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Biology

Condensats de protéines induits par dimérisation chimique sur les télomères

Published: April 12, 2021 doi: 10.3791/62173
Automatic Translation
1, 2, 1
1Department of Biological Sciences, Mellon College of Science, Carnegie Mellon University, 2Department of Chemistry, School of Arts and Sciences, University of Pennsylvania

Summary

Ce protocole illustre un système de dimérisation des protéines induit chimiquement pour créer des condensats sur la chromatine.  La formation d’un corps nucléaire de leucémie promyélocytaire (LEMP) sur des télomères avec des dimériseurs chimiques est démontrée. La croissance, la dissolution, la localisation et la composition des gouttelettes sont surveillées par imagerie cellulaire vivante, immunofluorescence (IF) et hybridation in situ par fluorescence (FISH).

Abstract

Les condensats associés à la chromatine sont impliqués dans de nombreux processus nucléaires, mais les mécanismes sous-jacents restent insaisissables. Ce protocole décrit un système de dimérisation des protéines induit chimiquement pour créer des condensats sur les télomères. Le dimériseur chimique se compose de deux ligands liés qui peuvent chacun se lier à une protéine: le ligand Halo à Halo-enzyme et le triméthoprime (TMP) à E. coli dihydrofolate réductase (eDHFR), respectivement. La fusion de l’enzyme Halo à une protéine télomère ancre les dimériseurs aux télomères par liaison covalente ligand-enzyme Halo. La liaison du TMP à l’eDHFR recrute la phase fusionnée de l’eDHFR séparant les protéines en télomères et induit la formation de condensats. Étant donné que l’interaction TMP-eDHFR n’est pas covalente, la condensation peut être inversée en utilisant un excès de TMP libre pour concurrencer le dimériseur pour la liaison eDHFR. Un exemple d’induction de la formation du corps nucléaire de la leucémie promyélocytaire (LEMP) sur les télomères et de détermination de la croissance, de la dissolution, de la localisation et de la composition des condensats est montré. Cette méthode peut être facilement adaptée pour induire des condensats à d’autres endroits génomiques en fusionnant Halo à une protéine qui se lie directement à la chromatine locale ou à dCas9 qui cible le locus génomique avec un ARN guide. En offrant la résolution temporelle requise pour l’imagerie en direct unicellulaire tout en maintenant la séparation de phase dans une population de cellules pour les essais biochimiques, cette méthode convient pour sonder à la fois la formation et la fonction des condensats associés à la chromatine.

Introduction

De nombreuses protéines et acides nucléiques subissent une séparation de phase liquide-liquide (LLPS) et s’auto-assemblent en condensats biomoléculaires pour organiser la biochimie dans les cellules1,2. Le LLPS des protéines de liaison à la chromatine conduit à la formation de condensats associés à des loci génomiques spécifiques et impliqués dans diverses fonctions locales de la chromatine3. Par exemple, LLPS de la protéine HP1 sous-tend la formation de domaines hétérochromatiques pour organiser le génome4,5,LLPS des facteurs de transcription forme des centres de transcription pour réguler la transcription6,LLPS des ARNm naissants et des combinaisons multisensiques la protéine génère des corps de locus histones pour réguler la transcription et le traitement des ARNm d’histones7.  Cependant, malgré la découverte de nombreux exemples de condensats associés à la chromatine, les mécanismes sous-jacents de la formation, de la régulation et de la fonction des condensats restent mal compris. En particulier, tous les condensats associés à la chromatine ne sont pas formés par LLPS et des évaluations minutieuses de la formation de condensats dans les cellules vivantes sont encore nécessaires8,9. Par exemple, il est démontré que la protéine HP1 chez la souris n’a qu’une faible capacité à former des gouttelettes liquides dans les cellules vivantes et que les foyers d’hétérochromatine se comportent comme des globules polymères effondrés10. Par conséquent, des outils pour induire des condensats de novo sur la chromatine dans les cellules vivantes sont souhaitables, en particulier ceux qui permettent l’utilisation de l’imagerie en direct et des essais biochimiques pour surveiller la cinétique de la formation de condensats, les propriétés physiques et chimiques des condensats résultants et les conséquences cellulaires de la formation de condensats.

Ce protocole rapporte un système de dimérisation chimique pour induire des condensats de protéines sur la chromatine11 (Figure 1A). Le dimériseur se compose de deux ligands liés interagissant avec les protéines: le triméthoprime (TMP) et le ligand Halo et peut dimériser des protéines fusionnées aux récepteurs apparentés: Escherichia coli dihydrofolate réductase (eDHFR) et une enzyme alkyldéhalogénase bactérienne (enzyme Halo), respectivement12. L’interaction entre le ligand Halo et l’enzyme Halo est covalente, ce qui permet à l’enzyme Halo d’être utilisée comme ancre en la fusionnant à une protéine liant la chromatine pour recruter une protéine de séparation de phase fusionnée à l’eDHFR en chromatine. Après le recrutement initial, une concentration locale accrue de la protéine séparatrice de phase dépasse la concentration critique nécessaire à la séparation de phase et nuclée ainsi un condensat à l’ancre(Figure 1B). En fusionnant des protéines fluorescentes (par exemple mCherry et eGFP) à eDHFR et Halo, la nucléation et la croissance des condensats peuvent être visualisées en temps réel avec la microscopie à fluorescence. Étant donné que l’interaction entre l’eDHFR et le TMP n’est pas covalente, un excès de TMP libre peut être ajouté pour concurrencer le dimériseur pour la liaison eDHFR. Cela libérera ensuite la protéine de séparation de phase de l’ancre et dissoudra le condensat associé à la chromatine.

