Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

חלבון המושרה בדמריזציה כימית מתנדם בטלומרים

Published: April 12, 2021 doi: 10.3791/62173
Automatic Translation
1, 2, 1
1Department of Biological Sciences, Mellon College of Science, Carnegie Mellon University, 2Department of Chemistry, School of Arts and Sciences, University of Pennsylvania

Summary

פרוטוקול זה ממחיש מערכת עמעום חלבונים המושרה כימית ליצירת עיבויים על כרומטין.  היווצרות של לוקמיה פרומיאלוציטית (PML) גוף גרעיני על טלומרים עם דימריזרים כימיים הוא הודגם. צמיחה טיפה, פירוק, לוקליזציה והרכב מנוטרים עם הדמיית תאים חיים, אימונופלואורסצנטיות (IF) ופלואורסצנטיות בהכלאה במקום (FISH).

Abstract

עיבויים הקשורים לכרומטין מעורבים בתהליכים גרעיניים רבים, אך המנגנונים הבסיסיים נותרים חמקמקים. פרוטוקול זה מתאר מערכת עמעום חלבונים המושרה כימית ליצירת עיבויים בטלומרים. הדימרייזר הכימי מורכב משני ליגנדים מקושרים שיכולים להיקשר כל אחד לחלבון: ליגנד Halo ל-Halo-enzyme וטימופרים (TMP) ל-E. coli dihydrofolate reductase (eDHFR), בהתאמה. היתוך של אנזים Halo לחלבון טלומר מעגן דימריזרים לטלומרים באמצעות כריכת אנזים הילה ליגנד קוולנטית. כריכה של TMP ל- eDHFR מגייסת שלב מותך eDHFR המפריד חלבונים לטלומרים ודורשת היווצרות עיבוי. מכיוון שאינטראקציית TMP-eDHFR אינה קוולנטית, ניתן להפוך עיבוי באמצעות TMP חינם עודף כדי להתחרות בדיימר עבור איגוד eDHFR. דוגמה של גרימת היווצרות גוף גרעיני של לוקמיה פרומיאלוציטית (PML) בטלומרים וקביעת צמיחה עיבוי, פירוק, לוקליזציה והרכב מוצגת. שיטה זו יכולה להיות מותאמת בקלות כדי לגרום עיבוי במקומות גנומיים אחרים על ידי היתוך Halo לחלבון שנקשר ישירות לכרומטין המקומי או dCas9 כי הוא ממוקד לוקוס גנומי עם RNA מדריך. על ידי הצעת הרזולוציה הזמנית הנדרשת להדמיה חיה של תא יחיד תוך שמירה על הפרדת פאזה באוכלוסיית תאים לבדיקות ביוכימיות, שיטה זו מתאימה לבדיקת היווצרות ותפקוד של עיבויים הקשורים לכרומטין.

Introduction

חלבונים וחומצות גרעין רבים עוברים הפרדת פאזה נוזלית-נוזלית (LLPS) ומרכיבים את עצמם לתוך עיבויים ביומולקולריים כדי לארגן ביוכימיה בתאים1,2. LLPS של חלבונים מחייב כרומטין מוביל להיווצרות של עיבויים הקשורים loci גנומי ספציפי והם מעורבים פונקציות כרומטין מקומיות שונות3. לדוגמה, LLPS של חלבון HP1 עומד בבסיס היווצרות של תחומים הטרוכרומטינים כדי לארגן את הגנום4,5, LLPS של גורמי שעתוק יוצר מרכזי שעתוק כדי לווסת את שעתוק6, LLPS של mRNAs המתהווה וחלבון מסרקים מרובי מיניים מייצר גופי לוקוס histone כדי לווסת את שעתוק ועיבוד של histone mRNAs7.  עם זאת, למרות דוגמאות רבות של עיבוי הקשורים כרומטין מתגלה, המנגנונים הבסיסיים של היווצרות עיבוי, רגולציה ותפקוד להישאר מובן היטב. בפרט, לא כל עיבוי הקשורים כרומטין נוצרים באמצעות LLPS והערכות זהירה של היווצרות עיבוי בתאים חיים עדיין נדרשים8,9. לדוגמה, חלבון HP1 בעכבר מוצג כבעל יכולת חלשה בלבד ליצור טיפות נוזליות בתאים חיים ומוקדי הטרוכרומטין מתנהגים כמו כדוריות פולימר שקרסו10. לכן, כלים כדי לגרום de novo עיבויים על כרומטין בתאים חיים רצויים, במיוחד אלה המאפשרים שימוש בהדמיה חיה וביקורת ביוכימית כדי לפקח על הקינטיקה של היווצרות עיבוי, התכונות הפיזיות והכימיות של העיבויים המתקבלים, ואת ההשלכות התאיות של היווצרות עיבוי.

פרוטוקול זה מדווח על מערכת עמעום כימית כדי לגרום לעיבוי חלבון בכרומטין11 (איור 1A). הדימרייזר מורכב משני ליגנדים מקושרים המקיימים אינטראקציה עם חלבונים: טרימתופרים (TMP) וליגנד Halo ויכול לעמעם חלבונים המותכים לקולטני הקוגניט: Escherichia coli dihydrofolate reductase (eDHFR) ואנזים אלקילדהלוגנאז חיידקי (אנזים Halo), בהתאמה12. האינטראקציה בין האנזים Halo ligand ואנזים Halo היא קוולנטית, ומאפשרת אנזים Halo לשמש עוגן על ידי היתוך אותו לחלבון מחייב כרומטין כדי לגייס חלבון הפרדת פאזה הותך eDHFR לכרומטין. לאחר הגיוס הראשוני, ריכוז מקומי מוגבר של השלב המפריד חלבון עובר את הריכוז הקריטי הדרוש להפרדת פאזה ובכך מגרגר עיבוי בעוגן (איור 1B). על ידי היתוך חלבונים פלואורסצנטיים (למשל mCherry ו- eGFP) ל- eDHFR והילה, ניתן לדמיין התגרענות וצמיחה של עיבויים בזמן אמת עם מיקרוסקופיית פלואורסצנטיות. מכיוון שהאינטראקציה בין eDHFR ל- TMP אינה קוולנטית, ניתן להוסיף TMP ללא עודף כדי להתחרות בדיימר עבור איגוד eDHFR. לאחר מכן זה ישחרר את חלבון הפרדת הפאזה מהעוגן ולהמיס את העיבוי הקשור לכרומטין.

