Summary
Detta protokoll illustrerar ett kemiskt inducerat protein dimerization system för att skapa kondensat på kromatin. Bildandet av promyelocytic leukemi (PML) nukleära organ på telomerer med kemiska dimerizers visas. Dropptillväxt, upplösning, lokalisering och sammansättning övervakas med levande celltomografi, immunofluorescens (IF) och fluorescens in situ hybridisering (FISH).
Abstract
Kromatin-associerade kondensat är inblandade i många kärntekniska processer, men de underliggande mekanismerna förblir svårfångade. Detta protokoll beskriver ett kemiskt inducerad protein dimerization system för att skapa kondensat på telomerer. Den kemiska dimerizern består av två länkade ligands som var och en kan binda till ett protein: Halo ligand till Halo-enzym och trimethoprim (TMP) till E. coli dihydrofolate reduktas (eDHFR), respektive. Fusion av Halo enzym till en telomere protein ankar dimerizers till telomerer genom kovavalent Halo ligand-enzymbindning. Bindning av TMP till eDHFR rekryterar eDHFR-smält fas som separerar proteiner till telomerer och inducerar kondensatbildning. Eftersom TMP-eDHFR-interaktionen inte är kovavalent kan kondensen vändas genom att använda överskottsfri TMP för att konkurrera med dimerizern för eDHFR-bindning. Ett exempel på inducera promyelocytic leukemi (PML) nukleära organ bildas på telomerer och bestämma kondensat tillväxt, upplösning, lokalisering och sammansättning visas. Denna metod kan enkelt anpassas för att inducera kondensat på andra genomiska platser genom att integrera Halo till ett protein som direkt binder till det lokala kromatinet eller dCas9 som är riktat mot den genomiska locusen med en guide RNA. Genom att erbjuda den tidsmässiga upplösning som krävs för levande avbildning med en cell samtidigt som fasseparation bibehålls i en population av celler för biokemiska analyser, är denna metod lämplig för att probing både bildandet och funktionen av kromatin-associerade kondensat.
Introduction
Många proteiner och nukleinsyror genomgår vätske-flytande fasseparation (LLPS) och självmonteras i biomolekylära kondensat för att organisera biokemi icellerna 1,2. LLPS av kromatinbindande proteiner leder till bildandet av kondensater som är associerade med specifika genomiska lokus och är inblandade i olika lokala kromatinfunktioner3. Till exempel ligger LLPS av HP1-protein bakom bildandet av heterochromatindomäner för att organiseragenomet 4,5,LLPS av transkriptionsfaktorer bildar transkriptionscentra för att reglera transkription6,LLPS av gryende mRNAs och multikönat kammarprotein genererar histonlocuskroppar för att reglera transkription och bearbetning av histonmRNAs7. Men trots många exempel på kromatin-associerade kondensat upptäcks, de underliggande mekanismerna för kondensatbildning, reglering och funktion förblir dåligt förstådda. I synnerhet bildas inte alla kromatinrelaterade kondensat genom LLPS och noggranna utvärderingar av kondensatbildning i levande celler behövs fortfarande8,9. Till exempel, HP1 protein i musen visas ha endast en svag kapacitet att bilda flytande droppar i levande celler och heterochromatin högborgar beter sig som kollapsade polymerglobobuler10. Därför är verktyg för att inducera de novokondensat på kromatin i levande celler önskvärda, särskilt de som tillåter användning av levande avbildning och biokemiska analyser för att övervaka kinetiken av kondensatbildning, de fysiska och kemiska egenskaperna hos de resulterande kondensaterna och de cellulära konsekvenserna av kondensatbildning.
Detta protokoll rapporterar ett kemiskt dimeriseringssystem för att inducera proteinkondensat påkromatin 11 (figur 1A). Dimerizern består av två sammankopplade protein-interagerande ligands: trimethoprim (TMP) och Halo ligand och kan dimerize proteiner smälta till cognate receptorer: Escherichia coli dihydrofolate reduktas (eDHFR) och en bakteriell alkyldehalogenase enzym (Halo enzym),respektive 12. Interaktionen mellan Halo ligand och Halo-enzymet är kovam, vilket gör att Halo-enzymet kan användas som ankare genom att smälta det till ett kromatinbindande protein för att rekrytera ett fasavskiljande protein som smälts till eDHFR till kromatin. Efter den första rekryteringen passerar den ökade lokala koncentrationen av fasavskiljande protein den kritiska koncentration som behövs för fasseparation och kärnar därmed ett kondensat vid ankaret (figur 1B). Genom att fusing fluorescerande proteiner (t.ex. mCherry och eGFP) till eDHFR och Halo, nukleation och tillväxt av kondensat kan visualiseras i realtid med fluorescensmikroskopi. Eftersom interaktionen mellan eDHFR och TMP inte är kovam, kan överskottsfri TMP läggas till för att konkurrera med dimerizer för eDHFR-bindning. Detta frigör sedan fasseparationsproteinet från ankaret och löser upp det kromatinrelaterade kondensatet.
