utför gustatory signaler som representerar alla fem smakmodaliteter till geniculate ganglion6,7. Detta lämnade dock fortfarande frågor om specificiteten hos neuronala svar på en given tastant: om det finns smakmodalitet specifika nervceller, polymodala nervceller eller en blandning av båda. Enstaka fiberinspelningar ger mer information om aktiviteten hos enskilda fibrer och deras kemiska känslighet8,9,10, men denna metodik är begränsad till att samla in data från ett litet antal fibrer. På samma sätt ger in vivo elektrofysiologiska inspelningar av enskilda råtta geniculate ganglion nervceller information om svaren från enskilda nervceller11,12,13, men förlorar fortfarande befolkningens aktivitet och ger relativt få neuroninspelningar per djur. För att analysera svarsmönstren hos neuronala ensembler utan att förlora enskilda nervcellers aktivitet ur sikte behövde nya tekniker användas.
Kalciumavbildning, särskilt med hjälp av genetiskt kodade kalciumindikatorer som GCaMP, har gett detta tekniskagenombrott 14,15,16,17,18. GCaMP använder kalcium som en proxy för neuronal aktivitet, vilket ökar grön fluorescens när kalciumnivåerna i cellen stiger. Nya former av GCaMP fortsätter att utvecklas för att förbättra signal-till-brusförhållandet, justera bindande kinetik och anpassa sig för specialiserade experiment19. GCaMP ger enkel neuronupplösning, till skillnad från hel nervinspelning, och kan samtidigt mäta svar från ensembler av nervceller, till skillnad från enkelfiber eller encellsinspelning. Kalciumavbildning av de genframkallande ganglierna har redan gett viktig information om justeringsprofilerna för dessa nervceller hos vilda möss16,20, och har identifierat perifer smak som missupplöser fenotyper hos genetiskt manipulerade möss18.
En stor svårighet att tillämpa in vivo kalcium imaging tekniker på geniculate ganglion är att det är inkapslat inom beniga tympanic bulla. För att få optisk åtkomst till geniculatet krävs känslig kirurgi för att ta bort lagren av ben, samtidigt som ganglionen förblir intakt. För det ändamålet har vi skapat denna guide för att hjälpa andra forskare att få tillgång till geniculate ganglion och avbilda GCaMP medierade fluorescerande svar av dessa nervceller för att smaka stimuli in vivo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Djurprotokoll granskades och godkändes av institutionella djurvårds- och användningskommittéer vid University of Texas San Antonio.
1. Föroperativ inställning
OBSERVERA: Observera att den första installationen av utrustning inte åtgärdas här, eftersom den kommer att variera beroende på pumpsystem, mikroskop, kamera och bildåtergivningsprogram som används. För installationsinstruktioner, se instruktionsmaterial från utrustningsleverantören. För utrustning som används av författarna, se materialförteckningen.
- Se till att vätska flödar genom alla fordons- och tastantledningar. Om linjen är blockerad, koppla bort och spola med vatten. Om linjen är kinked, massera tills vätskan flödar. Se till att vätskan startar och stannar på signalen.
- När alla linjer har bekräftats oblockerade, kör fordonet i 10 s och stäng sedan alla ventiler.
- Se till att bildframställningsprogramvaran är klar med alla nödvändiga variabler (t.ex. provlängd, filnamn, bildhastighet osv.). Använd μManager, ett programpaket för bildförvärv med öppen källkod, mata in 200 ms i fältet märkt Exponeringstid för en bildruta per sekund på 5Hz, välj x2 under binningoch tryck på knappen som heter Live. När videon startar trycker du på knappen på vänster sida märkt ROI. Detta kommer att resultera i ett 512x512-synfält.
2. Bedöva och immobilisera djuret
OBS: Följande protokoll är en terminalprocedur optimerad för möss av båda könen som väger 18-35 g. Det rekommenderas för användning med djur mellan 10 och 12 veckors ålder. Det kan användas med transgena djur som uttrycker genetiskt kodade kalciumindikatorer (GECIs) såsom Snap25-GCaMP6s, eller djur som stereotaxiskt injiceras med virala GECIs. Handskar, labbrock och ansiktsmask bör bäras under hela protokollet.
- Scruff djur och utföra en intraperitoneal injektion av Ketamin (100 mg/kg) och Xylazine (10 mg/kg). Utvärdera anestesidjupet via tå nypa innan du fortsätter.
- Raka toppen av huvudet amd operationsområdet framtill på nacken.
- Slå på värmedynan och placera djuret benägen på dynan.
- Applicera salva på djurets ögon för att undvika torkning av ögonen.
- Gör ett snitt (~ 1 cm) vid huvudets mittlinje för att exponera djurets skalle. Ta bort bindväven med en steril svabbpinne så att det nakna benet är tillgängligt. Använd en bomullsspetsad applikator för att säkerställa att skallen är torr.
- Applicera veterinärbindning på skallen. Var noga med att täcka den exponerade skallen. Vänta tills limet torkar.
- Blanda och applicera ett lager dentalcement på skallen i ett petriskållock. Baksidan av bomullsspetsad applikator som används i steg 2.5 fungerar bra för denna process. Placera huvudposten ovanpå tandcementet och applicera ett andra lager dentalcement för att smöra huvudposten på plats på skallen.
- Låt den sitta tills tandcementet är torrt och fast. Bryt bomullsspetsad applikator i hälften och använd de spetsiga ändarna för att peta tandcementet för att testa. Om tandcementet inte ger efter för att petas kan djuret vändas till en supin position.
3. Trakeotomi
- Applicera prekirurgisk skrubb på operationsområdet. Efter skrubba, gör ett mittlinjesnitt ~ 2 cm i halsens hud från bröstbenet till hakan.
- Dra tillbaka huden och underduberillary körtlar, var noga med att helt exponera de digastric musklerna.
- Hitta sömmen i den paratrakeala muskulaturen, separera den med trubbig dissekering och dra tillbaka den.
- Skär försiktigt en öppning i toppen av luftstrupen som är tillräckligt stor för att passa polyetenrör (D. 0,86 mm, O.D. 1,27 mm). Skär inte mer än halvvägs genom luftstrupens diameter. Sätt in slangar i luftstrupen mot lungorna.
- Flytta upprullningsdon för att frigöra paratrakeal muskulatur och dra tillbaka submaxillary körtlar.
- Limparaparatrakeal muskulatur tillsammans över slangar med minimal mängd veterinärlim (se figur 1A).
4. Bryta upp den tympaniska bullan
- Reta försiktigt önskad digastric muskel (vänster eller höger) upp och dra isär bindväven. Skär i den främre änden av muskeln, undvik blodkärl och dra tillbaka bakre tills den är fri från den tympaniska bullan.
- Luta huvudet tillbaka något för att lyfta den tympaniska bullan. Lokalisera grenen av halsartären främre till den bakre insättningspunkten för digastric muskeln. Känn dig bara bakre till detta blodkärl för konvex struktur av den tympaniska bulla.
- Leta efter en söm i muskulaturen på denna plats (se figur 1B). Med hjälp av två uppsättningar fina tångar dissekerar trubbigt i sömmen tills benet på den tympaniska bullan är synligt. Använd upprullningsdon för att hålla en klar bild av den tympaniska bullan.
- Hitta sömmen som löper fram till bakre delen av bullan (se figur 1C). Använd en kirurgisk sond, peta ett hål i benet i mitten av denna söm. Använd en uppsättning finslutssax för att skära ett cirkulärt område i benet, var noga med att inte skära blodkärlen främre, bakre och djupt under bullan.
5. Exponera geniculatet
- Inuti detta hål finns en konvex bit ben, det här är cochlea. Främre cochlea är en muskel, tensor tympani (se figur 1D). Använd fjädersaxen, skär tensor tympani och ta bort den.
- Gör en tå nypa. Om djuret svarar, ge en ketamin/xylazinblandning ata 1/3 dos för omgörning.
- Förbered bevattningsvätska och en sugledning. Använd den kirurgiska sonden och peta ett hål i cochlear-udden. Bevattna omedelbart vätskan som strömmar ut och ta bort den med sug. Denna vätska kommer att flöda mer eller mindre kontinuerligt från denna punkt och måste åtgärdas regelbundet.
- Förstora hålet i cochlea. Var försiktig med blodkärlet som omger cochlea till den bakre och laterala kanten.
- Luta musens huvud framåt. Lokalisera hålet i tinningbenet under vad som var cochlea (se figur 1E). Notera åsen främre till detta hål, denna ås sitter direkt över den sjunde nerven.