Nous avons utilisé cet outil pour induire la formation du corps nucléaire de la leucémie promyélocytaire de novo (LEMP) sur les télomères dans les cellules cancéreuses à télomérase négative qui utilisent une voie alternative d’allongement des télomères (ALT) pour le maintien des télomères13,14.  Les corps nucléaires PML sont des compartiments sans membrane impliqués dans de nombreux processus nucléaires15,16 et sont localisés de manière unique aux télomères ALT pour former des APM, pour les corps PML associés aux télomères ALT17,18. Les télomères se regroupent dans les ABC, probablement pour fournir des modèles de réparation pour la synthèse de l’ADN télomère dirigée par homologie dans ALT19. En effet, la synthèse de l’ADN télomère a été détectée dans les ABC et les ABC jouent un rôle essentiel dans l’enrichissement des facteurs de réparation de l’ADN sur les télomères20,21. Cependant, les mécanismes sous-jacents à l’assemblage APB et au clustering des télomères au sein des APB étaient inconnus. Étant donné que les protéines télomères dans les cellules ALT sont modifiées de manière unique par de petits modificateurs de type ubiquitine (SUMOs)22, de nombreux composants APB contiennent des sites desumoylation 22,23,24 ,25 et / ou des motifs interagissant SUMO (SIM)26,27 et des interactions SUMO-SIM conduisent à la séparation de phase28, nous avons émis l’hypothèse que la sumoylation sur les télomères conduit à l’enrichissement des protéines contenant SUMO / SIM et Les interactions SUMO-SIM entre ces protéines conduisent à une séparation de phase.  La protéine PML, qui a trois sites de sumoylation et un site SIM, peut être recrutée dans les télomères sumoyés pour former des ABC et la coalescence des ABC liquides conduit au regroupement des télomères. Pour tester cette hypothèse, nous avons utilisé le système de dimérisation chimique pour imiter la formation d’APB induite par la sumoylation en recrutant des CARTES SIM pour les télomères(Figure 2A)11. Le GFP est fusionné à Haloenzyme pour la visualisation et à la protéine de liaison aux télomères TRF1 pour ancrer le dimériseur aux télomères. La carte SIM est fusionnée à eDHFR et mCherry. La cinétique de la formation de condensats et le regroupement de télomères induit par la fusion de gouttelettes sont suivis par l’imagerie de cellules vivantes.  La séparation de phase est inversée en ajoutant un excès de TMP libre pour concurrencer la liaison eDHFR. L’immunofluorescence (FI) et l’hybridation in situ par fluorescence (FISH) sont utilisées pour déterminer la composition du condensat et l’association télomérique. Le recrutement de SIM enrichit le SUMO sur les télomères et les condensats induits contiennent du PML et sont donc des APM. Le recrutement d’un mutant SIM qui ne peut pas interagir avec SUMO n’enrichit pas SUMO sur les télomères ni n’induit de séparation de phase, ce qui indique que la force motrice fondamentale de la condensation APB est l’interaction SUMO-SIM. En accord avec cette observation, les polymères polySUMO-polySIM qui fusionnent à un facteur de liaison TRF2 RAP1 peuvent également induire la formation d’APB29. Par rapport au système de fusion polySUMO-polySIM où la séparation de phase se produit tant que suffisamment de protéines sont produites, l’approche de dimérisation chimique présentée ici induit une séparation de phase à la demande et offre ainsi une meilleure résolution temporelle pour surveiller la cinétique de la séparation de phase et du processus de regroupement des télomères. De plus, ce système de dimérisation chimique permet le recrutement d’autres protéines pour évaluer leur capacité à induire la séparation de phase et le regroupement des télomères. Par exemple, une protéine désordonnée recrutée dans les télomères peut également former des gouttelettes et des télomères de cluster sans induire la formation d’APB, ce qui suggère que le regroupement des télomères est indépendant de la chimie de l’APB et ne repose que sur la propriété liquide de l’APB11.

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Protocol

1. Production de lignées cellulaires transitoires

  1. Culture de cellules acceptrices U2OS sur des couvercles en verre de 22 x 22 mm (pour l’imagerie vivante) ou des couvercles circulaires de 12 mm de diamètre (pour IF ou FISH) recouverts de poly-D-lysine dans une plaque à 6 puits avec milieu de croissance (10% de sérum bovin fœtal et 1% de solution de pénicilline-streptomycine dans DMEM) jusqu’à ce qu’ils atteignent 60-70% de confluence.
  2. Remplacer le milieu de croissance par un milieu de transfection de 1 mL (milieu de croissance sans solution de pénicilline-streptomycine) avant la transfection.
  3. Pour chaque puits de transfection, ajouter 4 μL de réactif de transfection à 150 μL de milieux sériques réduits, vortex pendant 10 secondes, puis incuber pendant 5 minutes.
  4. Pour chaque puits, ajouter le plasmide de construction Halo (Halo-GFP-TRF1 ou Halo-TRF1) et le plasmide de construction eDHFR (mCherry-eDHFR-SIM ou mutant mCherry-eDHFR-SIM) à un rapport de masse de 1:1 (0,5 μg de plasmide de construction Halo avec 0,5 μg de plasmide de construction eDHFR) à 150 μL de milieu sérique réduit, goutte à goutte, mélange par pipetage.
    REMARQUE: Les étiquettes sont relativement petites (Halo 33 kD, eDHFR 28 kD, mCherry 30 kD, eGFP 27 kD) et aucun effet sur la séparation de phase n’a été observé. Cependant, il est conseillé d’utiliser des mutants tels que le mutant SIM utilisé ici pour s’assurer que le comportement de phase est sensible aux mutations et non aux balises. SIM est de PIASx28,30. La séquence SIM est AAAGTCGATGTAATTGACTTAACGATCGAATCTAGCAGCGATGAAGAAGAAGATCCACCGGCTAAACGT. Le mutant SIM est généré par la mutation des acides aminés SIM VIDL enVADA 28, et la séquence est AAAGTCGATGTAGCCGACGCCACGATCGAATCTAGCAGCGATGAAGAAGAAGATCCACCGGCTAAACGT. Nous avons déposé nos plasmides à addgene: #164644 3XHalo-GFP-TRF1; #164646 mCherry-eDHFR-SIM; #164649 mutant mCherry-eDHFR-SIM.
  5. Ajouter 150 μL de mélange de milieux sériques réduits en réactif de transfection à 150 μL de milieux sériques réduits avec de l’ADN, goutte à goutte, mélanger par pipetage, incuber pendant 5 minutes.
  6. Ajouter les 300 μL de mélange réactif-ADN de transfection aux cellules, goutte à goutte, puis replacer les cellules dans l’incubateur.
  7. Attendez 24 à 48 heures avant l’imagerie en direct, l’immunofluorescence (IF) ou l’hybridation in situ par fluorescence (FISH).

