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Cancer Research

एमआरएनए स्प्लिसिंग परिवर्तनों का अध्ययन करने के लिए E1A मिनीजीन टूल का उपयोग करना

Published: April 22, 2021 doi: 10.3791/62181
Automatic Translation
1, 1, 1
1Faculdade de Ciências Farmacêuticas, Universidade Estadual de Campinas

Summary

यह प्रोटोकॉल कीमोथैरेपी उपचार के बाद वैकल्पिक स्प्लिसिंग विनियमन में अस्वाभाविक कार्य के साथ प्रोटीन की भूमिका का मूल्यांकन करने के लिए एक तेजी से और उपयोगी उपकरण प्रस्तुत करता है।

Abstract

एमआरएनए प्रसंस्करण में अनुवाद के लिए एमआरएनए तैयार करने के लिए कई एक साथ कदम शामिल हैं, जैसे कि 5'कैपिंग, पॉली-ए अतिरिक्त और स्प्लिसिंग। संविलियन स्प्लिसिंग के अलावा, वैकल्पिक एमआरएनए स्प्लिसिंग एक जीन से बहुआयामी प्रोटीन की अभिव्यक्ति की अनुमति देता है। चूंकि इंटरैक्टोम अध्ययन आम तौर पर नए या अज्ञात प्रोटीन के लिए पहला विश्लेषण होता है, इसलिए स्प्लिसिंग कारकों के साथ चारा प्रोटीन का संबंध एक संकेत है कि यह एमआरएनए स्प्लिसिंग प्रक्रिया में भाग ले सकता है, लेकिन यह निर्धारित करने के लिए कि किस संदर्भ में या जीन को विनियमित किया जाता है, एक अनुभवजन्य प्रक्रिया है। इस फ़ंक्शन का मूल्यांकन करने के लिए एक अच्छा प्रारंभिक बिंदु शास्त्रीय मिनीजीन उपकरण का उपयोग कर रहा है। यहां हम विभिन्न सेलुलर तनाव उत्तेजनाओं के बाद वैकल्पिक स्प्लिसिंग परिवर्तनों का मूल्यांकन करने के लिए एडेनोवायरल E1A मिनीजीन उपयोग प्रस्तुत करते हैं। हमने विभिन्न तनाव वाले उपचारों के बाद नेक 4 प्रोटीन को स्थिर रूप से HEK293 में E1A मिनीजीन के स्प्लिसिंग का मूल्यांकन किया। प्रोटोकॉल में E1A मिनीजीन ट्रांसफैक्शन, सेल ट्रीटमेंट, आरएनए एक्सट्रेक्शन और सीडीएनए संश्लेषण शामिल हैं, जिसके बाद पीसीआर और जेल विश्लेषण और E1A स्प्लिट वेरिएंट का परिमाणीकरण शामिल है। विशिष्ट उपचारों के साथ संयुक्त इस सरल और अच्छी तरह से स्थापित विधि का उपयोग सेलुलर प्रक्रियाओं पर प्रकाश डालने के लिए एक विश्वसनीय प्रारंभिक बिंदु है या क्या जीन को एमआरएनए स्प्लिसिंग द्वारा विनियमित किया जा सकता है।

Introduction

स्प्लिसिंग यूकेरियोटिक एमआरएनए प्रसंस्करण में सबसे महत्वपूर्ण चरणों में से एक है जो एक साथ 5'mRNA कैपिंग और 3'mRNA पॉलीडेनिलेशन होता है, जिसमें एक्सॉन जंक्शन के बाद इंट्रोन हटाने शामिल हैं। स्प्लिसियोसोम द्वारा स्प्लिस साइटों (एसएस) की मान्यता, छोटे राइबोन्यूक्लियोप्रोटीन (snRNP U1, U2, U4 और U6), छोटे आरएनए (snRNAs) और कई नियामक प्रोटीन1 युक्त एक राइबोन्यूक्लियोप्रोटीन परिसर स्प्लिसिंग के लिए आवश्यक है।

यूकेरियोट्स में इंट्रॉन हटाने (संविलियन स्प्लिसिंग) के अलावा, इंट्रोन को बनाए रखा जा सकता है और एक्सॉन को बाहर रखा जा सकता है, इस प्रक्रिया को एमआरएनए वैकल्पिक स्प्लिसिंग (एएस) कहा जाता है। वैकल्पिक प्री-एमआरएनए स्प्लिसिंग यूकेरियोटिक जीनोम की कोडिंग क्षमता का विस्तार करता है जिससे अपेक्षाकृत कम संख्या में जीन से बड़ी और विविध संख्या में प्रोटीन का उत्पादन होता है। यह अनुमान लगाया गया है कि 95-100% मानव 100% जिनमें एक से अधिक एक्सोन होते हैं,वैकल्पिक स्प्लिसिंग2,3से गुजर सकते हैं। यह न्यूरोनल डेवलपमेंट, एपोप्टोसिस एक्टिवेशन और सेलुलर स्ट्रेस रिस्पांस4जैसी जैविक प्रक्रियाओं के लिए मौलिक है, जो जीन के एक ही प्रदर्शनों की सूची का उपयोग करके कोशिका कार्य को विनियमित करने के लिए जीव विकल्प प्रदान करता है।

वैकल्पिक स्प्लिसिंग के लिए आवश्यक मशीनरी का उपयोग संविलियन स्प्लिसिंग के लिए किया जाता है और एसएस का उपयोग वैकल्पिक स्प्लिसिंग घटना के लिए मुख्य निर्धारक है। संविलियन स्प्लिसिंग मजबूत स्प्लिसिंग साइटों के उपयोग से संबंधित है, जो आमतौर पर स्प्लिकोसोम मान्यता5के लिए आम सहमति रूपांकनों के समान होते हैं।