Vi använde detta verktyg för att inducera de novo promyelocytic leukemi (PML) nukleära organ bildas på telomerer i telomerasnegativa cancerceller som använder en alternativ förlängning av telomerer (ALT) väg för telomer underhåll13,14. PML-kärn- förkroppsligar är membran-mindre fack som är involverade i många kärn-bearbetar 15,16 och lokaliseras unikt till ALT telomeres för att bilda APBs, för ALT telomere-tillhörande PMLförkroppsligar 17,18. Telomerer kluster inom APB, förmodligen för att tillhandahålla reparation mallar för homology-riktade telomer DNA syntes i ALT19. Faktum är att telomer-DNA-syntes har upptäckts i APB och API: er spelar viktiga roller för att berika DNA-reparationsfaktorer på telomerer20,21. Mekanismerna bakom APB-sammansättning och telomerkluster inom API: er var dock okända. Eftersom telomerproteiner i ALT-celler är unikt modifierade av små ubiquitinliknande modifierare (SUMOs)22, innehåller många APB-komponenter sumoyleringsplatser 22,23,24,25 och / eller SUMO-interagerande motiv (SIMs)26,27 och SUMO-SIM interaktioner driver fasseparation28, vi antog att sumoylering på telomerer leder till berikning av SUMO / SIM som innehåller proteiner och SUMO-SIM-interaktioner mellan dessa proteiner leder till fasseparation. PML-protein, som har tre sumoyleringsplatser och en SIM-plats, kan rekryteras till sumoylaterade telomerer för att bilda APB och sammanförande av flytande APB leder till telomerkluster. För att testa denna hypotes använde vi det kemiska dimeriseringssystemet för att efterlikna sumoylering-inducerad EFTERKLÄDselbildning genom att rekrytera SIM till telomerer (Figur 2A)11. GFP är sammansmält till Haloenzyme för visualisering och till det telomerbindande proteinet TRF1 för att förankra dimerizern till telomerer. SIM-kortet är sammansmält till eDHFR och mCherry. Kinetik av kondensat bildas och dropp fusion-inducerad telomer kluster följs med levande cell imaging. Fasseparationen vänds genom att lägga till överflödig fri TMP för att konkurrera med eDHFR-bindning. Immunofluorescens (IF) och fluorescens in situ hybridisering (FISH) används för att bestämma kondensat sammansättning och telomeric associering. Rekrytering av SIM berikar SUMO på telomerer och de inducerade kondensaterna innehåller PML och är därför APB. Att rekrytera en SIM-mutant som inte kan interagera med SUMO berikar inte SUMO på telomerer eller inducerar fasseparation, vilket indikerar att den grundläggande drivkraften för APB-kondensation är SUMO-SIM-interaktion. Med denna iakttagelse kan polySUMO-polySIM-polymerer som smälts till en TRF2-bindningsfaktor RAP1 också inducera APB-formation29. Jämfört med polySUMO-polySIM fusionssystemet där fasseparation sker så länge tillräckligt med proteiner produceras, inducerar den kemiska dimeriseringsmetoden som presenteras här fasseparation på begäran och erbjuder därmed bättre temporal upplösning för att övervaka kinetiken för fasseparation och telomerklusterningsprocess. Dessutom tillåter detta kemiska dimeriseringssystem rekrytering av andra proteiner för att bedöma deras förmåga att inducera fasseparation och telomerkluster. Till exempel kan ett oordnat protein som rekryteras till telomerer också bilda droppar och kluster telomerer utan att inducera APB-bildning, vilket tyder på att telomerkluster är oberoende av APB-kemi och förlitar sig bara på APB flytande egendom11.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Produktion av tillfälliga cellinjer
- Kultur U2OS acceptorceller på 22 x 22 mm glaskåpor (för levande avbildning) eller cirkulära täcklips med diametern 12 mm (för IF eller FISH) belagda med poly-D-lysin i 6-brunnsplatta med tillväxtmedium (10% fetala nötkreatursserum och 1% Penicillin-Streptomycinlösning i DMEM) tills de når 60-70% beredskap.
- Ersätt tillväxtmedium med 1 ml transfektmedium (tillväxtmedium utan Penicillin-Streptomycin-lösning) före transfektion.
- För varje transfection brunn, tillsätt 4 μL transfection reagens till 150 μL reducerat serummedium, virvel i 10 sekunder och inkubera sedan i 5 minuter.
- För varje brunn, lägg till Halo-konstruktionsplasmid (Halo-GFP-TRF1 eller Halo-TRF1) och eDHFR-konstruktionsplasmid (mCherry-eDHFR-SIM eller mCherry-eDHFR-SIM-mutant) vid ett 1:1-massförhållande (0,5 μg Halo-konstruktionsplasmid med 0,5 μg eFR-konstruktionsplasmid) till 150 μL reducerat serummedium, droppevis, blanda genom pipettning.
OBS: Taggarna är relativt små (Halo 33 kD, eDHFR 28 kD, mCherry 30 kD, eGFP 27 kD) och ingen effekt på fasseparation observerades. Men med hjälp av mutanter som SIM-mutant som används här för att se till att fas beteendet är känsligt för mutationerna rekommenderas inte taggarna. SIM är från PIASx28,30. SIM-sekvensen är AAAGTCGATGTAATTGACTTAACGATCGAATCTAGCAGCGATGAAGAAGATCCACCGGCTAACGT. SIM-mutant genereras genom mutering av SIM-aminosyror VIDL till VADA28, och sekvensen är AAAGTCGATGTAGGACGCCACGATCGAATCTAGCAGCGATGAAGAAGAAGATCCACCGGCTAACGT. Vi deponerade våra plasmider för att addgene: #164644 3XHalo-GFP-TRF1; #164646 mCherry-eDHFR-SIM; #164649 mCherry-eDHFR-SIM mutant. - Tillsätt 150 μL transfection reagens -reducerad serummedieblandning till 150 μL reducerat serummedium med DNA, dropwise, blanda genom pipetting, inkubera i 5 minuter.
- Tillsätt 300 μL transfection reagens-DNA-blandning till celler, droppe och placera sedan cellerna tillbaka till inkubatorn.
- Vänta 24-48 timmar före live imaging, immunofluorescens (IF) eller fluorescens in situ hybridization (FISH).
2. Dimerisering på telomerer
- Lös dimerizers i dimetylsulfoxid vid 10 mM och förvara i mikrocentrifugrör av plast vid −80 °C för långtidslagring.
OBS: Istället för att använda dimerizer med TMP direkt kopplad till Halo (TMP-Halo, TH), dimerizer TMP-NVOC-Halo (TNH) som har en ljuskänslig linker, används 6-nitroveratryl oxykarbonyl (NVOC), mellan TMP och Haloligand31. Detta beror på att det tar mindre tid för TNH (~ 5 minuter) att sprida sig till cellen än TH (~ 20 minuter). Resultat som visas här kan också erhållas med TH. När du använder TNH, var försiktig så att dimerizern inte exponeras för ljus för att undvika NOVC-klyvning. Hantera TNH i ett mörkt rum med en dim rödljuslampa, förvara dimerizern i bärnstensfärgade plaströr och linda behållaren som innehåller TNH eller behandlade celler med aluminiumfolie. Imaging TNH med DIC är säkert. - Ta en alikvot på 10 mM dimerizer från −80 °C och späd i bildmedium till en lagerkoncentration på 10 μM och förvara vid −20 °C.
- När dimerizers är klara att användas, späd dimerizers från 10 μM stamlösning till en slutlig arbetskoncentration på 100 nM i tillväxtmedium (för fast avbildning) eller bildmedium. Behandla celler med 100 nM dimerizers (slutlig koncentration) på scenen för levande avbildning eller inkubera i 4-5 timmar för immunofluorescens (IF) och fluorescens in situ hybridisering (FISH).