2. Dimérisation sur télomères

  1. Dissoudre les dimérisants dans du sulfure de diméthyle à 10 mM et les stocker dans des tubes de microcentrifugation en plastique à −80 °C pour un stockage à long terme.
    REMARQUE: Au lieu d’utiliser le dimériseur avec TMP directement lié à Halo (TMP-Halo, TH), le dimériseur TMP-NVOC-Halo (TNH) qui a un linker photosensible, 6-nitroveratryl oxycarbonyl (NVOC), entre TMP et Haloligand est utilisé31. En effet, il faut moins de temps pour que la TNH (~ 5 minutes) diffuse dans la cellule que la TH (~ 20 minutes). Les résultats présentés ici peuvent également être obtenus en utilisant TH. Lorsque vous utilisez la TNH, veillez à ne pas exposer le dimériseur à la lumière pour éviter le clivage NOVC. Manipulez le TNH dans une pièce sombre avec une lampe à faible lumière rouge, rangez le dimériseur dans des tubes en plastique ambré et enveloppez le récipient contenant du TNH ou des cellules traitées avec du papier d’aluminium. L’imagerie TNH avec DIC est sûre.
  2. Prendre une aliquote de dimériseur de 10 mM à partir de −80 °C et diluer dans un milieu imageur jusqu’à une concentration en stock de 10 μM et conserver à −20 °C.
  3. Lorsqu’ils sont prêts à l’emploi, diluez les dimériseurs à partir d’une solution mère de 10 μM jusqu’à une concentration de travail finale de 100 nM dans un milieu de croissance (pour l’imagerie fixe) ou un milieu d’imagerie. Traiter les cellules avec des dimériseurs de 100 nM (concentration finale) sur scène pour l’imagerie vivante ou incuber pendant 4 à 5 heures pour l’immunofluorescence (FI) et l’hybridation in situ par fluorescence (FISH).
    REMARQUE: La concentration de dimériseurs utilisés affecte l’efficacité de la dimérisation et donc la séparation de phase. La concentration de dimériseur permettant une efficacité de dimérisation maximale dépend du type de cellule et de la concentration en protéines d’ancrage, elle devra donc être déterminée pour différentes expériences. Un moyen simple consiste à incuber des cellules exprimant la protéine d’ancrage et mCherry-eDHFR (sans fusionner avec la protéine de séparation de phase ou fusionnée à un mutant de séparation sans phase) et à identifier la concentration de dimériseur à laquelle l’intensité mCherry la plus élevée à l’ancre est atteinte. Une approche plus systématique consiste à incuber les cellules exprimant l’ancre uniquement avec différentes concentrations de dimériseurs, puis avec un colorant de liaison Halo pour aider à déterminer la concentration de dimériseur à laquelle l’intensité du colorant de liaison Halo commence à plafonner (c’est-à-dire que toutes les ancres fusionnées Halo sont occupées par le dimériseur et plus pour le colorant liant Halo)32.
  4. Pour inverser la dimérisation, incuber les cellules avec des dimériseurs pendant 2 à 5 heures (avec ou sans imagerie en direct) ou jusqu’à ce que la taille de gouttelette souhaitée soit atteinte et ajouter 100 μM de TMP libre (concentration finale) dilué dans un milieu imageur aux cellules.

3. Immunofluorescence (FI)

  1. Ensemencez10 5 cellules sur des verres à couverture circulaire de 12 mm de diamètre recouverts de poly-D-lysine dans une plaque à 6 puits. Transfectez ensuite les deux plasmides (Halo-GFP-TRF1 avec mCherry-eDHFR-SIM ou mCherry-eDHFR-SIM mutant) et attendez 24 à 48 heures avant de procéder à l’immunofluorescence.
    REMARQUE: Attendre plus d’un jour après la transfection peut obtenir une expression plus élevée.
  2. Diluer les dimérisants avec un milieu de croissance pour atteindre une concentration finale de 100 nM, ajouter des dimérisants dilués aux cellules et incuber à 37 °C pendant 4-5 heures.
    REMARQUE: La séparation de phase est rapidement induite après l’ajout de dimériseurs (< 30 minutes). Une incubation plus longue aide les gouttelettes à grossir en plus grandes tailles. Après la croissance des gouttelettes avec l’imagerie en direct peut être utilisé pour déterminer le temps qu’il faut pour que les gouttelettes atteignent un état souhaité.
  3. Fixer les cellules dans une solution de PBS contenant 4% de formaldéhyde et 0,1% de Triton X-100 pendant 10 minutes à température ambiante pour perméabiliser les cellules. Lavez les cellules 3 fois avec PBS.
    REMARQUE: Après cette étape, il peut être mis en pause et les cellules peuvent être stockées à 4 ° C pendant une semaine.
    Attention: Le formaldéhyde est nocif par inhalation et s’il est avalé, il irrite également les yeux, le système respiratoire et la peau et constitue un risque possible de cancer. Besoin de porter un équipement de protection individuelle, utiliser uniquement dans une hotte chimique. Mettez-le également dans un conteneur à déchets après utilisation, ne le jetez pas dans l’évier.
  4. Laver les couvercles deux fois avec 50 μL TBS-Tx et une fois avec 50 μL Antibody Dilution Buffer (AbDil). TBS-Tx a été fabriqué par TBS, 0,1% Triton X-100 et 0,05% Na-azide. AbDil a été fabriqué par TBS-Tx, 2% de BSA et 0,05% de Na-azide.
  5. Incuber chaque couvercle avec 50 μL d’anticorps primaire anti-PML (dilution 1:50 dans AbDil) / anti-SUMO1 (dilution 1:200 dans AbDil) / anticorps anti-SUMO2/3 (dilution 1:200 dans AbDil) à 4 °C dans une chambre humidifiée pendant la nuit. L’anticorps mCherry peut également être utilisé (dilution 1:200 dans AbDil) pour aider à détecter le signal mCherry pour FISH.
    REMARQUE: FISH éteint le signal fluorescent mCherry, ce qui rend difficile la différenciation des cellules transfectées avec des plasmides mCherry de celles qui ne sont pas transfectées dans les expériences FISH. L’utilisation de l’anticorps mCherry est conseillée. Alternativement, on peut faire une lignée cellulaire stable exprimant eDHFR contenant de la protéine.
  6. Lavez les couvercles 3 fois avec AbDil pour éliminer les anticorps primaires non liés.
  7. Incuber des cellules avec un anticorps secondaire [anticorps secondaire igG (H+L) anti-souris conjugué avec Alexa Fluor 647 pour PML et SUMO, anticorps secondaire anti-lapin IgG (H+L) conjugué avec Alexa Fluor 555 pour mCherry, tous deux à une dilution de 1:1000 dans AbDil] pendant 1 heure dans une boîte sombre à température ambiante.
  8. Laver les couvercles 3 fois avec TBS-Tx.
  9. Étiquetez les lames, diluez le DAPI dans un support de montage pour atteindre la concentration finale de DAPI de 1 μg/mL. Ensuite, mettez 2 μL de DAPI dilué sur la lame. Retournez les couvercles et placez-les sur la goutte DAPI, aspirez un liquide supplémentaire à partir du bord du couvercle.
  10. Scellez avec du vernis à ongles, laissez-le sécher et rincez par le haut de la housse avec de l’eau. Conserver au congélateur pour l’imagerie.

4. Hybridation in situ par fluorescence (FISH)

  1. Ensemencez10 5 cellules sur des verres à couverture circulaire de 12 mm de diamètre recouverts de poly-D-lysine dans une plaque à 6 puits. Transfecter les cellules avec des plasmides mutants Halo-TRF1 et mCherry-eDHFR-SIM ou mCherry-eDHFR-SIM et attendre 24-48 h avant de passer à FISH. L’étape de dimérisation est la même que celle décrite au 3.2.
    REMARQUE: Ici, TRF1 n’est pas fusionné avec GFP, de sorte que le canal vert est libéré pour la sonde d’ADN télomère.
  2. Fixez les cellules avec 4% de formaldéhyde pendant 10 minutes à température ambiante et lavez-les 4 fois avec du PBS. Pour IF-FISH, passez au protocole IF à partir d’ici et après avoir lavé l’anticorps secondaire dans IF (3.8), refixez les cellules avec 4% de formaldéhyde pendant 10 minutes à température ambiante et lavez-les trois fois avec du PBS.
  3. Couvercles déshydratés dans une série d’éthanol (70%, 80%, 90%, 2 minutes chacun).
  4. Incuber des couvercles avec une sonde PNA de 488 télC (rapport 1:2000) dans une solution d’hybridation de 5 μL à 75 °C pendant 5 minutes. La solution d’hybridation contient 70% de formamide désionisé, 10 mM de Tris (pH 7,4), 0,5% de réactif bloquant. Ensuite, incubez toute la nuit dans une chambre humidifiée à température ambiante.
  5. Laver les couvercles avec tampon de lavage (70% formamide, 10 mM Tris) 2 minutes pendant 3 fois à température ambiante et monter avec 1 μg / mL DAPI dans les supports de montage pour l’imagerie.
    REMARQUE: Le protocole FISH est un protocole publié33'34.