वैकल्पिक एक्सोन्स को आम तौर पर अपने सीआईएस-नियामकतत्वों के संविलियन एक्सन की तुलना में कम कुशलता से पहचाना जाता है, 5'SS और 3'SS में दृश्य इन एक्सॉन को फ्लैंक करते हैं, स्प्लिकोसोम के लिए एक अवर बाध्यकारी क्षमता दिखाते हैं। एमआरएनए में एक्सॉन्स (एक्सोनिक स्प्लिसिंग एन्हांसर्स (ईएसएस) और एक्सोनिक स्प्लिसिंग साइलेंसर (ईएसएस)) और इंट्रोनिक स्प्लिसिंग एन्हांसर्स (आईएसईएस) और इंट्रोनिक स्प्लिसिंग एन्लाइजर (आईएसएस) में स्थित एन्हांसर्स या साइलेंसर नाम के क्षेत्र भी शामिल हैं, जो क्रमशः5,विस्तार के उपयोग को बढ़ाते हैं या दमन करते हैं। इन दृश्यों को ट्रांस-नियामक तत्वों, या स्प्लिसिंग कारकों (एसएफ) द्वारा पहचाना जाता है। एसएफएस का प्रतिनिधित्व मुख्य रूप से प्रोटीन के दो परिवारों द्वारा किया जाता है, सेरीन/आर्जिनिन रिच स्प्लिसिंग फैक्टर्स (एसआरएफएस) जो ईएसएस और विषम परमाणु राइबोन्यूक्लियोप्रोटीन (एचएनआरआरपी) के परिवार को बांधते हैं जो ईएसएस दृश्यों5से बांधते हैं ।

वैकल्पिक स्प्लिसिंग को ट्रांस-कारकों के फॉस्फोरिलेशन/डीफोस्फोरिलेशन द्वारा संग्राहक किया जा सकता है जो इंटरैक्शन भागीदारों को संशोधित करता है और स्प्लिसिंग कारकों के सेलुलर स्थानीयकरण6,7,8। स्प्लिसिंग कारकों के नए नियामकों की पहचान करने से स्प्लिसिंग को विनियमित करने के लिए नए उपकरण प्रदान किए जा सकते हैं और इसके परिणामस्वरूप, कुछ कैंसर उपचार।

एक एमआरएनए माइक्रोएरे जीन अभिव्यक्ति प्रोफ़ाइल में अनुफ्रीवा एट अल9,101 सेल लाइनों में स्प्लिकोसोमोमल घटकों के स्तर में लगातार परिवर्तन और विभिन्न तनाव स्थितियों (प्लेटिनम आधारित दवाओं, गामा विकिरण, टोपोसोमरैरेस अवरोधकों, टायरोसिन किनेज़ अवरोधकों और टैक्सेन) के बाद मनाया गया। स्प्लिसिंग पैटर्न और कीमोथेरेपी प्रभावकारिता के बीच संबंध पहले से ही फेफड़ों के कैंसर की कोशिकाओं में प्रदर्शित किया गया है, जो कीमोथेरेपी प्रतिरोधी हैं, कैस्पा-9 वेरिएंट दर10में परिवर्तन दिखा । कीमोथैरेपी पैनल के साथ इलाज की कोशिकाओं प्रो-एपोटोटिक वेरिएंट में वृद्धि के साथ स्प्लिसिंग में परिवर्तन दिखाते हैं। गेब्रियल एटअल. 11 ने विभिन्न सेल लाइनों में सिस्प्लैटिन उपचार के बाद स्प्लिसिंग की कम से कम 700 घटनाओं में परिवर्तन देखा, यह इंगित करता है कि स्प्लिसिंग रास्ते सिस्प्लैटिन-प्रभावित हैं। स्प्लिसिंग मॉड्यूलर ने पहले ही एंटी-ट्यूमरल गतिविधि का प्रदर्शन किया है, जिसमें यह दर्शाया गया है कि स्प्लिसिंग ट्यूमर के विकास के लिए महत्वपूर्ण है और मुख्य रूप से कीमोथेरेपी प्रतिक्रिया12। इसलिए, नए प्रोटीन की विशेषता है जो कीमोथेरेपी जैसे सेलुलर स्ट्रेसर्स एजेंटों के बाद स्प्लिसिंग को विनियमित करते हैं, उपचार की नई रणनीतियों की खोज करने के लिए बहुत महत्वपूर्ण है।

इंटरैक्टोम अध्ययनों से वैकल्पिक स्प्लिसिंग विनियमन के सुराग, विशेष रूप से नए या अस्वाभाविक प्रोटीन के कार्यों की विशेषता के लिए महत्वपूर्ण, एएस में प्रोटीन की वास्तविक भूमिका को सत्यापित करने के लिए अधिक सामान्य और सरल दृष्टिकोण की मांग कर सकते हैं। मिनीजीन स्प्लिसिंग विनियमन को प्रभावित करने वाले प्रोटीन की सामान्य भूमिका के विश्लेषण के लिए महत्वपूर्ण उपकरण हैं। इनमें रुचि के जीन से लेकर वैकल्पिक रूप से कटा हुआ और जीनोमिक क्षेत्रों में13से अधिक के खंड होते हैं . एक मिनीजीन उपकरण का उपयोग करने से वीवो में स्प्लिसिंग के विश्लेषण की अनुमति मिलती है, जैसे कि मिनीजीन की लंबाई जो मामूली है और इसलिए प्रवर्धन प्रतिक्रिया की सीमा नहीं है; एक ही मिनीजीन का मूल्यांकन विभिन्न सेल लाइनों में किया जा सकता है; सभी सेलुलर घटक, मुख्य रूप से उनके विनियमन पोस्ट ट्रांसलेशनल संशोधन (फॉस्फोरिलेशन और सेल डिब्बों में परिवर्तन) मौजूद हैं और13,14को संबोधित किया जा सकता है . इसके अलावा, सेलुलर तनाव के बाद वैकल्पिक स्प्लिसिंग पैटर्न में परिवर्तन देखा जा सकता है और, एक मिनीजीन प्रणाली का उपयोग, विभिन्न उत्तेजनाओं द्वारा संग्राहक किए जा रहे मार्ग की पहचान करने की अनुमति देता है।

पहले से ही वर्णित कई मिनीजीन प्रणालियां हैं जो विभिन्न प्रकार की स्प्लिसिंग घटनाओं के लिए विशिष्ट हैं13,14,हालांकि, प्रारंभिक परख के रूप में, मिनीजीन ई1ए 15 वीवो में 5 के एसएस चयन के अध्ययन के लिए एक बहुत अच्छी तरह से स्थापित वैकल्पिक स्प्लिसिंग रिपोर्टर सिस्टम है। केवल एक जीन, E1A, पांच mRNAs से तीन अलग-अलग 5 'स्प्लिस साइटों और एक प्रमुख या एक छोटे से 3' स्प्लिस साइट16, 17, 18के चयन के आधार पर वैकल्पिक स्प्लिसिंग द्वारा उत्पादित कियाजाताहै। ई 1ए वेरिएंट की अभिव्यक्ति एडेनोवायरल संक्रमण19,20की अवधि के अनुसार बदलती है ।

हमने पहले दिखाया है कि दोनों Nek4 आइसोफॉर्म SRSF1 और hnRNPA1 जैसे स्प्लिसिंग कारकों के साथ बातचीत करते हैं और जबकि आइसोफॉर्म 2 परिवर्तन मिनीजीन E1A वैकल्पिक स्प्लिसिंग, आइसोफॉर्म 1 का उस21में कोई प्रभाव नहीं पड़ता है। क्योंकि आइसोफॉर्म 1 सबसे प्रचुर मात्रा में आइसोफॉर्म है और कीमोथेरेपी प्रतिरोध और डीएनए क्षति प्रतिक्रिया में परिवर्तन करता है, हम मूल्यांकन करते हैं कि क्या यह तनाव की स्थिति में मिनीजीन E1A वैकल्पिक स्प्लिसिंग बदल सकता है।

मिनीजीन परख एक सरल, कम लागत और तेजी से विधि है, क्योंकि यह केवल आरएनए निष्कर्षण, सीडीएनए संश्लेषण, प्रवर्धन और agarose जेल विश्लेषण की जरूरत है, और सेलुलर वैकल्पिक स्प्लिसिंग पैटर्न पर विभिन्न उपचारों के प्रभाव तक हितों के प्रोटीन द्वारा वैकल्पिक स्प्लिसिंग पर संभावित प्रभाव के बाद से मूल्यांकन करने के लिए एक उपयोगी उपकरण हो सकता है।

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Protocol

1. चढ़ाना कोशिकाओं

नोट: इस वर्णित प्रोटोकॉल में, HEK293 स्थिर सेल लाइनों, पहले Nek4 की स्थिर प्रारंभिक अभिव्यक्ति के लिए उत्पन्न21का इस्तेमाल किया गया था, हालांकि, एक ही प्रोटोकॉल कई अन्य सेल लाइनों के लिए उपयुक्त है, जैसे HEK29322,HeLa23,24,25,26,U-2 OS27,COS728,SH-SYY29 बेसल स्थितियों के तहत मिनीजीन E1A आइसोफॉर्म की अभिव्यक्ति का पैटर्न इन कोशिकाओं के बीच भिन्न होता है और प्रत्येक स्थिति के लिए विशेषता होनी चाहिए। यह प्रोटोकॉल स्थिर सेल लाइनों तक सीमित नहीं है। उम्मीदवार प्रोटीन के मूल्यांकन में सबसे आम दृष्टिकोण मिनीजीन की निश्चित राशि के साथ अपनी राशि बढ़ाने के क्षणिक सह-ट्रांसफैक्शन द्वारा है। नॉकआउट कोशिकाओं के लिए भी यही प्रोटोकॉल उपयुक्त है।

  1. वाहन, असंक्रमित और जीएफपी नियंत्रण पर विचार करने वाली प्लेट कोशिकाएं।
  2. दुल्बेको के संशोधित ईगल माध्यम (डीएमईएम) में रुचि के जीन की स्थिर अभिव्यक्ति के साथ संस्कृति HEK293 कोशिकाओं भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS), ४.५ ग्राम/एल ग्लूकोज के 10% के साथ पूरक, 4 एमएमएम एल-ग्लूटामाइन और हाइग्रोमाइसिन बी के 100 माइक्रोग्राम/एमएल के साथ रखरखाव, ऊतक संस्कृति-उपचारित प्लेटों पर 5% सीओ2 में 37 डिग्री सेल्सियस और एक आर्द्र वातावरण।
  3. 0.25% ट्राइप्सिन-ईडीटीए का उपयोग करके स्प्लिट सेल। प्लेट 3 x 105 कोशिकाएं 6-वेल प्लेटों में और उन्हें 5% सीओ 2 में 37 डिग्री सेल्सियस पर24घंटे के लिए इनक्यूबेट करें।
    नोट: ट्रांसफैक्शन के लिए, ट्रांसफैक्शन के बाद सेल डेथ को कम करने के लिए कोशिकाओं को 70-80% कन्फ्यूजेंट होना चाहिए।

2. सेल ट्रांसफैक्शन

नोट: PMTE1A minigene plasmid के 1-2 μg यहां इस्तेमाल किया गया था, लेकिन डीएनए राशि, साथ ही अभिव्यक्ति के समय, विषाक्तता से बचने के लिए ंयूनतम पर रखा जाना चाहिए । उदाहरण के लिए, 30 घंटे के ट्रांसफैक्शन के बाद हेला कोशिकाओं में उच्च विषाक्तता देखी गई, जिसमें 1 माइक्रोग्राम PMTE1A डीएनए था। यहां वर्णित ट्रांसफैक्शन के लिए, लिपिड आधारित ट्रांसफैक्शन रिएजेंट का उपयोग किया गया था

  1. चढ़ाना और ट्रांसफेक्ट HEK293 स्थिर कोशिकाओं के बाद सेल संगम 24 घंटे की जांच करें केवल जब 70-80% ढुलमुल ।
  2. वैक्यूम पंप सिस्टम का उपयोग करने के बजाय, सेल कल्चर माध्यम को एक पिपेट के साथ ध्यान से हटा दें। फिर ध्यान से एंटीबायोटिक दवाओं के बिना पूर्ण DMEM माध्यम के 2 ml जोड़ें और थाली वापस इनक्यूबेटर में डाल दिया ।
  3. ट्रांसफेक्शन बफर (200 μL/well) के साथ एक ट्यूब तैयार करें, 2 μg pMTE1A डीएनए, भंवर जोड़ें और फिर ट्रांसफैक्शन रीएजेंट के 2 माइक्रोन जोड़ें। भंवर फिर से और कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए इनक्यूबेट ।
  4. इनक्यूबेटर से प्लेटें निकालें और ध्यान से ट्रांसफैक्शन मिश्रण ड्रॉपवाइज जोड़ें।
  5. HEK293 स्थिर कोशिकाओं के लिए, ट्रांसफैक्शन के बाद नेक 4 अभिव्यक्ति प्रेरण 6 घंटे के लिए टेट्रासाइक्लिन (0.5 माइक्रोग्राम/एमएल) जोड़ें। मध्यम परिवर्तन जरूरी नहीं है।
    नोट: इस खंड में वर्णित मात्रा/मात्रा एक अच्छी तरह से के लिए कर रहे हैं । एक ही ट्यूब में प्रयोग में इस्तेमाल सभी कुओं के लिए मिश्रण तैयार करें।
  6. ईजीएफपी के साथ ट्रांसफेक्ट करने के लिए एक अच्छी तरह से तैयार करें, या ट्रांसफेक्शन दक्षता का अनुमान लगाने के लिए प्लाज्मिड व्यक्त करने वाला एक और फ्लोरोफोर। कम से कम 40% की ट्रांसफैक्शन दक्षता के साथ बेहतर परिणाम देखे जा सकते हैं, लेकिन कम ट्रांसफैक्शन दक्षता के साथ अच्छे प्रदर्शन पहले देखे गए थे।
  7. को-ट्रांसफैक्शन (ब्याज प्रोटीन और मिनीजीन) का उपयोग करते समय अंतर्जात एमआरएनए से परिणाम प्राप्त करने से बचने के लिए गैर-संक्रमित कोशिकाओं के साथ एक अच्छी तरह से रखें। E1A के मामले में, HEK293 कोशिकाएं पहले से ही E1A जीन30व्यक्त करती हैं।

3. दवाओं की तैयारी

नोट: समय और उपचार की एकाग्रता साहित्य के परिणामों के आधार पर चुना गया था, जो कुछ जीन के लिए वैकल्पिक splicing में परिवर्तन बताते हैं ।

  1. सेल व्यवहार्यता में कोई प्रभाव के साथ वैकल्पिक स्प्लिसिंग प्रेरण के लिए न्यूनतम एकाग्रता निर्धारित करने के लिए परख शुरू करने से पहले एक खुराक-प्रतिक्रिया वक्र प्रदर्शन करें।
  2. इथेनॉल में 5 एमएम एकाग्रता पर एक Paclitaxel स्टॉक समाधान तैयार करें। अंतिम एकाग्रता 1 माइक्रोन है। -20 डिग्री सेल्सियस पर रखें। वाहन नियंत्रण के रूप में 0.02% इथेनॉल का उपयोग करें।
  3. लगभग 0.5 मिलीग्राम प्रति एमएल (1.66 mM) पर 0.9% एनएसीएल में कमजोर करके एक सिस्प्लैटिन समाधान तैयार करें। थर्मल बाथ में लाइट, भंवर और इनक्यूबेट से बचाएं, 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस। अंतिम एकाग्रता 30 माइक्रोन है। एक महीने तक 2-10 डिग्री सेल्सियस पर ताजा या स्टोर तैयार करें।
    नोट: सभी दवाओं को प्रकाश से संरक्षित किया जाना चाहिए।

4. सेल उपचार और संग्रह

नोट: HEK293 स्थिर कोशिकाओं को ट्रांसफैक्शन के बाद 48 घंटे एकत्र किया गया था और इसके लिए ट्रांसफैक्शन के बाद 24 घंटे का इलाज किया गया था क्योंकि उच्चतम नेक 4 अभिव्यक्ति स्तर 48 घंटे के भीतर प्राप्त किया जाता है। हालांकि, इस समय 13S आइसोफॉर्म अभिव्यक्ति (90%) के उच्च स्तर देखे गए थे। 13S आइसोफॉर्म के अनुपात को कम करने के लिए, अधिकतम ट्रांसफेक्शन के बाद कोशिकाओं को 30 घंटे का इलाज और एकत्र करने का प्रयास करें।

  1. आरएनए/DNase फ्री टिप्स और ट्यूब का इस्तेमाल करें । निर्माता की सिफारिश के बाद फिनॉल-क्लोरोफॉर्म रिएजेंट के साथ कुल आरएनए निष्कर्षण करें।
  2. 24 घंटे ट्रांसफैक्शन के बाद फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप का इस्तेमाल कर सेल मॉर्फोलॉजी और ट्रांसफेक्शन एफिशिएंसी को वेरिफाई करें।
  3. सेल संस्कृति माध्यम को हटा दें, अधिमानतः वैक्यूम पंप सिस्टम के बजाय एक पिपेट का उपयोग करें। फिर पहले वर्णित अंतिम एकाग्रता में कीमोथैरेपी के साथ सेल कल्चर माध्यम जोड़ें।
  4. 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट, 18 -24 घंटे के लिए 5% सीओ 2।
  5. एक कंटेनर में सेल संस्कृति माध्यम को त्यागकर आरएनए को इकट्ठा करें और आरएनए निष्कर्षण के 0.5 - 1 मिलियन को सीधे अच्छी तरह से जोड़ें। यदि कुओं बहुत संकुचित हैं, आरएनए गुणवत्ता में सुधार करने के लिए आरएनए निष्कर्षण अभिवाक के 1 एमएल का उपयोग करें।
  6. पिपेट के साथ समरूप और 1.5 एमएल सेंट्रलाइज ट्यूब में स्थानांतरित करें। इस बिंदु पर, प्रोटोकॉल को -80 डिग्री सेल्सियस पर नमूनों को संग्रहीत करके रोका जा सकता है या आरएनए निष्कर्षण के लिए तुरंत आगे बढ़ना हो सकता है।
    चेतावनी: फिनॉल आधारित आरएनए निष्कर्षण रिएजेंट विषाक्त है और सभी प्रक्रियाओं को रासायनिक धुएं हुड में किया जाना चाहिए और अवशेषों को ठीक से निपटाया जाना चाहिए।

5. आरएनए निष्कर्षण और सीडीएनए संश्लेषण

  1. एक धुएं हुड में नमूने गल और कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए इनक्यूबेट । क्लोरोफॉर्म का 0.1 -0.2 एमएल जोड़ें और जोरदार आंदोलन करें।
  2. कमरे के तापमान पर 3 मिनट के लिए इनक्यूबेट।
  3. 12,000 x ग्राम और 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए सेंट्रलाइज।
  4. ऊपरी जलीय चरण ले लीजिए और एक नई 1.5 एमएल सेंट्रलाइज ट्यूब में स्थानांतरित करें। कुल मात्रा का लगभग 60% एकत्र करें; हालांकि, डीएनए या कार्बनिक (निचले) चरण को इकट्ठा न करें।
  5. आइसोप्रोपेनॉल के 0.25 - 0.5 एमएल जोड़ें और 4 बार उलटा करके आंदोलन करें। कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए इनक्यूबेट।
  6. 10 मिनट के लिए 12,000 x ग्राम पर सेंट्रलाइज, 4 डिग्री सेल्सियस पर और सुपरनैंट को त्यागें।
  7. आरएनए गोली को इथेनॉल (डायथिलपिरोकार्बोनेट (डीईपीसी) में 75%-उपचारित पानी के साथ दो बार धोएं। 5 मिनट के लिए 7,500 x ग्राम पर सेंट्रलाइज करें और इथेनॉल को त्यागें।
  8. एक तौलिया कागज पर ट्यूब उलटा द्वारा अतिरिक्त इथेनॉल निकालें और फिर 5 -10 मिनट के लिए गोली को आंशिक रूप से सूखने के लिए एक धुएं के हुड के अंदर ट्यूब को खुला छोड़ दें।
  9. डीईपीसी-उपचारित पानी के 15 माइक्रोन में आरएनए गोली को फिर से खर्च करें।
  10. आरएनए की गुणवत्ता को सत्यापित करने के लिए 230 एनएम, 260 एनएम और 280 एनएम पर अवशोषण का उपयोग करके कुल आरएनए की मात्रा निर्धारित करें।
  11. कुल आरएनए गुणवत्ता को सत्यापित करने के लिए, 30 मिनट 31 के लिए 2.5% सोडियम हाइपोक्लोराइट समाधान के 1.2% (v/v) के साथ1%एगर्लार्जेड जेल पूर्व-इलाज चलाएं।
  12. कुल आरएनए के 1-2 माइक्रोन का उपयोग करके सीडीएनए संश्लेषण करें।
    1. पिपेट आरएनए, ओलिगो-डीटी (50 माइक्रोन) का 1 माइक्रोन, डीएनटीपी (10 एमएम) का 1 माइक्रोन और नाभिक मुक्त पानी के साथ 12 माइक्रोल तक वॉल्यूम बनाता है। थर्मोसाइकिलर में 65 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए इनक्यूबेट।
    2. ठंडा करने और प्रतिक्रिया मिश्रण तैयार करने के लिए थर्मोसाइकिलर से नमूने निकालें: रिवर्स ट्रांसक्रिप्टेस बफर के 4 माइक्रोन, डिइयोथियटॉल (डीटीटी) के 2 माइक्रोन, और राइबोन्यूकलेस अवरोधक का 1 माइक्रोन। 2 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट।
    3. थर्मो-स्थिर रिवर्स ट्रांसक्रिप्ट के 1 माइक्रोल जोड़ें। 50 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट और 15 मिनट के लिए 70 डिग्री सेल्सियस पर एंजाइम निष्क्रिय।
      नोट: सीडीएनए को कई हफ्तों तक -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है। ख्यात इंट्रोन-अवधारण घटनाओं भेदभाव से जीनोमिक संदूषण के लिए एक गैर-रिवर्स ट्रांसक्रिप्टेज (एनआरटी) नियंत्रण करें।

6. pMTE1A मिनीजीन पीसीआर

  1. प्रतिक्रिया संरचना के साथ पीसीआर प्रदर्शन करें (एमजीसीएल2के 1.5 mM, डीएनटीपी मिश्रण के 0.3 mm, प्रत्येक प्राइमर के 0.5 माइक्रोन, 2.5 यू एक हॉट-स्टार्ट टैक पॉलीमरेज और सीडीएनए के 150 एनजी) निम्नलिखित शर्तों के साथ:
    2 मिनट के लिए 94 डिग्री सेल्सियस, 29 चक्र: 1 मिनट के लिए 94 डिग्री सेल्सियस, 2 मिनट के लिए 50 डिग्री सेल्सियस, 2 मिनट के लिए 72 डिग्री सेल्सियस, 10 मिनट के लिए 72 डिग्री सेल्सियस।
  2. 3% एगर उठे जेल में पीसीआर उत्पाद के 20-25 माइक्रोन लोड करें जिसमें न्यूक्लिक एसिड दाग होता है और लगभग 1 घंटे के लिए 100 वी पर चलता है।

7. एक छवि प्रसंस्करण और विश्लेषण सॉफ्टवेयर32 का उपयोग कर जेल का विश्लेषण

  1. चलाने के बाद, किसी भी बैंड संतृप्ति से बचने और एक छवि प्रसंस्करण सॉफ्टवेयर का उपयोग कर बैंड की मात्रा की मात्रा जेल (एक जेल इमेजिंग अधिग्रहण प्रणाली का उपयोग कर) तस्वीर ।
  2. मात्राकरण के लिए क्रमशः 13S, 12S और 9S आइसोफॉर्म के अनुरूप ~ 631 बीपी, ~ 493 बीपी और ~ 156 बीपी पर बैंड पर विचार करें।
  3. सॉफ्टवेयर के फाइल मेनू से, इमेजिंग अधिग्रहण प्रणाली से प्राप्त छवि फ़ाइल खोलें। ग्रेस्केल में परिवर्तित करें, चमक और इसके विपरीत समायोजित करें और यदि आवश्यक हो तो आउटलियर शोर को हटा दें।
  4. आयत चयन उपकरण के साथ पहली लेन के चारों ओर एक आयत ड्रा और विश्लेषण | के माध्यम से इसका चयन करें जैल | पहले लेन कमांड का चयन करें, या इसके लिए कीबोर्ड शॉर्टकट दबाकर।
  5. क्लिक करें और पहली लेन पर आयत के बीच में पकड़ और अगले लेन पर इसे खींचें करने के लिए माउस का प्रयोग करें। | का विश्लेषण करने के लिए जाओ जैल | अगली लेन का चयन करें,या उपलब्ध शॉर्टकट दबाएं। शेष सभी गलियों में इस कदम को दोहराएं।
  6. सभी गलियों पर प्रकाश डाला और गिने जाने के बाद, विश्लेषण करने के लिए जाओ | जैल | प्रत्येक लेन का प्रोफाइल प्लॉट खींचने के लिए प्लॉट लेन।
  7. सीधी-रेखा चयन उपकरण के साथ, प्रत्येक बैंड के अनुरूप प्रत्येक चोटी के आधार पर एक लाइन खींचें, पृष्ठभूमि शोर को छोड़कर। सभी चोटियों के बाद, हर लेन से, बंद कर दिया गया है, छड़ी उपकरण का चयन करें और प्रत्येक चोटी के अंदर क्लिक करें। हाइलाइट किए गए प्रत्येक चोटी के लिए, माप को दिखाई देने वाली परिणाम विंडो में पॉप अप करना चाहिए।
  8. प्रत्येक नमूने के लिए सभी 3 बैंड से तीव्रता राशि और कुल के सापेक्ष प्रत्येक आइसोफॉर्म के लिए प्रतिशत की गणना।
  9. प्रत्येक आइसोफॉर्म के प्रतिशत या अनुपचारित नमूनों के सापेक्ष प्रतिशत में अंतर प्लॉट करें।
    नोट: सुनिश्चित करें कि तीन E1A वेरिएंट का योग 100% के बराबर होना चाहिए।

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Representative Results

कीमोथेरेपी प्रदर्शनी के बाद कोशिकाओं में स्प्लिसिंग प्रोफाइल में परिवर्तन का मूल्यांकन करने के लिए E1A मिनीजीन का उपयोग करके एक 5 ' स्प्लिस साइटों परख किया गया था। Paclitaxel या सिस्प्लैटिन उपचार का मूल्यांकन किया गया था के बाद HEK293 स्थिर कोशिकाओं में के रूप में विनियमन में Nek4 की भूमिका।

Adenoviral E1A क्षेत्र विभिन्न स्प्लिस दाताओं के उपयोग के कारण एक आरएनए अग्रदूत से तीन मुख्य mRNAs के उत्पादन के लिए जिम्मेदार है। वे आम 5 ' और 3 ' टर्मिनी साझा करते हैं, लेकिन उनके उत्पादित introns के आकार में अलग है । Adenoviral E1A mRNAs उनके तलछट गुणांक, 13S, 12S और 9S के अनुसार नामित कर रहे हैं । एडेनोवायरस संक्रमण (लगभग 7 घंटे) के प्रारंभिक चरण के दौरान, वायरल डीएनए प्रतिकृति के लिए संक्रमित कोशिका को तैयार करने के लिए महत्वपूर्ण प्रोटीन (13S- 723 एए और 12S - 586 एए) का उत्पादन किया जाता है और, देर से चरण (लगभग 18 एच) में, उनके अलावा, एक छोटा प्रोटीन (9S -249 एए)20का उत्पादन किया जाता है। E1A से मिनीजीन युक्त प्लाज्मिड का उपयोग करके, प्रत्येक आइसोफॉर्म से एमआरएनए के अनुपात का मूल्यांकन करने वाले ट्रांसफैक्शन के बाद कोशिकाओं में वैकल्पिक स्प्लिसिंग पर प्रभाव देखा जा सकता है: 13S: 631 बीपी, 12S: 493 बीपी और 9S 156 बीपी(चित्रा 1A और बी)।

E1A आइसोफॉर्म वेरिएंट की बेसल अभिव्यक्ति सेल लाइन और E1A अभिव्यक्ति के समय पर निर्भर करता है। यह देखा गया कि HEK293-स्थिर सेल लाइन (HEK293-Flag) या HEK293 साइट युक्त पुनर्संयोजन (HEK293-FRT-मूल सेल लाइन) की एक उच्च अभिव्यक्ति से पता चलता है 13S HeLa कोशिकाओं (HeLa-PLKO) की तुलना में है कि E1A अभिव्यक्ति (चित्रा 1C और डी) के ४८ घंटे के बाद 13S और 12S isoforms के समान स्तर से पता चलता है ।

HEK293 स्थिर कोशिकाओं में मनाया 13S अभिव्यक्ति के उच्च स्तर काफी E1A अभिव्यक्ति (लगभग 30 घंटे) के छोटे समय के तहत कम हो गया है । 30 घंटे और 48 घंटे में 13S:12S:9S का अनुपात (%) क्रमशः 60:33:7 और 80:15:5 है(बिना प्रतिनिधित्व डेटा)। इस कारण से, प्रयोग शुरू करने से पहले बेसल सेलुलर मिनीजीन E1A स्प्लिसिंग प्रोफाइल की विशेषता होना महत्वपूर्ण है।

सिस्प्लैटिन के संपर्क में आने वाली कोशिकाओं ने 12S अभिव्यक्ति (अनुपचारित कोशिकाओं की तुलना में लगभग 15% की वृद्धि) के पक्ष में 5 के एसएस स्प्लिसिंग चयन में बदलाव दिखाया। यह प्रभाव HEK293 में देखा गया था जो फ्लैग खाली वेक्टर के साथ-साथ नेक 4 के आइसोफॉर्म 1 को व्यक्त करता है। जब अभिव्यक्ति के प्रतिशत में बड़े बदलाव देखे जाते हैं, तो प्रतिशत के साथ एक भूखंड स्पष्ट रूप से परिणामों(चित्रा 2)का प्रतिनिधित्व करता है।

उपचार का जवाब देने वाली दो शर्तों (फ्लैग और नेक 4 ओवरएक्सप्रेसियन) की तुलना करते समय, आमतौर पर डेटा का प्रतिनिधित्व करने का सबसे अच्छा तरीका ग्राफ पर मतभेदों की साजिश रच रहा है, क्योंकि अभिव्यक्ति का बेसल स्तर अलग हो सकता है, और प्रतिशत उपचार के वास्तविक प्रभाव को प्रतिबिंबित नहीं करेगा। यह चित्र 3में देखा जा सकता है । paclitaxel उपचार के बाद के रूप में परिवर्तन बहुत असतत थे, लेकिन परिवर्तन के निर्देश ध्वज और Nek4 व्यक्त कोशिकाओं में विपरीत थे ।

उपचार के बाद छोटे परिवर्तनों के बावजूद, परिणाम लगातार थे, यह दर्शाता है कि paclitaxel उपचार 13S आइसोफॉर्म में कमी की ओर जाता है, फ्लैग व्यक्त कोशिकाओं में 12S और 9S में वृद्धि के साथ, जबकि, दूसरी ओर, Nek4 व्यक्त कोशिकाओं में, विपरीत प्रभाव देखा जाता है ।

Figure 1
चित्रा 1:मिनीजीन E1A स्प्लिसिंग पैटर्न सेल लाइन पर निर्भर करता है। A)मिनीजीन E1A स्प्लिसिंग साइटों का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व। तीर मिनीजीन E1A आइसोफॉर्म्स प्रवर्धन के लिए प्राइमर एनीलिंग क्षेत्र का संकेत देते हैं। B)मिनीजीन E1A के वैकल्पिक स्प्लिसिंग से उत्पन्न आइसोफॉर्म। C)HEK293 stably झंडा खाली वेक्टर व्यक्त (HEK293-फ्लैग), हेला PLKO वेक्टर (हेला-PLKO) या, HEK293 recombinase युक्त साइटों के साथ संक्रमित (क्या HEK293 stabing झंडा या Nek4.1 से उत्पन्न थे-HEK293-FRT) pMTE1A plamid से संक्रमित थे । 48h ट्रांसफैक्शन के बाद कुल आरएनए को अलग-थलग कर दिया गया था और एगर उठे जेल(डी)में E1A आइसोफॉर्म अलग हो गए थे। आधार परिस्थितियों में HEK293-फ्लैग और हेला-पीएलको कोशिकाओं में 13S, 12S और 9S आइसोफॉर्म के प्रतिशत की तुलना करते हुए ग्राफ। तीन स्वतंत्र प्रयोगों से डेटा। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2:मिनीजीन E1A स्प्लिसिंग पैटर्न में सिस्प्लैटिन उपचार का प्रभाव। HEK293 स्टैबल खाली वेक्टर (फ्लैग) या Nek4.1 फ्लैग टैग को व्यक्त करते हुए, pMTE1A प्लाज्मिड से संक्रमित थे। ट्रांसफैक्शन टेट्रासाइक्लिन के छह घंटे बाद प्रोटीन एक्सप्रेशन इंडक्शन में जोड़ा गया । 24 घंटे से 48 घंटे तक, सेल कल्चर मीडियम को मीडियम के लिए बदला गया था जिसमें सिस्प्लैटिन के 30 माइक्रोन होते थे । इनक्यूबेशन के 24 घंटे के बाद, कुल आरएनए निकाला गया था और पीसीआर के उत्पादों को 3% एगरेग्ए जैल पर अलग किया गया था। A)प्रमुख मिनीजीन E1A आइसोफॉर्म को दर्शाया गया है। रेखांकन बी-डी तीन वेरिएंट (13S, 12S और 9S) के योग के सापेक्ष प्रत्येक आइसोफॉर्म का% प्रतिनिधित्व करते हैं। ईमें, प्रत्येक आइसोफॉर्म के लिए अभिव्यक्ति के प्रतिशत में अंतर वाहन (मध्यम) नियंत्रण के सापेक्ष प्रस्तुत किया जाता है। रेखांकन तीन स्वतंत्र प्रयोगों के मतलब और एसईएम के रूप में प्रस्तुत किए जाते हैं। * पी< 0.05, ** पी<0.01 अकीदतित टी टेस्ट में। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3:मिनीजीन E1A स्प्लिसिंग पैटर्न में Paclitaxel उपचार का प्रभाव। HEK293 ने फ्लैग खाली वेक्टर (फ्लैग) या नेक 4.1 फ्लैग को व्यक्त करते हुए pMTE1A प्लाज्मिड से संक्रमित किया था। ट्रांसफैक्शन टेट्रासाइक्लिन के छह घंटे बाद प्रोटीन एक्सप्रेशन इंडक्शन में जोड़ा गया । 24 घंटे से 48 घंटे तक, सेल कल्चर मीडियम को मीडियम द्वारा प्रतिस्थापित किया गया था जिसमें 1 माइक्रोन 1 माइक्रोन पैकिटैक्सेल या इथेनॉल (0.02%) वाहन नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया जाता था। इनक्यूबेशन के 24 घंटे के बाद, कुल आरएनए निकाला गया था और पीसीआर के उत्पादों को 3% एगरेग्ए जैल पर अलग किया गया था। A)प्रमुख आइसोफॉर्म को दर्शाया गया है। रेखांकन बी-डी तीन वेरिएंट (13S, 12S और 9S) के योग के सापेक्ष प्रत्येक आइसोफॉर्म का% प्रतिनिधित्व करते हैं। ईमें, प्रत्येक आइसोफॉर्म के लिए अभिव्यक्ति के प्रतिशत में अंतर वाहन (इथेनॉल) नियंत्रण के सापेक्ष प्रस्तुत किया जाता है। रेखांकन तीन स्वतंत्र प्रयोगों के मतलब और एसईएम के रूप में प्रस्तुत किए जाते हैं। * पी< 0.05 अकीदत ति परीक्षण में। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Discussion

वीवो में वैश्विक वैकल्पिक स्प्लिसिंग में प्रभाव निर्धारित करने के लिए मिनीजीन महत्वपूर्ण उपकरण हैं। एडेनोवायरल मिनीजीन ई 1ए का उपयोग दशकों से कोशिका13,14में इनकी मात्रा में वृद्धि करके प्रोटीन की भूमिका का मूल्यांकन करने के लिए सफलतापूर्वक किया जाता रहा है । यहां, हम कीमोमोथैरेपी एक्सपोजर के बाद वैकल्पिक स्प्लिसिंग का मूल्यांकन करने के लिए मिनीजीन E1A उपयोग का प्रस्ताव करते हैं। नेक 4 आइसोफॉर्म 1 को व्यक्त करने वाली एक स्थिर सेल लाइन का उपयोग किया गया था, जो क्षणिक ट्रांसफेक्शन के कारण अधिक प्रयोग की कलाकृतियों से बचता था। नेक 4 के आइसोफॉर्म 1 ने बेसलस्थितियोंमें मिनीजीन E1A वैकल्पिक स्प्लिसिंग में प्रभाव नहीं दिखाया, लेकिन इसमें कई स्प्लिसिंग संबंधित इंटरैक्टर्स हैं, इसलिए, हमें इन कोशिकाओं में E1A वैकल्पिक स्प्लिसिंग में कीमोमोथैरेपी उपचार के विशिष्ट प्रभाव का मूल्यांकन करने की अनुमति देता है।

इसकी कम संवेदनशीलता के बावजूद, मुख्य रूप से रेडियोधर्मी दृष्टिकोणों की तुलना में, यहां वर्णित विधि सरल है और विशेष अभिकर्षकों या प्रयोगशाला स्थितियों की आवश्यकता नहीं है। हालांकि, यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि मिनीजीन E1A 5 के एसएस चयन का एक वैश्विक रिपोर्टर है, हालांकि 3 के एसएस चयन का मूल्यांकन इस प्रोटोकॉल के साथ किया जा सकता है विशिष्ट मिनीजीन रिपोर्टर का उपयोग14,33,34किया जाना चाहिए। इसके अलावा, परिणाम सेल लाइन से प्रभावित हो सकते हैं और बेसल वैकल्पिक स्प्लिसिंग प्रोफाइल के कारण गलत व्याख्या से बचने के लिए सावधानीपूर्वक मूल्यांकन किया जाना चाहिए।

आमतौर पर, मिनीजीन E1A स्प्लिसिंग पैटर्न में बहुत अंतर केवल स्प्लिसिंग कारकों की अभिव्यक्ति को बदलने पर मनाया जाता है। इन कारकों की गतिविधि को मॉडुलन करने वाले प्रोटीन की बड़ी संख्या के कारण अन्य परिवर्तन कम स्पष्ट हैं। इस कारण से, अप्रत्यक्ष उम्मीदवार के लिए अध्ययन शुरू करते समय, इस उम्मीदवार प्रोटीन की बढ़ती मात्रा के आधार पर शास्त्रीय दृष्टिकोण को प्राथमिकता दी जानी चाहिए। जब कुछ प्रभाव देखा जाता है, तो उपचार का पता लगाने के लिए किया जा सकता है कि विनियमन एक विशेष सेलुलर उत्तेजना के लिए विशिष्ट हो सकता है।

प्रारंभिक सकारात्मक परिणाम के बाद, प्रयोग को अनुकूलित करने के लिए समय और दवा एकाग्रता का मानकीकरण किया जा सकता है।

यह सरल प्रोटोकॉल एक प्रारंभिक परख है, एक स्टार्ट-पॉइंट जो उत्तर दे सकता है कि क्या ब्याज का प्रोटीन वैकल्पिक स्प्लिसिंग में प्रभाव दिखाता है और भी, जब वैकल्पिक स्प्लिसिंग विनियमन में कुछ प्रभाव पहले से ही ज्ञात है, तो अध्ययन को अधिक सुसंगत मार्ग पर निर्देशित कर सकते हैं जहां प्रोटीन कीमोथेरेपी प्रतिक्रिया में वैकल्पिक स्प्लिसिंग को विनियमित करने की भूमिका निभाता है।

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Disclosures

लेखकों की घोषणा है कि वे कोई प्रतिस्पर्धी वित्तीय हितों की है ।

Acknowledgments

हम फंडाकाओ डी एम्पारो ए पेस्क्विसा डो एस्टाडो डी साओ पाउलो (एफएपीईपी, धन्यवाद देते हैं, इस शोध के वित्तपोषण के लिए ग्रांट टेमेटिको 2017/03489-1 के माध्यम से जेके और फैलोशिप को एफएलबी 2018/05350-3) और कॉन्सेल्हो नैसिनल डी डेसेवोल्विमेंटो सिएंटिको ई टेकनोलोजिको (सीएनपीक्यू) के माध्यम से। हम E1A क्लोनिंग में अपने काम के लिए pMTE1A प्लाज्मिड और Zerler और सहयोगियों को उपलब्ध कराने के लिए डॉ एड्रियन Krainer शुक्रिया अदा करना चाहते हैं । हम प्रो डॉ पैट्रसिया मोरिएल, प्रो डॉ वांडा परेरा अलमेडा, प्रो डॉ मार्सेलो लांसलोट्टी और प्रो डॉ करीना कोगो कोगो मुलर को भी धन्यवाद देते हैं ताकि हमें उनकी प्रयोगशाला अंतरिक्ष और उपकरणों का उपयोग करने की अनुमति दी जा सके ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
100 pb DNA Ladder Invitrogen 15628-050
6 wells plate Sarstedt 833920
Agarose Sigma A9539-250G
Cisplatin Sigma P4394
DEPC water ThermoFisher AM9920
DMEM ThermoFisher 11965118
dNTP mix ThermoFisher 10297-018
Fetal Bovine Serum - FBS ThermoFisher 12657029
Fluorescent Microscope Leica DMIL LED FLUO
Gel imaging acquisition system - ChemiDoc Gel Imagin System Bio-Rad
GFP - pEGFPC3 Clontech
HEK293 stable cells - HEK293 Flp-In Generated from Flp-In™ T-REx™ 293 - Invitrogen and described in ref 21
Hygromycin B ThermoFisher 10687010 Used for Flp-In cells maintenemant
Image processing and analysis software - FIJI software ref. 32
Lipid- based transfection reagent - jetOPTIMUS Polyplus Reagent Polyplus 117-07
Oligo DT ThermoFisher 18418020
Paclitxel Invitrogen P3456
Plate Reader/ UV absorbance Biotech Epoch Biotek/ Take3 adapter
pMTE1A plasmid Provided by Dr. Adrian Krainer
pMTE1A F Invitrogen  5’ -ATTATCTGCCACGGAGGTGT-3
pMTE1A R Invitrogen 5’ -GGATAGCAGGCGCCATTTTA-3’
Refrigerated centrifuge Eppendorf F5810R
Reverse Transcriptase - M-MLV ThermoFisher 28025013
Reverse transcriptase - Superscript IV ThermoFisher 18090050
Ribunuclease inhibitor RNAse OUT ThermoFisher 10777-019
RNA extraction phenol-chloroform based reagent - Trizol ThermoFisher 15596018
SybrSafe DNA gel stain ThermoFisher S33102
Taq Platinum Thermo 10966026
Tetracyclin Sigma T3383 Used for Flag empty or Nek4- Flag expression induction
Thermocycler Bio-Rad Bio-Rad T100
Trypsin Sigma T4799

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References

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कैंसर रिसर्च अंक 170 एमआरएनए वैकल्पिक स्प्लिसिंग मिनीजीन ई 1ए नेक 4 कीमोथेरेपी प्रतिक्रिया आइसोफॉर्म्स अभिव्यक्ति HEK293 स्थिर कोशिकाएं।
एमआरएनए स्प्लिसिंग परिवर्तनों का अध्ययन करने के लिए E1A मिनीजीन टूल का उपयोग करना
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Basei, F. L., Moura, L. A. R., Kobarg, J. Using the E1A Minigene Tool to Study mRNA Splicing Changes. J. Vis. Exp. (170), e62181, doi:10.3791/62181 (2021).

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