OBS: Koncentrationen av dimerizers som används påverkar dimeriseringseffektiviteten och därmed fasseparationen. Dimerizerkoncentrationen som möjliggör maximal dimeriseringseffektivitet beror på celltyp och ankarproteinkoncentration, så det måste bestämmas för olika experiment. Ett enkelt sätt är att inkubera celler som uttrycker ankarproteinet och mCherry-eDHFR (utan att smälta till fasen som separerar protein eller smälts till en icke-fas som separerar mutant) och identifiera dimerizerkoncentrationen vid vilken den högsta mCherry-intensiteten vid ankaret uppnås. Ett mer systematiskt tillvägagångssätt är att inkubera celler som uttrycker ankaret endast med olika koncentrationer av dimerizers och sedan med ett Halo-bindningsfärgämne för att bestämma dimerizerkoncentrationen vid vilken Halo-bindningsfärgningsintensiteten börjar platå (dvs. alla Halo-smälta ankare upptas av dimerizern och inget mer kvar för Halo-bindningsfärgämnet)32. - För att vända dimeriseringen, inkubera celler med dimerizers i 2-5 timmar (med eller utan levande avbildning) eller tills önskad droppstorlek uppnås och tillsätt 100 μM fri TMP (slutlig koncentration) utspädd i bildmedium till celler.
3. Immunofluorescens (IF)
- Frö 105 celler på cirkulära täckglas med 12 mm diameter belagda med poly-D-lysin i 6-brunnsplatta. Transfektera sedan de två plasmiderna (Halo-GFP-TRF1 med mCherry-eDHFR-SIM eller mCherry-eDHFR-SIM mutant) och vänta i 24-48 timmar innan du fortsätter till immunofluorescens.
OBS: Vänta mer än en dag efter transfection kan få högre uttryck. - Späd dimerizers med tillväxtmedium för att nå en slutlig koncentration på 100 nM, tillsätt utspädda dimerizers till celler och inkubera vid 37 °C i 4-5 timmar.
OBS: Fasseparation induceras snabbt efter tillsats av dimerizers (< 30 minuter). Längre inkubation hjälper droppar att grovna till större storlekar. Efter dropptillväxt med live-avbildning kan användas för att bestämma hur lång tid det tar för droppar att nå önskat tillstånd. - Fixera celler i PBS-lösning som innehåller 4% formaldehyd och 0,1% Triton X-100 i 10 minuter vid rumstemperatur för att permeabilisera celler. Tvätta celler 3 gånger med PBS.
OBS: Efter detta steg kan den pausas och celler kan förvaras vid 4 °C i upp till en vecka.
Varning: Formaldehyd är skadlig vid inandning och vid förtäring irriterar det också ögon, andningsorgan och hud och är en möjlig cancerrisk. Behöver bära personlig skyddsutrustning, använd endast i en kemisk rökhuv. Lägg den också i en avfallsbehållare efter användning, kassera den inte i diskbänken. - Tvätta täcken två gånger med 50 μL TBS-Tx och en gång med 50 μL antikroppsutspädningsbuffert (AbDil). TBS-Tx tillverkades av TBS, 0,1% Triton X-100 och 0,05% Na-azide. AbDil tillverkades av TBS-Tx, 2% BSA och 0,05% Na-azide.
- Inkubera varje locklip med 50 μL primärt anti-PML (1:50 utspädning i AbDil) / anti-SUMO1 (1:200 utspädning i AbDil) / anti-SUMO2/3 antikropp (1:200 utspädning i AbDil) vid 4 °C i en fuktad kammare över natten. mCherry antikropp kan också användas (1:200 utspädning i AbDil) för att upptäcka mCherry signal för FISH.
OBS: FISK släcker mCherry fluorescerande signal, vilket gör det svårt att skilja celler som transfecteras med mCherry plasmider från de som inte transfecteras i FISK experiment. Användning av mCherry antikropp rekommenderas. Alternativt kan man göra en stabil cellinje som uttrycker eDHFR som innehåller protein. - Tvätta täcken 3 gånger med AbDil för att ta bort obunden primär antikropp.
- Inkubera celler med sekundär antikropp [antimus IgG (H+L) sekundär antikropp konjugerad med Alexa Fluor 647 för PML och SUMO, anti-rabbit IgG (H +L) sekundär antikropp konjugerad med Alexa Fluor 555 för mCherry, båda vid 1:1000 utspädning i AbDil] i 1 timme i mörk låda vid rumstemperatur.
- Tvätta täcken 3 gånger med TBS-Tx.
- Etikettbilder, späd DAPI i monteringsmedier för att nå DAPI slutlig koncentration på 1 μg/ml. Lägg sedan 2 μL utspädd DAPI på bilden. Vänd täckena över och placera dem på DAPI-droppe, aspirera extra vätska från kanten av täckglaset.
- Försegla med nagellack, låt det torka och skölj från toppen av täcket med vatten. Spara i frysen för avbildning.
4. Fluorescens in situ hybridisering (FISH)
- Frö 105 celler på cirkulära täckglas med 12 mm diameter belagda med poly-D-lysin i 6-brunnsplatta. Transfektera celler med Halo-TRF1 och mCherry-eDHFR-SIM eller mCherry-eDHFR-SIM mutantplasmider och vänta i 24-48 h innan du fortsätter till FISH. Dimeriseringssteget är detsamma som beskrivs i 3.2.
OBS: Här är TRF1 inte smält med GFP så den gröna kanalen frigörs för telomer DNA-sond. - Fixera celler med 4% formaldehyd i 10 minuter vid rumstemperatur och tvätta 4 gånger med PBS. För IF-FISH, fortsätt till IF-protokollet härifrån och efter tvättning av sekundär antikropp i IF (3.8), refixceller med 4% formaldehyd i 10 minuter vid rumstemperatur och tvätta tre gånger med PBS.
- Dehydrera täcken i en etanolserie (70%, 80%, 90%, 2 min vardera).
- Inkubera täcken med 488-telC PNA-sond (1:2000-förhållande) i 5 μL hybridiseringslösning vid 75 °C i 5 minuter. Hybridiseringslösning innehåller 70% avjoniserad formamid, 10 mM Tris (pH 7,4), 0,5% blockerande reagens. Inkubera sedan över natten i en fuktad kammare vid rumstemperatur.
- Tvätta täcken med tvättbuffert (70% formamid, 10 mM Tris) 2 minuter i 3 gånger vid rumstemperatur och montera med 1 μg/mL DAPI i monteringsmedia för avbildning.
FISH-protokollet är ett publicerat protokoll33'34.
5. Live-bildbehandling
- När cellerna är klara för avbildning, montera täcken i magnetiska kammare med celler som hålls i 1 ml bildmedium utan fenolrött på en uppvärmd scen i en miljökammare.
- Ställ in mikroskop- och miljökontrollapparater. Bilder förvärvades med ett snurrande diskkonfokalt mikroskop med en 100x 1,4 NA-mål, en Piezo Z-Drive, en elektron multiplicera laddningskopplingskamera (EMCCD) och en laserkopplingsmodul utrustad med 455, 488, 561, 594 och 647 nm lasrar som styrs av bildprogramvara. Utgångskrafterna för alla lasrar är 20 mW uppmätta vid fiberns ände.
- Lokalisera celler med ljus GFP-signal på telomerer och diffusivt lokaliserad mCherry-signal i nukleoplasman. Hitta ett 20-tal celler, memorera varje position med x, y, z-information och ställ in parametrar för time lapse imaging med 0,5 μm avstånd för totalt 8 μm i Z och 5 minuters tidsintervall i 2-4 timmar för både GFP- och mCherry-kanaler. Använd 30% av 594 nm och 50% av 488 nm effektintensitet, med exponeringstider på 200 ms och kameraökning 300.
OBS: Laserenheters uteffekt är 20 mW. Ljus GFP-högborg indikerar större ankarstorlek som lättare kan kärna upp kondensat. Hitta celler med ett brett spektrum av mCherry-signal eftersom fasseparation beror på SIM-koncentrationen i cellen. Celler med för svag eller för ljus mCherry-signal kanske inte fasar separeras. Använd inte för mycket laserkraft eller för lång exponeringstid för att undvika fotografering. - Starta avbildningen och ta engångsslingan som förde dimerisering. Pausa avbildningen, tillsätt 0,5 ml bildmedier som innehåller 15 μL 10 μM dimerizer till bildkammaren på scenen så att den slutliga dimerizerkoncentrationen är 100 nM. Återuppta avbildningen.
- När du är redo att vända dimeriseringen, pausa avbildningen, tillsätt 0,5 ml bildmedier som innehåller 2 μL 100 mM lager TMP till bildkammaren på scenen för att få 100 μM TMP slutlig koncentration. Fortsätt avbildningsceller i 1-2 timmar.
6. Fast bildbehandling
- Samma mikroskop som ställts in som live-avbildning, scenvärme behövs inte. Använd 488 nm för att avbilda telomerFISK, 561 nm för mCherry IF och 647 nm för PML eller SUMO IF.
OBS: Om du inte använder en mCherry antikropp, bara direkt bild mCherry protein men signalera kanske dim på grund av släckning i FISK. Använd fortfarande 561 nm istället för 594 nm laser för att avbilda mCherry för att undvika signalavluftning av Cy5 till mCherry. - Leta reda på cirka 30-50 celler med röd signal (mCherry eller mCherry IF) för att välja för transfekterade celler.
- Bilderna togs med 0,3 μm avstånd för totalt 8 μm i Z för att samla in fler signaler. Använd 80% av 647 nm, 80% av 561 nm och 70% av 488 nm effektintensitet, med exponeringstider på 600 ms och kameraökning 300.
7. Bearbeta timelapse-bilder
- Definiera binär för telomerer
Välj en cell med all tid och z-stackinformation, välj bara GFP-kanalen och skapa ett binärt lager genom att definiera tröskelvärdet. Justera tröskelvärdets nedre och övre värden och använd funktioner som "Jämn", "Rengör" och "Fyll hål" för att se hur väl tröskeln plockar upp önskade objekt genom alla tidpunkter. - Subtrahera bakgrund
Välj alla kanaler, rita rektangelområdet av intresse (ROI) på bakgrunden (bortsett från cellen). Definiera denna ROI som bakgrund och subtrahera sedan bakgrundsintensiteten. - Länka telomer binär till telomerintensitet
Välj telomer binär och länka den till GFP-kanalen för beräkning av GFP-intensitet i binära objekt som telomerintensitet. - Beräkna telomernummer och intensitet över tid
Ange vilken information som ska exporteras, till exempel tid, objekt-ID, medelintensitet, summaintensitet och exportdata. Använd figurritningsprogram för att läsa den exporterade tabellen och generera siffror med telomernummer och telomerintensitet (sammanfatta intensiteten över volymen i varje telomer och sedan medelvärdet över alla telomerer i en cell) över tid.
8. Bearbeta bilder med fasta celler
- Definiera binär för APB
Välj transfekterade celler för analys genom att leta efter signal i 561nm kanal. Efter förfarandet i punkt 7.1, definiera tröskelvärdet i både GFP-kanalen (telomer-DNA FISH) och Cy5-kanalen (PML eller SUMO IF) för att generera binära för telomerer respektive PML-organ respektive SUMO. Sammanfoga binära GFP- och Cy5-lager och skapa ett nytt lager som innehåller partiklar som både har GFP- och Cy5-signal för att representera samlokalisering av PML-kropp på telomerer, alltså APB. - Beräkna APB/SUMO-tal och -intensitet
Subtrahera bildbakgrunden efter 7.2. Länka apb/SUMO binärt lager till Cy5-kanal efter 7.3. Beräkna APB/SUMO-tal och intensitet. Export- och diagramdata efter 7.4.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Representativa bilder av telomrisk lokalisering av SUMO som identifierats av telomer-DNA FISH och SUMO-protein IF visas i figur 2. Celler med SIM-rekrytering berikade SUMO1 och SUMO 2/3 på telomerer jämfört med celler med SIM-mutantrekrytering. Detta indikerar att SIM dimerization-inducerad SUMO-anrikning på telomerer beror på SUMO-SIM-interaktioner.
En representativ time lapse-film av TRF1 och SIM efter dimerisering visas i video 1. Ögonblicksbilder vid fyra tidpunkter visas i figur 3A. SIM rekryterades framgångsrikt till telomerer och både SIM- och TRF1-högborgar blev större och ljusare, vilket förutspåddes för vätskedroppar och tillväxt (figur 1B). Dessutom observerades fusion av TRF1-högborgar (figur 3B), vilket ledde till telomerkluster, vilket framgår av det minskade telomernumret(figur 3E)och ökad telomerintensitet över tiden (figur 3D). Däremot rekryterades SIM-mutant till telomerer efter dimerisering men inducerade inte någon droppbildning eller telomerkluster, eftersom telomerintensiteten inte växte och telomernumret inte minskade (Figur 3C,D,E, Video 2). Detta indikerar att fasseparation och därmed telomerkluster drivs av SUMO-SIM-interaktioner.
Återföring av fasseparation och telomerkluster efter att ha lagt till överflödig gratis TMP visas i video 3. Ögonblicksbilder vid fyra tidpunkter visas i figur 4A. Håller med om den förväntade kondensatupplösningen och avklustret av telomerer, telomernumret ökade och telomerintensiteten minskade med tiden (figur 4B,C).
Representativa bilder av APA som identifierats av telomer-DNA FISH och PML-protein IF visas i figur 5. Celler med SIM rekryterade har fler API: er än celler med SIM-mutant rekryterade, vilket tyder på att dimerisering-inducerade kondensat verkligen är API: er.
Siffrorna här visar representativa bilder. För statistisk analys med fler celler, se Zhang et. al., 202011.
Figur 1: Kemisk dimerisering för att inducera kromatinrelaterade kondensat. (A) Dimeriseringsschema: Dimerizern består av två länkade ligands, TMP och Halo som interagerar med eDHFR respektive Haloenzyme. Fasavskiljningsproteinet smälts till mCherry och eDHFR, och kromosomankarproteinet smälts till Halo och GFP. (B) Innan dimerizer (övre vänstra kärnan) tillsätts är majoriteten av kromosomankarproteiner (gröna rutor) lokaliserade till kromosomerna och en liten mängd ankarproteiner är diffust lokaliserade i nukleoplasman. Fasavskiljande proteiner som ska rekryteras (lila stjärnor) och fasavskiljande partners (proteiner som kommer att kondensera med fasen som separerar protein, röda trianglar) är diffust lokaliserade i nukleoplasman. Efter tillsats av dimerizers (övre högra kärnan) dimeriseras fasseparerande proteiner till ankarproteinet på kromosomerna och i nukleoplasman. Det kan finnas en viss överskottsfas som separerar proteiner i nukleoplasman, beroende på den relativa koncentrationen av ankarproteinet, fasavskiljande protein och dimerizern som används. Efter dimerization (nedre-höger kärnan) leder ökad lokal koncentration av fasen som separerar proteiner vid ankaret till fasseparation och bildandet av kromatinrelaterade kondensat. Fasavskiljande partners berikas vid ankaret på grund av samkondensering med eDHFR-smält fas som separerar protein. Ankarproteiner som inte är direkt bundna till kromatin kan berikas vid ankaret på grund av dimerisering till fasen som separerar protein. Efter att ha tillskring av överskottsfri TMP för att konkurrera med dimerizern för eDHFR-bindning (nedre vänstra kärnan) frigörs fasavskiljande protein från kromatin och kondensatet löses upp. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 2:SUMO berikas efter att ha rekryterat SIM till telomerer med dimerizers. (A) Dimerization schematiskt i detta experiment: SIM (eller SIM-mutant) smälts till mCherry och eDHFR, och TRF1 är smält till Halo och GFP. B)En representativ cell för telomer-DNA FISH och SUMO1 IF efter rekrytering av SIM. Botten är binärt lager som identifierar telomerer, SUMO1 och antal colocalized SUMO1 och telomer DNA-högborgar. Skalstänger: 5 μm. (C) En representativ cell för telomer DNA FISH och SUMO1 IF efter rekrytering av SIM-mutant. Längst ner finns det binära lagret av de bilder som används för att identifiera antalet colocalized SUMO1 och telomer DNA-högborgar. Skalstänger: 5 μm. (D) En representativ cell för telomer DNA FISH och SUMO2/3 IF efter rekrytering av SIM. Längst ner finns det binära skiktet som identifierar telomerer, SUMO2/3, och antalet colocalized SUMO2/3 och telomer DNA-högborgar. Skalstänger: 5 μm. (E) En representativ cell för telomer DNA FISH och SUMO2/3 IF efter rekrytering av SIM-mutant. Längst ner finns det binära lagret av de bilder som används för att identifiera antalet colocalized SUMO2/3 och telomer DNA-högborgar. Skalstänger: 5 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3:Dimeriserings-inducerad fasseparation driver telomerkluster. (A) Ögonblicksbilder av TRF1-GFP och SIM-mCherry före och efter tillsats av 100 nM dimerizer (slutlig koncentration). Längst ner finns telomer binärt lager identifieras från TRF1-GFP. Skalstänger: 5 μm. ( B )Ettfusionsevenemang efter rekrytering av SIM till telomerer. Skalstänger: 2 μm. Tidsintervall: 5 min. (C) Ögonblicksbilder av TRF1-GFP och SIM mutant-mCherry före och efter tillsats av 100 nM dimerizer (slutlig koncentration). Längst ner finns telomer binärt lager identifieras från TRF1-GFP. Skalstänger: 5 μm. (D) Genomsnittlig telomerintensitet (sammanfatta intensiteten över volymen i varje telomer och sedan medelvärdet över alla telomerer i en cell) över tid efter rekrytering av SIM (grön, för cell i figur 3A)och SIM-mutant (blå, för cell i figur 3C). (E) Telomernummer över tid efter rekrytering av SIM(grönt, för cell i figur 3A)och SIM-mutant (blå, för cell i figur 3C). Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 4:Återföring av kondens och telomerkluster. a)Ögonblicksbilder av TRF1-GFP och SIM-mCherry efter tillsats av 100 μM TMP (slutlig koncentration) till celler med kondensat som bildats i 3 timmar. Längst ner finns telomer binärt lager identifieras från TRF1-GFP. Skalstänger: 5 μm. (B) Genomsnittlig telomerintensitet (sammanfatta intensiteten över volymen i varje telomer och sedan medelvärdet över alla telomerer i en cell) över tiden för cellen i figur 4A. C)Telomernummer över tid för cell i figur 4A. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 5: Dimeriseringsinducerade kondensat ärA.( A ) En representativ cell för telomer DNA FISH och PML IF efter rekrytering av SIM. Längst ner finns det binära skiktet som identifierar telomerer, PML-kroppar och antalet colocalized PML och telomer DNA-foci, dvs. antal AFF. Skalstänger: 5 μm. (B) En representativ cell för telomer DNA FISH och PML IF efter rekrytering av SIM-mutant. Längst ner finns det binära lagret av de bilder som används för att identifiera antalet colocalized PML och telomer DNA foci, dvs. antal AFF. Skalstänger: 5 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Video 1: Rekrytering av SIM-kort med dimerizers till telomerer driver fasseparation och telomerkluster. Live-avbildning av SIM-mCherry, TRF1-GFP och sammanslagningskanaler före och efter tillsats av 100 nM dimerizer (slutlig koncentration). Skalstänger: 5 μm. Tidsintervall: 5 min. Tid som visas. Klicka här för att ladda ner den här videon.
Video 2: Rekrytering av SIM-mutant kan inte driva fasseparation och telomerkluster. Live imaging av SIM mutant-mCherry, TRF1-GFP och slå samman kanaler före och efter tillsats av 100 nM dimerizer (slutlig koncentration). Skalstänger: 5 μm. Tidsintervall: 5 min. Tid som visas. Klicka här för att ladda ner den här videon.
Video 3: Återföring av kondensation och telomerkluster. Live imaging av SIM-mCherry, TRF1-GFP och sammanfoga kanaler efter att ha lagt till 100 μM TMP (slutlig koncentration) till celler med kondensat bildas i 3 timmar. Skalstänger: 5 μm. Tidsintervall: 5 min. Tid som visas. Klicka här för att ladda ner den här videon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Detta protokoll visade bildandet och upplösningen av kondensat på telomerer med ett kemisk dimerization system. Kinetik av fas separation och droplet-fusion-inducerad telomer kluster övervakas med levande imaging. Kondensatlokalisering och sammansättning bestäms med DNA FISH och protein IF.
Det finns två kritiska steg i det här protokollet. Den första är att bestämma protein- och dimerizerkoncentrationen. Framgången med att inducera lokal fasseparation vid en genomisk locus bygger på ökningen av den lokala koncentrationen av fasen som separerar proteinet ovanför den kritiska koncentrationen för fasseparation (Figur 1B). Den globala koncentrationen av den fas som separerar protein måste vara tillräckligt hög så att det finns tillräckligt med proteiner för att koncentreras lokalt. Koncentrationen av fasavskiljande protein kan inte vara för hög så att global fasseparation har inträffat eller lätt kan induceras. Ankarets DNA-längd (eller storlek på det modifierade kromatin som ankarproteinet binder till) och koncentrationen av Halo-smält ankarprotein bestämmer storleken på nukleationscentret vid maximal dimeriseringseffektivitet. Ju större ankarstorlek desto lätt är det att kärna upp kondensat. Dimeriseringseffektiviteten påverkas av mängden dimerizers i förhållande till mängden ankarproteiner. För få dimerizers kan inte uppta alla tillgängliga ankarproteiner medan för många dimerizers resulterar i icke-produktiv bindning av eDHFR till överskottet dimerizers snarare än till de på ankarproteinet. Dimerizerkoncentrationen, tillsammans med ankarets DNA-längd och koncentration av Halo-smält ankarprotein, kan användas för att bestämma den kritiska koncentration som krävs för nukleär lokal fasseparation. Ett systematiskt tillvägagångssätt för att variera dessa parametrar (ankar-DNA-längd, ankarproteinkoncentration, fasseparationsproteinkoncentration och dimerizerkoncentration) kan användas för att kartlägga ett flerdimensionellt fasdiagram. Men om intresset inte ligger i att kartlägga fasdiagram utan bilda kromatin associerade kondensat som demonstreras här, är det mycket lätt att helt enkelt plocka celler med ljus Halo-GFP-signal (större ankarstorlek) och celler med ett brett spektrum av ljusstyrka för mCherry-eDHFR (olika fasseparerande proteinkoncentrationer) för att avbilda med dimerizerkoncentrationen för maximal dimerisering som bestäms i protokoll 2.3. Det andra kritiska steget är att undvika fotoblekning i live-avbildning. Till skilja sig från den globala fasseparationen där droppar (ljus mCherry-högborgar som märker fasavskiljande protein) kommer att uppstå efter fasseparation, kan lokal kondensation på genomiska platser inte lätt upptäckas genom att bedöma förekomsten av mCherry foci. Detta beror på att rekrytering av proteinet ensam, utan fasseparation, till genomisk lokus kommer att resultera i bildandet av mCherry lokala högborgar. Fasseparation sker efter rekrytering, så mCherry foci fortsätter att bli större och ljusare efter den första rekryteringen. Fasseparation-inducerad berikning kan också uppstå i GFP-kanalen (ankarproteinet) på grund av dimeriseringen av ankarproteinet till fasseparationsproteinet. Därför bör förändringar av fociens fysiska egenskaper (storlek och intensitet) över tiden snarare än närvaron av högborgar användas för att bedöma fasseparation. Även om det kan vara svårt att skilja dimerisering eller fas separation-inducerad berikning av mCherry (byte protein) högborgar, uppstår berikning av GFP (ankarprotein) högborgar endast om det finns fas separation (Figur 3D). Därför kan anrikningen av ankarprotein användas för att enkelt bedöma fasseparation. Fotoblekning till följd av hög lasereffekt eller lång exponeringstid under avbildning gör det svårare att bedöma fasavskiljning från levande avbildning och bör därför undvikas så mycket som möjligt genom att justera bildförhållandena. Observera att ökningen av foci-intensitet och storlek över tid är egenskaper hos LLPS men inte kan användas som enda bevis för LLPS. I det fall som presenteras här användes droppfusion som bevis för bildandet av flytande droppar, vilket kanske inte förekommer för mindre antal ankare eller färre mobila ankare. Utan droppfusion kan andra metoder som diffusion av kondensatkomponenter och känslighet för små molekylförstärkning användas för att ytterligare bekräfta kondensatbildningen8,9,11.
Även om detta kemiska dimeriseringssystem återger temporal upplösning krävs för övervakning av fas separation i levande celler, saknar det rumslig upplösning på cellulär och subcellulär nivå. Tack vare dimerizers modulära design är det möjligt att göra ljuskänsliga dimerizers genom att fästa en fotocage på TMP, vilket gör länkaren ljuskänslig eller båda12,32,35. Genom att helt enkelt byta dimerizers inom samma konstruerade cellbakgrund för olika applikationer kan hög rumslig och temporal kontroll av dimeriseringen, återföring av dimerisering eller båda med ljus uppnås. Vi föreställer oss med dessa ljuskänsliga dimerizers, det kommer att kunna styra fasseparation med hög rumslig och temporal precision. Jämfört med de tillgängliga optogenetiska verktygen för att kontrollera fasseparation genom ljuskänsliga proteiner36,37, är en nackdel med det kemiska dimeriseringssystemet att det bara kan vända fasseparation en gång. Detta system kan dock upprätthålla varaktig rekrytering och därmed fasseparation utan ljus, vilket gör det mer lämpligt för långsiktiga live-bildapplikationer som att följa dropptillväxt eller cellulära konsekvenser av fasseparation. Dessutom gör förmågan att behandla en population av celler utan ljus det bekvämt för biokemiska analyser som de som behövs för att bestämma kondensatsammansättning eller förändringar i genomorganisationen.
Denna metod kan enkelt anpassas för att inducera kondensat på andra platser på genomet. Man kan helt enkelt identifiera ett protein som binder till den genomiska platsen av intresse och smälta det till Halo för att använda det som ankare (Figur 1B). Alternativt kan man kombinera detta med CRISPR och säkring dCas9 till Halo och använda guide RNAs för att förankra Halo till den genomiska lokus av intresse38. Dessutom kan man förankra Halo i en ectopic DNA-matris (t.ex. LacO) integrerad i genomet genom att smält halo till målproteinet (t.ex. LacI). Man kan sedan använda en bottom-up-metod för att bedöma ett proteins förmåga att fasa separera lokalt på kromatin, hur dess fasseparationsförmåga påverkas av proteindruncations, mutationer eller postöversättningsändringar, eller hur kondensatet påverkar lokala funktioner som kromatinmodifiering, replikering eller transkription. Sammanfattningsvis kan detta kemiska dimeriseringssystem användas för att inducera ett brett spektrum av kondensat på olika kromatinplatser och är särskilt lämpligt för att undersöka hur materialegenskaperna och den kemiska sammansättningen av kromatinrelaterade kondensat bidrar till kromatinfunktioner genom att kombinera långsiktig levande avbildning med biokemiska analyser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av US National Institutes of Health (1K22CA23763201 till H.Z., GM118510 till D.M.C.) och Charles E. Kaufman foundation till H.Z. Författarna vill tacka Jason Tones för korrekturläsningen av manuskriptet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% Trypsin, 0.1% EDTA in HBSS w/o Calcium, Magnesium and Sodium Bicarbonate | Corning | MT25053CI | |
| 16% Formaldehyde (w/v), Methanol-free | Thermo Scientific | 28906 | Prepare 1% in 1x PBS |
| 6 Well Culture Plate | VWR | 10861-554 | |
| Aluminum Foil | Fisher Scientific | 01-213-101 | |
| Anti-mCherry antibody | Abcam | Ab183628 | |
| Anti-PML antibody | Santa Cruz | sc966 | |
| Anti-SUMO1 antibody | Abcam | Ab32058 | |
| Anti-SUMO2/3 antibody | Cytoskeleton | Asm23 | |
| Blocking Reagent | Roche | 11096176001 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Fisher Scientific | BP9706100 | |
| BTX Tube micro 1.5ML | VWR | 89511-258 | |
| Circle Cover Slips | Thermo Scientific | 3350 | |
| Confocal microscope | Nikon | MQS31000 | |
| DAPI | Fisher Scientific | D1306 | |
| Dimethyl Sulphoxide | Sigma-Aldrich | 472301 | |
| DMEM with L-Glutamine, 4.5g/L Glucose and Sodium Pyruvate | Corning | MT10017CV | |
| EMCCD Camera | iXon Life | 897 | |
| Ethanol | Fisher Scientific | 4355221 | |
| Fetal Bovine Serum, Qualified, USDA-approved Regions | Gibco | A4766801 | |
| Formamide, Deionized | MilliporeSigma | 46-101-00ML | |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L), Recombinant Secondary Antibody, Alexa Fluor 647 | Invitrogen | A28181 | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L), Recombinant Secondary Antibody, Alexa Fluor 647 | Invitrogen | A32733 | |
| High Precision Straight Tapered Ultra Fine Point Tweezers/Forceps | Fisher Scientific | 12-000-122 | |
| Laser merge module | Nikon | NIIMHF47180 | |
| Leibovitz's L-15 Medium | Gibco | 21083027 | |
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | Invitrogen | 11668027 | |
| Figure plotting software, MATLAB | The MathWorks | ||
| Microscope Slide Box | Fisher Scientific | 34487 | |
| Nail Polish | Fisher Scientific | 50-949-071 | |
| Imaging software, NIS-Elements | Nikon | ||
| Opti-MEM Reduced Serum Media | Gibco | 51985091 | |
| Parafilm | Bemis | 13-374-12 | |
| PBS 10x, pH 7.4 | Fisher Scientific | 70-011-044 | |
| Penicillin-Streptomycin Solution,100X | Gibco | 15140122 | |
| Piezo Z-Drive | Physik Instrumente (PI) | 91985 | |
| Pipet Tips | VWR | 10017 | |
| Plain and Frosted Clipped Corner Microscope Slides | Fisher Scientific | 22-037-246 | |
| Poly-D-Lysine solution | Sigma-Aldrich | A-003-E | |
| Sodium Azide | Fisher Scientific | BP922I-500 | |
| Spinning disk | Yokogawa | CSU-X1 | |
| Square Cover Slips | Thermo Scientific | 3305 | |
| TBS 10x solution | Fisher Scientific | BP2471500 | |
| TelC-Alexa488 | PNA Bio | F1004 | |
| TMP | Synthesized by Chenoweth lab | Available upon request | |
| TNH | Synthesized by Chenoweth lab | Available upon request | |
| Tris Solution | Fisher Scientific | 92-901-00ML | |
| Triton X-100 10% Solution | MilliporeSigma | 64-846-350ML | Prepare 0.5% in 1x PBS |
| U2Os cell line | From E.V. Makayev lab (Nanyang Technological University, Singapore) | HTB-96 | |
| VECTASHIELD Antifade Mounting Medium | Vector Laboratories | NC9524612 |
References
- Shin, Y., Brangwynne, C. P. Liquid phase condensation in cell physiology and disease. Science. 357 (6357), (2017).
- Banani, S. F., Lee, H. O., Hyman, A. A., Rosen, M. K. Biomolecular condensates: organizers of cellular biochemistry. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (5), 285-298 (2017).
- Sabari, B. R., Dall'Agnese, A., Young, R. A. Biomolecular condensates in the nucleus. Trends in Biochemical Sciences. , 1-17 (2020).
- Strom, A. R., et al. Phase separation drives heterochromatin domain formation. Nature. 547 (7662), 241-245 (2017).
- Larson, A. G., et al. Liquid droplet formation by HP1α suggests a role for phase separation in heterochromatin. Nature. 547 (7662), 236-240 (2017).
- Boija, A., et al. Transcription factors activate genes through the phase-separation capacity of their activation domains. Cell. 175 (7), 1842-1855 (2018).
- Hur, W., et al. CDK-Regulated phase separation seeded by histone genes ensures precise growth and function of histone locus bodies. Developmental Cell. 54 (3), 379-394 (2020).
- McSwiggen, D. T., Mir, M., Darzacq, X., Tjian, R. Evaluating phase separation in live cells: diagnosis, caveats, and functional consequences. Genes & Development. 33 (23-24), 1619-1634 (2019).
- Peng, A., Weber, S. C. Evidence for and against liquid-liquid phase separation in the nucleus. Non-coding RNA. 5 (4), (2019).
- Erdel, F., et al. Mouse heterochromatin adopts digital compaction states without showing hallmarks of HP1-driven liquid-liquid phase separation. Molecular Cell. 78 (2), 236-249 (2020).
- Zhang, H., et al. Nuclear body phase separation drives telomere clustering in ALT cancer cells. Molecular Biology of the Cell. 31 (18), 2048-2056 (2020).
- Ballister, E. R., Aonbangkhen, C., Mayo, A. M., Lampson, M. A., Chenoweth, D. M. Localized light-induced protein dimerization in living cells using a photocaged dimerizer. Nature Communications. 5, 1-9 (2014).
- Yeager, T. R., et al. Telomerase-negative immortalized human cells contain a novel type of promyelocytic leukemia (PML) body. Cancer Research. 59 (17), 4175-4179 (1999).
- Zhang, J. M., Zou, L. Alternative lengthening of telomeres: From molecular mechanisms to therapeutic outlooks. Cell and Bioscience. 10 (1), 1-9 (2020).
- Corpet, A., et al. PML nuclear bodies and chromatin dynamics: catch me if you can. Nucleic Acids Research. , 1-23 (2020).
- Li, Y., Ma, X., Wu, W., Chen, Z., Meng, G. PML nuclear body biogenesis, carcinogenesis, and targeted therapy. Trends in Cancer. 6 (10), 889-906 (2020).
- Dilley, R. L., Greenberg, R. A. ALTernative telomere maintenance and cancer. Trends in Cancer. 1 (2), 145-156 (2015).
- Sobinoff, A. P., Pickett, H. A. Alternative lengthening of telomeres: DNA repair pathways converge. Trends in Genetics. 33 (12), 921-932 (2017).
- Draskovic, I., et al. Probing PML body function in ALT cells reveals spatiotemporal requirements for telomere recombination. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (37), 15726 (2009).
- Zhang, J. M., Yadav, T., Ouyang, J., Lan, L., Zou, L. Alternative lengthening of telomeres through two distinct break-induced replication pathways. Cell Reports. 26 (4), 955-968 (2019).
- Loe, T. K., et al. Telomere length heterogeneity in ALT cells is maintained by PML-dependent localization of the BTR complex to telomeres. Genes and Development. 34 (9-10), 650-662 (2020).
- Potts, P. R., Yu, H. The SMC5/6 complex maintains telomere length in ALT cancer cells through SUMOylation of telomere-binding proteins. Nature Structural and Molecular Biology. 14 (7), 581-590 (2007).
- Chung, I., Leonhardt, H., Rippe, K. De novo assembly of a PML nuclear subcompartment occurs through multiple pathways and induces telomere elongation. Journal of Cell Science. 124 (21), 3603-3618 (2011).
- Shen, T. H., Lin, H. K., Scaglioni, P. P., Yung, T. M., Pandolfi, P. P. The mechanisms of PML-nuclear body formation. Molecular Cell. 24 (3), 331-339 (2006).
- Shima, H., et al. Activation of the SUMO modification system is required for the accumulation of RAD51 at sites of DNA damage. Journal of Cell Science. 126 (22), 5284-5292 (2013).
- Yalçin, Z., Selenz, C., Jacobs, J. J. L. Ubiquitination and SUMOylation in telomere maintenance and dysfunction. Frontiers in Genetics. 8, 1-15 (2017).
- Sarangi, P., Zhao, X. SUMO-mediated regulation of DNA damage repair and responses. Trends in Biochemical Sciences. 40 (4), 233-242 (2015).
- Banani, S. F., et al. Compositional control of phase-separated cellular bodies. Cell. 166 (3), 651-663 (2016).
- Min, J., Wright, W. E., Shay, J. W. Clustered telomeres in phase-separated nuclear condensates engage mitotic DNA synthesis through BLM and RAD52. Genes and Development. 33 (13-14), 814-827 (2019).
- Song, J., Durrin, L. K., Wilkinson, T. A., Krontiris, T. G., Chen, Y. Identification of a SUMO-binding motif that recognizes SUMO-modified proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (40), 14373-14378 (2004).
- Zhang, H., Chenoweth, D. M., Lampson, M. A. Chapter 7 - Optogenetic control of mitosis with photocaged chemical dimerizers. Mitosis and Meiosis Part A. 144, 157-164 (2018).
- Zhang, H., et al. Optogenetic control of kinetochore function. Nature Chemical Biology. 13 (10), 1096-1101 (2017).
- Cho, N. W., Dilley, R. L., Lampson, M. A., Greenberg, R. A. Interchromosomal homology searches drive directional ALT telomere movement and synapsis. Cell. 159 (1), 108-121 (2014).
- Dilley, R. L., et al. Break-induced telomere synthesis underlies alternative telomere maintenance. Nature. 539 (7627), 54-58 (2016).
- Aonbangkhen, C., Zhang, H., Wu, D. Z., Lampson, M. A., Chenoweth, D. M. Reversible control of protein localization in living cells using a photocaged-photocleavable chemical dimerizer. Journal of the American Chemical Society. 140 (38), 11926-11930 (2018).
- Shin, Y., et al. Spatiotemporal control of intracellular phase transitions using light-activated optoDroplets. Cell. 168 (1-2), 159-171 (2017).
- Shin, Y., et al. Liquid nuclear condensates mechanically sense and restructure the genome. Cell. 175 (6), 1481-1491 (2018).
- Xiang, X., et al. CRISPR/Cas9-mediated gene tagging: a step-by-step protocol. Methods in Molecular Biology. 1961, 255-269 (2019).