5. Imagerie en direct

  1. Lorsque les cellules sont prêtes pour l’imagerie, montez des couvercles dans des chambres magnétiques avec des cellules maintenues dans un milieu d’imagerie de 1 mL sans rouge phénol sur une scène chauffée dans une chambre environnementale.
  2. Installez un microscope et un appareil de contrôle de l’environnement. Les images ont été acquises avec un microscope confocal à disque rotatif avec un objectif 100x 1,4 NA, un Piezo Z-Drive, une caméra EMCCD (Electron Multiplying Charge-Coupled Device) et un module de fusion laser équipé de lasers 455, 488, 561, 594 et 647 nm contrôlés par un logiciel d’imagerie. Les puissances de sortie de tous les lasers sont de 20 mW mesurées à l’extrémité de la fibre.
  3. Localisez les cellules avec un signal GFP brillant sur les télomères et un signal mCherry localisé de manière diffusive dans le nucléoplasme. Trouvez environ 20 cellules, mémorisez chaque position avec des informations x, y, z et configurez les paramètres pour l’imagerie en accéléré avec un espacement de 0,5 μm pour un total de 8 μm en Z et un intervalle de temps de 5 minutes pendant 2 à 4 heures pour les canaux GFP et mCherry. Utilisez 30 % de 594 nm et 50 % d’intensité énergétique de 488 nm, avec des temps d’exposition de 200 ms et un gain de caméra de 300.
    REMARQUE: La puissance de sortie des unités laser est de 20 mW. Les foyers GFP brillants indiquent une plus grande taille d’ancrage qui peut nucléer les condensats plus facilement. Trouvez des cellules avec une large gamme de signaux mCherry, car la séparation de phase dépend de la concentration de SIM dans la cellule. Les cellules dont le signal mCherry est trop faible ou trop lumineux peuvent ne pas se séparer. Pour éviter le photobleaching, n’utilisez pas trop de puissance laser ou un temps d’exposition trop long.
  4. Commencez l’imagerie et prenez une boucle unique comme pré-dimérisation. Pause d’imagerie, ajoutez un support d’imagerie de 0,5 mL contenant 15 μL de dimériseur de 10 μM à la chambre d’imagerie sur la scène afin que la concentration finale du dimériseur soit de 100 nM. Reprendre l’imagerie.
  5. Lorsque vous êtes prêt à inverser la dimérisation, suspendez l’imagerie, ajoutez un support d’imagerie de 0,5 mL contenant 2 μL de TMP stock de 100 mM à la chambre d’imagerie sur la scène pour obtenir une concentration finale de TMP de 100 μM. Continuez à imager les cellules pendant 1 à 2 heures.

6. Imagerie fixe

  1. Même configuration de microscope que l’imagerie en direct, le chauffage de la scène n’est pas nécessaire. Utilisez 488 nm pour imager le télomère FISH, 561 nm pour mCherry IF et 647 nm pour PML ou SUMO IF.
    REMARQUE: Si vous n’utilisez pas d’anticorps mCherry, imagez directement la protéine mCherry, mais signalez peut-être faible en raison de la trempe dans FISH.  Utilisez toujours un laser de 561 nm plutôt que de 594 nm pour imager mCherry afin d’éviter le saignement du signal de Cy5 à mCherry.
  2. Localisez environ 30 à 50 cellules avec signal rouge (mCherry ou mCherry IF) à sélectionner pour les cellules transfectées.
  3. Les images ont été prises avec un espacement de 0,3 μm pour un total de 8 μm en Z pour collecter plus de signaux. Utilisez 80 % des 647 nm, 80 % des 561 nm et 70 % des 488 nm d’intensité énergétique, avec des temps d’exposition de 600 ms et un gain de caméra de 300.

7. Traiter les images time-lapse

  1. Définir le binaire pour les télomères
    Choisissez une cellule avec toutes les informations de temps et de pile z, choisissez uniquement le canal GFP et créez une couche binaire en définissant un seuil. Ajustez les valeurs inférieure et supérieure du seuil et utilisez des fonctions telles que « Lisser », « Nettoyer » et « Remplir les trous » pour voir dans quelle mesure le seuil capte les objets souhaités à travers tous les points temporels.
  2. Soustraire l’arrière-plan
    Choisissez tous les canaux, dessinez le rectangle Région d’intérêt (ROI) sur l’arrière-plan (à l’exception de la cellule). Définissez ce retour sur investissement comme arrière-plan, puis soustrayez l’intensité de l’arrière-plan.
  3. Lier le binaire télomère à l’intensité du télomère
    Choisissez le binaire télomère et liez-le au canal GFP pour calculer l’intensité GFP dans les objets binaires en tant qu’intensité télomère.
  4. Calculer le nombre et l’intensité des télomères au fil du temps
    Spécifiez les informations à exporter, telles que l’heure, l’ID d’objet, l’intensité moyenne, l’intensité de la somme et les données d’exportation. Utilisez un logiciel de traçage de figures pour lire le tableau exporté et générer des chiffres du nombre de télomères et de l’intensité des télomères (résumer l’intensité sur le volume de chaque télomère, puis faire la moyenne sur tous les télomères d’une cellule) au fil du temps.

8. Traiter les images à cellules fixes

  1. Définir le binaire pour les APOST
    Choisissez des cellules transfectées pour l’analyse en recherchant un signal dans un canal 561nm. En suivant la procédure décrite en 7.1, définissez un seuil dans les canaux GFP (TELOMER DNA FISH) et Cy5 (PML ou SUMO IF) pour générer un binaire pour les télomères et les corps PML ou SUMO, respectivement. Fusionnez les couches binaires GFP et Cy5 et créez une nouvelle couche contenant des particules qui ont toutes deux un signal GFP et Cy5 pour représenter la colocalisation du corps PML sur les télomères, donc les APM.
  2. Calculer le nombre et l’intensité APB/SUMO
    Soustrayez l’arrière-plan de l’image après 7.2. Lier la couche binaire APB/SUMO au canal Cy5 après la version 7.3. Calculer le nombre et l’intensité APB/SUMO. Exporter et tracer les données suivant la section 7.4.

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Representative Results

Des images représentatives de la localisation télomérique de SUMO identifiées par l’ADN télomère FISH et la protéine SUMO IF sont montrées à la figure 2. Les cellules à recrutement SIM enrichissent SUMO1 et SUMO 2/3 sur télomères par rapport aux cellules à recrutement mutant SIM. Cela indique que l’enrichissement SUMO induit par la dimérisation SIM sur les télomères dépend des interactions SUMO-SIM.

