Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Визуализация и количественная оценка повреждения ДНК на основе эндонуклеазы

Published: August 21, 2021 doi: 10.3791/62175
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1
1Institute of Pathology, Faculty of Medicine, University of Szeged
* These authors contributed equally

Summary

В этой статье представлены основные этапы иммуноокрашивания и иммунопреципитации хроматина. Эти протоколы обычно используются для изучения клеточных процессов, связанных с повреждением ДНК, а также для визуализации и количественной оценки набора белков, связанных с репарацией ДНК.

Abstract

Клетки постоянно подвергаются воздействию различных повреждающих ДНК агентов, вызывая различные клеточные реакции. Применение биохимического и генетического подходов имеет важное значение для выявления клеточных событий, связанных с набором и сборкой комплексов репарации ДНК в месте повреждения ДНК. За последние несколько лет было разработано несколько мощных инструментов, чтобы вызвать повреждение ДНК, специфичное для сайта. Более того, новые семенные методы позволяют изучать эти процессы на уровне одноклеточного разрешения с использованием как фиксированных, так и живых клеток. Хотя эти методы были использованы для изучения различных биологических процессов, здесь мы представляем наиболее широко используемые протоколы в области репарации ДНК, флуоресцентного иммуноокрашивания (IF) и иммунопреципитации хроматина (ChIP), которые в сочетании с повреждением ДНК на основе эндонуклеазы позволяют визуализировать и количественно оценивать геномную занятость факторов репарации ДНК направленным и регулируемым образом, соответственно. Эти методы предоставляют исследователям мощные инструменты для идентификации новых белков, связанных с поврежденным геномным локусом, а также их постперекренческих модификаций, необходимых для их тонкой регуляции во время репарации ДНК.

Introduction

Наш геном постоянно подвергается испытаниям со стороны различных агентов, повреждающих ДНК. Эти атаки могут происходить от источников окружающей среды, таких как ультрафиолетовый свет или облучение, а также от эндогенных источников, таких как побочные продукты метаболизма, вызванные окислительным стрессом или ошибками репликации1,2. Эти поражения могут влиять на целостность одной или обеих нитей ДНК, и если генерируемые ошибки становятся постоянными, это часто приводит к транслокациям и нестабильности генома, что может привести к опухолевомугенезу 3,4. Для поддержания целостности генома в ходе эволюции было разработано несколько систем восстановления. В соответствии с химическими и физическими свойствами конкретных типов повреждений ДНК могут быть активированы несколько механизмов репарации. Несоответствия, абосные участки, одноцепочечные разрывы и 8-оксогуанин (8-оксоГ) могут быть удалены либо путем восстановления несоответствия, либо путем восстановления основания-иссечения5,6. Поражения, вызванные УФ-индуцированными фотопродуктами и громоздкими аддуктами, могут быть восстановлены либо нуклеотидно-эксцизионной репарацией (NER), либо процессом двухцепочечного разрыва ДНК (DSBR)7,8. NER состоит из двух основных подпутей: транскрипционно-связанного NER (TC-NER) и глобального геномного NER (GG-NER). Что касается фазы клеточного цикла, то после индукции двухцепочечного разрыва ДНК могут быть активированы два подпутя: негомологичное конечное соединение (NHEJ) и гомологичная рекомбинация (HR)1,9. NHEJ, который является доминирующим путем в покоящихся клетках, может быть активирован во всех фазах клеточного цикла, представляя собой более быстрый, но подверженный ошибкампуть 10. С другой стороны, HR является безошибочным путем, в котором DSB восстанавливаются на основе поиска последовательности-гомологии сестринских хроматид, поэтому он в основном присутствует в фазах11клеточного цикла S и G2. Кроме того, микрогомологически-опосредованное конечное соединение (MMEJ) является еще одним механизмом восстановления DSB, отличным от вышеупомянутых, основанным на KU70/80- и RAD51-независимом способе повторного лигирования ранее резецированных микрогомологий последовательностей, фланкируя сломанные концы ДНК. Поэтому MMEJ считается подверженным ошибкам и очень мутагенным12. Во время репарации ДНК DSB могут индуцировать реакцию повреждения ДНК (DDR), что приводит к активации киназ контрольных точек, которые останавливают клеточный цикл во время репарации13,14,15. РДР активизируется в ответ на вербовку и широкое распространение инициаторов ключевых участников процесса ремонта вокруг поражений, способствуя формированию ремонтного очага. В этом раннем сигнальном каскаде ATM (Ataxia Telangiectasia Mutated) киназа играет ключевую роль, катализируя фосфорилирование варианта гистона H2AX в Ser139 (называемом γH2AX) вокруг поражения16. Это раннее событие отвечает за набор дополнительных факторов ремонта и начало процессов последующего ремонта. Хотя точная функция рекрутированных белков в центре репарации еще не полностью охарактеризована, образование и динамика репараторных очагов были исследованы несколькими лабораториями. Эти маркеры широко используются для отслеживания кинетики ремонта, но их точная роль в процессе ремонта остается неуловимой. Из-за большого значения, но плохого понимания клеточных процессов, связанных с репарацией ДНК, до сих пор было разработано несколько методов для индуцирования и визуализации ГДР.