השתמשנו בכלי זה כדי לגרום להיווצרות גוף גרעיני של לוקמיה פרומיאלוציטית דה נובו (PML) בטלומרים בתאי סרטן שליליים טלומראז המשתמשים בהארכה חלופית של מסלול הטלומרים (ALT) לתחזוקת הטלומר13,14.  גופים גרעיניים PML הם תאים ללא ממברנה המעורבים בתהליכים גרעיניים רבים15,16 והם מקומיים באופן ייחודי טלומר ALT כדי ליצור APBs, עבור גופי PML הקשורים טלומר ALT17,18. אשכול טלומרים בתוך APBs, ככל הנראה כדי לספק תבניות תיקון עבור סינתזת DNA טלומר מונחה הומולוגיה ב ALT19. ואכן, סינתזת DNA טלומר זוהתה APBs ו APBs לשחק תפקידים חיוניים העשרת גורמי תיקון DNA בטלומרים20,21. עם זאת, המנגנונים שבביד הרכבת APB ואשכול הטלומר בתוך APBs לא היו ידועים. מאז חלבוני טלומר בתאי ALT משתנים באופן ייחודי על ידי מחליף קטן דמוי אוביקוויטין (SUMOs)22, רכיבי APB רבים מכילים אתרי סומוילציה 22,23,24,25 ו / או מוטיבים אינטראקציה SUMO (SIMs)26,27 ואינטראקציות SUMO-SIM כונן הפרדת שלב28, שיערנו כי סומוילציה על טלומרים מוביל להעשרה של SUMO / SIM המכיל חלבונים ו אינטראקציות SUMO-SIM בין חלבונים אלה מובילות להפרדת פאזה.  חלבון PML, שיש לו שלושה אתרי סומוילציה ואתר SIM אחד, ניתן לגייס טלומרים סומויליים כדי ליצור APBs והתמזגות של APBs נוזלי מוביל להתקבצות טלומרים. כדי לבחון השערה זו, השתמשנו במערכת הדממה הכימית כדי לחקות היווצרות APB הנגרמת על ידי סומוילציה על ידי גיוס SIM לטלומרים (איור 2A)11. GFP מותך Haloenzyme להדמיה ולחלבון טלומר מחייב TRF1 כדי לעגן את הדמיר לטלומרים. ה-SIM מותך ל-eDHFR ול-mCherry. קינטיקה של היווצרות עיבוי ו clustersion טיפה המושרה טלומר קיבוץ הם אחריו עם הדמיה תא חי.  הפרדת הפאזה הפוכה על-ידי הוספת TMP חינם עודף כדי להתחרות בכריכה של eDHFR. אימונופלואורסצנטיות (IF) ופלואורסצנטיות בהכלאה במקום (FISH) משמשים לקביעת הרכב עיבוי ואיגוד טלומרי. גיוס SIM מעשיר את SUMO בטלומרים והמרוכזים המושרים מכילים PML ולכן הם APBs. גיוס מוטציה SIM שאינה יכולה לקיים אינטראקציה עם SUMO אינה מעשירה את SUMO בטלומרים או גורמת להפרדת פאזה, מה שמצביע על כך שהכוח המניע הבסיסי ל עיבוי APB הוא אינטראקציית SUMO-SIM. מסכים עם תצפית זו, פוליסומו-פוליסים פולימרים שהתמזגו לגורם מחייב TRF2 RAP1 יכול גם לגרום להיווצרות APB29. בהשוואה למערכת ההיתוך polySUMO-polySIM שבה הפרדת פאזה מתרחשת כל עוד מיוצרים מספיק חלבונים, גישת הדמיזציה הכימית המוצגת כאן גורמת להפרדת פאזה על פי דרישה ובכך מציעה רזולוציה זמנית טובה יותר לניטור הקינטיקה של הפרדת פאזה ותהליך קיבוץ הטלומר. בנוסף, מערכת עמעום כימית זו מאפשרת גיוס חלבונים אחרים כדי להעריך את יכולתם בגרימת הפרדת פאזה ואשכולות טלומר. לדוגמה, חלבון מופרע המגויס לטלומרים יכול גם ליצור טיפות וטלומרים מקבצי מבלי לגרום להיווצרות APB, דבר המצביע על קיבוץ טלומר שאינו תלוי בכימיה של APB ונשען רק על נכס נוזלי APB11.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. ייצור קווי תאים ארעיים

  1. תאי קבלה של U2OS על כיסויי זכוכית בקוטר 22 x 22 מ"מ (להדמיה חיה) או כיסויים עגולים בקוטר 12 מ"מ (עבור IF או FISH) מצופים בפולי-D-ליצין בצלחת 6-well עם מדיום צמיחה (10% סרום בקר עוברי ופתרון 1% פניצילין-סטרפטומיצין ב- DMEM) עד שהם מגיעים להשפעה של 60-70%.
  2. החלף את מדיום הצמיחה עם 1 מ"ל transfection בינוני (מדיום צמיחה ללא פתרון פניצילין-סטרפטומיצין) לפני transfection.
  3. עבור כל תחול היטב, להוסיף 4 ריאגנט transfection μL כדי 150 μL מופחת מדיה בסרום, מערבולת במשך 10 שניות ולאחר מכן דגירה במשך 5 דקות.
  4. עבור כל באר, להוסיף Plasmid לבנות Halo (מוטציה Halo-GFP-TRF1 או Halo-TRF1) ו- eDHFR לבנות plasmid (mCherry-eDHFR-SIM או mCherry-eDHFR-SIM מוטציה) ביחס מסה 1:1 (0.5 מיקרוגרם Halo לבנות plasmid עם 0.5 μg eDHFR לבנות plasmid) כדי 150 μL מופחת מדיה בסרום, dropwise, לערבב על ידי pipetting.
    הערה: התגים קטנים יחסית (Halo 33 kD, eDHFR 28 kD, mCherry 30 kD, eGFP 27 kD) ולא נצפתה השפעה על הפרדת פאזה. עם זאת, מומלץ להשתמש במוטנטים כגון מוטציה SIM כדי לוודא שהתנהגות הפאזה רגישה למוטציות ולא לתגיות. ה-SIM הוא מ-PIASx28,30. SIM sequence is AAAGTCGATGTAATTGACTTAACGATCGAATCTAGCAGCGATGAAGAAGAAGATCCACCGGCTAAACGT. מוטציה SIM נוצר על ידי מוטציה חומצות אמינו SIM VIDL כדי VADA28, והרצף הוא AAAGTCGATGTAGCCGACGCCACGATCGAATCTAGCAGCGATGAAGAAGAAGATCCACCGGCTAAACGT. הפקדנו את הפלסמידים שלנו כדי להוסיף: #164644 3XHalo-GFP-TRF1; #164646 mCherry-eDHFR-SIM; #164649 מוטציה mCherry-eDHFR-SIM.
  5. הוסף 150 μL של ריאגנט ריאגנט מופחת תערובת מדיה בסרום ל 150 μL מופחת סרום מדיה עם DNA, dropwise, לערבב על ידי pipetting, דגירה במשך 5 דקות.
  6. מוסיפים את 300 μL של תערובת ריאגנט-DNA transfection לתאים, dropwise ולאחר מכן למקם תאים בחזרה אינקובטור.
  7. המתן 24-48 שעות לפני הדמיה חיה, אימונופלואורסצנטיות (IF) או פלואורסצנטיות בהכלאה במקום (FISH).