Un film en accéléré représentatif de TRF1 et SIM après dimérisation est montré dans la vidéo 1. Les instantanés à quatre points temporels sont illustrés à la figure 3A. La CARTE SIM a été recrutée avec succès pour les télomères et les foyers SIM et TRF1 sont devenus plus grands et plus lumineux, comme prévu pour la formation et la croissance de gouttelettes liquides(Figure 1B). En outre, la fusion des foyers TRF1 a été observée (Figure 3B), ce qui a conduit à un regroupement des télomères comme le montre le nombre réduit de télomères (Figure 3E) et à une augmentation de l’intensité des télomères au fil du temps (Figure 3D). En revanche, le mutant SIM a été recruté pour les télomères après dimérisation, mais n’a induit aucune formation de gouttelettes ou de regroupement de télomères, car l’intensité des télomères n’a pas augmenté et le nombre de télomères n’a pas diminué(Figure 3C,D, E, Vidéo 2). Cela indique que la séparation de phase et donc le regroupement des télomères sont entraînés par les interactions SUMO-SIM.

L’inversion de la séparation de phase et du regroupement des télomères après l’ajout d’un excès de TMP libre est montrée dans la vidéo 3. Les instantanés à quatre points temporels sont illustrés à la figure 4A. En accord avec la dissolution et le désagroupage prévus des télomères, le nombre de télomères a augmenté et l’intensité des télomères a diminué au fil du temps(Figure 4B,C).

Des images représentatives des ABC identifiés par l’ADN télomère FISH et la protéine PML IF sont montrées à la figure 5. Les cellules avec SIM recruté ont plus d’APN que les cellules avec un mutant SIM recruté, ce qui suggère que les condensats induits par la dimérisation sont en effet des APN.

Les chiffres ici montrent des images représentatives. Pour une analyse statistique avec plus de cellules, veuillez vous référer à Zhang et. al., 202011.

Figure 1
Figure 1: Dimérisation chimique pour induire des condensats associés à la chromatine. (A) Schéma de dimérisation : Le dimériseur se compose de deux ligands liés, TMP et Halo qui interagissent avec eDHFR et Haloenzyme, respectivement. La protéine de séparation de phase est fusionnée à mCherry et eDHFR, et la protéine d’ancrage chromosomique est fusionnée à Halo et GFP. (B) Avant d’ajouter un dimériseur (noyau en haut à gauche), la majorité des protéines d’ancrage chromosomique (carrés verts) sont localisées dans les chromosomes et une petite quantité de protéines d’ancrage sont localisées de manière diffuse dans le nucléoplasme. Les protéines de séparation de phase à recruter (étoiles violettes) et les partenaires de séparation de phase (protéines qui vont se condenser avec la protéine de séparation de phase, triangles rouges) sont localisés de manière diffuse dans le nucléoplasme. Après avoir ajouté des dimériseurs (noyau en haut à droite), les protéines de séparation de phase sont dimérisées en protéine d’ancrage sur les chromosomes et dans le nucléoplasme. Il pourrait y avoir un excès de protéines de séparation de phase dans le nucléoplasme, en fonction de la concentration relative de la protéine d’ancrage, de la protéine de séparation de phase et du dimériseur utilisé. Après dimérisation (noyau en bas à droite), l’augmentation de la concentration locale des protéines séparant la phase à l’ancre conduit à la séparation de phase et à la formation de condensats associés à la chromatine. Les partenaires de séparation de phase sont enrichis à l’ancre en raison de la cocondensation avec la protéine de séparation de phase fusionnée eDHFR. Les protéines d’ancrage qui ne sont pas directement liées à la chromatine peuvent être enrichies à l’ancre en raison de la dimérisation de la protéine séparatrice de phase. Après avoir ajouté un excès de TMP libre pour concurrencer le dimériseur pour la liaison eDHFR (noyau en bas à gauche), la protéine de séparation de phase est libérée de la chromatine et le condensat est dissous. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2: SUMO est enrichi après le recrutement de SIM en télomères avec dimériseurs. (A) Schéma de dimérisation dans cette expérience: SIM (ou MUTANT SIM) est fusionné à mCherry et eDHFR, et TRF1 est fusionné à Halo et GFP. (B) Une cellule représentative pour les télomères DNA FISH et SUMO1 IF après le recrutement de SIM. En bas se trouve la couche binaire identifiant les télomères, SUMO1 et le nombre de foyers d’ADN SUMO1 et télomères colocalisés. Barres d’échelle: 5 μm. (C) Une cellule représentative de l’ADN télomère FISH et SUMO1 IF après le recrutement du mutant SIM. En bas se trouve la couche binaire des images utilisées pour identifier le nombre de foyers d’ADN SUMO1 et télomères colocalisés. Barres d’échelle: 5 μm. (D) Une cellule représentative de l’ADN télomère FISH et SUMO2/3 IF après le recrutement de SIM. En bas se trouve la couche binaire identifiant les télomères, SUMO2/3, et le nombre de foyers d’ADN colocalisés SUMO2/3 et télomères. Barres d’échelle: 5 μm. (E) Une cellule représentative de l’ADN télomère FISH et SUMO2/3 IF après le recrutement du mutant SIM. En bas se trouve la couche binaire des images utilisées pour identifier le nombre de foyers d’ADN SUMO2/3 et télomères colocalisés. Barres d’échelle : 5 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3: La séparation de phase induite par la dimérisation entraîne le regroupement des télomères. (A) Instantanés de TRF1-GFP et SIM-mCherry avant et après l’ajout d’un dimériseur de 100 nM (concentration finale). En bas se trouve la couche binaire télomère identifiée à partir de TRF1-GFP. Barres d’échelle: 5 μm. (B) Un événement de fusion après le recrutement de SIM aux télomères. Barres d’échelle: 2 μm. Intervalle de temps: 5 min. (C) Instantanés de TRF1-GFP et SIM mutant-mCherry avant et après l’ajout de 100 nM dimériseur (concentration finale). En bas se trouve la couche binaire télomère identifiée à partir de TRF1-GFP. Barres d’échelle : 5 μm. (D) Intensité moyenne des télomères (résumer l’intensité sur le volume dans chaque télomère, puis la moyenne sur tous les télomères d’une cellule) au fil du temps après le recrutement de la carte SIM (en vert, pour la cellule de la figure 3A)et du mutant SIM (en bleu, pour la cellule de la figure 3C). (E) Nombre de télomères au fil du temps après le recrutement de la carte SIM (en vert, pour la cellule de la figure 3A)et du mutant SIM (en bleu, pour la cellule de la figure 3C). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4: Inversion de la condensation et regroupement des télomères. (A) Instantanés de TRF1-GFP et SIM-mCherry après avoir ajouté 100 μM TMP (concentration finale) aux cellules avec des condensats formés pendant 3 h. En bas se trouve la couche binaire télomère identifiée à partir de TRF1-GFP. Barres d’échelle : 5 μm. (B) Intensité moyenne des télomères (résumer l’intensité sur le volume dans chaque télomère, puis la moyenne sur tous les télomères d’une cellule) au fil du temps pour la cellule à la figure 4A. (C) Nombre de télomères au fil du temps pour la cellule de la figure 4A. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 5
Figure 5: Les condensats induits par dimérisation sont des APM. (A) Une cellule représentative de l’ADN télomère FISH et PML IF après recrutement SIM. En bas se trouve la couche binaire identifiant les télomères, les corps PML et le nombre de foyers d’ADN COLOCALISÉS PML et télomères, c’est-à-dire le nombre d’AAP. Barres d’échelle: 5 μm. (B) Une cellule représentative de l’ADN télomère FISH et PML IF après recrutement du mutant SIM. En bas se trouve la couche binaire des images utilisées pour identifier le nombre de foyers d’ADN de LEMP et de télomères colocalisés, c’est-à-dire le nombre d’APM. Barres d’échelle : 5 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Vidéo 1 : Recruter une carte SIM avec des dimériseurs aux télomères entraîne la séparation de phase et le regroupement des télomères. Imagerie en direct de SIM-mCherry, TRF1-GFP et canaux de fusion avant et après l’ajout d’un dimériseur de 100 nM (concentration finale). Barres d’échelle: 5 μm. Intervalle de temps: 5 min. Heure comme indiqué. Veuillez cliquer ici pour télécharger cette vidéo.

Vidéo 2 : Le mutant SIM recruteur ne peut pas conduire à la séparation de phase et au regroupement des télomères. Imagerie en direct de SIM mutant-mCherry, TRF1-GFP et canaux de fusion avant et après l’ajout d’un dimériseur de 100 nM (concentration finale). Barres d’échelle: 5 μm. Intervalle de temps: 5 min. Heure comme indiqué. Veuillez cliquer ici pour télécharger cette vidéo.

Vidéo 3 : Inversion de la condensation et regroupement des télomères. Imagerie en direct de SIM-mCherry, TRF1-GFP et canaux de fusion après ajout de 100 μM TMP (concentration finale) aux cellules avec des condensats formés pendant 3 h. Barres d’échelle: 5 μm. Intervalle de temps: 5 min. Heure comme indiqué. Veuillez cliquer ici pour télécharger cette vidéo.

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Discussion

Ce protocole a démontré la formation et la dissolution de condensats sur des télomères avec un système de dimérisation chimique. La cinétique de la séparation de phase et du regroupement des télomères induit par la fusion de gouttelettes est surveillée par imagerie en direct. La localisation et la composition des condensats sont déterminées avec l’ADN FISH et la protéine IF.

Ce protocole présente deux étapes critiques. La première consiste à déterminer la concentration en protéines et en dimérisants. Le succès de l’induction de la séparation de phase locale à un locus génomique repose sur l’augmentation de la concentration locale de la protéine de séparation de phase au-dessus de la concentration critique pour la séparation de phase (Graphique 1B). La concentration globale de la protéine de séparation de phase doit être suffisamment élevée pour qu’il y ait suffisamment de protéines pour être concentrées localement. La concentration de la protéine de séparation de phase ne peut pas être trop élevée, de sorte que la séparation globale de phase s’est produite ou peut être facilement induite.  La longueur de l’ADN d’ancrage (ou la taille de la chromatine modifiée à laquelle la protéine d’ancrage se lie) et la concentration de la protéine d’ancrage fusionnée au halo déterminent la taille du centre de nucléation à l’efficacité maximale de dimérisation. Plus la taille de l’ancre est grande, plus il est facile de nucléer les condensats. L’efficacité de dimérisation est affectée par la quantité de dimériseurs par rapport à la quantité de protéines d’ancrage. Trop peu de dimériseurs ne peuvent pas occuper toutes les protéines d’ancrage disponibles tandis que trop de dimériseurs entraînent une liaison non productive de l’eDHFR aux dimériseurs en excès plutôt qu’à ceux de la protéine d’ancrage. La concentration du dimériseur, ainsi que la longueur de l’ADN d’ancrage et la concentration de la protéine d’ancrage fusionnée halo, peuvent être utilisées pour déterminer la concentration critique requise pour la séparation de phase locale. Une approche systématique pour faire varier ces paramètres (longueur de l’ADN d’ancrage, concentration de protéines d’ancrage, concentration de protéines de séparation de phase et concentration de dimériseur) peut être utilisée pour cartographier un diagramme de phase multidimensionnel. Cependant, si l’intérêt n’est pas de cartographier le diagramme de phase mais de former des condensats associés à la chromatine comme démontré ici, il est très facile de choisir simplement des cellules avec un signal Halo-GFP lumineux (taille d’ancrage plus grande) et des cellules avec une large plage de luminosité pour mCherry-eDHFR (concentration de protéines séparant différentes phases) à imager avec la concentration de dimériseur pour une dimérisation maximale déterminée dans le protocole 2.3. La deuxième étape critique consiste à éviter le photobleaching en imagerie en direct. Contrairement à la séparation globale des phases où des gouttelettes (foyers mCherry brillants marquant la protéine de séparation de phase) émergeront après la séparation de phase, la condensation locale aux emplacements génomiques ne peut pas être facilement repérée en jugeant de la présence de foyers mCherry. En effet, le recrutement de la protéine seule, sans séparation de phase, dans les loci génomiques entraînera la formation de foyers locaux mCherry. La séparation de phase se produit après le recrutement, de sorte que les foyers continuent de devenir plus grands et plus lumineux après le recrutement initial. L’enrichissement induit par la séparation de phase peut également se produire dans le canal GFP (la protéine d’ancrage), en raison de la dimérisation de la protéine d’ancrage à la protéine de séparation de phase. Par conséquent, le changement des propriétés physiques (taille et intensité) des foyers au fil du temps plutôt que la présence de foyers devrait être utilisé pour juger de la séparation des phases. Bien qu’il puisse être difficile de différencier la dimérisation ou l’enrichissement induit par la séparation de phase des foyers mCherry (protéine de proie), l’enrichissement des foyers GFP (protéine d’ancrage) ne se produit que s’il y a séparation de phase (Figure 3D). Par conséquent, l’enrichissement de la protéine d’ancrage peut être utilisé pour juger facilement de la séparation de phase. Le photobleachage résultant d’une puissance laser élevée ou d’un long temps d’exposition pendant l’imagerie rend plus difficile de juger de la séparation de phase de l’imagerie en direct et doit donc être évité autant que possible en ajustant les conditions d’imagerie. Notez que les augmentations de l’intensité et de la taille des foyers au fil du temps sont des caractéristiques du LLPS, mais ne peuvent pas être utilisées comme seule preuve pour LLPS. Dans le cas présenté ici, la fusion de gouttelettes a été utilisée comme preuve de la formation de gouttelettes liquides, ce qui peut ne pas se produire pour un plus petit nombre d’ancres ou moins d’ancres mobiles. Sans fusion de gouttelettes, d’autres méthodes telles que la diffusion des composants du condensat et la sensibilité à la perturbation des petites molécules peuvent être utilisées pour confirmer davantage la formation de condensats.8,9,11.

Bien que ce système de dimérisation chimique rende la résolution temporelle nécessaire à la surveillance de la séparation de phase dans les cellules vivantes, il manque de résolution spatiale au niveau cellulaire et subcellulaire. Grâce à la conception modulaire des dimériseurs, il est possible de fabriquer des dimériseurs sensibles à la lumière en attachant un photocage à TMP, rendant l’éditeur de liens photosensible ou les deux12,32,35. En changeant simplement les dimériseurs dans le même fond de cellule d’ingénierie pour différentes applications, un contrôle spatial et temporel élevé de la dimérisation, de l’inversion de la dimérisation, ou les deux avec la lumière peut être obtenu. Nous envisageons qu’avec ces dimériseurs sensibles à la lumière, il sera capable de contrôler la séparation de phase avec une grande précision spatiale et temporelle. Par rapport aux outils optogénétiques disponibles pour contrôler la séparation de phase à travers des protéines sensibles à la lumière36,37, un inconvénient du système de dimérisation chimique est qu’il ne peut inverser la séparation de phase qu’une seule fois. Cependant, ce système peut maintenir un recrutement soutenu et donc une séparation de phase sans lumière, ce qui le rend plus adapté aux applications d’imagerie en direct à long terme telles que le suivi de la croissance des gouttelettes ou des conséquences cellulaires de la séparation de phase. En outre, la capacité de traiter une population de cellules sans lumière le rend pratique pour les essais biochimiques tels que ceux nécessaires pour déterminer la composition du condensat ou les changements dans l’organisation du génome.

Cette méthode peut être facilement adaptée pour induire des condensats à d’autres endroits du génome. On peut simplement identifier une protéine qui se lie à l’emplacement génomique d’intérêt et la fusionner à Halo pour l’utiliser comme ancre(Figure 1B). Alternativement, on peut combiner cela avec CRISPR et fusionner dCas9 à Halo et utiliser des ARN guides pour ancrer Halo aux loci génomiques d’intérêt38. De plus, on peut ancrer Halo à un réseau d’ADN ectopique (par exemple LacO) intégré dans le génome en fusionnant Halo à la protéine de ciblage (par exemple LacI). On peut ensuite utiliser une approche ascendante pour évaluer la capacité d’une protéine à se séparer localement sur la chromatine, comment sa capacité de séparation de phase est affectée par les troncations de protéines, les mutations ou les modifications post-traductionnelles, ou comment le condensat affecte les fonctions locales telles que la modification, la réplication ou la transcription de la chromatine. Pour résumer, ce système de dimérisation chimique peut être utilisé pour induire une large gamme de condensats sur divers emplacements de chromatine et est particulièrement adapté pour étudier comment les propriétés des matériaux et la composition chimique des condensats associés à la chromatine contribuent aux fonctions de la chromatine en combinant l’imagerie en direct à long terme avec des essais biochimiques.

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Disclosures

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgments

Ce travail a été soutenu par les National Institutes of Health des États-Unis (1K22CA23763201 à H.Z., GM118510 à D.M.C.) et la fondation Charles E. Kaufman à H.Z. Les auteurs tiennent à remercier Jason Tones d’avoir relu le manuscrit.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.25% Trypsin, 0.1% EDTA in HBSS w/o Calcium, Magnesium and Sodium Bicarbonate Corning MT25053CI
16% Formaldehyde (w/v), Methanol-free Thermo Scientific 28906 Prepare 1% in 1x PBS
6 Well Culture Plate VWR 10861-554
Aluminum Foil Fisher Scientific 01-213-101
Anti-mCherry antibody Abcam Ab183628
Anti-PML antibody Santa Cruz sc966
Anti-SUMO1 antibody Abcam Ab32058
Anti-SUMO2/3 antibody Cytoskeleton Asm23
Blocking Reagent Roche 11096176001
Bovine Serum Albumin (BSA) Fisher Scientific BP9706100
BTX Tube micro 1.5ML  VWR 89511-258
Circle Cover Slips Thermo Scientific 3350
Confocal microscope  Nikon MQS31000
DAPI Fisher Scientific D1306
Dimethyl Sulphoxide  Sigma-Aldrich 472301
DMEM with L-Glutamine, 4.5g/L Glucose and Sodium Pyruvate Corning MT10017CV
EMCCD Camera iXon Life  897
Ethanol Fisher Scientific 4355221
Fetal Bovine Serum, Qualified, USDA-approved Regions Gibco A4766801
Formamide, Deionized MilliporeSigma 46-101-00ML
Goat anti-Mouse IgG (H+L), Recombinant Secondary Antibody, Alexa Fluor 647 Invitrogen A28181
Goat anti-Rabbit IgG (H+L), Recombinant Secondary Antibody, Alexa Fluor 647 Invitrogen A32733
High Precision Straight Tapered Ultra Fine Point Tweezers/Forceps Fisher Scientific 12-000-122
Laser merge module  Nikon NIIMHF47180
Leibovitz's L-15 Medium Gibco 21083027
Lipofectamine 2000 Transfection Reagent Invitrogen 11668027
Figure plotting software, MATLAB The MathWorks
Microscope Slide Box Fisher Scientific 34487
Nail Polish Fisher Scientific 50-949-071
Imaging software, NIS-Elements  Nikon
Opti-MEM Reduced Serum Media Gibco 51985091
Parafilm Bemis 13-374-12
PBS 10x, pH 7.4 Fisher Scientific 70-011-044
Penicillin-Streptomycin Solution,100X Gibco 15140122
Piezo Z-Drive  Physik Instrumente (PI) 91985
Pipet Tips VWR 10017
Plain and Frosted Clipped Corner Microscope Slides Fisher Scientific 22-037-246
Poly-D-Lysine solution Sigma-Aldrich A-003-E
Sodium Azide Fisher Scientific BP922I-500
Spinning disk Yokogawa CSU-X1
Square Cover Slips Thermo Scientific 3305
TBS 10x solution Fisher Scientific BP2471500
TelC-Alexa488 PNA Bio F1004
TMP Synthesized by Chenoweth lab Available upon request
TNH Synthesized by Chenoweth lab Available upon request
Tris Solution Fisher Scientific 92-901-00ML
Triton X-100 10% Solution MilliporeSigma 64-846-350ML Prepare 0.5% in 1x PBS
U2Os cell line From E.V. Makayev lab (Nanyang Technological University, Singapore) HTB-96
VECTASHIELD Antifade Mounting Medium Vector Laboratories NC9524612

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References

  1. Shin, Y., Brangwynne, C. P. Liquid phase condensation in cell physiology and disease. Science. 357 (6357), (2017).
  2. Banani, S. F., Lee, H. O., Hyman, A. A., Rosen, M. K. Biomolecular condensates: organizers of cellular biochemistry. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (5), 285-298 (2017).
  3. Sabari, B. R., Dall'Agnese, A., Young, R. A. Biomolecular condensates in the nucleus. Trends in Biochemical Sciences. , 1-17 (2020).
  4. Strom, A. R., et al. Phase separation drives heterochromatin domain formation. Nature. 547 (7662), 241-245 (2017).
  5. Larson, A. G., et al. Liquid droplet formation by HP1α suggests a role for phase separation in heterochromatin. Nature. 547 (7662), 236-240 (2017).
  6. Boija, A., et al. Transcription factors activate genes through the phase-separation capacity of their activation domains. Cell. 175 (7), 1842-1855 (2018).
  7. Hur, W., et al. CDK-Regulated phase separation seeded by histone genes ensures precise growth and function of histone locus bodies. Developmental Cell. 54 (3), 379-394 (2020).
  8. McSwiggen, D. T., Mir, M., Darzacq, X., Tjian, R. Evaluating phase separation in live cells: diagnosis, caveats, and functional consequences. Genes & Development. 33 (23-24), 1619-1634 (2019).
  9. Peng, A., Weber, S. C. Evidence for and against liquid-liquid phase separation in the nucleus. Non-coding RNA. 5 (4), (2019).
  10. Erdel, F., et al. Mouse heterochromatin adopts digital compaction states without showing hallmarks of HP1-driven liquid-liquid phase separation. Molecular Cell. 78 (2), 236-249 (2020).
  11. Zhang, H., et al. Nuclear body phase separation drives telomere clustering in ALT cancer cells. Molecular Biology of the Cell. 31 (18), 2048-2056 (2020).
  12. Ballister, E. R., Aonbangkhen, C., Mayo, A. M., Lampson, M. A., Chenoweth, D. M. Localized light-induced protein dimerization in living cells using a photocaged dimerizer. Nature Communications. 5, 1-9 (2014).
  13. Yeager, T. R., et al. Telomerase-negative immortalized human cells contain a novel type of promyelocytic leukemia (PML) body. Cancer Research. 59 (17), 4175-4179 (1999).
  14. Zhang, J. M., Zou, L. Alternative lengthening of telomeres: From molecular mechanisms to therapeutic outlooks. Cell and Bioscience. 10 (1), 1-9 (2020).
  15. Corpet, A., et al. PML nuclear bodies and chromatin dynamics: catch me if you can. Nucleic Acids Research. , 1-23 (2020).
  16. Li, Y., Ma, X., Wu, W., Chen, Z., Meng, G. PML nuclear body biogenesis, carcinogenesis, and targeted therapy. Trends in Cancer. 6 (10), 889-906 (2020).
  17. Dilley, R. L., Greenberg, R. A. ALTernative telomere maintenance and cancer. Trends in Cancer. 1 (2), 145-156 (2015).
  18. Sobinoff, A. P., Pickett, H. A. Alternative lengthening of telomeres: DNA repair pathways converge. Trends in Genetics. 33 (12), 921-932 (2017).
  19. Draskovic, I., et al. Probing PML body function in ALT cells reveals spatiotemporal requirements for telomere recombination. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (37), 15726 (2009).
  20. Zhang, J. M., Yadav, T., Ouyang, J., Lan, L., Zou, L. Alternative lengthening of telomeres through two distinct break-induced replication pathways. Cell Reports. 26 (4), 955-968 (2019).
  21. Loe, T. K., et al. Telomere length heterogeneity in ALT cells is maintained by PML-dependent localization of the BTR complex to telomeres. Genes and Development. 34 (9-10), 650-662 (2020).
  22. Potts, P. R., Yu, H. The SMC5/6 complex maintains telomere length in ALT cancer cells through SUMOylation of telomere-binding proteins. Nature Structural and Molecular Biology. 14 (7), 581-590 (2007).
  23. Chung, I., Leonhardt, H., Rippe, K. De novo assembly of a PML nuclear subcompartment occurs through multiple pathways and induces telomere elongation. Journal of Cell Science. 124 (21), 3603-3618 (2011).
  24. Shen, T. H., Lin, H. K., Scaglioni, P. P., Yung, T. M., Pandolfi, P. P. The mechanisms of PML-nuclear body formation. Molecular Cell. 24 (3), 331-339 (2006).
  25. Shima, H., et al. Activation of the SUMO modification system is required for the accumulation of RAD51 at sites of DNA damage. Journal of Cell Science. 126 (22), 5284-5292 (2013).
  26. Yalçin, Z., Selenz, C., Jacobs, J. J. L. Ubiquitination and SUMOylation in telomere maintenance and dysfunction. Frontiers in Genetics. 8, 1-15 (2017).
  27. Sarangi, P., Zhao, X. SUMO-mediated regulation of DNA damage repair and responses. Trends in Biochemical Sciences. 40 (4), 233-242 (2015).
  28. Banani, S. F., et al. Compositional control of phase-separated cellular bodies. Cell. 166 (3), 651-663 (2016).
  29. Min, J., Wright, W. E., Shay, J. W. Clustered telomeres in phase-separated nuclear condensates engage mitotic DNA synthesis through BLM and RAD52. Genes and Development. 33 (13-14), 814-827 (2019).
  30. Song, J., Durrin, L. K., Wilkinson, T. A., Krontiris, T. G., Chen, Y. Identification of a SUMO-binding motif that recognizes SUMO-modified proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (40), 14373-14378 (2004).
  31. Zhang, H., Chenoweth, D. M., Lampson, M. A. Chapter 7 - Optogenetic control of mitosis with photocaged chemical dimerizers. Mitosis and Meiosis Part A. 144, 157-164 (2018).
  32. Zhang, H., et al. Optogenetic control of kinetochore function. Nature Chemical Biology. 13 (10), 1096-1101 (2017).
  33. Cho, N. W., Dilley, R. L., Lampson, M. A., Greenberg, R. A. Interchromosomal homology searches drive directional ALT telomere movement and synapsis. Cell. 159 (1), 108-121 (2014).
  34. Dilley, R. L., et al. Break-induced telomere synthesis underlies alternative telomere maintenance. Nature. 539 (7627), 54-58 (2016).
  35. Aonbangkhen, C., Zhang, H., Wu, D. Z., Lampson, M. A., Chenoweth, D. M. Reversible control of protein localization in living cells using a photocaged-photocleavable chemical dimerizer. Journal of the American Chemical Society. 140 (38), 11926-11930 (2018).
  36. Shin, Y., et al. Spatiotemporal control of intracellular phase transitions using light-activated optoDroplets. Cell. 168 (1-2), 159-171 (2017).
  37. Shin, Y., et al. Liquid nuclear condensates mechanically sense and restructure the genome. Cell. 175 (6), 1481-1491 (2018).
  38. Xiang, X., et al. CRISPR/Cas9-mediated gene tagging: a step-by-step protocol. Methods in Molecular Biology. 1961, 255-269 (2019).

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Condensats de protéines induits par dimérisation chimique sur les télomères
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