- Sätt in en kirurgisk sond i hålet och lyft försiktigt det temporala benet för att exponera den sjunde nerven (se figur 1F). Utvärdera hur mycket av den sjunde nerven som är synlig och om geniculatet inte är helt exponerat, luta djurets huvud tillbaka och försök att dra upp ben från främre till nerven.
- Om ganglionen fortfarande inte är helt synlig, dra upp mer ben underifrån. Var mycket försiktig så att sonden inte placeras djupt under benet eftersom det kan skada geniculatet.
Figur 1:Kirurgisk exponering av den geniculate ganglion. (A) Bild av mus hals hålighet post trakeotomy. Arrow pekar på den digastriska muskeln som ligger över operationsområdet som utforskas i resten av figuren. (B) Bild av regionen under den tidigare angivna digastric muskeln. Pilen anger sömmen i muskulatur för trubbig dissekering. C)Bild av Tympanic Bulla. Pil indikerar söm i benet för att bryta med en kirurgisk sond. (D) Bild av kirurgiskt område efter öppnandet av bullan. Nedre vänstra pilen indikerar cochlea, övre pilen pekar mot tensor tympani. Boxad linje anger område i (E) och (F). (E) Bild av kirurgiskt område efter cochlea har brutits och innehållet avlägsnats. Vit pil anger var kirurgisk sond som refereras i protokoll steg 5.6 ska placeras. (F) En bild av den exponerade geniculate ganglion. Pil indikerar den sjunde nervens kropp, streckad triangel omger den geniculate ganglion. Panelerna A-B, Skala = 5 mm. Panelerna C-F, Skala = 1 mm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
6. Kör tastant panel
- Använd sug för att avlägsna vätska från över geniculatet. Placera valfri en absorberande punkt för att minska sippring och hjälp i mikroskopnavigering.
- Placera djuret på absorberande dyna under mikroskopet. Lokalisera den geniculate ganglion: användbara landmärken inkluderar hålet kvar i bulla, hålet i tinningbenet och den sjunde nerven. Använd FITC/GFP-filtret på epifluorescensomfånget, kontrollera om det finns enskilda GCaMP-uttrycksgenula ganglionneuroner. Ett 10x-mål (workind avstånd 10mm) ger tillräcklig upplösning för att spåra enskilda cellers aktivitet, men ett 20x-mål (arbetsavstånd 12 mm) kan också användas.
- Placera dispenseringsnålen för tastantlinje ordentligt i djurets mun. Placera en Petri-skål under djurets mun för att fånga vätska.
- Se till att kameran visar mikroskopets synfält. Synkronisera starten av videoinspelningen med början av tastantpresentationen.
- Under inspelningen tittar du på live-feed för svar, drift och seepage.
- Om det sker, sug vätskan tills vyn av geniculatet är klar och upprepa. Om drift uppstår, kontrollera att alla delar av huvudstolpen är ordentligt åtdragna. Om inga svar uppstår kontrollera att vätskan flödar och att mikroskopet och kameran är fokuserade på rätt plats utan att något skymdar synfältet.
- Upprepa tills önskat antal videor har erhållits. Lätta försiktigt upprullningsdonen och upprepa sedan steg 3-6 på motsatt sida.
- Efter att de önskade videorna har erhållits för alla önskade ganglier, avliva djuret via livmoderhalscancer förskjutning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Efter protokollet var ett transgent Snap25-GCaMP6s djur sederat, geniculate ganglier exponerades och tastant applicerades på tungan medan video spelades in. Syftet med experimentet var att definiera vilka smakämnen som framkallade svar från varje cell. Tastanter (30 mM AceK, 5 mM kinin, 60 mM NaCl, 50 mM IMP + 1 mM MPG, 50 mM citronsyra)18 löstes upp i DI-vatten och applicerades på tungan i 2 s separerade med 13 s DI-vatten.
Figur 2: Svar från genkulerade ganglionneuroner på smakämnen med hjälp av in vivo GCaMP6s imaging. (A) Epifluorescerande bild av den genframkallande ganglionen av en Snap25-GCaMP6s transgen mus under baslinjen när vatten perfunderas över tungan. Streckade linjer anger de ungefärliga gränserna för den geniculate ganglion. Den sjunde hjärnnerven är märkt som sådan. B)Ögonblicksbild av samma ganglion i( A) som en söt tastant (AceK 30 mM) appliceras på musens tunga. Observera flera enskilda nervceller ökning av fluorescens intensitet. Rutan Streckad linje anger söt svarscell som används i( C) änden. C)Spår från fem nervceller som indikerar amplituden hos deras GCaMP6s medierade fluorescens som svar på en panel av smakämnen bestående av sött (30 mM acesulfam K), bittert (5 mM kinin); salt (60 mM NaCl); umami (50 mM monopotassiumglutamat och 1mm inosinmonofofat); och sur (50 mM citronsyra). Färgade staplar visar placeringen och varaktigheten (2 s) av stimulansen under experimentets tidskurs. Dessa representativa uppgifter innehåller inget svar på umami. Enskilda nervceller svarar ofta på både bittra och sura stimuli (bottenspår) 16,18,20. Panelerna A-B, Skala = 5 mm. Panel C, vågrät skalstång indikerar 6,5 sekunder, vertikal skalstång anger tröskelvärdet på 4 % dF/F. Klicka här för att se en större version av den här siffran.
Som kan ses i figur 2, smak stimuli tillämpas på tungan bör resultera i en snabb, övergående ökning av GCaMP fluorescens, vilket orsakar en märkbar förändring i ljusstyrka bland svarande nervceller. Videon kan analyseras med en mängd olika programvarupaket för att producera spår som visar förändringarna i fluorescens över baslinjen (dF / F) över tiden för enskilda regioner av intresse (till exempel enskilda nervceller), vilket visar svaren från varje cell på tastantpanelen. I en framgångsrik operation, i en Snap25-GCaMP6s transgen linje, är det typiskt att se svar i 20-40 nervceller inom en enda ganglion / synfält. Detta kan ändras beroende på vilken transgen linje som används eller om AAV-GCaMP används istället. Observera att fluorescens vid baslinjen kan påverkas av ett antal faktorer, inklusive GCaMP: s uttrycksnivå och eventuella skador på cellerna under operationen. Förändringar i fluorescensintensitet över en tröskelnivå (vanligtvis df/f > 3-faldigt över det genomsnittliga bruset)20,21 anses vara ett positivt svar.
För att bestämma tidpunkten för stimulanstillförseln bör den tid det tar för vätska att flöda genom linjerna mätas för att veta när en vätskeförändring faktiskt kommer i kontakt med tungan. För att minska denna fördröjning, använd ett måttligt flöde (5-10 ml/min) och en kort längd av slangar som leder från perfusionsgrenröret till munhålan. Vanligtvis, med de stimuli som beskrivs här, börjar fluorescens nästan omedelbart efter att tastant appliceras på tungan och börjar blekna nästan omedelbart efter att tastanten har stoppats och munhålan tvättas med fordonslösning. När du arbetar med en okänd stimulans kan det vara till hjälp att observera förändringen i fluorescensen i en region utan att svara på nervceller för att jämföra övergripande förändringar i bilden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Detta arbete beskriver ett steg-för-steg-protokoll för att kirurgiskt exponera geniculate ganglion och visuellt registrera aktiviteten hos dess nervceller med GCaMP6s. Detta förfarande är mycket likt det som beskrivitstidigare 17, med några anmärkningsvärda undantag. För det första möjliggör användningen av en huvudstolpe enkel justering av huvudpositionering under operationen. För det andra, när det gäller stimulansleverans, strömmar Wus och Dvoryanchikovs tillvägagångssätt smakstimuli genom matstrupsslang17, medan detta protokoll levererar vätska direkt i munnen med en dispenseringsnål. Båda metoderna kan användas för att framgångsrikt framkalla geniculate ganglion neuron svar genom att stimulera svampform och palatal smak knoppar.
En anteckning om att upprätthålla ett tydligt bildfält: efter att ha brutit cochlea kommer det att finnas kontinuerlig sippring av vätska i håligheten, inklusive direkt över geniculate ganglion. Det är också möjligt att blödning kommer att skymma den geniculate ganglion. Medan en liten mängd seepage kanske inte är tillräckligt för att förhindra avbildning, kan även små mängder blod helt ocklusiv ganglierna. Dessa frågor kan hanteras på ett par sätt. För det första, om seepage är relativt liten, kan den tas bort med hjälp av en sugledning utrustad med en trubbig dispenseringsnål mellan försöken. Alternativt kan vätska också vara ond bort från fältet genom att försiktigt placera absorberande punkter bakre eller laterala till den sjunde nerven. Om flödet är särskilt dåligt kan det vara nödvändigt att applicera sug på håligheten under avbildning. En noggrant placerad suglina kan hålla ganglierna fria medan de appliceras på en sidoplats, för att undvika att skymta ganglierna under avbildning.
Själva avbildningen kan utföras med hjälp av olika stilar av mikroskopinställningar, var och en med sina åtföljande fördelar och begränsningar. När du använder ett epifluorescensomfång18,21, är det bara möjligt att avbilda de mer ytliga nervcellerna. Ett annat problem med epifluorescensavbildning är att signaler från djupare celler kommer ut som förändringar i bakgrundsfluorescens (ur fokusljus) så var försiktig med analysen för att inte plocka upp fluorescensförändringar från andra celler i ROI. För särskilt tunna strukturer, såsom de geniculate ganglierna, kan dessa frågor inte vara problematiska. Användning av ett 2-foton16- eller konfokalt20-mikroskop kan potentiellt möjliggöra bildceller i djupare lager.
Det är viktigt att lyfta fram några kritiska steg och sätt att felsöka vanliga problem. För det första måste det noteras att analysen kommer att variera avsevärt beroende på vilken programvara som används. ImageJ tillhandahåller verktyg med öppen källkod som är tillräckliga för preliminär analys. Ta först bort små rörelseartefakter med hjälp av Bildstabilisatorplugin22, Använd sedan ImageJ för att beräkna förändringen i fluorescens dividerat med baslinjefluorescens (dF /F). Detta kan åstadkommas med hjälp av ett av många open source-makron för ImageJ23, det refererade makrot innehåller detaljerade installationsanteckningar. För andra makron, se deras dokumentation. Efter korrigering för dF/F använder du de främre och omvända knapparna längst ner i bildstacken för att observera cellsvar på stimuli. Använd lassoverktyget från verktygsfältet och välj fluorescerande celler individuellt. När du har markerat en cell använder du | Staplar | Plot-Z-Axel. Detta ger tillräcklig information för att fastställa svarsprofiler och analysera tidsrelaterade händelser i varje intresseregion. Mer avancerad analys var länge domänen för anpassade skript i Matlab, R, etc. Men populariteten för kalciumavbildning har gradvis lett till utvecklingen av flera öppna källor resurser för analys inklusive CaImAn, EZCalcium och mer24,25.
Kalciumavbildning är ett kraftfullt verktyg för att undersöka aktiviteten hos neurala ensembler med enkel neuronupplösning. På grund av geniculate ganglions lilla storlek är detta protokoll särskilt kraftfullt eftersom hela ganglion kan visualiseras inom ett enda fält. Det finns dock vissa begränsningar för denna teknik. Förutom de begränsningar som är gemensamma för alla kalcium imaging experiment, är det kirurgiska tillvägagångssättet som beskrivs här invasivt och måste utföras under anestesi. Detta är ett terminalförfarande - djuret måste avlivas omedelbart efter avbildning. Därför är detta kirurgiska tillvägagångssätt inte lämpligt för vakna /beter inspelningar.
Under de senaste åren har forskare använt denna teknik för att studera svarsprofiler av nervcellerna i geniculate ganglion16,20,18. Det senaste arbetet har fokuserat på potentiella genetiska markörer som kan användas för att manipulera subpopulationer inom ganglierna och har visat hur transgena Cre-förarlinjer och Cre-beroende GCaMP kan användas för att identifiera svarsprofilerna för dessapopulationer 26. Annat arbete kan använda GCaMP med fotoaktiverade proteiner som pa-mCherry för att först identifiera och sedan markera celler som aktiveras av tastants för att sedan användas i immunohistokemi eller in situ hybridisering27. Det kan också vara möjligt att använda kalciumberoende fotokonvertibla proteiner som CaMPARI i samma effekt samtidigt som experimentella metoder används som liknar dem som beskrivs här28. Oavsett de specifika frågorna och experimenten erbjuder kalciumavbildning ett kraftfullt verktyg för att utforska svarsprofilerna hos neuroner som är engagerade i ett antal aktiviteter, och dess användbarhet för att utforska smaksystemet börjar bara.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har ingen intressekonflikt att rapportera.
Acknowledgments
Författarna tackar S. Humayun för musskötsel. Finansiering för detta arbete har delvis tillhandahållits av UTSA: s Brain Health Consortium Graduate and Postdoctoral Seed Grant (B.E.F.) och NIH-SC2-GM130411 till L.J.M.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 x #5 Inox Forceps | Fine Science Tools | NC9792102 | |
| 1ml Syringe with luer lock | Fisher Scientific | 14-823-30 | |
| 2 x #3 Inox Forceps | Fine Science Tools | M3S 11200-10 | |
| 27 Gauge Blunt Dispensing Needle | Fisher Scientific | NC1372532 | |
| 3M Vetbond | Fisher Scientific | NC0398332 | |
| 4-40 Machine Screw Hex Nuts | Fastenere | 3SNMS004C | |
| 4-40 Socket Head Cap Screw | Fastenere | 3SSCS04C004 | |
| Absorbent Points | Fisher Scientific | 50-930-668 | |
| Acesulfame K | Fisher Scientific | A149025G | |
| Artificial Tears | Akorn | 59399-162-35 | |
| BD Allergist Trays with Permanently Attached Needle | Fisher Scientific | 14-829-6D | |
| Blunt Retractors | FST | 18200-09 | |
| Breadboard | Thor Labs | MB8 | |
| Citric Acid | Fisher Scientific | A95-3 | |
| Cohan-Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15000-02 | |
| Contemporary Ortho-Jet Liquid | Lang | 1504 | |
| Contemporary Ortho-Jet Powder | Lang | 1520 | |
| Cotton Tipped Applicators | Fisher | 19-062-616 | |
| Custom Head Post Holder | eMachineShop | See attached file 202410.ems | |
| Custom Metal Head Post | eMachineShop | See attached file 202406.ems | |
| DC Temperature Controller | FHC | 40-90-8D | |
| Digital Camera, sCMOS OrcaFlash4 Microscope Mounted | Hamamatsu | C13440 | |
| Disection Scope | Leica | M80 | |
| Hair Clippers | Kent Scientific | CL7300-Kit | |
| IMP | Fisher Scientific | AAJ6195906 | |
| Ketamine | Ketaved | NDC 50989-996-06 | |
| LED Cold Light Source | Leica Mcrosystems | KL300LED | |
| Luer Lock 1/16" Tubing Adapters | Fisher | 01-000-116 | |
| Microscope | Olympus | BX51WI | |
| Mini-series Optical Posts | Thorlabs | MS2R | |
| MPG | Fisher Scientific | AAA1723230 | |
| MXC-2.5 Rotatable probe Clamp | Siskiyou | 14030000E | |
| NaCl | Fisher Scientific | 50-947-346 | |
| petri dishes | Fisher Scientific | FB0875713A | |
| Pressurized air | Airgas | AI Z300 | |
| Quinine | Fisher Scientific | AC163720050 | |
| Self Sticking Labeling Tape | Fisher Scientific | 159015R | |
| Silicone Pinch Valve Tubing 1/32" x 1/16" o.d. (per foot) | Automate Scientific | 05-14 | |
| Sola SM Light Engine | Lumencor | ||
| Snap25-2A-GCaMP6s-D | JAX | 025111 | |
| Student Fine Scissors | Fine Science Tools | 91460-11 | |
| Surgical Probe | Roboz Surgical Store | RS-6067 | |
| Surgical Probe Holder | Roboz Surgical Store | RS-6061 | |
| Thread | Gütermann | 02776 | |
| BD Intramedic Tubing | Fisher Scientific | 22-046941 | |
| Two Stage Gas Regulator | Airgas | Y12FM244B580-AG | |
| Tygon vinyl tubing - 1/16" | Automate Scientific | 05-11 | |
| Valvelink8.2 digital/manual controller | Automate Scientific | 01-18 | |
| Valvelink8.2 Pinch Valve Perfusion System | Automate Scientific | 17-pp-54 | |
| Xylazine | Anased | NADA# 139-236 |
References
- Krimm, R. F. Factors that regulate embryonic gustatory development. BMC Neuroscience. 8, Suppl 3 4 (2007).
- Taruno, A., Matsumoto, I., Ma, Z., Marambaud, P., Foskett, J. K. How do taste cells lacking synapses mediate neurotransmission? CALHM1, a voltage-gated ATP channel. Bioessays. (35), 1111-1118 (2013).
- Taruno, A., et al. Taste transduction and channel synapses in taste buds. Pflugers Archiv-European Journal of Physiology. 473, 3-13 (2021).
- Kinnamon, S. C., Finger, T. E. A taste for ATP: neurotransmission in taste buds. Frontiers in Cell Neuroscience. 7, 264 (2013).
- Chandrashekar, J., Hoon, M. A., Ryba, N. J., Zuker, C. S. The receptors and cells for mammalian taste. Nature. 444 (7117), 288-294 (2006).
- Yarmolinsky, D. A., Zuker, C. S., Ryba, N. J. Common sense about taste: from mammals to insects. Cell. 139 (2), 234-244 (2009).
- Ninomiya, Y., Tonosaki, K., Funakoshi, M.
- Formaker, B. K., MacKinnon, B. I., Hettinger, T. P., Frank, M. E. Opponent effects of quinine and sucrose on single fiber taste responses of the chorda tympani nerve. Brain Research. 772 (1-2), 239-242 (1997).
- Frank, M. The classification of mammalian afferent taste nerve fibers. Chemical Senses. 1 (1), 53-60 (1974).
- Ogawa, H., Yamashita, S., Sato, M. Variation in gustatory nerve fiber discharge pattern with change in stimulus concentration and quality. Journal of Neurophysiology. 37 (3), 443-457 (1974).
- Sollars, S. I., Hill, D. L. In vivo recordings from rat geniculate ganglia: taste response properties of individual greater superficial petrosal and chorda tympani neurones. Journal of Physiology. 564, Pt 3 877-893 (2005).
- Yokota, Y., Bradley, R. M. Geniculate ganglion neurons are multimodal and variable in receptive field characteristics. Neuroscience. 367, 147-158 (2017).
- Breza, J. M., Curtis, K. S., Contreras, R. J. Temperature modulates taste responsiveness and stimulates gustatory neurons in the rat geniculate ganglion. Journal of Neurophysiology. 95 (2), 674-685 (2006).
- Chen, T. W., et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).
- Luo, L., Callaway, E. M., Svoboda, K. Genetic dissection of neural circuits: A decade of progress. Neuron. 98 (4), 865 (2018).
- Barreto, R. P. J., et al. The neural representation of taste quality at the periphery. Nature. 517, 373-376 (2015).
- Wu, A., Dvoryanchikov, G. Live animal calcium imaging of the geniculate ganglion. Protocol Exchange. , 106 (2015).
- Lee, H., Macpherson, L. J., Parada, C. A., Zuker, C. S., Ryba, N. J. P.
- Dana, H., et al. High-performance calcium sensors for imaging activity in neuronal populations and microcompartments. Nature Methods. 16 (7), 649-657 (2019).
- Wu, A., Dvoryanchikov, G., Pereira, E., Chaudhari, N., Roper, S. D. Breadth of tuning in taste afferent neurons varies with stimulus strength. Nature Communications. 6, 8171 (2015).
- Yarmolinsky, D. A., et al. Coding and plasticity in the mammalian thermosensory system. Neuron. 92 (5), 1079-1092 (2016).
- Li, K. The image stabilizer plugin for ImageJ. , Available from: http://www.cs.cmu.edu/~ kangli/code/Image_Stabilizer. html (2008).
- Ackman, J. dF Over F movie ImageJ Plugin. , Available from: https://gist.github.com/ackman678/5817461 (2014).
- Cantu, D. A., et al. EZcalcium: Open-source toolbox for analysis of calcium imaging data. Frontiers in Neural Circuits. 14, 25 (2020).
- Giovannucci, A., et al. CaImAn an open source tool for scalable calcium imaging data analysis. Elife. 8, (2019).
- Zhang, J., et al. Sour sensing from the tongue to the brain. Cell. 179 (2), 392-402 (2019).
- Lee, D., Kume, M., Holy, T. E. A molecular logic of sensory coding revealed by optical tagging of physiologically-defined neuronal types. bioRxiv. , 692079 (2019).
- Moeyaert, B., et al. Improved methods for marking active neuron populations. Nature Communication. 9 (1), 4440 (2018).