2. דימרציה בטלומרים

  1. ממיסים דימריזרס בדימתיל סולפוקסיד ב-10 מ"מ ומאחסנים בצינורות מיקרוצנטריפוגה מפלסטיק ב-80 מעלות צלזיוס לאחסון לטווח ארוך.
    הערה: במקום להשתמש בדמרייזר עם TMP המקושר ישירות Halo (TMP-Halo, TH), דימרייזר TMP-NVOC-Halo (TNH) שיש לו מקשר רגיש לאור, 6-ניטרבטריל אוקסיקרבוניל (NVOC), בין TMP להלוליגנד משמש31. הסיבה לכך היא שלוקח פחות זמן ל- TNH (~ 5 דקות) לפזר לתא מאשר TH (~ 20 דקות). ניתן להשיג את התוצאות המוצגות כאן גם באמצעות TH. בעת שימוש TNH, להיזהר לא לחשוף את dimerizer לאור כדי למנוע מחשוף NOVC. יש לטפל ב- TNH בחדר חשוך עם מנורת אור אדום עמומה, לאחסן את הדימרייזר בצינורות פלסטיק ענבר ולעטוף את המיכל המכיל TNH או תאים מטופלים בנייר אלומיניום. הדמיית TNH עם DIC היא בטוחה.
  2. קח aliquot של 10 mM dimerizer מ −80 °C (50 °F) לדלל מדיום הדמיה לריכוז מלאי של 10 μM ולאחסן ב -20 °C (50 °F).
  3. כאשר אתה מוכן לשימוש, לדלל dimerizers מ 10 תמיסת מלאי μM לריכוז עבודה סופי של 100 ננומטר במדיום צמיחה (עבור הדמיה קבועה) או מדיום הדמיה. לטפל בתאים עם 100 ננומטרים dimerizers (ריכוז סופי) על הבמה עבור הדמיה חיה או דגירה במשך 4-5 שעות עבור immunofluorescence (IF) פלואורסצנטיות בהכלאה במקום (FISH).
    הערה: הריכוז של dimerizers בשימוש משפיע על יעילות עמעום ובכך הפרדת שלב. ריכוז הדמירייזר המאפשר יעילות עמעום מקסימלית תלוי בסוג התא וריכוז חלבון עוגן, ולכן יהיה צורך לקבוע אותו לניסויים שונים. דרך פשוטה אחת היא לדגור על תאים המבטאים את חלבון העוגן ואת mCherry-eDHFR (מבלי להתמזג לשלב המפריד בין חלבון או להתמזג למוטנט מפריד שאינו פאזה) ולזהות את ריכוז הדימרייזר שבו מושגת עוצמת mCherry הגבוהה ביותר בעוגן. גישה שיטתית יותר היא לדגור על תאים המבטאים את העוגן רק בריכוזים שונים של דימריזרים ולאחר מכן עם צבע מחייב Halo כדי לעזור לקבוע את ריכוז הדימרייזר שבו עוצמת הצבע מחייב Halo מתחיל לרמה (כלומר, כל עוגנים הילו-התמזגו תפוסים על ידי דימרייזר ולא נשאר יותר עבור צבע כריכת Halo)32.
  4. כדי להפוך את הדממה, דגירה תאים עם dimerizers במשך 2-5 שעות (עם או בלי הדמיה חיה) או עד גודל טיפה הרצוי מושגת ולהוסיף 100 μM חינם TMP (ריכוז סופי) מדולל מדיום הדמיה לתאים.

3. אימונופלואורסצנטיות (IF)

  1. זרע 105 תאים על כוסות כיסוי עגולות בקוטר 12 מ"מ מצופה פולי-D-ליסין בצלחת 6-well. לאחר מכן להעביר את שני plasmids (Halo-GFP-TRF1 עם mCherry-eDHFR-SIM או mCherry-eDHFR-SIM מוטציה) ולחכות 24-48 שעות לפני שתמשיך immunofluorescence.
    הערה: המתן יותר מיממה לאחר ההדבקה יכול לקבל ביטוי גבוה יותר.
  2. לדלל dimerizers עם בינוני צמיחה כדי להגיע לריכוז הסופי של 100 ננומטר, להוסיף dimerizers מדולל לתאים לדגור ב 37 °C (4-5 שעות.
    הערה: הפרדת פאזה מושרה במהירות לאחר הוספת דימריזרים (< 30 דקות). דגירה ארוכה יותר מסייעת טיפות גסות לגדלים גדולים יותר. בעקבות גידול טיפה עם הדמיה חיה יכול לשמש כדי לקבוע את הזמן שלוקח טיפות להגיע למצב הרצוי.
  3. תקן תאים בתמיסת PBS המכילה 4% פורמלדהיד ו-0.1% טריטון X-100 למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר כדי לחדר לתאים. לשטוף תאים 3 פעמים עם PBS.
    הערה: לאחר שלב זה, ניתן להשהות אותו ותאים ניתן לאחסן ב 4 °C (70 °F) עד שבוע.
    אזהרה: פורמלדהיד מזיק על ידי שאיפה ואם נבלע, הוא גם מגרה את העיניים, מערכת הנשימה והעור ומהווה סכנה אפשרית לסרטן. צריך ללבוש ציוד מגן אישי, להשתמש רק במכסה אדים כימי. גם לשים אותו במיכל פסולת לאחר השימוש, לא להיפטר ממנו בכיור.
  4. כביסה מכסה פעמיים עם 50 μL TBS-Tx ופעם אחת עם 50 μL חיץ דילול נוגדנים (AbDil). TBS-Tx נעשה על ידי TBS, 0.1% טריטון X-100 ו 0.05% Na-azide. עבדיל נעשה על ידי TBS-Tx, 2% BSA ו 0.05% Na-azide.
  5. דגירה כל כיסוי עם 50 μL ראשי אנטי PML (1:50 דילול בעבדיל) / אנטי SUMO1 (1:200 דילול ב AbDil) / נוגדן נגד SUMO2/3 (1:200 דילול ב AbDil) ב 4 °C בתא לח לילה. נוגדן mCherry יכול לשמש גם (1:200 דילול ב AbDil) כדי לעזור לזהות אות mCherry עבור דגים.
    הערה: דגים מרווה את האות פלואורסצנטי mCherry, מה שמקשה להבדיל בין תאים transfectds mCherry מאלה שאינם transfected בניסויים דגים. מומלץ להשתמש בנוגדן mCherry. לחלופין, ניתן ליצור קו תאים יציב המבטא eDHFR המכיל חלבון.
  6. לשטוף מכסה 3 פעמים עם AbDil כדי להסיר נוגדן ראשוני מאוגד.
  7. תאי דגירה עם נוגדן משני [נוגדן אנטי עכבר IgG (H+L) מצומד עם אלכסה פלור 647 עבור PML ו- SUMO, נוגדן משני נגד ארנב IgG (H + L) מצומד עם אלכסה פלור 555 עבור mCherry, שניהם בשעה 1:1000 דילול בעבד] במשך שעה אחת בקופסה כהה בטמפרטורת החדר.
  8. כביסה מכסה 3 פעמים עם TBS-Tx.
  9. שקופיות תווית, לדלל DAPI במדיה הרכבה כדי להגיע לריכוז הסופי DAPI של 1 מיקרוגרם / מ"ל. לאחר מכן שים DAPI מדולל של 2 μL בשקופית. הפוך את כיסויי הכיסוי מעל ומניח אותם על טיפת DAPI, לשאוף נוזל נוסף מקצה כיסוי.
  10. אוטמים עם לק, נותנים לו להתייבש ולשטוף מראש כיסוי עם מים. שמור במקפיא להדמיה.

4. פלואורסצנטיות בהכלאה במקום (FISH)

  1. זרע 105 תאים על כוסות כיסוי עגולות בקוטר 12 מ"מ מצופה פולי-D-ליסין בצלחת 6-well. להעביר תאים עם Halo-TRF1 ו mCherry-eDHFR-SIM או mCherry-eDHFR-SIM מוטציה plasmids ולחכות 24-48 שעות לפני שתמשיך דגים. שלב הדממה זהה לזה המתואר ב- 3.2.
    הערה: כאן TRF1 אינו התמזג עם GFP ולכן הערוץ הירוק הוא שוחרר לבדיקת DNA טלומר.
  2. תקן תאים עם 4% פורמלדהיד במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר ושטוף 4 פעמים עם PBS. עבור IF-FISH, המשך לפרוטוקול IF מכאן ולאחר שטיפת נוגדן משני ב- IF (3.8), תאי refix עם 4% פורמלדהיד במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר ולשטוף שלוש פעמים עם PBS.
  3. מייבש כיסויים בסדרת אתנול (70%, 80%, 90%, 2 דקות כל אחד).
  4. כיסויי דגירה עם גשושית PNA 488-telC (יחס של 1:2000) בפתרון היברידיזציה של 5 מיקרו-אל ב-75 °C (75 °F) למשך 5 דקות. פתרון הכלאה מכיל 70% פורממיד דה-יונאי, 10 מ"מ טריס (pH 7.4), 0.5% חסימת ריאגנט. ואז לדגור לילה בחדר לח בטמפרטורת החדר.
  5. לשטוף כיסויים עם חוצץ לשטוף (70% פורממיד, 10 mM Tris) 2 דקות במשך 3 פעמים בטמפרטורת החדר ולהרכיב עם DAPI 1 מיקרוגרם / מ"ל במדיה הרכבה להדמיה.
    הערה: פרוטוקול FISH הוא פרוטוקולשפורסם 33'34.