Были созданы различные методы и системы, чтобы вызвать желаемый тип повреждения ДНК. Например, некоторые агенты [такие как неокарзиностатин (NCS), флеомицин, блеомицин, γ облучение, УФ] могут индуцировать большое количество случайных разрывов ДНК в непрогностических геномных позициях, в то время как другие (эндонуклеазы, такие как AsiSI, I-PpoI или I-SceI, а также лазерное полосание) могут вызывать разрывы ДНК в известных геномных локусах17,18,19,20,21. Здесь мы сосредоточимся на методах на основе эндонуклеазы, которые в настоящее время используются для изучения DDR в клетках млекопитающих и дрожжей. Помимо выделения принципов этих методов, мы подчеркиваем как их преимущества, так и недостатки.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Иммунодетекция специфических белков

  1. Подготовка клеточной культуры и экспериментальная установка
    1. Поддерживать клетки U2OS в монослоях в питательной среде DMEM, дополненной 10% сывороткой для телят плода, 2 мМ глютамина и 1% антибиотико-антимикотическим раствором.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для индукции повреждений ДНК на основе эндонуклеазы используйте среду, обработанную древесным углем или без стероидов, чтобы избежать утечки системы.
    2. Выращивают клетки в увлажненной 5% CO2 среде при 37 °C до 80% слияния, обновляя среду каждые 2-3 дня.
    3. Аспирировать среду и промыть клетки 1x PBS. Отсоедините клетки раствором Трипсина-ЭДТА. Когда клетки отсоединяются, остановите активность трипсина, добавив культурную среду к клеткам, получив клеточную суспензию.
    4. Подсчитайте ячейки с помощью камеры подсчета ячеек. Пластина 2 x 104 ячейки/мл/скважина на 24-скважинной пластине, со стерильными круглыми крышками 12 мм в каждой скважине.
    5. Инкубировать ячейки в течение 24 ч при 37 °C в увлажненной 5% атмосфере CO2, чтобы обеспечить прикрепление к покровам.
    6. Обработайте клетки 10 нг/мл неокарциностатина (NCS) путем непосредственной пипетки повреждающего агента в культивированную среду. Инкубируют клетки с NCS-содержащей средой в течение 15 мин, затем промыть их 1x PBS и добавить в клетки свежую, дополненную питательную среду. В противном случае используйте соответствующий агент (т.е. 4-OHT) для индуцирования DSB через системы на основе эндонуклеазы без обновления среды22.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве альтернативы, используйте облучение для индуцирования повреждения ДНК, в диапазоне от 30 мин до 8 ч времени восстановления с использованием потока нейтронов между 2-20 Гр23.
    7. Инкубировать клетки в течение 1-8 ч при 37 °C в увлажненной 5% атмосфере CO2 для отслеживания кинетики репарации ДНК.
  2. Фиксация клеток
    ПРИМЕЧАНИЕ: 300-500 мкл растворов/скважин следует использовать на следующих этапах (этапы 1.2-1.5) для адекватного покрытия всех клеток. Каждый этап инкубации и промывки (кроме инкубации антител) следует выполнять на орбитальном шейкере с мягким перемешиванием.
    1. После индукции DSB и инкубации клеток удалите среду из прикрепленных клеток и промывайте клетки один раз с помощью 1x PBS.
    2. Зафиксируйте клетки 4% раствором формальдегид-ПБС в течение 20 мин при 25 °C.
  3. Пермеабилизация клеток
    1. Удалите фиксирующий раствор и промыть ячейки три раза 1x PBS в течение 5 минут каждая.
    2. Удалите PBS и добавьте 0,2% Triton X-100, растворенного в PBS. Инкубировать образцы в течение 20 мин.
  4. Блокировка неспецифических сайтов привязки
    1. Промыть ячейки три раза с 1x PBS.
    2. Блокируют неспецифические сайты связывания 5% BSA (бычную сывороточную фракцию V альбумина), разведенного в ПБСТ (1x PBS, дополненный 0,1% Tween-20), и инкубируют пермеабилизированные образцы в течение не менее 20 мин.
  5. Иммунофлуоресцентное окрашивание
    1. Добавьте необходимое количество первичных антител (т.е. анти-γH2AX, анти-ДНК-PKcs), разведенных в 1% растворе BSA-PBST. Поместите каждый покров вверх ногами на парафиновую пленку над каплей 10 мкл разбавленного антитела против γH2AX.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В случае коиммуноразрашивания разводят соответствующим образом оба антитела в одном и том же 1% растворе BSA-PBST.
    2. Инкубировать образцы в камере влажности в течение 1,5 ч при 4 °C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Инкубация также может быть выполнена при 4 °C в течение ночи.
    3. Поместите крышки обратно стороной вверх в 24-скважинную пластину и трижды промыть в течение 5 минут с 1x PBS.
    4. Добавьте необходимое количество вторичного антитела, разведенного в 1% BSA-PBST. Поместите каждый покров вверх ногами на парафиновую пленку над каплей разбавленного антитела 10 мкл.
    5. Инкубировать образцы в камере влажности при 4 °C в течение 1 ч.
    6. Поместите крышки обратно стороной вверх в 24-скважинную пластину и трижды промыть в течение 5 минут с 1x PBS.
    7. Перед удалением последнего моющего раствора PBS аккуратно выньте крышки с помощью пинцета и иглы, а затем поместите их вверх ногами на стеклянные слайды с каплями монтажной среды (дополненной DAPI).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте образования пузырьков воздуха. Когда монтажная среда высохнет, рекомендуется заделать края обложек лаком для ногтей, чтобы предотвратить сморщение образцов.

2. Иммунопреципитация хроматина

  1. Клеточный сбор, сшивание, клеточный и ядерный лизис и фрагментация ДНК
    1. Культивь на каждую пробу примерно5 х 10 6 клеток/мл в чашке 150 мм.
    2. Удалите питательную среду и дважды промыть клетки ледяным 1x PBS.
    3. Зафиксируйте клетки 1% раствором формальдегида-PBS, поместите пластины на орбитальный шейкер и осторожно перемешивайте в течение 20 мин.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Формальдегид летучий; всегда готовьте свежий рабочий раствор. В некоторых случаях раствор формальдегида содержит метанол для его стабилизации, но лучше использовать раствор без метанола, чтобы избежать вмешательства в последующие реакции.
    4. Стопируют фиксацию глицином 125 мМ и инкубируют на орбитальном шейкере с мягким перемешиванием в течение 5 мин при 25 °C.
    5. Поместите тарелки на лед и дважды промойте ледяным 1x PBS.
    6. Соскоблите ячейки в ледяном 1x PBS и переложите их в конические трубки по 15 мл.
    7. Центрифугировать ячейки при 2,500 х г в течение 5 мин при 4 °C.
    8. Осторожно аспирировать супернатант и повторно суспендировать гранулу в 2 мл буфера лизиса клеток [5 мМ PIPES pH 8,0, 85 мМ KCl, 0,5% NP-40, 1x PIC (коктейль ингибитора протеазы)] и инкубировать на льду в течение 10 мин.
    9. Центрифугируют клеточную суспензию при 2,500 х г в течение 5 мин при 4 °C.
    10. Осторожно выбрасывают супернатант и повторно суспендируют гранулу в 500-1 500 мкл буфера ядерного лизиса (50 мМ Tris-HCl pH 8,0, 10 мМ ЭДТА рН 8,0, 0,8% SDS, 1x PIC) и инкубируют на льду в течение 30-60 мин. Переложите лисат в полистирольная коническая трубка, подходящая для ультразвуковой обшивки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку буфер ядерного лизиса содержит SDS, он будет выпадать в осадок на льду, и раствор станет белым. Раствор должен стать прозрачным после ультразвуковой обивки.
    11. Ультразвуком лисат для сдвига ДНК до среднего размера фрагмента 300-1000 bp.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Соответствующие циклы и условия ультразвуковой работы должны быть установлены в соответствии с типом ячейки и оборудованием для ультразвуковой работы. Фрагменты размером менее 200 bp не подходят для ChIP, потому что взаимодействия нуклеосомы и ДНК могут быть нарушены.
  2. Разворот сшивания, определение размеров фрагментов, обшитых ультразвуком
    1. Возьмите 100 мкл ультразвукового образца, чтобы проверить размер фрагмента ультразвукового хроматина. Оставшийся хроматин следует хранить при −80 °C.
    2. Добавляют 0,5 мг/мл РНКазы А к каждому 100 мкл образца и инкубируют их при 37°С в течение 20 мин для активации РНКазы.
    3. Инкубировать образцы при 65 °C в течение ночи.
    4. На следующий день добавляют 500 мкг/мл протеиназы К и 0,5% SDS и инкубируют образцы при 50 °C в течение 3 ч.
    5. Добавьте 0,5 объема фенола и 0,5 объема смеси хлороформ-изоамилового спирта (24:1) в каждый образец.
    6. Вихрь в течение 1 мин.
    7. Центрифуга при 13 000 х г в течение 10 мин.
    8. Перенесите верхнюю кувужную фазу в новую микроцентрифужную трубку.
    9. Добавьте 1 объем смеси хлороформ-изоамилового спирта (24:1) в каждый образец.
    10. Вихрь в течение 1 мин.
    11. Центрифуга при 13 000 х г в течение 10 мин.
    12. Перенесите верхнюю кувужную фазу в новую микроцентрифужную трубку.
    13. Добавьте 2,5 объема 96% этанола и 0,1 объема 3 М Na-ацетата рН 5,2.
    14. Инкубировать не менее 20 мин при −80 °C.
    15. Центрифугировать образцы при 13 000 х г в течение 10 мин при 4 °C.
    16. Удалите этанол и промыть гранулу 400 мкл 70% этанола.
    17. Центрифугировать образцы при 13 000 х г в течение 10 мин при 4 °C.
    18. Удалите этанол и высушите гранулы на воздухе.
    19. Повторно суспендируют гранулы в 10 мкл ТЭ.
    20. Запустите образцы на 0,8% агарозном гелевом. Размер хроматина, выпавленного ультразвуком, должен составлять около 500 bp.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте буфер загрузки без бромфенола, потому что размер этого красителя составляет примерно 500 bp, что может нарушить правильное обнаружение фрагментов хроматина. Вместо этого рекомендуется использовать нагрузочный буфер, дополненный ксилол-цианолем, который составляет примерно 3000 бп.
    21. Если размер хроматина приемлем, разбавьте замороженные образцы хроматина из шага 2.1. в 3 объемах буфера разбавления (10 мМ Tris-HCl pH 8,0, 0,5 мМ EGTA pH 8,0, 1% Triton X-100, 140 мМ NaCl, 1x PIC) и перемешивать образцы путем вращения в течение 10 мин при 4 °C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот этап необходим для разбавления SDS, присутствующего в буфере ядерного лизиса, чтобы избежать вмешательства в последующие реакции, включая измерение концентрации хроматина.
    22. Измерьте концентрацию ДНК образцов хроматина при 260/280 нм с помощью спектрофотометра.
  3. Подготовка шариков, предварительная очистка и иммунопреципитация
    1. Подготовьте бусины (овечьи против кроликов или мышиные IgG) для предварительной очистки и иммунопреципитации. Дважды стирайте шарики в течение 10 мин при 4 °C с буфером RIPA (50 мМ Tris-HCl pH 8,0, 1 мМ ЭДТА рН 8,0, 1% Тритон X-100, 0,1% Na-DOC, 0,1% SDS, 150 мМ NaCl и 1X PIC).
    2. Повторно суспендирует бусины в том же объеме буфера RIPA, что и на шаге 2.3.1.
    3. Предварительно очищают 25-30 мкг хроматина каждого образца с 4 мкл шариков путем вращения в течение 1-2 ч при 4 °C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Добавьте буфер RIPA к каждому образцу хроматина до 500 мкл конечного объема, чтобы образцы правильно смешивались при вращении. Не забудьте вывести хроматин для NAC (No Antibody Control) и TIC (Total Input Control) в случае каждого набора образцов. Для ИПК требуется только конечный объем до 200 мкл.
    4. Высадите шарики магнитом и перенесите супернатант в новую микроцентрифужную трубку.
    5. Добавьте соответствующее количество антител к каждому образцу хроматина (кроме NAC и TIC) и вращайте в течение ночи при 4 °C.
    6. На следующий день добавьте 40 мкл промытых шариков к каждому образцу (кроме TIC) и высиживайте их в течение ночи, вращаясь при 4 °C.
  4. Стирка
    1. Промывайте один раз с 300 мкл низкосолевого буфера (20 мМ Tris-HCl pH 8,0, 150 мМ NaCl, 2 мМ EDTA pH 8,0, 1% Triton X-100, 0,1% SDS, 1x PIC) в течение 10 мин путем вращения при 4 °C.
    2. Промывайте один раз с 300 мкл буфера с высоким содержанием соли (20 мМ Tris-HCl pH 8,0, 300 мМ NaCl, 2 мМ EDTA pH 8,0, 1% Triton X-100, 0,1% SDS, 1x PIC) в течение 10 мин путем вращения при 4 °C.
    3. Промывайте однократно с 300 мкл буфера LiCl (250 мМ LiCl, 1% NP-40, 1% Na-DOC, 1 мМ EDTA pH 8,0, 10 мМ Tris-HCl pH 8,0, 1x PIC) в течение 10 мин путем вращения при 4 °C.
    4. Промывайте дважды с 300 мкл TE (10 мМ Tris-HCl pH 8,0, 1 мМ EDTA pH 8,0) в течение 10 мин путем вращения, для первой промывки при 4 °C, а второй стирки при 25 °C.
  5. Элюция
    1. Добавьте 200 мкл элюированного буфера (1% SDS и 100 мМ NaHCO3)к шарикам и инкубируют при 65 °C в термошейкере в течение 15 мин с непрерывным встряхиванием (около 400 об/мин). Перенесите супернатант в новую трубку и снова элюируют шарики в 200 мкл буфера элюидения. Комбинируйте элюаты (конечный объем 400 мкл).
    2. Добавьте NaCl к конечной концентрации 200 мМ в каждом образце. Дополни образцы TIC 200 мкл буфера элюидности и добавьте NaCl.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Начиная с этого этапа, TIC следует обрабатывать в тех же условиях, что и другие образцы.
    3. Инкубировать образцы при 65°С (без встряхивания) в течение не менее 6 ч.
    4. Добавьте 1 мл холодного 100% этанола к каждому образцу, дважды поверните пробирки для смешивания и выживите ДНК на ночь при -80 °C.
    5. На следующий день центрифугу в течение 30 мин при 13 000 х г при 4 °C.
    6. Выбросьте супернатант и промыть гранулу 70% EtOH.
    7. Центрифугировать образцы при 13 000 х г в течение 10 мин при 4 °C.
    8. Выбросьте супернатант и высушите гранулы на воздухе.
    9. Повторно суспендируют гранулы в 100 мкл ТЭ и добавляют 0,5 мг/мл РНКазы А к каждому образцу. Инкубировать при 37 °C в течение 20 мин для активации РНКазы.
  6. Разворот сшивки
    1. Добавьте 500 мкг/мл протеиназы K и 0,5% SDS, затем инкубируют образцы при 50 °C в течение 2 ч.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если вы переходите к ChIP-seq, избегайте экстракции фенол-хлороформа, так как она ингибирует последующий процесс NGS. Вместо этого рекомендуется использовать коммерчески доступный комплект (см. Таблицу материалов).
    2. Добавьте 0,5 объема фенола и 0,5 объема смеси хлороформ-изоамилового спирта (24:1) в каждый образец.
    3. Вихрь в течение 1 мин.
    4. Центрифуга при 13 000 х г в течение 10 мин.
    5. Перенесите верхнюю кувужную фазу в новую микроцентрифужную трубку.
    6. Добавьте 1 объем смеси хлороформ-изоамилового спирта (24:1) в каждый образец.
    7. Вихрь в течение 1 мин.
    8. Центрифуга при 13 000 х г в течение 10 мин.
    9. Перенесите верхнюю кувужную фазу в новую микроцентрифужную трубку.
  7. Экстракция ДНК
    1. Добавьте 2,5 объема 96% этанола и 0,1 объема 3 М Na-ацетата рН 5,2.
    2. Инкубировать не менее 20 мин при −80 °C.
    3. Центрифугировать образцы при 13 000 х г в течение 10 мин при 4 °C.
    4. Удалите этанол и промыть гранулу 400 мкл 70% этанола.
    5. Центрифугировать образцы при 13 000 х г в течение 10 мин при 4 °C.
    6. Удалите этанол и высушите гранулы на воздухе.
    7. Повторно суспендируют гранулы в 50 мкл ТЭ.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Изучение направленных на сайт процессов репарации DSB в клетках может быть достигнуто либо путем стабильной, либо путем транзиторной трансфекции. Однако следует отметить, что стабильная трансфекция обеспечивает однородную клеточную популяцию, что дает единый и, следовательно, более надежный клеточный ответ. В случае транзиторной трансфекции только небольшая часть клеточной популяции занимает и поддерживает плазмиду, что вносит разнообразие в эксперимент. Создание клеточных систем на основе эндонуклеазы ER-I-PpoI или ER-AsiSI требует 50% популяции конфлюентных клеток, которая более эффективно трансфицируется плазмидами, кодирующей эндонуклеазу. Для трансфекции также могут использоваться коммерчески доступные трансфекционные реагенты или методы, основанные на вирусной инфекции. Если необходимо применить метод микроскопической визуализации и потребоваться транзиторная трансфекция, направленные DSB могут быть индуцированы добавлением 4-OHT через 24 ч после трансфекции, которое связывается с ER-конденсированными эндонуклеазами и позволяет ядерную транслокацию и индукцию DSB. Для определения наиболее подходящих временных точек может быть выполнена иммунофлуоресцентная микроскопия и обнаружение γH2AX в разных временных точках после лечения 4-OHT. В физиологических условиях может быть обнаружено максимум 10-15 очагов γH2AX на клетку, и образование сильных репарационных очагов может быть вызвано эндонуклеасами (или различными другими методами, не обсуждаемыми здесь, например, лазерным микроизрасширением). Типичная эндонуклеаза I-PpoI приводит к образованию повышенных сигналов γH2AX вокруг ядрышка путем индуцирования DSB в рибосомной ДНК (рДНК). Если разрывы ремонтируются NHEJ или HR, количество ремонтных очагов со временем уменьшается. По этой причине рекомендуются репрезентативные временные точки в 0 ч, 30 мин, 1, 2, 4 и 8 ч после лечения 4-OHT. Для отслеживания процессов репарации ДНК наиболее часто используемой клеточной линией является U2OS, так как все известные пути репарации полностью функциональны в этих клетках. При исследовании нескольких белков в одних и тех же клетках колокализация может быть изучена путем объединения антител, конъюгированных с различными флуорофорами, с различными длинами волн излучения, выращенными у разных видов животных, как показано на рисунке 1. В нем представлена индукция DSB через индуцируемую стабильную клеточную линию, которая основана на эндонуклеазе рестрикции ER-AsiSI, слитой с гемагглютининовой меткой (HA). Доксициклин может индуцировать экспрессию и секвестрацию HA-ER-AsiSI в цитоплазме, которую можно отслеживать с помощью антитела против ГК(рисунок 1.третья колонка, вторая сырая). Инкубация в течение 4 ч с 4-OHT, через 24 ч после добавления доксициклина, может индуцировать большое количество DSB, поскольку эндонуклеаза была перемещена в ядро(рисунок 1.третий столбец, третий сырой и второй столбец, третий сырой). DSB можно визуализировать с помощью антитела, распознающего γH2AX.

Figure 1
Рисунок 1:Иммунофлуоресцентная микроскопия используется для обнаружения γH2AX в культивированных клетках, экспрессирующих HA-ER-AsiSI. Добавление DOX (доксициклина) активирует цитоплазматическую экспрессию HA-ER-AsiSI, а 4-OHT (4-гидрокситамоксифен) (4 ч) индуцирует ядерную транслокацию белка синтеза, что приводит к индукции DSB в известных геномных позициях. Окрашивание HA (гемагглютинин) (антитело против HA) представляет собой белок слияния HA-ER-AsiSI зеленым цветом, а индукция разрывов подтверждается окрашиванием γH2AX (антитело анти-γH2AX) красным цветом. Шкала представляет собой 20 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Колокализация репарационных белков в месте повреждения указывает на то, что они набираются в один и тот же участок поражения ДНК, но они не обязательно взаимодействуют друг с другом. Разрешение конфокальной микроскопии составляет приблизительно 300 нм; Чтобы определить паттерн связывания специфических репараций белков в месте разрыва, вместо этого рекомендуется микроскопия сверхвысокого разрешения (STORM) 24. Однако этот метод требует дорогостоящего микроскопического оборудования и опытного исследователя. Альтернативно, паттерн связывания репарационных белков может быть исследован путем иммунопреципитации хроматина с использованием стабильных клеточных линий DIvA или U2OS-pEP15, которые могут экспрессировать эндонуклеазы AsiSI и I-PpoI регулируемым образом, соответственно17,21. После добавления 4-OHT обе эндонуклеазы могут разрезать ДНК в последовательности, специфичной для конкретной последовательности, что дает нам возможность разрабатывать локус-специфические праймеры для ожидаемых мест разрыва и окружающих их геномных областей. Применяя антитело γH2AX в иммунопреципитационной части ChIP, мы можем временно следить за кинетикой репарации ДНК при различных условиях (таких как глушение или ингибирование определенных факторов репарации, представляющих интерес, т. Е. ДНК-PKcs). Типичный экспериментальный результат, полученный с помощью ChIP-qPCR, представлен на рисунке 2. В нем временное обогащение γH2AX демонстрируется как ответ на повреждение ДНК, вызванное I-PpoI. В левой части изображения показан своевременно обнаруженный сигнал γH2AX в месте разрыва, в то время как в правой части распределение γH2AX представлено в контрольной области гена, в которой DSB не были индуцированы.

Figure 2
Рисунок 2:Временное обогащение γH2AX, определяемое иммунопреципитацией хроматина в ответ на повреждение ДНК, вызванное I-PpoI. Слева, сигнал γH2AX в месте разрыва; справа, распределение γH2AX в контрольной области, где DSB не индуцировались (антитело анти-γH2AX). Представленные результаты получены из одного биологического эксперимента, а полосы ошибок указывают на вариации соответствующих реплик образцов. N=3. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Хотя репарации ДНК является относительно недавней областью исследований, наши знания быстро расширяются с помощью различных биохимических и микроскопических методов. Сохранение генетической информации имеет решающее значение для клеток, поскольку мутации, происходящие в генах, участвующих в процессах репарации, являются одними из ведущих причин опухолевого генеза, и поэтому важно прояснить ключевые этапы путей репарации ДНК.

Биохимические методы (т.е. вестерн-блот, иммунопреципитация, масс-спектрометрия и т.д.) требуют большого количества клеток, а изученные процессы репарации представляют собой снимок желаемой клеточной популяции. Выполнение экспериментов ChIP является трудоемким, хлопотным и многие соображения должны быть приняты во внимание при разработке конкретного эксперимента для изучения процесса ремонта DSB. Ниже приведены некоторые примеры: (I) клетки должны быть правильно лизированы; настоятельно рекомендуется применять двухступенчатый метод лизации с использованием отдельного буфера клеточного и ядерного лизиса для обеспечения более высокой доступности хроматиновой фракции (II), хроматин не должен подвергаться чрезмерному или недостаточному анализу; соответствующие условия ультразвуковой работы должны быть оптимизированы для каждого типа клеток заранее (III) должно быть определено соответствующее количество очищенных антител, поскольку антитела против одного и того же белка от разных компаний проявляют неидентичные характеристики (IV) для эффективного иммунопреципитации, 25-30 мкг начального хроматина должны быть использованы в каждом состоянии (V) соответствующее время фиксации должно быть оптимизировано, поскольку сверхфиксация может привести к ложноположительным результатам путем сшивки отдаленных белковых комплексов, а недофиксация может предотвратить надлежащую сшивку между ДНК и желаемым белком (VI) на основе применяемого антитела, тип шариков (белок A или G) должен быть тщательно определен (VII) на этапах промывки, порядок промывки буферов должен быть тщательно сохранен, чтобы избежать высвобождения антитела из шариков (VIII) во время экстракции ДНК, следы фенола должны быть должным образом устранены, чтобы избежать снижения эффективности дальнейших последующих реакций. Поскольку этот метод снижает выход восстановленной ДНК, наш личный совет заключается в том, чтобы использовать конкретный набор для очистки ДНК. Когда все критические точки были должным образом решены, ChIP может предоставить ценные данные для размещения желаемого белка в различных геномных локусах и может разгадать критические шаги в процессах репарации ДНК.

Однако ChIP в сочетании с qPCR является косвенным подходом к изучению распределения белка в выбранных геномных областях и не позволяет специфически распознавать сайт связывания ДНК или непосредственно исследовать функцию белка. Моно- или поликлональные антитела, используемые для захвата белково-ДНК-комплексов, также могут перекрестно реагировать с другими белками, что приводит к ложноположительным данным, и поэтому антитела, используемые в этом методе, должны быть ChIP-класса и высокоспецифичными по отношению к интересующий белок. Тем не менее, ChIP является широко используемым методом, и на его основе были разработаны дальнейшие подходы, такие как ChIP-on-chip и ChIP-seq. Первый основан на гибридизации иммунопреципитированных и очищенных фрагментов ДНК на микрочипе с большим разнообразием небольших случайных последовательностей ДНК, которые дополнительно усиливают отожженные последовательности, предоставляя ценную информацию о сайтах связывания белка. Тем не менее, ChIP-seq стал привлекательным альтернативным подходом, поскольку он обеспечивает общегеномное картирование белково-ДНК-комплексов с более высоким разрешением, чем ChIP-on-chip, и высокопроизводительным секвенированием генома. ChIP-seq произвел революцию в области репарации ДНК, раскрыв сайты связывания ДНК различных факторов транскрипции, что дает представление о регуляции генов и распутывании ландшафтов хроматина в масштабе всего генома25. Согласно этому, область репарации ДНК получила огромную выгоду от ChIP-seq, поскольку эти данные играют решающую роль в различных заболеваниях и биологических путях, таких как прогрессирование рака. Тем не менее, были разработаны различные модификации метода ChIP, такие как HaloChIP, который не требует специфического антитела против интересующего белка, а скорее использует последовательности, кодирующие ДНК-связывающие белки, слитые с HaloTag, которые трансфехтируются в клетки и впоследствии для сшивания, желаемые белково-ДНК-комплексы могут быть захвачены с помощью HaloLink Resin. Однако этот метод опирается на сверхэкспрессию, а не на эндогенный уровень желаемых белков, что может привести к неправильной интерпретации данных26.

Кроме того, микроскопические методы предоставляют ценную информацию о пространственно-временном отслеживании восстановления повреждений ДНК даже на уровне одной клетки. Быстрое улучшение антител, выращенных против специфических белков репарации, привело к более глубокому пониманию механизма подпутей NER и DSBR, а также их постпереводной регуляции. Микроскопическое поле было революционизировано методами высокого разрешения, такими как микроскопия сверхвысокого разрешения, которая позволяет визуализировать клеточные процессы, вызванные повреждением ДНК, на нуклеосомном уровне, а также обеспечивает точное отображение колокализации белка24. Однако следует отметить, что дисперсия в клеточных линиях должна быть рассмотрена во время эксперимента, поскольку скорость восстановления может расходиться, что может затруднить интерпретацию результатов. Учитывая быструю эволюцию методологии флуоресцентной визуализации и преднамеренную разработку экспериментальной установки, ценная возможность исследовать клеточные и молекулярные реакции, вызванные повреждением ДНК, при разрешении одного белка на уровне одной клетки находится на пути к совершенству.

В заключение, сочетание микроскопии сверхвысокого разрешения и методологии секвенирования одной клетки может значительно улучшить наше понимание поля репарации ДНК.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Никакой

Acknowledgments

Это исследование финансировалось грантом Национального офиса исследований, разработок и инноваций GINOP-2.3.2-15-2016-00020, GINOP-2.3.2-15-2016-00036, GINOP-2.2.1-15-2017-00052, EFOP 3.6.3-VEKOP-16-2017-00009, NKFI-FK 132080, исследовательской стипендией Яноша Больяй Венгерской академии наук BO/27/20, ÚNKP-20-5-SZTE-265, краткосрочной стипендией EMBO 8513 и Фондом Tempus.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
4-OHT Sigma Aldrich H7904
Agarose Lonza 50004
Antibiotic-Antimycotic Solution (100×), Stabilized Sigma Aldrich A5955
Anti-gamma H2A.X (phospho S139) antibody Abcam ab26350
Bovine Serum Fraction V albumin Biosera PM-T1725
TrackIt™ Cyan/Yellow Loading Buffer Thermo Fisher Scientific 10482035
DMEM with 1.0 g/L Glucose, without L-Glutamine Lonza 12-707F
Doxycycline Sigma Aldrich D9891
Dynabeads™ M-280 Sheep Anti-Mouse IgG Invitrogen 11202D
Dynabeads™ M-280 Sheep Anti-Rabbit IgG Invitrogen 11204D
EDTA Sigma Aldrich E6758
EGTA Sigma Aldrich E3889
Ethanol Molar Chemicals 02910-101-340
Fetal Bovine Serum (South America Origin), EU-approved Gibco ECS0180L
Formaldehyde 37% solution free from acid Sigma Aldrich 1.03999
GlutaMAX™ Supplement Thermo Fisher Scientific 35050038
Glycine Sigma Aldrich 50046
IPure kit v2 Diagenode C03010015
Isoamyl alcohol Sigma Aldrich W205702
LiCl Sigma Aldrich L9650
NaCl Sigma Aldrich S5886
Na-DOC Sigma Aldrich D6750
NaHCO3 Sigma Aldrich S5761
Neocarzinostatin from Streptomyces carzinostaticus Sigma Aldrich N9162
NP-40 Sigma Aldrich I8896
PBS Powder without Ca2+, Mg2+ Sigma Aldrich L182-50-BC
Phenol Sigma Aldrich P4557
PIPES Sigma Aldrich P1851
Polysorbate 20 (Tween 20) Molar Chemicals 09400-203-190
KCl Sigma Aldrich P5405
ProLong™ Gold Antifade Mountant with DAPI Thermo Fisher Scientific P36935
Protease Inhibitor Cocktail Set I Roche 11873580001
Proteinase K Sigma Aldrich P2308
P-S2056 DNAPKcs antibody Abcam ab18192
RNase A Roche 10109169001
CH3COONa Sigma Aldrich S2889
SDS Sigma Aldrich L3771
Tris Acetate-EDTA buffer Sigma Aldrich T6025
Tris-HCl Sigma Aldrich 91228
TRITON X-100 Molar Chemicals 09370-006-340
Trypsin from porcine pancreas Sigma Aldrich T4799
Trypsin-EDTA (0.5%), no phenol red Gibco 15400054

