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Biology

Visualizando e quantificando danos de DNA específicos do local baseados em endonuclease

Published: August 21, 2021 doi: 10.3791/62175
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1
1Institute of Pathology, Faculty of Medicine, University of Szeged
* These authors contributed equally

Summary

Este artigo introduz passos essenciais de imunoprecipitação de imunossuagem e cromatina. Esses protocolos são comumente usados para estudar processos celulares relacionados ao dano de DNA e para visualizar e quantificar o recrutamento de proteínas implicadas na reparação do DNA.

Abstract

As células são continuamente expostas a vários agentes prejudiciais ao DNA, induzindo diferentes respostas celulares. A aplicação de abordagens bioquímicas e genéticas é essencial para revelar eventos celulares associados ao recrutamento e montagem de complexos de reparação de DNA no local do dano ao DNA. Nos últimos anos, várias ferramentas poderosas foram desenvolvidas para induzir danos de DNA específicos do local. Além disso, novas técnicas seminais nos permitem estudar esses processos no nível de resolução unicelular usando células fixas e vivas. Embora essas técnicas tenham sido utilizadas para estudar vários processos biológicos, aqui apresentamos os protocolos mais amplamente utilizados no campo da reparação de DNA, Fluorescence Imunostaining (IF) e Chromatin Imunoprecipitation (ChIP), que em combinação com danos de DNA específicos do local baseados em endonuclease possibilitam visualizar e quantificar a ocupação genômica de fatores de reparação de DNA de forma direcionada e regulamentada, respectivamente. Essas técnicas fornecem ferramentas poderosas para os pesquisadores identificarem novas proteínas ligadas ao lócus genômico danificado, bem como suas modificações pós-translacionais necessárias para sua regulação de ajuste fino durante a reparação do DNA.

Introduction

Nosso genoma está constantemente sendo desafiado por vários agentes prejudiciais ao DNA. Esses ataques podem derivar de fontes ambientais, como luz UV ou irradiação, bem como de fontes endógenas, como subprodutos metabólicos causados por estresse oxidativo ou erros de replicação1,2. Essas lesões podem afetar a integridade de um ou ambos os fios de DNA, e se os erros gerados se tornarem persistentes, muitas vezes levam a translocações e instabilidade do genoma, o que pode resultar em tumorigênese3,4. Para manter a integridade do genoma, vários sistemas de reparo foram desenvolvidos durante a evolução. De acordo com as propriedades químicas e físicas de tipos específicos de dano de DNA, múltiplos mecanismos de reparação podem ser ativados. Incompatibilidades, locais abasic, quebras de fios únicos e 8-oxoguanina (8-oxoG) podem ser removidos por reparo de incompatibilidade ou via de reparo de excisão base5,6. Lesões causadas por fotoprodutos induzidos por UV e adutos volumosos podem ser reparadas pelo reparo nucleotídeo-excisão (NER) ou pelo processo de quebra de dois fios (DSBR) de DNA7,8. O NER consiste em duas subseções principais: NER (TC-NER) e NER genômica global (GG-NER). Em relação à fase do ciclo celular, após a indução de quebra de duplo fio do DNA, duas subsomidas podem ser ativadas: junção final não homólogo (NHEJ) e recombinação homólogo (HR)1,9. O NHEJ, que é o caminho dominante nas células de descanso, pode ser ativado em todas as fases do ciclo celular, representando uma via mais rápida, mas propensa a erros10. Por outro lado, o RH é uma via livre de erros, na qual os DSBs são reparados com base na pesquisa seqüencial-homologia dos cromátides irmãs, portanto está presente principalmente nas fases de ciclo celular S e G211. Além disso, a junção final mediada pela microhomologia (MMEJ) é outro mecanismo de reparo DSB, distinto dos mencionados, baseado em uma maneira ku70/80 e RAD51 independente de religação de sequências microhomologos anteriormente resseccionadas flanqueando as extremidades de DNA quebradas. Portanto, o MMEJ é considerado propenso a erros e altamente mutagênico12. Durante o reparo do DNA, os DSBs podem induzir a resposta a danos de DNA (DDR), que resulta na ativação de quinases de ponto de verificação que param o ciclo celular durante o reparo13,14,15. O DDR é ativado como resposta ao recrutamento e ampla disseminação dos principais atores iniciadores do processo de reparo em torno das lesões, contribuindo para a formação de um foco de reparo. Nesta cascata de sinalização inicial, o ATM (Ataxia Telangiectasia Mutated) quinase desempenha um papel fundamental ao catalisar a fosforilação da variante histone H2AX em Ser139 (referida como γH2AX) em torno da lesão16. Este evento inicial é responsável pelo recrutamento de fatores adicionais de reparo e pelo início de processos de reparo a jusante. Embora a função exata das proteínas recrutadas no foco de reparo ainda não tenha sido totalmente caracterizada, a formação e a dinâmica dos focos de reparação têm sido investigadas por diversos laboratórios. Estes marcadores são amplamente usados para seguir a cinética de reparo, mas seu papel preciso durante o processo de reparo permanece indescritível. Devido à grande importância, mas má compreensão dos processos celulares relacionados à reparação de DNA, vários métodos foram desenvolvidos até agora para induzir e visualizar o DDR.

Vários métodos e sistemas foram estabelecidos para induzir o tipo desejado de dano de DNA. Por exemplo, alguns agentes [como neocarzinostatina (NCS), fleomicina, bleomicina, γ-irradiação, UV] podem induzir um grande número de quebras aleatórias de DNA em posições genômicas não preditivas, enquanto outras (endonucleases, como AsiSI, I-PpoI ou I-SceI, bem como tira laser) podem induzir quebras de DNA em loci genômica conhecida17,18,19,20,21. Aqui, focamos nas técnicas baseadas em endonuclease atualmente utilizadas para estudar o DDR em células de mamíferos e leveduras. Além de destacar os princípios dessas técnicas, enfatizamos suas vantagens e desvantagens.

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Protocol

1. Imunodeseção de proteínas específicas

  1. Preparação da cultura celular e configuração experimental
    1. Manter células U2OS em monocamadas em cultura DMEM meio suplementado com soro de bezerro fetal de 10%, 2 mM de glutamina e 1% solução antibiótico-antimicomolética.
      NOTA: Para indução de dano de DNA à base de endonuclease, use meio tratado com carvão ou sem esteroides para evitar vazamentos no sistema.
    2. Cultivar células em um ambiente umidificado de 5% de CO2 a 37 °C até 80% de confluência, renovando o meio a cada 2-3 dias.
    3. Aspire o meio e lave as células com 1x PBS. Desapegar células com solução Trypsin-EDTA. Quando as células se desprendem, pare a atividade de trippsina adicionando meio de cultura às células, gerando uma suspensão celular.
    4. Conte as células usando uma câmara de contagem de células. Placa 2 x 104 células/mL/bem em uma placa de 24 poços, com tampas redondas estéreis de 12 mm em cada poço.
    5. Incubar células por 24 h a 37 °C em uma atmosfera umidificada de 5% de CO2 para permitir o apego às tampas.
    6. Trate as células com 10 ng/mL de neocarzinostatina (NCS) ao canalizar diretamente o agente nocivo para o meio cultivado. Incubar as células com o meio contendo NCS por 15 minutos, depois lavá-las com 1x PBS e adicionar meio de cultura fresco e suplementado às células. Caso contrário, use o agente apropriado (ou seja, 4-OHT) para induzir DSBs através de sistemas baseados em endonuclease sem atualizar o médio22.
      NOTA: Alternativamente, use a irradiação para induzir danos ao DNA, variando de 30 min até 8h de tempo de recuperação usando fluxo de nêutrons entre 2-20 Gy23.
    7. Incubar células por 1-8 h a 37 °C em uma atmosfera umidificada de 5% de CO2 para seguir a cinética da reparação de DNA.
  2. Fixação de células
    NOTA: 300-500 μL de soluções/poços devem ser usados nas seguintes etapas (etapas 1.2-1.5) para cobrir todas as células adequadamente. Cada etapa de incubação e lavagem (exceto a incubação de anticorpos) deve ser realizada em um agitador orbital com agitação suave.
    1. Após a indução e incubação de células do DSB, remova o meio das células anexadas e lave as células uma vez com 1x PBS.
    2. Fixar células com solução de 4% de formaldeído-PBS por 20 min a 25 °C.
  3. Permeabilização das células
    1. Remova a solução de fixação e lave as células três vezes com 1x PBS por 5 minutos cada.
    2. Remova o PBS e adicione 0,2% Triton X-100 dissolvido em PBS. Incubar as amostras por 20 minutos.
  4. Bloqueio de sites de vinculação não específicos
    1. Lave as células três vezes com 1x PBS.
    2. Bloqueie locais de ligação não específicos com 5% de BSA (Bovine Serum Fraction V albumin) diluído em PBST (1x PBS complementado com 0,1% Tween-20), e incubar as amostras permeabilizadas por pelo menos 20 min.
  5. Coloração de imunofluorescência
    1. Adicione a quantidade adequada de anticorpos primários (ou seja, anti-γH2AX, anti-DNA-PKcs) diluídos em 1% de solução BSA-PBST. Coloque cada deslizamento de cabeça para baixo em um filme de parafina sobre uma gota de 10 μL do anticorpo anti-γH2AX diluído.
      NOTA: No caso de co-imunostensão diluir adequadamente ambos os anticorpos na mesma solução BSA-PBST de 1%.
    2. Incubar as amostras em uma câmara de umidade por 1,5 h a 4 °C.
      NOTA: A incubação também pode ser realizada a 4 °C durante a noite.
    3. Coloque as tampas de volta sendo lateral para cima na placa de 24 poços e lave três vezes por 5 min com 1x PBS.
    4. Adicione a quantidade adequada de anticorpos secundários diluídos em 1% BSA-PBST. Coloque cada deslizamento de cabeça para baixo em um filme de parafina sobre uma gota de 10 μL do anticorpo diluído.
    5. Incubar as amostras em uma câmara de umidade a 4 °C por 1 h.
    6. Coloque as tampas de volta sendo lateral para cima na placa de 24 poços e lave três vezes por 5 min com 1x PBS.
    7. Antes de remover a última solução de lavagem PBS, retire delicadamente as tampas usando uma pinça e uma agulha e, em seguida, coloque-as de cabeça para baixo em lâminas de vidro com gotículas de meio de montagem (suplementadas com DAPI).
      NOTA: Evite a formação de bolhas de ar. Quando o meio de montagem seca, recomenda-se selar as bordas das tampas com esmalte para evitar o encolhimento das amostras.

2. Imunoprecipitação de cromatina

  1. Coleta celular, crosslinking, lise celular e nuclear e fragmentação de DNA
    1. Cultura aproximadamente 5 x 106 células/mL em um prato de 150 mm para cada amostra.
    2. Remova o meio de cultura e lave as células duas vezes com 1x pbs gelado.
    3. Fixar as células com 1% de solução formaldeído-PBS, colocar as placas em um agitador orbital e agitar suavemente por 20 minutos.
      NOTA: O formaldeído é volátil; sempre prepare uma nova solução de trabalho. Em alguns casos, a solução de formaldeído contém metanol para estabilizá-lo, mas é melhor usar uma solução livre de metanol para evitar interferências com reações a jusante.
    4. Pare a fixação com 125 mM de glicina e incuba em um agitador orbital com agitação suave por 5 min a 25 °C.
    5. Coloque as placas no gelo e lave duas vezes com 1x PBS gelado.
    6. Raspe as células em 1x PBS gelado e transfira-as para tubos cônicos de 15 mL.
    7. Centrifugar as células a 2.500 x g por 5 min a 4 °C.
    8. Aspire cuidadosamente o supernasciente e resuspenque a pelota em 2 mL de tampão de lise celular [5 mM PIPES pH 8.0, 85 mM KCl, 0,5% NP-40, 1x PIC (coquetel inibidor de protease)] e incubar no gelo por 10 minutos.
    9. Centrifugar a suspensão da célula a 2.500 x g por 5 min a 4 °C.
    10. Descarte cuidadosamente o supernasciente e resuspenque a pelota em 500-1.500 μL de tampão de lise nuclear (50 mM Tris-HCl pH 8.0, 10 mM EDTA pH 8.0, 0,8% SDS, 1x PIC) e incubar no gelo por 30-60 min. Transfira o lise para um tubo cônico de poliestireno adequado para a sônicação.
      NOTA: Uma vez que o tampão de lise nuclear contém SDS, ele precipitará no gelo, e a solução ficará branca. A solução deve tornar-se transparente após a sônicação.
    11. Sonicar o lise para cisalhamento dna para um tamanho médio de fragmento de 300-1.000 bp.
      NOTA: Os ciclos e condições de sônica apropriadas devem ser definidos de acordo com o tipo de célula e o equipamento de sônica. Fragmentos menores que 200 bp não são adequados para ChIP, porque as interações nucleossomo-DNA podem ser interrompidas.
  2. Reversão do crosslinking, determinação dos tamanhos de fragmentos sonicados
    1. Tire 100 μL da amostra sonicada para verificar o tamanho do fragmento da cromatina sônica. O restante da cromatina deve ser armazenado a −80 °C.
    2. Adicione 0,5 mg/mL RNase A a cada 100 μL da amostra e incuba-os a 37 °C por 20 min para ativar o RNase.
    3. Incubar as amostras a 65 °C durante a noite.
    4. No dia seguinte, adicione 500 μg/mL de Proteinase K e 0,5% SDS, e incubar as amostras a 50 °C por 3h.
    5. Adicione 0,5 volume de fenol e 0,5 volume de mistura de álcool clorofórmio-isoamílico (24:1) a cada amostra.
    6. Vórtice por 1 min.
    7. Centrifugar a 13.000 x g por 10 min.
    8. Transfira a fase aquosa superior para um novo tubo de microcentrífuga.
    9. Adicione 1 volume de mistura de clorofórmio-isoamílico (24:1) a cada amostra.
    10. Vórtice por 1 min.
    11. Centrifugar a 13.000 x g por 10 min.
    12. Transfira a fase aquosa superior para um novo tubo de microcentrífuga.
    13. Adicione 2,5 volumes de 96% de etanol e 0,1 volume de 3 M de PH na-acetato 5,2.
    14. Incubar por pelo menos 20 min a −80 °C.
    15. Centrifugar as amostras a 13.000 x g por 10 min a 4 °C.
    16. Retire o etanol e lave a pelota com 400 μL de 70% de etanol.
    17. Centrifugar as amostras a 13.000 x g por 10 min a 4 °C.
    18. Retire o etanol e o ar seque a pelota.
    19. Resuspend a pelota em 10 μL de TE.
    20. Execute as amostras em um gel de 0,8% de agarose. O tamanho da cromatina sônica deve ser de cerca de 500 bp.
      NOTA: Use tampão de carregamento livre de bromofenol azul porque o tamanho deste corante é de aproximadamente 500 bp, o que pode perturbar a detecção adequada de fragmentos de cromatina. Em vez disso, recomenda-se usar tampão de carga complementado com xileno-cianola, que é de aproximadamente 3.000 bp.
    21. Se o tamanho da cromatina for aceitável, dilui as amostras de cromatina congelada da etapa 2.1. em 3 volumes de tampão de diluição (10 mM Tris-HCl pH 8.0, 0,5 mM EGTA pH 8.0, 1% Triton X-100, 140 mM NaCl, 1x PIC) e misture as amostras via rotação por 10 min a 4 °C.
      NOTA: Esta etapa é necessária para diluir o SDS presente no tampão de lise nuclear para evitar interferências com reações a jusante, incluindo a medição da concentração de cromatina.
    22. Meça a concentração de DNA das amostras de cromatina em 260/280 nm usando um espectrofotômetro.
  3. Preparação de contas, pré-limpeza e imunoprecipitação
    1. Prepare contas (anti-coelho ou IgG de camundongos) para as etapas de pré-limpeza e imunoprecipitação. Lave contas duas vezes por 10 min a 4 °C com tampão RIPA (50 mM Tris-HCl pH 8.0, 1 mM EDTA pH 8.0, 1% Triton X-100, 0,1% Na-DOC, 0,1% SDS, 150 mM NaCl e 1X PIC).
    2. Resuspenha as contas no mesmo volume do buffer RIPA da etapa 2.3.1.
    3. Pré-claro 25-30 μg chromatina de cada amostra com 4 μL das contas via rotação para 1-2 h a 4 °C.
      NOTA: Adicione o buffer RIPA a cada amostra de cromatina até 500 μL de volume final para deixar as amostras se misturarem adequadamente sob rotação. Não se esqueça de tirar cromatina para NAC (No Antibody Control) e TIC (Total Input Control) no caso de cada conjunto amostral. Os TICs exigem apenas um volume final de até 200 μL.
    4. Precipitar as contas com um ímã e transferir o supernatante para um novo tubo de microcentrífuga.
    5. Adicione a quantidade apropriada de anticorpo a cada amostra de cromatina (exceto NAC e TIC) e gire durante a noite a 4 °C.
    6. No dia seguinte, adicione 40 μL de contas lavadas a cada amostra (exceto TIC) e incuba-as durante a noite, girando a 4 °C.
  4. Lavagem
    1. Lave uma vez com 300 μL de tampão de sal baixo (20 mM Tris-HCl pH 8.0, 150 mM NaCl, 2 mM EDTA pH 8.0, 1% Triton X-100, 0,1% SDS, 1x PIC) por 10 min via rotação a 4 °C.
    2. Lave uma vez com 300 μL de tampão de sal alto (20 mM Tris-HCl pH 8.0, 300 mM NaCl, 2 mM EDTA pH 8.0, 1% Triton X-100, 0,1% SDS, 1x PIC) por 10 min via rotação a 4 °C.
    3. Lave uma vez com 300 μL de tampão LiCl (250 mM LiCl, 1% NP-40, 1% Na-DOC, 1 mM EDTA pH 8.0, 10 mM Tris-HCl pH 8.0, 1x PIC) para 10 min via rotação a 4 °C.
    4. Lave duas vezes com 300 μL de TE (10 mM Tris-HCl pH 8.0, 1 mM EDTA pH 8.0) para 10 min via rotação, para a primeira lavagem a 4 °C, e a segunda lavagem a 25 °C.
  5. Eluição
    1. Adicione 200 μL do tampão de elução (1% SDS e 100 mM NaHCO3) às contas e incubar a 65 °C em um termelétrica por 15 minutos com agitação contínua (aproximadamente 400 RPM). Transfira o supernatante para um novo tubo e contas elute novamente em 200 μL de tampão de Elução. Combine eluatos (volume final de 400 μL).
    2. Adicione NaCl a uma concentração final de 200 mM em cada amostra. Suplemente as amostras TIC com 200 μL de tampão de elução e adicione NaCl também.
      NOTA: A partir desta etapa, a TIC deve ser tratada nas mesmas condições das outras amostras.
    3. Incubar as amostras a 65 °C (sem tremer) por pelo menos 6 h.
    4. Adicione 1 mL de etanol frio 100% a cada amostra, gire os tubos duas vezes para misturar e precipitar o DNA durante a noite a −80 °C.
    5. No dia seguinte, centrífuga por 30 min a 13.000 x g a 4 °C.
    6. Descarte o supernasce e lave a pelota com 70% de EtOH.
    7. Centrifugar as amostras a 13.000 x g por 10 min a 4 °C.
    8. Descarte o supernatante e o ar seque as pelotas.
    9. Resuspenque as pelotas em 100 μL de TE e adicione 0,5 mg/mL de RNase A a cada amostra. Incubar a 37 °C por 20 min para ativar o RNase.
  6. Reversão do crosslinking
    1. Adicione 500 μg/mL de Proteinase K e 0,5% SDS e incuba as amostras a 50 °C por 2 h.
      NOTA: Se seguir para ChIP-seq, evite a extração fenol-clorofórmio, pois inibe o processo de NGS a jusante. Em vez disso, recomenda-se usar um kit comercialmente disponível (ver Tabela de Materiais).
    2. Adicione 0,5 volume de fenol e 0,5 volume de mistura de clorofórmio-isoamil (24:1) a cada amostra.
    3. Vórtice por 1 min.
    4. Centrifugar a 13.000 x g por 10 min.
    5. Transfira a fase aquosa superior para um novo tubo de microcentrífuga.
    6. Adicione 1 volume de mistura de clorofórmio-isoamílico (24:1) a cada amostra.
    7. Vórtice por 1 min.
    8. Centrifugar a 13.000 x g por 10 min.
    9. Transfira a fase aquosa superior para um novo tubo de microcentrífuga.
  7. Extração de DNA
    1. Adicione 2,5 volumes de 96% de etanol e 0,1 volume de 3 M de PH na-acetato 5,2.
    2. Incubar por pelo menos 20 min a −80 °C.
    3. Centrifugar as amostras a 13.000 x g por 10 min a 4 °C.
    4. Retire o etanol e lave a pelota com 400 μL de 70% de etanol.
    5. Centrifugar as amostras a 13.000 x g por 10 min a 4 °C.
    6. Retire o etanol e o ar seque a pelota.
    7. Resuspend a pelota em 50 μL de TE.

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Representative Results

Estudar processos de reparo induzidos pelo DSB direcionados ao local nas células pode ser alcançado através de transfecção estável ou transitória. No entanto, deve-se notar que a transfecção estável garante uma população celular homogênea, o que dá uma resposta celular unificada e, portanto, mais confiável. No caso da transfecção transitória, apenas uma pequena proporção da população celular ocupa e mantém o plasmídeo, o que introduz a diversidade no experimento. Estabelecer sistemas celulares baseados em endonuclease ER-I ou ER-AsiSI requerem uma população celular confluente de 50%, que é mais eficazmente transfeinada com plasmídeos codificando a endonuclease. Para a transfecção, também podem ser utilizados reagentes de transfecção disponíveis comercialmente ou métodos baseados em infecção viral. Se uma técnica de visualização microscópica for aplicada e a transfecção transitória for necessária, os DSBs direcionados podem ser induzidos pela adição de 4-OHT 24 h após a transfecção, que se liga às endonucleases fundidas pelo ER e permite a translocação nuclear e a indução de DSB. Para determinar os pontos de tempo mais adequados, a microscopia baseada em imunofluorescência e a detecção de manchas ocidentais de γH2AX em diferentes pontos de tempo após o tratamento 4-OHT podem ser realizadas. Sob condições fisiológicas, pode-se detectar um máximo de 10-15 focos γH2AX por célula, e a formação de fortes focos de reparação pode ser desencadeada por endonucleases (ou várias outras técnicas não discutidas aqui, por exemplo, microirradição a laser). Uma endonuclease I-PpoI típica leva à formação de sinais γH2AX elevados ao redor do nucleólus induzindo DSBs no DNA ribossômico (rDNA). Se as quebras forem reparadas pelo NHEJ ou pelo RH, o número de focos de reparo diminui com o tempo. Por essa razão, são recomendados pontos de tempo representativos em 0h, 30 min, 1, 2, 4 e 8h após os tratamentos 4-OHT. Para rastrear os processos de reparação de DNA, a linha celular mais usada é o U2OS, já que todas as vias de reparo conhecidas são totalmente funcionais nessas células. Ao investigar várias proteínas nas mesmas células, a co-localização pode ser estudada combinando anticorpos conjugados com diferentes fluoroforos com diferentes comprimentos de onda de emissão criados em diferentes espécies animais, como mostrado na Figura 1. Nela, a indução de DSBs através de uma linha de célula estável indutível é representada, que se baseia na endonuclease de restrição ER-AsiSI fundida com a tag hemagglutinina (HA). A doxiciclina pode induzir a expressão e o sequestro de HA-ER-AsiSI no citoplasma que pode ser rastreado usando um anticorpo contra HA (Figura 1. terceira coluna, segunda crua). A incubação por 4h com 4-OHT, 24 h após a adição de doxiciclina, pode induzir um alto número de DSBs desde que a endonuclease foi translocada para o núcleo (Figura 1. terceira coluna, terceira e segunda coluna, terceira crua). Os DSBs podem ser visualizados usando um anticorpo que reconhece γH2AX.

Figure 1
Figura 1: A microscopia de imunofluorescência é usada para detectar γH2AX em células cultivadas expressando HA-ER-AsiSI. A adição de DOX (doxiciclina) ativa a expressão citoplasmática de HA-ER-AsiSI e 4-OHT (4-hidroxytamoxifen) (4h) induz a translocação nuclear da proteína de fusão, o que leva à indução de DSBs em posições genômicas conhecidas. A coloração ha (hemagglutinina) (anticorpo anti-HA) representa a proteína de fusão HA-ER-AsiSI em verde, e a indução de quebras é verificada pela coloração γH2AX (anticorpo anti-γH2AX) em vermelho. As barras de escala representam 20 μm. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

A co-localização de proteínas de reparo no local do dano indica que elas são recrutadas para o mesmo local da lesão de DNA, mas não necessariamente interagem entre si. A resolução da microscopia confocal é de aproximadamente 300 nm; para determinar o padrão de ligação de proteínas de reparo específicas no local de ruptura, a microscopia de superrespeso (STORM) é recomendada 24. No entanto, esse método requer equipamentos microscópicos caros e um pesquisador especialista. Alternativamente, o padrão de ligação das proteínas de reparação pode ser examinado pela imunoprecipitação de cromatina utilizando linhas de células estáveis DIvA ou U2OS-pEP15, que podem expressar endonucleases AsisI e I-PpoI de forma regulamentada,respectivamente 17,21. Após a adição de 4-OHT, ambos os endonucleases podem cortar o DNA de forma específica de sequência que nos dá a oportunidade de projetar primers específicos de lócus para os locais de ruptura esperados e suas regiões genômicas circundantes. Aplicando anticorpos γH2AX na parte de imunoprecipitação do ChIP, podemos seguir temporalmente a cinética de reparação de DNA em diferentes condições (como silenciar ou inibição de certos fatores de reparação de interesse, ou seja, DNA-PKcs). Um resultado experimental típico obtido usando ChIP-qPCR está representado na Figura 2. Nela, o enriquecimento temporal do γH2AX é demonstrado como uma resposta aos danos de DNA induzidos pelo I-PpoI. Na parte esquerda da imagem, o sinal γH2AX detectado oportunamente é mostrado no local de ruptura enquanto na parte direita, a distribuição γH2AX é representada em uma região genética de controle na qual os DSBs não foram induzidos.

Figure 2
Figura 2: Enriquecimento temporal de γH2AX determinado pela imunoprecipitação de cromatina em resposta ao dano de DNA induzido pelo I-PpoI. À esquerda, sinal γH2AX no local de ruptura; direito, distribuição γH2AX em uma região de controle onde os DSBs não foram induzidos (anticorpo anti-γH2AX). Os resultados representados são derivados de um experimento biológico, e as barras de erro indicam as variações das réplicas da amostra correspondente. N=3. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

Embora a reparação de DNA seja um campo de pesquisa relativamente recente, nosso conhecimento está se expandindo rapidamente com a ajuda de vários métodos bioquímicos e microscópicos. Preservar informações genéticas é crucial para as células, uma vez que mutações que ocorrem em genes envolvidos em processos de reparação estão entre as principais causas da tumorigênese e, portanto, elucidar os passos-chave das vias de reparação do DNA é essencial.

Técnicas bioquímicas (ou seja, mancha ocidental, imunoprecipitação, espectrometria de massa, etc.) requerem grande número de células e os processos de reparo estudados representam um instantâneo da população celular desejada. Realizar experimentos chip é trabalhoso, problemático e muitas considerações devem ser levadas em conta ao projetar experimentos específicos para estudar o processo de reparo do DSB. As seguintes etapas são alguns exemplos: (I) as células devem ser adequadamente lísedas; é altamente recomendável aplicar um método de lisação em duas etapas usando um tampão de lise celular e nuclear separado para garantir maior acessibilidade à cromatina fração de cromatina (II) não deve ser super ou subsônica; as condições adequadas de sônica devem ser otimizadas para cada tipo celular de antemão (III) a quantidade adequada de anticorpo purificado deve ser determinada uma vez que anticorpos contra a mesma proteína de diferentes empresas apresentam características não idênticas (IV) para a imunoprecipitação eficiente, 25-30 ug cromatina inicial deve ser usada em cada condição (V) o tempo apropriado de fixação deve ser otimizado, como a superfixação pode resultar em resultados falsos positivos, cruzando os complexos proteicos distantes e a subfixação pode impedir a ligação cruzada adequada entre o DNA e a proteína desejada (VI) com base no anticorpo aplicado, o tipo das contas (proteína A ou G) deve ser cuidadosamente determinada (VII) durante as etapas de lavagem, a ordem dos tampões de lavagem deve ser completamente mantida para evitar a liberação do anticorpo das contas (VIII) durante a extração, a ordem dos tampões de lavagem deve ser completamente mantida para evitar a liberação do anticorpo das contas (VIII) durante a extração, a ordem dos tampões de lavagem deve ser completamente mantida para evitar a liberação do anticorpo das contas (VIII) durante a extração, a ordem dos tampões de lavagem deve ser completamente mantida para evitar a liberação do anticorpo das contas (VIII) durante a extração, a ordem dos tampões de lavagem deve ser completamente mantida para evitar a liberação do anticorpo das contas (VIII) durante a extração, a ordem dos tampões de lavagem deve ser completamente mantida para evitar a liberação do anticorpo das contas (VIII) durante a extração, a ordem dos tampões de lavagem deve ser completamente mantida para evitar a liberação do anticorpo das contas (VIII) durante a extração, a ordem dos tampões de lavagem deve ser completamente mantida para evitar a liberação do anticorpo das contas (VIII) durante a extração, a ordem dos tampões de lavagem deve ser completamente mantida para evitar a liberação do Os traços de fenol devem ser devidamente eliminados para evitar diminuir a eficiência das reações mais a jusante. Uma vez que este método reduz o rendimento do DNA recuperado, nosso conselho pessoal é usar um kit específico de purificação de DNA. Quando todos os pontos críticos foram devidamente abordados, o ChIP pode fornecer dados valiosos para a ocupação da proteína desejada em diferentes loci genômicas e pode desvendar etapas críticas nos processos de reparação de DNA.

No entanto, o ChIP combinado com qPCR é uma abordagem indireta para estudar a distribuição de proteínas em regiões genômicas selecionadas e não permite reconhecer especificamente o local de ligação de DNA ou examinar diretamente a função da proteína. Anticorpos mono ou policlonais usados para capturar os complexos de DNA proteico também podem reagir cruzadamente com outras proteínas que levam a dados falso-positivos e, portanto, os anticorpos usados nesta técnica devem ser de grau ChIP e altamente específicos contra a proteína de interesse. No entanto, o ChIP é uma técnica amplamente utilizada e outras abordagens baseadas nisso foram desenvolvidas, como ChIP-on-chip e ChIP-seq. O primeiro conta com a hibridização dos fragmentos de DNA imunoprecipitados e purificados em uma microarray com uma grande variedade de pequenas sequências aleatórias de DNA que amplificam ainda mais as sequências de annealed fornecendo informações valiosas sobre locais de ligação de proteínas. No entanto, o ChIP-seq emergiu como uma abordagem alternativa atraente, uma vez que fornece mapeamento em todo o genoma de complexos de DNA proteico com maior resolução do que o sequenciamento do genoma chip-on-chip e de alto rendimento. O ChIP-seq revolucionou o campo de reparação do DNA, divulgando locais de ligação de DNA de vários fatores de transcrição fornecendo insights sobre a regulação genética e desvendando paisagens de cromatina em uma escala de genoma25. De acordo com isso, o campo de reparação do DNA tem tremendamente lucrado com o ChIP-seq, uma vez que esses dados desempenham um papel crucial em várias doenças e caminhos biológicos, como a progressão do câncer. No entanto, várias modificações do método ChIP foram desenvolvidas, como o HaloChIP, que não requer anticorpos específicos contra a proteína de interesse, mas sim usa sequências codificando proteínas de ligação de DNA fundidas com HaloTag, que são transfectadas para células e, posteriormente, para crosslinking, os complexos de DNA proteico desejados podem ser capturados usando HaloLink Resin. No entanto, essa técnica se baseia na superexpressão e não no nível endógeno das proteínas desejadas que podem resultar em dados mal interpretados26.

Além disso, técnicas microscópicas fornecem informações valiosas sobre o rastreamento espesso do reparo de danos de DNA, mesmo em um nível de célula única. A rápida melhoria dos anticorpos levantados contra proteínas de reparação específicas levou a uma compreensão mais profunda do mecanismo das subsusidades NER e DSBR, bem como sua regulação pós-translacional. O campo microscópico tem sido revolucionado por técnicas de alta resolução, como a microscopia de super resolução, que permite a visualização de processos celulares induzidos por danos de DNA no nível nucleosômico, além de garantir o mapeamento preciso da co-localizaçãode proteínas 24. No entanto, deve-se notar que a variância nas linhagens celulares deve ser considerada durante o experimento, pois a taxa do reparo pode divergir, o que pode dificultar a interpretação dos resultados. Considerando a rápida evolução da metodologia de imagem de fluorescência e o desenho deliberado da configuração experimental, uma oportunidade preciosa para investigar as respostas celulares e moleculares induzidas por danos de DNA em uma única resolução proteica em um nível de célula única está a caminho da perfeição.

Em conclusão, a combinação de microscopia de superrescopia e metodologia de sequenciamento unicelular pode melhorar significativamente nossa compreensão do campo de reparação de DNA.

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Disclosures

Nenhum

Acknowledgments

Esta pesquisa foi financiada pelo Escritório Nacional de Pesquisa, Desenvolvimento e Inovação, que concede GINOP-2.3.2-15-2016-00020, GINOP-2.3.2.2-15-2016-00036, GINOP-2.2.1-15-2017-00052, EFOP 3.6.3-VEKOP-16-2017-00009, NKFI-FK 132080, a Bolsa de Pesquisa János Bolyai da Academia Húngara de Ciências BO/27/20, ÚNKP-20-5-SZTE-265, bolsa de curto prazo da EMBO 8513 e a Fundação Tempus.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
4-OHT Sigma Aldrich H7904
Agarose Lonza 50004
Antibiotic-Antimycotic Solution (100×), Stabilized Sigma Aldrich A5955
Anti-gamma H2A.X (phospho S139) antibody Abcam ab26350
Bovine Serum Fraction V albumin Biosera PM-T1725
TrackIt™ Cyan/Yellow Loading Buffer Thermo Fisher Scientific 10482035
DMEM with 1.0 g/L Glucose, without L-Glutamine Lonza 12-707F
Doxycycline Sigma Aldrich D9891
Dynabeads™ M-280 Sheep Anti-Mouse IgG Invitrogen 11202D
Dynabeads™ M-280 Sheep Anti-Rabbit IgG Invitrogen 11204D
EDTA Sigma Aldrich E6758
EGTA Sigma Aldrich E3889
Ethanol Molar Chemicals 02910-101-340
Fetal Bovine Serum (South America Origin), EU-approved Gibco ECS0180L
Formaldehyde 37% solution free from acid Sigma Aldrich 1.03999
GlutaMAX™ Supplement Thermo Fisher Scientific 35050038
Glycine Sigma Aldrich 50046
IPure kit v2 Diagenode C03010015
Isoamyl alcohol Sigma Aldrich W205702
LiCl Sigma Aldrich L9650
NaCl Sigma Aldrich S5886
Na-DOC Sigma Aldrich D6750
NaHCO3 Sigma Aldrich S5761
Neocarzinostatin from Streptomyces carzinostaticus Sigma Aldrich N9162
NP-40 Sigma Aldrich I8896
PBS Powder without Ca2+, Mg2+ Sigma Aldrich L182-50-BC
Phenol Sigma Aldrich P4557
PIPES Sigma Aldrich P1851
Polysorbate 20 (Tween 20) Molar Chemicals 09400-203-190
KCl Sigma Aldrich P5405
ProLong™ Gold Antifade Mountant with DAPI Thermo Fisher Scientific P36935
Protease Inhibitor Cocktail Set I Roche 11873580001
Proteinase K Sigma Aldrich P2308
P-S2056 DNAPKcs antibody Abcam ab18192
RNase A Roche 10109169001
CH3COONa Sigma Aldrich S2889
SDS Sigma Aldrich L3771
Tris Acetate-EDTA buffer Sigma Aldrich T6025
Tris-HCl Sigma Aldrich 91228
TRITON X-100 Molar Chemicals 09370-006-340
Trypsin from porcine pancreas Sigma Aldrich T4799
Trypsin-EDTA (0.5%), no phenol red Gibco 15400054

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Biologia Edição 174 reparação de DNA imunoprecipitação de cromatina microscopia fluorescente DSBs específicos do local imunosstaining
Visualizando e quantificando danos de DNA específicos do local baseados em endonuclease
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Pantazi, V., Berzsenyi, I., Borsos,… More

Pantazi, V., Berzsenyi, I., Borsos, B. N., Pankotai, T. Visualizing and Quantifying Endonuclease-Based Site-Specific DNA Damage. J. Vis. Exp. (174), e62175, doi:10.3791/62175 (2021).

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