5. הדמיה חיה

  1. כאשר התאים מוכנים להדמיה, הרכב מכסה בתאים מגנטיים עם תאים מתוחזקים במדיום הדמיה של 1 מ"ל ללא פנול אדום על במה מחוממת בתא סביבתי.
  2. הגדירו מיקרוסקופ ומנגנוני בקרה סביבתית. התמונות נרכשו עם מיקרוסקופ קונפוקלי דיסק מסתובב עם מטרה 100x 1.4 NA, פיזו Z-Drive, אלקטרון הכפלת התקן מטען מצמיד (EMCCD) מצלמה, מודול מיזוג לייזר מצויד 455, 488, 561, 594 ו 647 ננומטר לייזרים הנשלטים על ידי תוכנת הדמיה. סמכויות הפלט של כל הלייזרים נמדדות בקצה הסיבים.
  3. אתר תאים עם אות GFP בהיר בטלומרים ואות mCherry מקומי באופן מפוזר בנוקלופלזם. מצא סביב 20 תאים, לשנן כל מיקום עם x, Y, z מידע ולהגדיר פרמטרים עבור הדמיה לשגות זמן עם מרווח של 0.5 מיקרומטר עבור סך של 8 מיקרומטר ב- Z ומרווח זמן של 5 דקות עבור 2-4 שעות עבור ערוצי GFP ו mCherry. השתמש ב-30% מ-594 ננומטר וב-50% מעוצמת הספק של 488 ננומטר, עם זמני חשיפה של 200 אלפיות שני ומצלמה משיגה 300.
    הערה: כוח הפלט של יחידות לייזר הוא 20 mW. מוקדי GFP בהירים מציינים גודל עוגן גדול יותר שיכול לגרעין עיבוי בקלות רבה יותר. מצא תאים עם מגוון רחב של אות mCherry מכיוון שהפרדת פאזה תלויה בריכוז ה- SIM בתא. תאים עם אות mCherry עמום מדי או בהיר מדי עשויים שלא להפריד פאזה. כדי להימנע מהלבנת תמונות, אין להשתמש ביותר מדי כוח לייזר או זמן חשיפה ארוך מדי.
  4. התחל הדמיה וקח לולאה חד-פעמית כקדם-עמעום. השהה הדמיה, הוסף מדיית הדמיה של 0.5 מ"ל המכילה 15 μL של 10 מיקרומטר דימרייזר לתא ההדמיה על הבמה כך שריכוז הדמירייזר הסופי הוא 100 ננומטר. לחדש את ההדמיה.
  5. כאשר אתה מוכן להפוך את הדממה, השהה הדמיה, הוסף מדיית הדמיה של 0.5 מ"ל המכילה 2 μL של TMP מלאי 100 מ"מ לתא ההדמיה על הבמה כדי לקבל ריכוז סופי של 100 מיקרומטר TMP. המשך תאי הדמיה במשך 1-2 שעות.

6. הדמיה קבועה

  1. אותו מיקרוסקופ מוגדר כהדמיה חיה, חימום במה אינו נחוץ. השתמש ב- 488 ננומטר כדי לדמיין טלומר FISH, 561 ננומטר עבור mCherry IF ו- 647 ננומטר עבור PML או SUMO IF.
    הערה: אם לא משתמשים בנוגדן mCherry, רק תמונה ישירה חלבון mCherry אבל אות אולי עמום בגלל מרווה ב FISH.  עדיין להשתמש 561 ננומטר ולא 594 ננומטר לייזר כדי לדמיין mCherry כדי למנוע דימום אות דרך של Cy5 כדי mCherry.
  2. אתר סביב 30-50 תאים עם אות אדום (mCherry או mCherry IF) כדי לבחור עבור תאים שהודבקו.
  3. תמונות צולמו עם מרווח של 0.3 מיקרומטר עבור סך של 8 מיקרומטר ב- Z לאיסוף אותות נוספים. השתמש ב- 80% מ- 647 ננומטר, 80% מ- 561 ננומטר ו- 70% מעוצמת הספק של 488 ננומטר, עם זמני חשיפה של 600 אלפיות שני ומצלמה להשיג 300.

7. לעבד תמונות בזמן לשגות

  1. הגדרת בינארי עבור טלומרים
    בחרו תא אחד עם כל הזמן ומידע מחסנית z, בחרו רק בערוץ GFP ויצרו שכבה בינארית על-ידי הגדרת סף. התאם את הערכים התחתונים והעליון של הסף והשתמש בפונקציות כגון "חלק", "נקי" ו"מלא חורים" כדי לראות עד כמה הסף מרים את האובייקטים הרצויים דרך כל נקודות הזמן.
  2. חיסור רקע
    בחר את כל הערוצים, צייר אזור מלבן של עניין (ROI) ברקע (מלבד התא). הגדר ROI זה כרקע ולאחר מכן הפחת את עוצמת הרקע.
  3. קישור טלומר בינארי לעוצמת הטלומר
    בחר טלומר בינארי וקשר אותו לערוץ GFP לחישוב עוצמת GFP באובייקטים הבינאריים כעוצמת טלומר.
  4. חישוב מספר טלומר ועוצמת לאורך זמן
    ציין איזה מידע יש לייצא, כגון זמן, מזהה אובייקט, עוצמת ממוצעת, עוצמת סכום וייצוא נתונים. השתמש בתוכנת התוויית איור כדי לקרוא את הטבלה המיוצאת וליצור דמויות של מספר טלומר ועוצמת טלומר (לסכם את עוצמת הנפח בכל טלומר ולאחר מכן ממוצע על כל הטלומרים בתא) לאורך זמן.

8. עיבוד תמונות של תאים קבועים

  1. הגדרת בינארי עבור APBs
    בחר תאים שהודבקו לניתוח על-ידי חיפוש אות בערוץ 561nm. לאחר ההליך ב- 7.1, הגדר סף הן GFP (דג DNA טלומר) והן Cy5 (PML או SUMO IF) כדי ליצור בינארי עבור טלומרים וגופי PML או SUMO, בהתאמה. מזגו שכבות בינאריות GFP ו-Cy5 ויצרו שכבה חדשה המכילה חלקיקים שיש להם אות GFP ו-Cy5 כדי לייצג לוקליזציה משותפת של גוף PML בטלומרים, וכך APBs.
  2. חישוב מספר ועוצמה של APB/SUMO
    הפחת רקע תמונה לאחר 7.2. קשר שכבה בינארית APB /SUMO לערוץ Cy5 לאחר 7.3. חשב מספר APB/SUMO ואת עוצמתו. ייצוא והתוויה של נתונים לאחר 7.4.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

תמונות מייצגות של לוקליזציה טלומרית של SUMO שזוהתה על ידי דגי DNA טלומר וחלבון SUMO IF מוצגות באיור 2. תאים עם גיוס SIM העשירו את SUMO1 ו- SUMO 2/3 בטלומרים בהשוואה לתאים עם גיוס מוטציות SIM. הדבר מצביע על כך שהעשרת SUMO הנגרמת על-ידי DIMERIZATION בתחום הטלומרים תלויה באינטראקציות SUMO-SIM.

סרט זמן מייצג של TRF1 ו- SIM לאחר דימרציה מוצג בסרטון 1. תמונות בארבע נקודות זמן מוצגות באיור 3A. ה-SIM גויס בהצלחה לטלומרים וגם מוקדי ה-SIM וה-TRF1 הפכו גדולים ובהירים יותר, כצפוי להיווצרות טיפות נוזליות ולצמיחה (איור 1B). בנוסף, נצפתה היתוך של מוקדי TRF1 (איור 3B),מה שהוביל להתקבצות טלומר כפי שמוצג במספר הטלומר המופחת (איור 3E)ועוצמת הטלומר המוגברת לאורך זמן (איור 3D). לעומת זאת, מוטציית SIM גויסה לטלומרים לאחר דימרציה אך לא עורר היווצרות טיפה או קיבוץ טלומר, מכיוון שעוצמת הטלומר לא גדלה ומספר הטלומר לא הצטמק(איור 3C,D, E, Video 2). הדבר מציין כי הפרדת פאזה ולכן קיבוץ באשכולות טלומר מונע על ידי אינטראקציות SUMO-SIM.

היפוך הפרדת הפאזה והתקבצות הטלומר לאחר הוספת TMP חינם עודף מוצג בסרטון 3. תמונות בארבע נקודות זמן מוצגות באיור 4A. בהתאם לפירוק העיבוי הצפוי ולפירוק התקבצות הטלומרים, גדל מספר הטלומר ועוצמת הטלומר ירדה עם הזמן (איור 4B, C).

תמונות מייצגות של APBs שזוהו על ידי דנ"א טלומר דגים וחלבון PML IF מוצגות באיור 5. לתאים עם SIM שגויסו יש יותר APBs מאשר תאים עם מוטציה SIM מגויס, מה שמרמז על עיבוי המושרה בדמריזציה הם אכן APBs.

הנתונים כאן מראים תמונות מייצגות. לניתוח סטטיסטי עם תאים נוספים, עיין ב- Zhang et. אל, 202011.

Figure 1
איור 1: דימרציה כימית כדי לגרום לעיבויים הקשורים לכרומטין. (A)סכמטי דימרציה: הדמירייזר מורכב משני ליגנדים מקושרים, TMP והילה שמתקשרים עם eDHFR והילונזיים, בהתאמה. חלבון הפרדת הפאזה מותך ל-mCherry ו-eDHFR, וחלבון עוגן הכרומוזום מותך ל-Halo ול-GFP. (B)לפני הוספת דימרייזר (גרעין שמאלי עליון), רוב חלבוני עוגן כרומוזום (ריבועים ירוקים) הם מקומיים לכרומוזומים וכמות קטנה של חלבוני עוגן הם מפוזרים בגרעין. שלב הפרדת חלבונים לגיוס (כוכבים סגולים) והפרדת שלבים שותפים (חלבונים שיתעבה עם השלב המפריד חלבון, משולשים אדומים) הם מפוזרים בגרעיןopלסמה. לאחר הוספת דימריזרים (גרעין ימני עליון), חלבונים מפרידי פאזה מעומעמים לחלבון העוגן על הכרומוזומים ובגרעין. יכול להיות שלב עודף המפריד חלבונים בגרעין, בהתאם לריכוז היחסי של חלבון העוגן, חלבון הפרדת פאזה ואת dimerizer בשימוש. לאחר דימרציה (גרעין ימין תחתון), ריכוז מקומי מוגבר של השלב המפריד חלבונים בעוגן מוביל להפרדת פאזה ויצירת עיבויים הקשורים לכרומטין. שותפי הפרדת שלב מועשרים בעוגן בגלל עיבוי משותף עם החלבון המפריד בין שלב eDHFR. חלבוני עוגן שאינם קשורים ישירות לכרומטין יכולים להיות מועשרים בעוגן בגלל עמעום לשלב המפריד חלבון. לאחר הוספת TMP חינם עודף להתחרות עם דימרייזר עבור כריכת eDHFR (גרעין השמאלי התחתון), חלבון הפרדת שלב משתחרר הכרומטין ואת ה עיבוי מומס. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: SUMO מועשרת לאחר גיוס סים לטלומרים עם דימריזרים. (A)סכמטי דימרציה בניסוי זה: SIM (או מוטציה SIM) מותך mCherry ו- eDHFR, ו- TRF1 מותך Halo ו- GFP. (B)תא מייצג עבור דגי DNA טלומר ו SUMO1 אם לאחר גיוס סים. התחתון הוא שכבה בינארית המזהה טלומרים, SUMO1 ומספר מוקדי DNA של סומו1 וטלומר. מוטות קנה מידה: 5 מיקרומטר. (C)תא מייצג לדגי DNA טלומר ו- SUMO1 IF לאחר גיוס מוטציה של SIM. בתחתית נמצאת השכבה הבינארית של התמונות המשמשות לזיהוי מספר מוקדי ה- SUMO1 וה- DNA של הטלומר. מוטות קנה מידה: 5 מיקרומטר. (D)תא מייצג לדגי DNA טלומר ו- SUMO2/3 IF לאחר גיוס ה- SIM. בתחתית נמצאת השכבה הבינארית המזהה טלומרים, SUMO2/3 ומספר מוקדי ה- SUMO2/3 וה- DNA של הטלומר. מוטות קנה מידה: 5 מיקרומטר. (E) תא מייצג לדגי DNA טלומר ו- SUMO2/3 IF לאחר גיוס מוטציה של SIM. בתחתית נמצאת השכבה הבינארית של התמונות המשמשות לזיהוי מספר מוקדי ה- SUMO2/3 וה- DNA של הטלומר. סרגלי קנה מידה: 5 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: הפרדת פאזה הנגרמת על-ידי דימרציה מניעה קיבוץ טלומר. (A)תמונות של TRF1-GFP ו- SIM-mCherry לפני ואחרי הוספת דימרייזר של 100 ננומטר (ריכוז סופי). בתחתית נמצאת השכבה הבינארית הטלומר שזוהתה מ- TRF1-GFP. מוטות קנה מידה: 5 מיקרומטר. (B)אירוע היתוך לאחר גיוס SIM לטלומרים. מוטות קנה מידה: 2 מיקרומטר. מרווח זמן: 5 דקות (C) תמונות של TRF1-GFP ו- SIM מוטציה-mCherry לפני ואחרי הוספת דימרייזר 100 ננומטר (ריכוז סופי). בתחתית נמצאת השכבה הבינארית הטלומר שזוהתה מ- TRF1-GFP. סרגלי קנה מידה: 5 מיקרומטר.(D)עוצמת הטלומר הממוצעת (מסכם את עוצמת הנפח בכל טלומר ולאחר מכן ממוצע על כל הטלומרים בתא) לאורך זמן לאחר גיוס SIM (ירוק, לתא באיור 3A)ומוטנט SIM (כחול, לתא באיור 3C). (E)מספר טלומר לאורך זמן לאחר גיוס SIM (ירוק, לתא באיור 3A)ומוטנט SIM (כחול, לתא באיור 3C). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4: היפוך עיבוי ואשכול טלומר. (A)תמונות של TRF1-GFP ו- SIM-mCherry לאחר הוספת 100 μM TMP (ריכוז סופי) לתאים עם עיבוי שנוצר עבור 3 שעות. בתחתית נמצאת השכבה הבינארית הטלומר שזוהתה מ- TRF1-GFP. סרגלי קנה מידה: 5 מיקרומטר. (B)עוצמת הטלומר הממוצעת (מסכם את עוצמת הנפח בכל טלומר ולאחר מכן ממוצע על כל הטלומרים בתא) לאורך זמן עבור התא באיור 4A. (C)מספר טלומר לאורך זמן לתא באיור 4A. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 5
איור 5: עיבויים המושרים בדמריזציה הם APBs. (A)תא מייצג עבור דגי DNA טלומר ו- PML IF לאחר גיוס ה- SIM. בתחתית נמצאת השכבה הבינארית המזהה טלומרים, גופי PML ומספר מוקדי ה- PML והדנ"א של הטלומר, כלומר מספר ה- APBs. מוטות קנה מידה: 5 מיקרומטר. (B)תא מייצג עבור דג DNA טלומר ו- PML אם לאחר גיוס מוטציה SIM. בתחתית נמצאת השכבה הבינארית של התמונות המשמשות לזיהוי מספר מוקדי ה- PML וה- DNA של הטלומר, כלומר, מספר ה- APBs. סרגלי קנה מידה: 5 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