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Borsos, B. N., Majoros, H., Pankotai, T. Ubiquitylation-Mediated Fine-Tuning of DNA Double-Strand Break Repair. Cancers (Basel). 12 (6), (2020).
  2. Borsos, B. N., Majoros, H., Pankotai, T. Emerging Roles of Post-Translational Modifications in Nucleotide Excision Repair. Cells. 9 (6), (2020).
  3. Stephens, P. J., et al. The landscape of cancer genes and mutational processes in breast cancer. Nature. 486 (7403), 400-404 (2012).
  4. Turnbull, C., et al. Gene-gene interactions in breast cancer susceptibility. Human Molecular Genetics. 21 (4), 958-962 (2012).
  5. Saxowsky, T. T., Meadows, K. L., Klungland, A., Doetsch, P. W. 8-Oxoguanine-mediated transcriptional mutagenesis causes Ras activation in mammalian cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (48), 18877-18882 (2008).
  6. Jiricny, J. The multifaceted mismatch-repair system. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 7 (5), 335-346 (2006).
  7. Hanawalt, P. C., Spivak, G. Transcription-coupled DNA repair: two decades of progress and surprises. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 9 (12), 958-970 (2008).
  8. Kanaar, R., Wyman, C., Rothstein, R. Quality control of DNA break metabolism: in the 'end', it's a good thing. EMBO Journal. 27 (4), 581-588 (2008).
  9. Lemaitre, C., et al. Nuclear position dictates DNA repair pathway choice. Genes & Development. 28 (22), 2450-2463 (2014).
  10. Lieber, M. R. The mechanism of double-strand DNA break repair by the nonhomologous DNA end-joining pathway. Annual Review of Biochemistry. 79, 181-211 (2010).
  11. Lambert, S., Lopez, B. S. Characterization of mammalian RAD51 double strand break repair using non-lethal dominant-negative forms. EMBO Journal. 19 (12), 3090-3099 (2000).
  12. Xu, S., et al. p300-mediated acetylation of histone demethylase JMJD1A prevents its degradation by ubiquitin ligase STUB1 and enhances its activity in prostate cancer. Cancer Research. , (2020).
  13. Kastan, M. B., Bartek, J. Cell-cycle checkpoints and cancer. Nature. 432 (7015), 316-323 (2004).
  14. Roy, R., Chun, J., Powell, S. N. BRCA1 and BRCA2: different roles in a common pathway of genome protection. Nature Reviews Cancer. 12 (1), 68-78 (2011).
  15. Krenning, L., vanden Berg, J., Medema, R. H. Life or Death after a Break: What Determines the Choice. Molecular Cell. 76 (2), 346-358 (2019).
  16. Rogakou, E. P., Pilch, D. R., Orr, A. H., Ivanova, V. S., Bonner, W. M. DNA double-stranded breaks induce histone H2AX phosphorylation on serine 139. Journal of Biological Chemistry. 273 (10), 5858-5868 (1998).
  17. Caron, P., et al. WWP2 ubiquitylates RNA polymerase II for DNA-PK-dependent transcription arrest and repair at DNA breaks. Genes & Development. 33 (11-12), 684-704 (2019).
  18. Caron, P., et al. Cohesin protects genes against gammaH2AX Induced by DNA double-strand breaks. PLoS Genetics. 8 (1), 1002460 (2012).
  19. Berkovich, E., Monnat, R. J., Kastan, M. B. Assessment of protein dynamics and DNA repair following generation of DNA double-strand breaks at defined genomic sites. Nature Protocols. 3 (5), 915-922 (2008).
  20. Paques, F., Duchateau, P. Meganucleases and DNA double-strand break-induced recombination: perspectives for gene therapy. Current Gene Therapy. 7 (1), 49-66 (2007).
  21. Pankotai, T., Bonhomme, C., Chen, D., Soutoglou, E. DNAPKcs-dependent arrest of RNA polymerase II transcription in the presence of DNA breaks. Nature Structural & Molecular Biology. 19 (3), 276-282 (2012).
  22. Iacovoni, J. S., et al. High-resolution profiling of gammaH2AX around DNA double strand breaks in the mammalian genome. EMBO Journal. 29 (8), 1446-1457 (2010).
  23. Poinsignon, C., et al. Phosphorylation of Artemis following irradiation-induced DNA damage. European Journal of Immunology. 34 (11), 3146-3155 (2004).
  24. Varga, D., Majoros, H., Ujfaludi, Z., Erdelyi, M., Pankotai, T. Quantification of DNA damage induced repair focus formation via super-resolution dSTORM localization microscopy. Nanoscale. 11 (30), 14226-14236 (2019).
  25. Kim, J. A., Kruhlak, M., Dotiwala, F., Nussenzweig, A., Haber, J. E. Heterochromatin is refractory to gamma-H2AX modification in yeast and mammals. Journal of Cell Biology. 178 (2), 209-218 (2007).
  26. Daniels, D. L., Urh, M. Isolation of intracellular protein--DNA complexes using HaloCHIP, an antibody-free alternative to chromatin immunoprecipitation. Methods in Molecular Biology. 977, 111-124 (2013).

Tags

Биология Выпуск 174 Репарация ДНК иммунопреципитация хроматина флуоресцентная микроскопия сайт-специфические DSB иммуноокрашивание
Визуализация и количественная оценка повреждения ДНК на основе эндонуклеазы
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Pantazi, V., Berzsenyi, I., Borsos,… More

Pantazi, V., Berzsenyi, I., Borsos, B. N., Pankotai, T. Visualizing and Quantifying Endonuclease-Based Site-Specific DNA Damage. J. Vis. Exp. (174), e62175, doi:10.3791/62175 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter