Summary
Her presenterer vi hvordan man eksponerer den geniculate ganglion av en levende, bedøvet laboratoriemus og hvordan du bruker kalsiumavbildning for å måle svarene til ensembler av disse nevronene for å smake stimuli, noe som gir mulighet for flere forsøk med forskjellige sentralstimulerende midler. Dette gir mulighet for grundige sammenligninger av hvilke nevroner som reagerer på hvilke smaksstoffer.
Abstract
I løpet av de siste ti årene har fremskritt innen genetisk kodede kalsiumindikatorer (GECIer) fremmet en revolusjon innen in vivo funksjonell avbildning. Ved å bruke kalsium som proxy for nevronaktivitet, gir disse teknikkene en måte å overvåke responsen til individuelle celler i store nevronale ensembler til en rekke stimuli i sanntid. Vi, og andre, har brukt disse teknikkene for å avbilde svarene til individuelle geniculate ganglion nevroner for å smake stimuli påført tungene til levende bedøvede mus. Den geniculate ganglion består av cellelegemer av gustatory nevroner som innerverer fremre tunge og gane, samt noen somatosensoriske nevroner som innerverer ørets pinna. Avbildning av smaksfremkallende responser fra individuelle geniculate ganglion neuroner med GCaMP har gitt viktig informasjon om tuningprofilene til disse nevronene i ville mus, samt en måte å oppdage perifer smak som feilsefinerer fenotyper hos genetisk manipulerte mus. Her demonstrerer vi den kirurgiske prosedyren for å eksponere geniculate ganglion, GCaMP fluorescence image acquisition, innledende trinn for dataanalyse og feilsøking. Denne teknikken kan brukes med transgent kodet GCaMP, eller med AAV-mediert GCaMP-uttrykk, og kan endres til bildespesifikke genetiske delsett av interesse (dvs. Cre-mediert GCaMP-uttrykk). Totalt sett er in vivo kalsiumavbildning av geniculate ganglion neuroner en kraftig teknikk for å overvåke aktiviteten til perifere gustatory nevroner og gir komplementær informasjon til mer tradisjonelle helnerve chorda tympani-opptak eller smaksadferdsanalyser.
Introduction
En nøkkelkomponent i pattedyrets perifere smakssystem er den geniculate ganglion. I tillegg til noen somatosensoriske nevroner som innervaterer ørets pinna, består geniculatet av cellelegemene til gustatory nevroner som innerverer den fremre tungen og ganen. I likhet med andre perifere sensoriske nevroner er de geniculate ganglion nevronene pseudo-unipolar med en lang axon som projiserer perifert til smaksløkene, og sentralt til hjernestammekjernen i den ensomme kanalen1. Disse nevronene aktiveres hovedsakelig ved frigjøring av ATP av smaksreseptorceller som reagerer på smakstimuli i munnhulen2,3. ATP er en viktig nevrotransmitter for smaksignalering, og P2rx reseptorer uttrykt av gustatory ganglion nevroner er nødvendige for aktivering4. Gitt at smaksreseptorceller uttrykker spesifikke smaksreseptorer for en bestemt smaksmodalitet (søt, bitter, salt, umami eller sur), har det blitt hypoteset at gustatory ganglion neuron responser på smakstimuli også ville være smalt innstilt5.
Hele nerveopptak har vist både chorda tympani og de større overlegne petrosale nervene utfører gustatory signaler som representerer alle fem smak modaliteter til geniculate ganglion6,7. Dette etterlot imidlertid fortsatt spørsmål om spesifisiteten av nevronale responser på en gitt tastant: hvis det er smakmodalitetsspesifikke nevroner, polymodale nevroner eller en blanding av begge deler. Enkeltfiberopptak gir mer informasjon om aktiviteten til individuelle fibre og deres kjemiske følsomheter8,9,10, men denne metoden er begrenset til å samle inn data fra et lite antall fibre. På samme måte gir in vivo elektrofysiologiske registreringer av individuelle rottegenululate ganglion nevroner informasjon om svarene til individuelle nevroner11,12,13, men mister fortsatt befolkningens aktivitet og gir relativt få nevronopptak per dyr. For å analysere responsmønstrene til nevronale ensembler uten å miste av syne aktiviteten til individuelle nevroner, måtte nye teknikker brukes.
Kalsiumavbildning, spesielt ved hjelp av genetisk kodede kalsiumindikatorer som GCaMP, har gitt dette tekniske gjennombruddet14,15,16,17,18. GCaMP bruker kalsium som proxy for nevronaktivitet, noe som øker grønn fluorescens etter hvert som kalsiumnivået i cellen stiger. Nye former for GCaMP fortsetter å bli utviklet for å forbedre signal-til-støy-forholdet, justere bindende kinetikk og tilpasse seg spesialiserte eksperimenter19. GCaMP gir enkel nevronoppløsning, i motsetning til hel nerveopptak, og kan samtidig måle svar av ensembler av nevroner, i motsetning til enkeltfiber eller enkeltcelleopptak. Kalsiumavbildning av geniculate ganglia har allerede gitt viktig informasjon om tuningprofilene til disse nevronene i villtype mus16,20, og har identifisert perifer smak feilwiring fenotyper i genetisk manipulerte mus18.
En stor vanskelighet med å bruke in vivo kalsiumavbildningsteknikker på geniculate ganglion er at den er innkapslet i den benete tympaniske bulla. For å få optisk tilgang til geniculatet, er det nødvendig med delikat kirurgi for å fjerne lagene av bein, samtidig som ganglionen holdes intakt. For det formålet har vi laget denne guiden for å hjelpe andre forskere med å få tilgang til geniculate ganglion og bilde GCaMP medierte fluorescerende responser fra disse nevronene for å smake stimuli in vivo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Dyreprotokoller ble gjennomgått og godkjent av Institutional Animal Care and Use Committees ved University of Texas San Antonio.
1. Forhåndsoperativt oppsett
MERK: Vær oppmerksom på at det første oppsettet av utstyr ikke er adressert her, da det vil variere basert på pumpesystem, mikroskop, kamera og bildebehandlingsprogramvare som brukes. Hvis du vil ha informasjon om oppsett, kan du se instruksjonsmateriell fra utstyrsleverandøren. For utstyr som brukes av forfatterne, se Materiallisten.
- Sørg for at væske strømmer gjennom alle kjøretøy (vann) og tastantlinjer. Hvis linjen er blokkert, kobler du fra og spyler med vann. Hvis linjen er knekt, masser til væsken strømmer. Sørg for at væsken starter og stopper på signalet.
- Når alle linjene er bekreftet ublokkert, kjør kjøretøy i 10 s og lukk deretter alle ventiler.
- Kontroller at bildebehandlingsprogramvaren er klar med alle nødvendige variabler (f.eks. prøvelengde, filnavn, bildefrekvens osv.). Bruk μManager, en programvarepakke for bildeanskaffelse med åpen kildekode, skriv inn 200 ms i feltet merket Eksponeringstid for et bilde per sekund på 5 Hz, velg x2 under binning, og trykk på knappen merket Live. Når videoen starter, trykker du på knappen på venstre side merket avkastning. Dette vil resultere i et synsfelt på 512 x 512.
2. Bedøvelse og immobilisering av dyret
MERK: Følgende protokoll er en terminal prosedyre optimalisert for mus av begge kjønn som veier 18-35 g. Det anbefales for bruk med dyr mellom 10 og 12 uker. Den kan brukes med transgene dyr som uttrykker genetisk kodede kalsiumindikatorer (GECIer) som Snap25-GCaMP6s, eller dyr stereotaxically injisert med virale GECIer. Hansker, labfrakk og ansiktsmaske bør brukes i hele protokollen.
- Scruff dyr og utføre en intraperitoneal injeksjon av Ketamine (100 mg/kg) og Xylazine (10 mg/kg). Vurder dybden av anestesi via tåklemme før du fortsetter.
- Barber toppen av hodet amd det kirurgiske området foran på nakken.
- Slå på varmeputen og plasser dyret utsatt på puten.
- Påfør salve på dyrets øyne for å unngå tørking av øynene.
- Lag et snitt (~ 1 cm) midt på hodet for å eksponere dyrets skalle. Fjern bindevevet ved hjelp av en steril vattpinne slik at det nakne beinet er tilgjengelig. Bruk en bomullsspisset applikator for å sikre at skallen er tørr.
- Påfør veterinærbinding på skallen. Pass på å dekke den eksponerte skallen. Vent til limet tørker.
- Bland og påfør et lag med tannsement på skallen i et Petri-parabolens lokk. Bakenden av bomullsspissapplikatoren som brukes i trinn 2.5, vil fungere bra for denne prosessen. Plasser hodepinnen på toppen av tannsementen og påfør et andre lag med tannsement for å smøre hodepinnen på plass på skallen.
- La den sitte til tannsementen er tørr og solid. Bryt bomullsspissapplikatoren i to og bruk de spisse endene til å stikke tannsementen for å teste. Hvis tannsementen ikke gir etter for å bli stikket, kan dyret bli vendt til en liggende stilling.
3. Trakeotomi
- Påfør pre-kirurgisk skrubb på kirurgisk område. Etter skrubb, lag et midtlinje snitt ~ 2 cm i halsens hud fra brystbenet til haken.
- Trekk tilbake huden og sub-maxillary kjertler, sørg for å fullt ut utsette digastriske muskler.
- Finn sømmen i paratrakeal muskulaturen, skill den med stump disseksjon, og trekk den tilbake åpen.
- Klipp forsiktig en åpning i toppen av luftrøret som er stor nok til å passe til polyetylenrør (I.D. 0,86 mm, O.D. 1,27 mm). Ikke skjær mer enn halvveis gjennom luftrørets diameter. Sett slangen inn i luftrøret mot lungene.
- Omplasser retraktorer for å frigjøre paratrakeal muskulatur og trekke tilbake submaxillary kjertlene.
- Lim paratrakeal muskulatur sammen over slanger med minimal mengde veterinærlim (se figur 1A).
4. Bryte opp tympanisk bulla
- Ert forsiktig ønsket digastrisk muskel (venstre eller høyre) opp og trekk fra hverandre bindevevet. Klipp i den fremre enden av muskelen, unngå blodkar, og trekk tilbake bakre til klar av tympanisk bulla.
- Vipp hodet litt tilbake for å løfte tympanisk bulla. Finn grenen av halspulsåren fremre til det bakre innsettingspunktet til den digastriske muskelen. Føl deg bare bakre til dette blodkaret for den konvekse strukturen til tympanisk bulla.
- Se etter en søm i muskulaturen på dette stedet (se figur 1B). Ved hjelp av to sett med fine tang, stump dissekering i sømmen til beinet på tympanisk bulla er synlig. Bruk retraktorer for å holde et klart syn på tympanisk bulla.
- Finn sømmen som går fremre for å bakre på bulla (se figur 1C). Bruk en kirurgisk sonde, stikk et hull i beinet i midten av denne sømmen. Bruk et sett med fin ende saks for å kutte et sirkulært område i beinet, pass på at du ikke kutter blodårene fremre, bakre og dypt under bulla.
5. Utsettegeniculatet
- Innenfor dette hullet er en konveks bit av bein, dette er cochlea. Fremre til cochlea er en muskel, tensor tympani (se figur 1D). Bruk vårsaksen, kutt tensor tympani og fjern den.
- Utfør en tåklemme. Hvis dyret reagerer, gi en ketamin/xylazinblanding ata 1/3 dose for reosing.
- Forbered vanningsvæske og en sugelinje. Bruk den kirurgiske sonden, stikk et hull i cochlear-odden. Umiddelbart irriger væsken som strømmer ut og fjern den med sug. Denne væsken vil strømme mer eller mindre kontinuerlig fra dette punktet og må adresseres med jevne mellomrom.
- Forstørr hullet i cochlea. Vær forsiktig med blodkaret som omkranser cochlea til bakre og laterale kant.
- Vipp musens hode fremover. Finn hullet i temporalbenet under det som var cochlea (se figur 1E). Legg merke til åsen fremre til dette hullet, denne åsen sitter rett over den syvende nerven.
- Sett en kirurgisk sonde inn i hullet og løft forsiktig temporalbenet for å eksponere den syvende nerven (se figur 1F). Ta lager av hvor mye av den syvende nerven som er synlig, og hvis geniculatet ikke er fullt eksponert, vipp dyrets hode tilbake og prøv å trekke opp bein fra fremre til nerven.
- Hvis ganglion fortsatt ikke er fullt synlig, trekk opp mer bein nedenfra. Vær svært forsiktig så du ikke plasserer sonden dypt under benet, da dette kan skadegeniculatet.
Figur 1: Kirurgisk eksponering av geniculate ganglion. (A) Bilde av musens nakkehulestolpe trakeotomi. Pilen peker på den digastriske muskelen som ligger over det kirurgiske området utforsket i resten av figuren. (B) Bilde av region under den tidligere angitte digastriske muskelen. Pilen indikerer sømmen i muskulatur for stump disseksjon. (C) Bilde av Tympanic Bulla. Pil indikerer søm i beinet for å bryte med en kirurgisk sonde. (D) Bilde av kirurgisk område etter åpning av bulla. Nedre venstre pil indikerer cochlea, øvre pil peker på tensor tympani. Innrammet linje angir området i (E) og (F). (E) Bilde av kirurgisk område etter at cochlea er ødelagt og innholdet fjernet. Hvit pil angir hvor kirurgisk sonde det refereres til i protokolltrinn 5.6. (F) Et bilde av den eksponerte geniculate ganglion. Pil indikerer kroppen av den syvende nerven, stiplet trekant omgir den geniculate ganglion. Paneler A-B, Skala = 5 mm. Paneler C-F, Skala = 1 mm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
6. Kjør tastantpanel
- Bruk sug for å fjerne væske fra overgeniculatet. Plasser eventuelt et absorberende punkt for å bidra til å redusere sikring og hjelp til mikroskopnavigasjon.
- Plasser dyret på absorberende pute under mikroskopet. Finn den geniculate ganglion: nyttige landemerker inkluderer hullet igjen i bulla, hullet i temporalbenet og den syvende nerven. Bruk FITC/GFP-filteret på epifluorescence-området, se etter individuelle GCaMP-uttrykkende geniculate ganglion neuroner. En 10x mål (arbeidsavstand 10mm) vil gi tilstrekkelig oppløsning til å spore aktiviteten til individuelle celler, men en 20x mål (arbeidsavstand 12 mm) kan også brukes.
- Plasser dispenseringsnålen for tastant linje fast i dyrets munn. Legg en Petri-tallerken under dyrets munn for å fange væske.
- Kontroller at kameraet viser mikroskopets synsfelt. Synkroniser starten på videoopptaket med starten av tastantpresentasjonen.
- Under innspillingen kan du se live feed for svar, drift og seepage.
- Hvis det oppstår sepage, suge væsken til visningen av geniculatet er klar og gjenta. Hvis det oppstår drift, må du kontrollere at alle deler av hodestolpen er godt strammet. Hvis det ikke oppstår noen reaksjoner, kontroller at væsken flyter og at mikroskopet og kameraet er fokusert på riktig sted uten at noe skjuler synsfeltet.
- Gjenta til ønsket antall videoer er oppnådd. Lett tilbaketrekking forsiktig, og gjenta deretter trinn 3-6 på motsatt side.
- Etter at de ønskede videoene er oppnådd for alle ønskede ganglia, euthanize dyret via cervical dislocation.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Etter protokollen ble et transgent Snap25-GCaMP6s dyr bedøvet, geniculate ganglia ble utsatt, og tastant ble brukt på tungen mens video ble spilt inn. Målet med eksperimentet var å definere hvilke smaksstoffer som fremkalte svar fra hver celle. Tastants (30 mM AceK, 5 mM Quinine, 60 mM NaCl, 50 mM IMP + 1 mM MPG, 50 mM sitronsyre)18 ble oppløst i DI-vann og ble påført tungen i 2 s separert med 13 s DI vann.
Figur 2: Responser av geniculate ganglion neuroner til tastants ved hjelp av in vivo GCaMP6s avbildning. (A) Epifluorescent bilde av geniculate ganglion av en Snap25-GCaMP6s transgen mus under baseline som vann er perfused over tungen. Stiplede linjer angir de omtrentlige grensene til den geniculate ganglion. Den syvende kranialnerven er merket som sådan. (B) Øyeblikksbilde av samme ganglion i (A) som en søt tastant (AceK 30 mM) påføres musens tunge. Legg merke til at flere individuelle nevroner øker i fluorescensintensitet. Stiplet linjeboks angir søt responderende celle som brukes i (C) end. (C) Spor fra fem nevroner som indikerer amplituden til deres GCaMP6s medierte fluorescens som svar på et panel av smakstoffer som består av søtt (30 mM acesulfam K), bitter (5 mM kinin); salt (60 mM NaCl); umami (50 mM monopotassium glutamat og 1mM inosinmonofosfat); og sur (50 mM sitronsyre). Fargede stenger viser plasseringen og varigheten (2 s) av stimulansen i løpet av eksperimentets tidsforløp. Disse representative dataene inkluderer ikke et svar på umami. Individuelle nevroner reagerer vanligvis på både bitter og sur stimuli (bunnspor) 16,18,20. Paneler A-B, Skala = 5 mm. Panel C, horisontal skalastang indikerer 6,5 sekunder, vertikal skalastang indikerer terskel på 4% dF / F. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Som det fremgår av figur 2, bør smakstimuli påført tungen resultere i en rask, forbigående økning i GCaMP-fluorescens, noe som forårsaker en merkbar endring i lysstyrke blant responderende nevroner. Videoen kan analyseres med en rekke programvarepakker for å produsere spor som viser endringene i fluorescens over baseline (dF / F) over tid av individuelle interesseregioner (for eksempel individuelle nevroner), og dermed viser svarene til hver celle til tastantpanelet. I en vellykket operasjon, i en Snap25-GCaMP6s transgen linje, er det typisk å se svar i 20-40 nevroner innenfor en enkelt ganglion / synsfelt. Dette kan endres avhengig av den transgene linjen som brukes, eller hvis AAV-GCaMP brukes i stedet. Vær oppmerksom på at baseline fluorescens kan påvirkes av en rekke faktorer, inkludert uttrykksnivået til GCaMP, og mulig skade på cellene under operasjonen. Endringer i fluorescensintensitet over et terskelnivå (vanligvis df/ f > 3 ganger over gjennomsnittlig støy)20,21 regnes som en positiv respons.
For å bestemme tidspunktet for stimulanslevering, bør tiden det tar for væske å strømme gjennom linjene måles for å vite når en væskeendring faktisk kommer i kontakt med tungen. For å redusere denne forsinkelsen, bruk en moderat strømningshastighet (5-10 ml / min) og en kort lengde på slangen som fører fra perfusjonsmanifolden til munnhulen. Vanligvis, med stimuli beskrevet her, starter fluorescens nesten umiddelbart etter at tastant er påført tungen og vil begynne å falme nesten umiddelbart etter at tastanten er stoppet og munnhulen vaskes med kjøretøyløsning. Når du arbeider med en ukjent stimulus, kan det være nyttig å observere endringen i fluorescens i en region uten å svare nevroner for å sammenligne generelle endringer i bildet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dette arbeidet beskriver en trinnvis protokoll for kirurgisk eksponering av geniculate ganglion og visuelt registrere aktiviteten til nevronene med GCaMP6s. Denne prosedyren er veldig lik den som er beskrevet tidligere17, med noen få bemerkelsesverdige unntak. For det første gir bruk av en hodestolpe enkel justering av hodeposisjonering under operasjonen. For det andre, når det gjelder stimulanslevering, strømmer tilnærmingen til Wu og Dvoryanchikov stimuli gjennom esophageal tubing17, mens denne protokollen leverer væske direkte inn i munnen med en dispenserende nål. Begge metodene kan brukes til å fremkalle geniculate ganglion neuron responser ved å stimulere soppform og palatal smak knopper.
Et notat om å opprettholde et klart bildefelt: Etter å ha brutt cochlea, vil det være kontinuerlig skjæring av væske i hulrommet, inkludert direkte over den geniculate ganglion. Det er også mulig at blødning vil skjule den geniculate ganglion. Selv om en liten mengde sprut kanskje ikke er tilstrekkelig til å forhindre avbildning, kan selv små mengder blod helt okkludere ganglia. Disse problemene kan løses på et par måter. For det første, hvis sepage er relativt liten, kan den fjernes ved hjelp av en sugelinje utstyrt med en stump dispenseringsnål mellom forsøk. Alternativt kan væske også vekes bort fra feltet ved å forsiktig plassere absorberende punkter bakre eller laterale til den syvende nerven. Hvis strømmen er spesielt dårlig, kan det være nødvendig å bruke sug på hulrommet under avbildning. En nøye plassert sugelinje kan holde gangliaen klar mens den påføres et lateralt sted, for å unngå å skjule ganglia under avbildning.
Selve avbildningen kan oppnås ved hjelp av forskjellige stiler av mikroskopoppsett, hver med sine ledsagerfordeler og begrensninger. Når du bruker et epifluorescence-omfang18,21, er det bare mulig å avbilde de mer overfladiske nevronene. Et annet problem med epifluorescence imaging er at signaler fra dypere celler vil komme ut som endringer i bakgrunnsfluorescens (ute av fokuslys) så vær forsiktig med analysen for ikke å plukke opp fluorescensendringer fra andre celler i avkastningen. For spesielt tynne strukturer, som geniculate ganglia, kan disse problemene ikke være problematiske. Bruk av et 2-foton16 eller konfokalt20 mikroskop kan potensielt tillate bildeceller i dypere lag.
Det er viktig å fremheve noen kritiske trinn og måter å feilsøke vanlige problemer på. For det første må det bemerkes at analysen vil variere betydelig avhengig av programvaren som brukes. Åpen kildekode-programvaren, ImageJ gir verktøy som er tilstrekkelig for foreløpig analyse. Fjern først små bevegelsesartefakter ved hjelp av bildestabilisatorplugin22, Bruk deretter ImageJ til å beregne endringen i fluorescens delt på baseline fluorescens (dF / F). Dette kan gjøres ved hjelp av en av mange åpen kildekode-makroer for ImageJ23, den refererte makroen inneholder detaljerte installasjonsmerknader. Hvis du vil ha andre makroer, kan du se i dokumentasjonen. Når du har korrigert for dF/F, bruker du forover- og reversknappene nederst i bildestakken for å observere celleresponser på stimuli. Bruk lassoverktøyet fra verktøylinjen til å velge fluorescerende celler individuelt. Når du har merket en celle, bruker du Bilde | Stabler | Plott-Z-akse. Dette vil gi tilstrekkelig informasjon til å bestemme responsprofiler og analysere tidsrelaterte hendelser for hver region av interesse (ROI). Mer avansert analyse var lenge domenet til tilpassede skript i Matlab, R, etc. Imidlertid har populariteten til kalsiumavbildning gradvis ført til utvikling av flere åpen kildekode-ressurser for analyse, inkludert CaImAn, EZCalcium og mer24,25.
Kalsiumavbildning er et kraftig verktøy for å undersøke aktiviteten til nevrale ensembler med enkel nevronoppløsning. På grunn av den geniculate ganglionens lille størrelse, er denne protokollen spesielt kraftig fordi hele ganglion kan visualiseres innenfor et enkelt felt. Det er imidlertid noen begrensninger i denne teknikken. I tillegg til begrensningene som er felles for alle kalsiumavbildningsforsøk, er den kirurgiske tilnærmingen beskrevet her invasiv og må utføres under anestesi. Dette er en terminal prosedyre - dyret må avlives umiddelbart etter avbildning. Derfor er denne kirurgiske tilnærmingen ikke egnet for våken / oppføre opptak.
I løpet av de siste årene har forskere brukt denne teknikken til å studere responsprofiler av nevronene i den geniculate ganglion16,20,18. Nyere arbeid har fokusert på potensielle genetiske markører som kan brukes til å manipulere subpopulasjoner i ganglia og har vist hvordan transgene Cre-driverlinjer og Cre-avhengige GCaMP kan brukes til å identifisere responsprofilene til disse populasjonene26. Annet arbeid kan bruke GCaMP med fotoaktiverte proteiner som pa-mCherry for først å identifisere og deretter merke celler aktivert av smaksstoffer som deretter skal brukes i immunhiistokjemi eller in situ hybridisering27. Det kan også være mulig å bruke kalsiumavhengige fotokonvertible proteiner som CaMPARI til samme effekt mens du bruker eksperimentelle metoder som ligner de som er beskrevet her28. Uavhengig av de spesifikke spørsmålene og eksperimentene, tilbyr kalsiumavbildning et kraftig verktøy for å utforske responsprofilene til nevroner engasjert i en rekke aktiviteter, og nytten i å utforske smakssystemet begynner bare.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikt å rapportere.
Acknowledgments
Forfatterne takker S. Humayun for musehold. Støtten til dette arbeidet er delvis gitt av UTSAs Brain Health Consortium Graduate and Postdoctoral Seed Grant (B.E.F.) og NIH-SC2-GM130411 til L.J.M.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 x #5 Inox Forceps | Fine Science Tools | NC9792102 | |
| 1ml Syringe with luer lock | Fisher Scientific | 14-823-30 | |
| 2 x #3 Inox Forceps | Fine Science Tools | M3S 11200-10 | |
| 27 Gauge Blunt Dispensing Needle | Fisher Scientific | NC1372532 | |
| 3M Vetbond | Fisher Scientific | NC0398332 | |
| 4-40 Machine Screw Hex Nuts | Fastenere | 3SNMS004C | |
| 4-40 Socket Head Cap Screw | Fastenere | 3SSCS04C004 | |
| Absorbent Points | Fisher Scientific | 50-930-668 | |
| Acesulfame K | Fisher Scientific | A149025G | |
| Artificial Tears | Akorn | 59399-162-35 | |
| BD Allergist Trays with Permanently Attached Needle | Fisher Scientific | 14-829-6D | |
| Blunt Retractors | FST | 18200-09 | |
| Breadboard | Thor Labs | MB8 | |
| Citric Acid | Fisher Scientific | A95-3 | |
| Cohan-Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15000-02 | |
| Contemporary Ortho-Jet Liquid | Lang | 1504 | |
| Contemporary Ortho-Jet Powder | Lang | 1520 | |
| Cotton Tipped Applicators | Fisher | 19-062-616 | |
| Custom Head Post Holder | eMachineShop | See attached file 202410.ems | |
| Custom Metal Head Post | eMachineShop | See attached file 202406.ems | |
| DC Temperature Controller | FHC | 40-90-8D | |
| Digital Camera, sCMOS OrcaFlash4 Microscope Mounted | Hamamatsu | C13440 | |
| Disection Scope | Leica | M80 | |
| Hair Clippers | Kent Scientific | CL7300-Kit | |
| IMP | Fisher Scientific | AAJ6195906 | |
| Ketamine | Ketaved | NDC 50989-996-06 | |
| LED Cold Light Source | Leica Mcrosystems | KL300LED | |
| Luer Lock 1/16" Tubing Adapters | Fisher | 01-000-116 | |
| Microscope | Olympus | BX51WI | |
| Mini-series Optical Posts | Thorlabs | MS2R | |
| MPG | Fisher Scientific | AAA1723230 | |
| MXC-2.5 Rotatable probe Clamp | Siskiyou | 14030000E | |
| NaCl | Fisher Scientific | 50-947-346 | |
| petri dishes | Fisher Scientific | FB0875713A | |
| Pressurized air | Airgas | AI Z300 | |
| Quinine | Fisher Scientific | AC163720050 | |
| Self Sticking Labeling Tape | Fisher Scientific | 159015R | |
| Silicone Pinch Valve Tubing 1/32" x 1/16" o.d. (per foot) | Automate Scientific | 05-14 | |
| Sola SM Light Engine | Lumencor | ||
| Snap25-2A-GCaMP6s-D | JAX | 025111 | |
| Student Fine Scissors | Fine Science Tools | 91460-11 | |
| Surgical Probe | Roboz Surgical Store | RS-6067 | |
| Surgical Probe Holder | Roboz Surgical Store | RS-6061 | |
| Thread | Gütermann | 02776 | |
| BD Intramedic Tubing | Fisher Scientific | 22-046941 | |
| Two Stage Gas Regulator | Airgas | Y12FM244B580-AG | |
| Tygon vinyl tubing - 1/16" | Automate Scientific | 05-11 | |
| Valvelink8.2 digital/manual controller | Automate Scientific | 01-18 | |
| Valvelink8.2 Pinch Valve Perfusion System | Automate Scientific | 17-pp-54 | |
| Xylazine | Anased | NADA# 139-236 |
References
- Krimm, R. F. Factors that regulate embryonic gustatory development. BMC Neuroscience. 8, Suppl 3 4 (2007).
- Taruno, A., Matsumoto, I., Ma, Z., Marambaud, P., Foskett, J. K. How do taste cells lacking synapses mediate neurotransmission? CALHM1, a voltage-gated ATP channel. Bioessays. (35), 1111-1118 (2013).
- Taruno, A., et al. Taste transduction and channel synapses in taste buds. Pflugers Archiv-European Journal of Physiology. 473, 3-13 (2021).
- Kinnamon, S. C., Finger, T. E. A taste for ATP: neurotransmission in taste buds. Frontiers in Cell Neuroscience. 7, 264 (2013).
- Chandrashekar, J., Hoon, M. A., Ryba, N. J., Zuker, C. S. The receptors and cells for mammalian taste. Nature. 444 (7117), 288-294 (2006).
- Yarmolinsky, D. A., Zuker, C. S., Ryba, N. J. Common sense about taste: from mammals to insects. Cell. 139 (2), 234-244 (2009).
- Ninomiya, Y., Tonosaki, K., Funakoshi, M.
- Formaker, B. K., MacKinnon, B. I., Hettinger, T. P., Frank, M. E. Opponent effects of quinine and sucrose on single fiber taste responses of the chorda tympani nerve. Brain Research. 772 (1-2), 239-242 (1997).
- Frank, M. The classification of mammalian afferent taste nerve fibers. Chemical Senses. 1 (1), 53-60 (1974).
- Ogawa, H., Yamashita, S., Sato, M. Variation in gustatory nerve fiber discharge pattern with change in stimulus concentration and quality. Journal of Neurophysiology. 37 (3), 443-457 (1974).
- Sollars, S. I., Hill, D. L. In vivo recordings from rat geniculate ganglia: taste response properties of individual greater superficial petrosal and chorda tympani neurones. Journal of Physiology. 564, Pt 3 877-893 (2005).
- Yokota, Y., Bradley, R. M. Geniculate ganglion neurons are multimodal and variable in receptive field characteristics. Neuroscience. 367, 147-158 (2017).
- Breza, J. M., Curtis, K. S., Contreras, R. J. Temperature modulates taste responsiveness and stimulates gustatory neurons in the rat geniculate ganglion. Journal of Neurophysiology. 95 (2), 674-685 (2006).
- Chen, T. W., et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).
- Luo, L., Callaway, E. M., Svoboda, K. Genetic dissection of neural circuits: A decade of progress. Neuron. 98 (4), 865 (2018).
- Barreto, R. P. J., et al. The neural representation of taste quality at the periphery. Nature. 517, 373-376 (2015).
- Wu, A., Dvoryanchikov, G. Live animal calcium imaging of the geniculate ganglion. Protocol Exchange. , 106 (2015).
- Lee, H., Macpherson, L. J., Parada, C. A., Zuker, C. S., Ryba, N. J. P.
- Dana, H., et al. High-performance calcium sensors for imaging activity in neuronal populations and microcompartments. Nature Methods. 16 (7), 649-657 (2019).
- Wu, A., Dvoryanchikov, G., Pereira, E., Chaudhari, N., Roper, S. D. Breadth of tuning in taste afferent neurons varies with stimulus strength. Nature Communications. 6, 8171 (2015).
- Yarmolinsky, D. A., et al. Coding and plasticity in the mammalian thermosensory system. Neuron. 92 (5), 1079-1092 (2016).
- Li, K. The image stabilizer plugin for ImageJ. , Available from: http://www.cs.cmu.edu/~ kangli/code/Image_Stabilizer. html (2008).
- Ackman, J. dF Over F movie ImageJ Plugin. , Available from: https://gist.github.com/ackman678/5817461 (2014).
- Cantu, D. A., et al. EZcalcium: Open-source toolbox for analysis of calcium imaging data. Frontiers in Neural Circuits. 14, 25 (2020).
- Giovannucci, A., et al. CaImAn an open source tool for scalable calcium imaging data analysis. Elife. 8, (2019).
- Zhang, J., et al. Sour sensing from the tongue to the brain. Cell. 179 (2), 392-402 (2019).
- Lee, D., Kume, M., Holy, T. E. A molecular logic of sensory coding revealed by optical tagging of physiologically-defined neuronal types. bioRxiv. , 692079 (2019).
- Moeyaert, B., et al. Improved methods for marking active neuron populations. Nature Communication. 9 (1), 4440 (2018).