וידאו 1: גיוס SIM עם דימריזרים לטלומרים מניע הפרדת פאזה ואשכולות טלומר. הדמיה חיה של SIM-mCherry, TRF1-GFP ומיזוג ערוצים לפני ואחרי הוספת דימרייזר 100 ננומטר (ריכוז סופי). מוטות קנה מידה: 5 מיקרומטר. מרווח זמן: 5 דקות. זמן כפי שמוצג. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הסרטון הזה.

וידאו 2: גיוס מוטציה SIM לא יכול להניע הפרדת פאזה ואשכול טלומר. הדמיה חיה של SIM מוטציה-mCherry, TRF1-GFP ומיזוג ערוצים לפני ואחרי הוספת 100 nM dimerizer (ריכוז סופי). מוטות קנה מידה: 5 מיקרומטר. מרווח זמן: 5 דקות. זמן כפי שמוצג. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הסרטון הזה.

וידאו 3: היפוך עיבוי ואשכול טלומר. הדמיה חיה של SIM-mCherry, TRF1-GFP ומיזוג ערוצים לאחר הוספת 100 μM TMP (ריכוז סופי) לתאים עם עיבוי שנוצר עבור 3 שעות. מוטות קנה מידה: 5 מיקרומטר. מרווח זמן: 5 דקות. זמן כפי שמוצג. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הסרטון הזה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

פרוטוקול זה הדגים היווצרות ופירוק של עיבויים בטלומרים עם מערכת עמעום כימית. קינטיקה של הפרדת פאזה ואשכול טלומר המושרה על ידי טיפה-היתוך מנוטרים באמצעות הדמיה חיה. לוקליזציה מרוכזת והרכב נקבעים עם דג DNA וחלבון IF.

קיימים שני שלבים קריטיים בפרוטוקול זה. הראשון הוא לקבוע חלבון וריכוז עמעום. ההצלחה בגרימת הפרדת פאזה מקומית בלוקוס גנומי מסתמכת על העלייה בריכוז המקומי של השלב המפריד בין חלבון מעל הריכוז הקריטי להפרדת פאזה (איור 1B). הריכוז העולמי של השלב המפריד בין חלבון צריך להיות גבוה מספיק, כך שיש מספיק חלבונים כדי להיות מרוכזים באופן מקומי. ריכוז החלבון המפריד בין השלבים לא יכול להיות גבוה מדי, כך שהפרדת הפאזה העולמית התרחשה או שניתן לגרום לה בקלות.  אורך ה- DNA העוגן (או גודל הכרומטין המותאם אליו נקשר חלבון העוגן) וריכוז חלבון העוגן ההילה קובעים את גודל מרכז התגרענות ביעילות עמעום מקסימלית. ככל שגודל העוגן גדול יותר, כך קל לגרעין עיבויים. יעילות הדממה מושפעת מכמות הדימרימרים ביחס לכמות חלבוני העוגן. מעט מדי דימריזרים אינם יכולים להכיל את כל חלבוני העוגן הזמינים בעוד שיותר מדי דימריזרים גורמים לקשירה לא פרודוקטיבית של eDHFR לפח העודף ולא לאלה שבחלבון העוגן. ריכוז דימרייזר, יחד עם אורך ה- DNA העוגן והריכוז של חלבון עוגן התמזג Halo, ניתן להשתמש כדי לקבוע את הריכוז הקריטי הנדרש עבור הפרדת פאזה מקומית nucleating. גישה שיטתית לשינוי פרמטרים אלה (אורך DNA עוגן, ריכוז חלבון עוגן, ריכוז חלבון הפרדת פאזה וריכוז dimerizer) ניתן להשתמש כדי למפות דיאגרמת שלב רב ממדית. עם זאת, אם העניין אינו בדיאגרמת שלב מיפוי אלא יצירת chromatin הקשורים-עיבויים כמו הודגם כאן, קל מאוד פשוט לבחור תאים עם אות Halo-GFP בהיר (גודל עוגן גדול יותר) ותאים עם מגוון רחב של בהירות עבור mCherry-eDHFR (שלבים שונים הפרדת ריכוז חלבון) כדי תמונה עם ריכוז dimerizer עבור dimerization מקסימלי שנקבע בפרוטוקול 2.3. הצעד הקריטי השני הוא להימנע מהלבנת תמונות בהדמיה חיה. בשונה מהפרדת פאזה גלובלית שבה טיפות (מוקדי mCherry בהירים המתייגים את השלב המפריד בין חלבון) יצאו לאחר הפרדת פאזה, עיבוי מקומי במקומות גנומיים לא ניתן לזהות בקלות על ידי שיפוט נוכחות של מוקדי mCherry. הסיבה לכך היא שגיוס החלבון לבדו, ללא הפרדת פאזה, ללוק גנומי יביא להיווצרות מוקדים מקומיים mCherry. הפרדת פאזה מתרחשת לאחר הגיוס, כך שמוצצי mCherry ממשיכים להיות גדולים ובהירים יותר לאחר הגיוס הראשוני. ההעשרה המושרה בהפרדה פאזה יכולה להתרחש גם בערוץ GFP (חלבון העוגן), בשל עמעום חלבון העוגן לחלבון הפרדת הפאזה. לכן, שינוי המאפיינים הפיזיים (גודל ועוצמת) של המוקד לאורך זמן ולא נוכחות של מוקדים צריך לשמש כדי לשפוט הפרדת פאזה. אמנם זה עלול להיות קשה להבדיל עמעום או שלב הפרדה המושרה העשרה של mCherry (חלבון טרף) מוקדים, העשרה של GFP (חלבון עוגן) מוקדים מתרחשת רק אם יש הפרדת פאזה (איור תלת-ממדי). לכן, העשרה של חלבון עוגן יכול לשמש כדי לשפוט בקלות הפרדת פאזה. ההלבנה המונעת מכוח לייזר גבוה או מזמן חשיפה ארוך במהלך ההדמיה מקשה על שיפוט הפרדת פאזה מהדמיה חיה ולכן יש להימנע ככל האפשר על ידי התאמת תנאי ההדמיה. שים לב כי העליות בעוצמת המוקדים ובגודל לאורך זמן הם מאפיינים של LLPS אך לא ניתן להשתמש בהם כראיה היחידה עבור LLPS. במקרה שהוצג כאן, היתוך טיפה שימש כראיה להיווצרות טיפות נוזליות, אשר לא יכול להתרחש עבור מספר קטן יותר של עוגנים או פחות עוגנים ניידים. ללא היתוך טיפה, שיטות אחרות כגון דיפוזיה של רכיבי עיבוי ורגישות הפרעה מולקולה קטנה יכול לשמש כדי לאשר עוד יותר היווצרות עיבוי8,9,11.

למרות שמערכת עמעום כימית זו מעניקה רזולוציה זמנית הנדרשת לניטור הפרדת פאזה בתאים חיים, היא חסרה רזולוציה מרחבית ברמה התאית והתת-תאית. הודות לעיצוב המודולרי של הדימרימרים, ניתן לייצר דימרימרים רגישים לאור על ידי הצמדת צילומים ל- TMP, מה שהופך את המקשר לרגיש לאור אושניהם 12,32,35. פשוט על ידי החלפת dimerizers בתוך אותו רקע תא מהונדס עבור יישומים שונים, שליטה מרחבית וטמפורלית גבוהה של עמעום, היפוך של dimerization, או שניהם עם אור ניתן להשיג. אנו מדמיינים עם הדימריזרים הרגישים לאור, הוא יוכל לשלוט בהפרדת פאזה בדיוק מרחבי וטמפורלי גבוה. בהשוואה לכלים האופטוגנטיים הזמינים לשליטה בהפרדת פאזה באמצעות חלבונים רגישים לאור36,37, חיסרון של מערכת הדמיזציה הכימית הוא שהיא יכולה להפוך את הפרדת הפאזה רק פעם אחת. עם זאת, מערכת זו יכולה לשמור על גיוס מתמשך ובכך הפרדת שלבים ללא אור, מה שהופך אותה מתאימה יותר ליישומי הדמיה חיים לטווח ארוך כגון מעקב אחר צמיחת טיפות או השלכות תאיות של הפרדת פאזה. בנוסף, היכולת לטפל באוכלוסיית תאים ללא אור עושה את זה נוח לבדיקות ביוכימיות כגון אלה הדרושים כדי לקבוע הרכב עיבוי או שינויים בארגון הגנום.

שיטה זו יכולה להיות מותאמת בקלות כדי לגרום עיבוי במקומות אחרים על הגנום. אפשר פשוט לזהות חלבון שנקשר למיקום הגנומי של עניין ולמזג אותו להילה כדי להשתמש בו כעוגן(איור 1B). לחלופין, ניתן לשלב זאת עם CRISPR ו- fuse dCas9 להילה ולהשתמש ב- RNAs מדריך כדי לעגן את Halo ללוק הגנומי של עניין38. בנוסף, ניתן לעגן את Halo למערך דנ"א חוץ רחמי (למשל לאקו) המשולב בגנום על ידי היתוך Halo לחלבון המטרה (למשל LacI). לאחר מכן ניתן להשתמש בגישה מלמטה למעלה כדי להעריך את היכולת של חלבון לשלב נפרד באופן מקומי על כרומטין, כיצד יכולת הפרדת הפאזה שלו מושפעת מקיצוצים בחלבון, מוטציות או שינויים לאחר התרגום, או כיצד העיבוי משפיע על פונקציות מקומיות כגון שינוי כרומטין, שכפול או שעתוק. לסיכום, מערכת עמעום כימי זה יכול לשמש כדי לגרום למגוון רחב של עיבויים על מיקומי כרומטין שונים והוא מתאים במיוחד לחקור כיצד תכונות החומר וההרכב הכימי של עיבויים הקשורים כרומטין לתרום פונקציות כרומטין על ידי שילוב הדמיה חיה לטווח ארוך עם בדיקות ביוכימיות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכה על ידי המכונים הלאומיים לבריאות בארה"ב (1K22CA23763201 ל H.Z., GM118510 עד D.M.C.) וקרן צ'ארלס א. קאופמן ל- H.Z. המחברים רוצים להודות לג'ייסון טונס על הגהת כתב היד.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.25% Trypsin, 0.1% EDTA in HBSS w/o Calcium, Magnesium and Sodium Bicarbonate Corning MT25053CI
16% Formaldehyde (w/v), Methanol-free Thermo Scientific 28906 Prepare 1% in 1x PBS
6 Well Culture Plate VWR 10861-554
Aluminum Foil Fisher Scientific 01-213-101
Anti-mCherry antibody Abcam Ab183628
Anti-PML antibody Santa Cruz sc966
Anti-SUMO1 antibody Abcam Ab32058
Anti-SUMO2/3 antibody Cytoskeleton Asm23
Blocking Reagent Roche 11096176001
Bovine Serum Albumin (BSA) Fisher Scientific BP9706100
BTX Tube micro 1.5ML  VWR 89511-258
Circle Cover Slips Thermo Scientific 3350
Confocal microscope  Nikon MQS31000
DAPI Fisher Scientific D1306
Dimethyl Sulphoxide  Sigma-Aldrich 472301
DMEM with L-Glutamine, 4.5g/L Glucose and Sodium Pyruvate Corning MT10017CV
EMCCD Camera iXon Life  897
Ethanol Fisher Scientific 4355221
Fetal Bovine Serum, Qualified, USDA-approved Regions Gibco A4766801
Formamide, Deionized MilliporeSigma 46-101-00ML
Goat anti-Mouse IgG (H+L), Recombinant Secondary Antibody, Alexa Fluor 647 Invitrogen A28181
Goat anti-Rabbit IgG (H+L), Recombinant Secondary Antibody, Alexa Fluor 647 Invitrogen A32733
High Precision Straight Tapered Ultra Fine Point Tweezers/Forceps Fisher Scientific 12-000-122
Laser merge module  Nikon NIIMHF47180
Leibovitz's L-15 Medium Gibco 21083027
Lipofectamine 2000 Transfection Reagent Invitrogen 11668027
Figure plotting software, MATLAB The MathWorks
Microscope Slide Box Fisher Scientific 34487
Nail Polish Fisher Scientific 50-949-071
Imaging software, NIS-Elements  Nikon
Opti-MEM Reduced Serum Media Gibco 51985091
Parafilm Bemis 13-374-12
PBS 10x, pH 7.4 Fisher Scientific 70-011-044
Penicillin-Streptomycin Solution,100X Gibco 15140122
Piezo Z-Drive  Physik Instrumente (PI) 91985
Pipet Tips VWR 10017
Plain and Frosted Clipped Corner Microscope Slides Fisher Scientific 22-037-246
Poly-D-Lysine solution Sigma-Aldrich A-003-E
Sodium Azide Fisher Scientific BP922I-500
Spinning disk Yokogawa CSU-X1
Square Cover Slips Thermo Scientific 3305
TBS 10x solution Fisher Scientific BP2471500
TelC-Alexa488 PNA Bio F1004
TMP Synthesized by Chenoweth lab Available upon request
TNH Synthesized by Chenoweth lab Available upon request
Tris Solution Fisher Scientific 92-901-00ML
Triton X-100 10% Solution MilliporeSigma 64-846-350ML Prepare 0.5% in 1x PBS
U2Os cell line From E.V. Makayev lab (Nanyang Technological University, Singapore) HTB-96
VECTASHIELD Antifade Mounting Medium Vector Laboratories NC9524612

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Shin, Y., Brangwynne, C. P. Liquid phase condensation in cell physiology and disease. Science. 357 (6357), (2017).
  2. Banani, S. F., Lee, H. O., Hyman, A. A., Rosen, M. K. Biomolecular condensates: organizers of cellular biochemistry. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (5), 285-298 (2017).
  3. Sabari, B. R., Dall'Agnese, A., Young, R. A. Biomolecular condensates in the nucleus. Trends in Biochemical Sciences. , 1-17 (2020).
  4. Strom, A. R., et al. Phase separation drives heterochromatin domain formation. Nature. 547 (7662), 241-245 (2017).
  5. Larson, A. G., et al. Liquid droplet formation by HP1α suggests a role for phase separation in heterochromatin. Nature. 547 (7662), 236-240 (2017).
  6. Boija, A., et al. Transcription factors activate genes through the phase-separation capacity of their activation domains. Cell. 175 (7), 1842-1855 (2018).
  7. Hur, W., et al. CDK-Regulated phase separation seeded by histone genes ensures precise growth and function of histone locus bodies. Developmental Cell. 54 (3), 379-394 (2020).
  8. McSwiggen, D. T., Mir, M., Darzacq, X., Tjian, R. Evaluating phase separation in live cells: diagnosis, caveats, and functional consequences. Genes & Development. 33 (23-24), 1619-1634 (2019).
  9. Peng, A., Weber, S. C. Evidence for and against liquid-liquid phase separation in the nucleus. Non-coding RNA. 5 (4), (2019).
  10. Erdel, F., et al. Mouse heterochromatin adopts digital compaction states without showing hallmarks of HP1-driven liquid-liquid phase separation. Molecular Cell. 78 (2), 236-249 (2020).
  11. Zhang, H., et al. Nuclear body phase separation drives telomere clustering in ALT cancer cells. Molecular Biology of the Cell. 31 (18), 2048-2056 (2020).
  12. Ballister, E. R., Aonbangkhen, C., Mayo, A. M., Lampson, M. A., Chenoweth, D. M. Localized light-induced protein dimerization in living cells using a photocaged dimerizer. Nature Communications. 5, 1-9 (2014).
  13. Yeager, T. R., et al. Telomerase-negative immortalized human cells contain a novel type of promyelocytic leukemia (PML) body. Cancer Research. 59 (17), 4175-4179 (1999).
  14. Zhang, J. M., Zou, L. Alternative lengthening of telomeres: From molecular mechanisms to therapeutic outlooks. Cell and Bioscience. 10 (1), 1-9 (2020).
  15. Corpet, A., et al. PML nuclear bodies and chromatin dynamics: catch me if you can. Nucleic Acids Research. , 1-23 (2020).
  16. Li, Y., Ma, X., Wu, W., Chen, Z., Meng, G. PML nuclear body biogenesis, carcinogenesis, and targeted therapy. Trends in Cancer. 6 (10), 889-906 (2020).
  17. Dilley, R. L., Greenberg, R. A. ALTernative telomere maintenance and cancer. Trends in Cancer. 1 (2), 145-156 (2015).
  18. Sobinoff, A. P., Pickett, H. A. Alternative lengthening of telomeres: DNA repair pathways converge. Trends in Genetics. 33 (12), 921-932 (2017).
  19. Draskovic, I., et al. Probing PML body function in ALT cells reveals spatiotemporal requirements for telomere recombination. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (37), 15726 (2009).
  20. Zhang, J. M., Yadav, T., Ouyang, J., Lan, L., Zou, L. Alternative lengthening of telomeres through two distinct break-induced replication pathways. Cell Reports. 26 (4), 955-968 (2019).
  21. Loe, T. K., et al. Telomere length heterogeneity in ALT cells is maintained by PML-dependent localization of the BTR complex to telomeres. Genes and Development. 34 (9-10), 650-662 (2020).
  22. Potts, P. R., Yu, H. The SMC5/6 complex maintains telomere length in ALT cancer cells through SUMOylation of telomere-binding proteins. Nature Structural and Molecular Biology. 14 (7), 581-590 (2007).
  23. Chung, I., Leonhardt, H., Rippe, K. De novo assembly of a PML nuclear subcompartment occurs through multiple pathways and induces telomere elongation. Journal of Cell Science. 124 (21), 3603-3618 (2011).
  24. Shen, T. H., Lin, H. K., Scaglioni, P. P., Yung, T. M., Pandolfi, P. P. The mechanisms of PML-nuclear body formation. Molecular Cell. 24 (3), 331-339 (2006).
  25. Shima, H., et al. Activation of the SUMO modification system is required for the accumulation of RAD51 at sites of DNA damage. Journal of Cell Science. 126 (22), 5284-5292 (2013).
  26. Yalçin, Z., Selenz, C., Jacobs, J. J. L. Ubiquitination and SUMOylation in telomere maintenance and dysfunction. Frontiers in Genetics. 8, 1-15 (2017).
  27. Sarangi, P., Zhao, X. SUMO-mediated regulation of DNA damage repair and responses. Trends in Biochemical Sciences. 40 (4), 233-242 (2015).
  28. Banani, S. F., et al. Compositional control of phase-separated cellular bodies. Cell. 166 (3), 651-663 (2016).
  29. Min, J., Wright, W. E., Shay, J. W. Clustered telomeres in phase-separated nuclear condensates engage mitotic DNA synthesis through BLM and RAD52. Genes and Development. 33 (13-14), 814-827 (2019).
  30. Song, J., Durrin, L. K., Wilkinson, T. A., Krontiris, T. G., Chen, Y. Identification of a SUMO-binding motif that recognizes SUMO-modified proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (40), 14373-14378 (2004).
  31. Zhang, H., Chenoweth, D. M., Lampson, M. A. Chapter 7 - Optogenetic control of mitosis with photocaged chemical dimerizers. Mitosis and Meiosis Part A. 144, 157-164 (2018).
  32. Zhang, H., et al. Optogenetic control of kinetochore function. Nature Chemical Biology. 13 (10), 1096-1101 (2017).
  33. Cho, N. W., Dilley, R. L., Lampson, M. A., Greenberg, R. A. Interchromosomal homology searches drive directional ALT telomere movement and synapsis. Cell. 159 (1), 108-121 (2014).
  34. Dilley, R. L., et al. Break-induced telomere synthesis underlies alternative telomere maintenance. Nature. 539 (7627), 54-58 (2016).
  35. Aonbangkhen, C., Zhang, H., Wu, D. Z., Lampson, M. A., Chenoweth, D. M. Reversible control of protein localization in living cells using a photocaged-photocleavable chemical dimerizer. Journal of the American Chemical Society. 140 (38), 11926-11930 (2018).
  36. Shin, Y., et al. Spatiotemporal control of intracellular phase transitions using light-activated optoDroplets. Cell. 168 (1-2), 159-171 (2017).
  37. Shin, Y., et al. Liquid nuclear condensates mechanically sense and restructure the genome. Cell. 175 (6), 1481-1491 (2018).
  38. Xiang, X., et al. CRISPR/Cas9-mediated gene tagging: a step-by-step protocol. Methods in Molecular Biology. 1961, 255-269 (2019).

Tags

ביולוגיה גיליון 170 עיבויים הפרדת פאזה נוזלית דימרייזר כימי עיבוי מקומי טלומרים גוף גרעיני PML
חלבון המושרה בדמריזציה כימית מתנדם בטלומרים
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zhao, R., Chenoweth, D. M., Zhang,… More

Zhao, R., Chenoweth, D. M., Zhang, H. Chemical Dimerization-Induced Protein Condensates on Telomeres. J. Vis. Exp. (170), e62173, doi:10.3791/62173 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter