Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

استخدام أداة E1A Minigene لدراسة تغييرات الربط مرنا

Published: April 22, 2021 doi: 10.3791/62181
Automatic Translation
1, 1, 1
1Faculdade de Ciências Farmacêuticas, Universidade Estadual de Campinas

Summary

يقدم هذا البروتوكول أداة سريعة ومفيدة لتقييم دور البروتين مع وظيفة غير مطهرة في تنظيم الربط البديل بعد العلاج الكيميائي.

Abstract

تتضمن معالجة الحمض النووي الريبي خطوات متعددة في وقت واحد لإعداد مرنا للترجمة، مثل 5'capping، إضافة متعددة A والربط. وإلى جانب الربط التأسيسي، يسمح الربط البديل من الحمض النووي الريبي بالتعبير عن البروتينات متعددة الوظائف من جين واحد. كما دراسات interactome عموما التحليل الأول للبروتينات الجديدة أو غير معروفة، وارتباط بروتين الطعم مع عوامل الربط هو مؤشر على أنه يمكن أن تشارك في عملية الربط ميرنا، ولكن لتحديد في أي سياق أو ما هي الجينات التي تنظم هي عملية تجريبية. نقطة انطلاق جيدة لتقييم هذه الوظيفة هو استخدام أداة مينيجين الكلاسيكية. هنا نقدم استخدام مينيجين E1A أدينوفيرالي لتقييم التغييرات الربط البديلة بعد محفزات الإجهاد الخلوية المختلفة. قمنا بتقييم الربط من E1A minigene في HEK293 الإفراط في التعبير عن بروتين Nek4 بعد علاجات الإجهاد المختلفة. ويشمل البروتوكول E1A minigene transfection، والعلاج الخلوي، واستخراج الحمض النووي الريبي وتوليف cDNA، تليها PCR وتحليل هلام وتكميم المتغيرات E1A مقسمة. استخدام هذه الطريقة البسيطة والراسخة جنبا إلى جنب مع علاجات محددة هو نقطة انطلاق موثوقة لتسليط الضوء على العمليات الخلوية أو ما هي الجينات التي يمكن تنظيمها عن طريق الربط ميرنا.

Introduction

الربط هو من بين أهم الخطوات في معالجة الحمض النووي الريبي eukaryotic الذي يحدث في وقت واحد إلى 5'mRNA توج و3'mRNA polyadenylation، تتألف من إزالة intron تليها تقاطع exon. الاعتراف مواقع الربط (SS) من قبل الربط، وهو مجمع ريبونوكليوبروتين تحتوي على البروتينات الريبونوكليوبروتين الصغيرة (snRNP U1، U2، U4 و U6)، والحمض النووي الريبي الصغيرة (snRNAs) والعديد من البروتينات التنظيمية1 ضروري للربط.

إلى جانب إزالة intron (الربط التأسيسي) ، في eukaryotes ، يمكن الاحتفاظ introns ويمكن استبعاد exons ، وتكوين عملية تسمى mRNA الربط البديل (AS). توسيع الربط البديل قبل مرنا القدرة على الترميز من الجينوم eukaryotic السماح لإنتاج عدد كبير ومتنوع من البروتينات من عدد قليل نسبيا من الجينات. وتشير التقديرات إلى أن 95-100٪ من mRNAs الإنسان التي تحتوي على أكثر من exon واحد يمكن أن تخضع للصق بديل2،3. وهذا أمر أساسي للعمليات البيولوجية مثل تطوير الخلايا العصبية، وتنشيط موت الخلايا المبرمج واستجابة الإجهاد الخلوي4،وتوفير بدائل الكائن الحي لتنظيم عمل الخلية باستخدام نفس ذخيرة الجينات.

الآلات اللازمة للربط البديل هي نفسها المستخدمة في الربط التأسيسي واستخدام SS هو المحدد الرئيسي لحدوث الربط البديل. الربط التأسيسي يرتبط باستخدام مواقع الربط القوية ، والتي عادة ما تكون أكثر تشابها مع الزخارف التوافقية للاعتراف باللصق5.

وعادة ما يتم التعرف على exons البديلة أقل كفاءة من exons التأسيسية مرة واحدة في رابطة الدول المستقلة- العناصر التنظيمية ، وتسلسل في 5 SS و 3 SS يحيط هذه exons ، وتظهر قدرة ملزمة أدنى إلى الربط. يحتوي مرنا أيضا على مناطق تسمى القدرة أو كواتم الصوت الموجودة في exons (معززات الربط exonic (ESEs) وكاتم الصوت اللصق exonic (ESSs)) و introns (القدرة على الربط intronic (ISEs) وكاتم الصوت الربط intronic (ISSs)) التي تعزز أو قمع استخدام exon، على التوالي5. يتم التعرف على هذه التسلسلات من خلال العناصر العابرة للتنظيم، أو عوامل الربط (SF). يتم تمثيل SFs بشكل رئيسي من قبل عائلتين من البروتينات ، وعوامل الربط الغنية بالسرين / الأرجينين (SRSFs) التي ترتبط ب ESEs وعائلة البروتينات الريبونوكليوبروتية النووية غير المتجانسة (hnRNPs) التي ترتبط بتسلسل ESSs5.

يمكن تعديل الربط البديل عن طريق الفوسفور / إزالة الفوسفور من العوامل العابرة لتعديل شركاء التفاعلات والتوطين الخلوي لعوامل الربط6و7و8. ويمكن أن يوفر تحديد منظمين جدد لعوامل الربط أدوات جديدة لتنظيم الربط، وبالتالي بعض علاجات السرطان.

أنوفرييفا وآخرون.9, في صورة التعبير الجيني ميكروراي مرنا, لاحظت تغييرات متسقة في مستويات المكونات اللصق في 101 خطوط الخلية وبعد ظروف الإجهاد المختلفة (الأدوية القائمة على البلاتين, تشعيع غاما, مثبطات توبويسوميراز, مثبطات كيناز التيروزين والتكسير). العلاقة بين نمط الربط وفعالية العلاج الكيميائي وقد ثبت بالفعل في خلايا سرطان الرئة, التي هي مقاومة للعلاج الكيميائي, تظهر تغييرات في المتغيرات caspase-9 معدل10. تظهر خلايا HEK293 المعالجة بلوحة العلاج الكيميائي تغييرات في الربط مع زيادة في المتغيرات المؤيدة للبوبتوتيك. ولاحظ غابرييل وآخرون11 تغيرات في ما لا يقل عن 700 حدث من أحداث الربط بعد علاج سيسبلاتين في خطوط الخلايا المختلفة، مشيرا إلى أن مسارات الربط تتأثر سيسبلاتين. وقد أظهرت التشكيلات الربط بالفعل النشاط المضاد للورم، مما يدل على أن الربط مهم للتنمية الورمية، وأساسا، استجابة العلاج الكيميائي12. وبالتالي ، فإن توصيف البروتينات الجديدة التي تنظم الربط بعد عوامل الإجهاد الخلوية ، مثل العلاج الكيميائي ، مهم جدا لاكتشاف استراتيجيات جديدة للعلاج.

يمكن أن تتطلب أدلة تنظيم الربط البديل من دراسات interactome ، ذات الأهمية الخاصة لتوصيف وظائف البروتينات الجديدة أو غير المكصرة ، نهجا أكثر عمومية وبساطة للتحقق من الدور الحقيقي للبروتين في AS. Minigenes هي أدوات هامة لتحليل الدور العام للبروتين التي تؤثر على تنظيم الربط. أنها تحتوي على أجزاء من جين الفائدة التي تحتوي على مناطق الجينوم مقسمة بدلا من ذلك ويحيط13. استخدام أداة minigene يسمح تحليل الربط في الجسم الحي مع العديد من المزايا مثل طول minigene الذي هو طفيف، وبالتالي ليس قيدا على رد فعل تضخيم; يمكن تقييم نفس المينيجين في خطوط الخلايا المختلفة؛ جميع المكونات الخلوية، وأساسا تعديل ما بعد الترجمة تنظيم (الفوسفور والتغيرات في مقصورات الخلية) موجودة ويمكن معالجتها13،14. وعلاوة على ذلك، يمكن ملاحظة التغيرات في نمط الربط البديل بعد الإجهاد الخلوي، واستخدام نظام مينيجين، تسمح لتحديد المسار الذي يتم تحويره من قبل محفزات مختلفة.

هناك العديد من أنظمة minigene الموصوفة بالفعل والتي هي محددة لأنواع مختلفة من الأحداث الربط13،14، ومع ذلك ، كخبار أولي ، فإن minigene E1A15 هو نظام مراسل الربط البديل الراسخ للغاية لدراسة اختيار 5 SS في الجسم الحي. من جين واحد فقط، E1A، يتم إنتاج خمسة mRNAs بواسطة الربط البديل على أساس اختيار ثلاثة مواقع مختلفة 5' لصق واحد رئيسي أو واحد طفيفة 3' لصق الموقع16،17،18. التعبير عن المتغيرات E1A يتغير وفقا لفترة العدوى الغدية19،20.

لقد أظهرنا سابقا أن كلا من isoforms Nek4 تتفاعل مع عوامل الربط مثل SRSF1 وhnRNPA1 وعلى الرغم من isoform 2 التغييرات minigene E1A الربط البديل، isoform 1 ليس له أي تأثير في ذلك21. لأن isoform 1 هو isoform الأكثر وفرة ويغير مقاومة العلاج الكيميائي والاستجابة للتلف الحمض النووي، ونحن تقييم ما إذا كان يمكن تغيير الربط البديل E1A minigene في حالة الإجهاد.

الفحص مينيجين هو بسيط، منخفضة التكلفة وطريقة سريعة، لأنه يحتاج فقط استخراج الحمض النووي الريبي، توليف cDNA، تضخيم وجل agarose التحليلات، ويمكن أن يكون أداة مفيدة لتقييم منذ تأثير محتمل على الربط البديل من قبل بروتين المصالح حتى تأثير العلاجات المختلفة على نمط الربط البديل الخلوية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. الخلايا الطلاء

ملاحظة: في هذا البروتوكول الموصوف، HEK293 خطوط الخلايا مستقرة، ولدت سابقا للتعبير غير قابل للانستقراء من Nek4 استخدمت21،ومع ذلك، فإن البروتوكول نفسه هو مناسبة لكثير من خطوط الخلايا الأخرى، مثل HEK29322،HeLa23،24،25،26،U-2 OS27،COS728،SH-SY5Y29. نمط التعبير عن النظائر E1A minigene تحت ظروف القاعدية يختلف بين هذه الخلايا، وينبغي أن تتميز لكل شرط. لا يقتصر هذا البروتوكول على خطوط الخلايا المستقرة. النهج الأكثر شيوعا في تقييم البروتين المرشح هو عن طريق عابرة المشاركة في زيادة مقداره مع كمية ثابتة من minigene. البروتوكول نفسه مناسب لخلايا خروج المغلوب.

  1. خلايا لوحة النظر في السيارة، غير المصابة وGFP الضوابط.
  2. ثقافة خلايا HEK293 مع تعبير مستقر عن جين الاهتمام في دولبيكو النسر المعدل المتوسط (DMEM) تكملها مع 10٪ من مصل البقر الجنيني (FBS)، 4.5 غرام / لتر الجلوكوز، 4 م ل-الجلوتامين والحفاظ مع 100 ميكروغرام/مل من hygromycin B، على لوحات الأنسجة المعالجة بزراعة في 37 درجة مئوية في 5٪ CO2 والغلاف الجوي المرطب.
  3. تقسيم الخلايا باستخدام 0.25٪ تريبسين-EDTA. لوحة 3 × 105 خلايا في لوحات 6 آبار واحتضانها لمدة 24 ساعة في 37 درجة مئوية في 5٪ CO2.
    ملاحظة: بالنسبة للإصابة بالعدوى، يجب أن تكون الخلايا التقاء بنسبة 70-80٪ لتقليل موت الخلية بعد العدوى.

2. إصابة الخلية

ملاحظة: تم استخدام 1-2 ميكروغرام من pMTE1A مينيجين بلازميد هنا، ولكن كمية الحمض النووي، فضلا عن وقت التعبير، يجب أن تبقى في الحد الأدنى لتجنب السمية. فعلى سبيل المثال، لوحظ ارتفاع السمية في خلايا هيلا بعد 30 ساعة من العدوى مع 1 ميكروغرام من الحمض النووي pMTE1A. بالنسبة للإصابة العابرة الموصوفة هنا ، تم استخدام كاشف العدوى القائم على الدهون

  1. تحقق من التقاء الخلايا 24 ساعة بعد الطلاء وخلايا HEK293 مستقرة transfect فقط عندما التقاء 70-80٪.
  2. إزالة الخلايا ثقافة المتوسطة بعناية مع ماصة، بدلا من استخدام نظام مضخة فراغ. ثم أضف بعناية 2 مل من متوسط DMEM الكامل بدون مضادات حيوية ووضع الطبق مرة أخرى في الحاضنة.
  3. إعداد أنبوب مع العازلة transfection (200 ميكرولتر / بئر)، إضافة 2 ميكروغرام من الحمض النووي pMTE1A، دوامة ومن ثم إضافة 2 ميكرولتر من كاشف العدوى. دوامة مرة أخرى واحتضان لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  4. إزالة لوحات من الحاضنة وإضافة بعناية خليط العدوى دروبيوايز.
  5. إلى خلايا HEK293 المستقرة، أضف التتراسيكلين (0.5 ميكروغرام/مل) لحث تعبير Nek4 بعد 6 ح من الإصابة. التغيير المتوسط ليس ضروريا.
    ملاحظة: وحدات التخزين/المبالغ الموضحة في هذا المقطع هي بئر واحد. إعداد الخليط لجميع الآبار المستخدمة في التجربة في نفس الأنبوب.
  6. إعداد بئر واحد لtransfect مع EGFP، أو آخر الفلوروفورا التعبير عن البلازميد لتقدير كفاءة العدوى. ويمكن ملاحظة نتائج أفضل مع كفاءة العدوى بنسبة 40٪ على الأقل، ولكن لوحظ سابقا أداء جيد مع انخفاض كفاءة العدوى.
  7. عند استخدام العدوى المشتركة (بروتين الفائدة والمينيجين) الحفاظ على بئر مع الخلايا غير المصابة لتجنب الحصول على نتائج من الحمض النووي الريبي الذاتية. في حالة E1A، خلايا HEK293 تعبر بالفعل عن الجين E1A30.

3. إعداد الأدوية

ملاحظة: تم اختيار وقت وتركيز العلاج بناء على نتائج الأدب، والتي تشير إلى التغيرات في الربط البديل لبعض الجينات.

  1. قم بإجراء منحنى الجرعة والاستجابة قبل بدء الفحص لتحديد الحد الأدنى من التركيز على تحريض الربط البديل دون أي تأثير في صلاحية الخلية.
  2. إعداد محلول الأسهم Paclitaxel في تركيز 5 MM في الإيثانول. التركيز النهائي هو 1 ميكرومتر. استخدام الإيثانول 0.02٪ كتحكم في السيارة.
  3. إعداد محلول سيسبلاتين عن طريق تخفيف في 0.9٪ NaCl في حوالي 0.5 ملغ / مل (1.66 mM). حماية من الضوء، دوامة واحتضان في حمام حراري، 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. التركيز النهائي هو 30 ميكرومتر. إعداد الطازجة أو تخزينها في 2-10 درجة مئوية لمدة شهر واحد.
    ملاحظة: يجب حماية جميع الأدوية من الضوء.

4. علاج الخلايا وجمعها

ملاحظة: تم جمع خلايا مستقرة HEK293 48 ساعة بعد العدوى، ولهذا عولجت 24 ساعة بعد transfection لأن يتم تحقيق أعلى مستوى التعبير Nek4 في غضون 48 ساعة. ومع ذلك، لوحظت مستويات عالية من التعبير isoform 13S (حتى 90٪) في هذا الوقت. لتقليل نسبة متساوي الشكل 13S، حاول علاج وجمع الخلايا 30 ساعة بعد الحد الأقصى للإصابة.

  1. استخدام RNA / DNase نصائح مجانية والأنابيب. إجراء استخراج الحمض النووي الريبي الكلي مع كاشف الفينول الكلوروفورم بعد توصية الشركة المصنعة.
  2. 24 ساعة بعد العدوى، تحقق من مورفولوجيا الخلايا وكفاءة العدوى باستخدام المجهر الفلوري.
  3. إزالة الخلية ثقافة المتوسطة، وذلك باستخدام تفضيلي ماصة بدلا من نظام مضخة فراغ. ثم أضف خلية الثقافة المتوسطة مع العلاج الكيميائي في التركيز النهائي الموصوفة سابقا.
  4. حضانة عند 37 درجة مئوية، 5٪ CO2 لمدة 18 - 24 ساعة.
  5. جمع الحمض النووي الريبي عن طريق التخلص من الخلايا ثقافة المتوسطة في حاوية وإضافة 0.5 - 1 مل من كاشف استخراج الحمض النووي الريبي مباشرة إلى البئر. إذا كانت الآبار التقاء جدا، استخدم 1 مل من كاشف استخراج الحمض النووي الريبي لتحسين جودة الحمض النووي الريبي.
  6. تجانس مع ماصة ونقلها إلى أنبوب الطرد المركزي 1.5 مل. عند هذه النقطة، يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتا عن طريق تخزين العينات عند -80 درجة مئوية أو الانتقال فورا إلى استخراج الحمض النووي الريبي.
    تحذير: كاشف استخراج الحمض النووي الريبي القائم على الفينول سام ويجب إجراء جميع الإجراءات في غطاء الدخان الكيميائي والتخلص من المخلفات بشكل صحيح.

5. استخراج الحمض النووي الريبي وتوليف cDNA

  1. في غطاء الدخان إذابة العينات واحتضان لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. إضافة 0.1 -0.2 مل من الكلوروفورم والهياج بقوة.
  2. حضانة لمدة 3 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
  3. جهاز طرد مركزي لمدة 15 دقيقة عند 12,000 × ز و 4 °C.
  4. جمع المرحلة المائية العليا ونقلها إلى أنبوب طرد مركزي جديد 1.5 مل. جمع حوالي 60٪ من إجمالي الحجم. ومع ذلك، لا تجمع الحمض النووي أو المرحلة العضوية (السفلية).
  5. إضافة 0.25 - 0.5 مل من الأيزوبروبانول والتحريض عن طريق عكس 4 مرات. حضانة لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  6. جهاز الطرد المركزي في 12،000 × ز لمدة 10 دقيقة، في 4 درجة مئوية والتخلص من supernatant.
  7. غسل بيليه الحمض النووي الريبي مرتين مع الإيثانول (75٪ في المياه المعالجة ديثيليبيروكربونات (DEPC). جهاز الطرد المركزي في 7500 x ز لمدة 5 دقائق والتخلص من الإيثانول.
  8. إزالة الإيثانول الزائد عن طريق عكس الأنبوب على ورقة منشفة ومن ثم ترك أنبوب مفتوح داخل غطاء محرك السيارة الدخان لتجفيف جزئيا بيليه لمدة 5-10 دقيقة.
  9. Resuspend بيليه الجيش الملكي النيبالي في 15 ميكرولتر من المياه المعالجة DEPC.
  10. قياس إجمالي الحمض النووي الريبي باستخدام الامتصاص في 230 نانومتر، 260 نانومتر، و 280 نانومتر للتحقق من جودة الحمض النووي الريبي.
  11. للتحقق من جودة الحمض النووي الريبي الكلي، قم بتشغيل جل الآغاروز 1٪ المعالج مسبقا بنسبة 1.2٪ (v/v) من محلول هيبوكلوريت الصوديوم بنسبة 2.5٪ لمدة 30 دقيقة31.
  12. إجراء توليفة cDNA باستخدام 1-2 ميكروغرام من إجمالي الحمض النووي الريبي.
    1. ماصة الحمض النووي الريبي، 1 ميكرولتر من أوليغو دي تي (50 ميكرومتر)، 1 ميكرولتر من dNTP (10 mM) وتصنع الحجم إلى 12 ميكرولتر مع ماء خال من النيوكليز. احتضان في thermocycler لمدة 5 دقائق في 65 درجة مئوية.
    2. إزالة عينات من thermocycler لتهدئة وإعداد خليط التفاعل: 4 ميكرولتر من العازلة النسخ العكسي، 2 ميكرولتر من dithiothreitol (DTT)، و 1 ميكرولتر من مثبط ريبونوكليز. حضانة عند 37 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة.
    3. إضافة 1 ميكرولتر من النسخ العكسي الحرارية مستقرة. احتضان في 37 درجة مئوية لمدة 50 دقيقة وتعطيل الانزيم في 70 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
      ملاحظة: يمكن تخزين cDNA عند -20 درجة مئوية لعدة أسابيع. إجراء مراقبة غير عكسية للنسخ (NRT) للتلوث الجينومي من التمييز المفترض لأحداث الاحتفاظ بالانترون.

6. pMTE1A مينيجين PCR

  1. أداء PCR مع تكوين رد الفعل (1.5 mM من MgCl2، 0.3 mM من مزيج dNTP ، 0.5 ميكرومتر من كل التمهيدي ، 2.5 U من Taq Polymerase الساخنة و 150 نانوغرام من cDNA) مع الشروط التالية:
    94 درجة مئوية لمدة دقيقتين، 29 دورة من: 94 درجة مئوية لمدة دقيقة واحدة، 50 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة، 72 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة، 72 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
  2. تحميل 20-25 ميكرولتر من المنتج PCR في هلام agarose 3٪ تحتوي على وصمة عار حمض النيوكليك وتشغيلها في 100 V لحوالي 1 ساعة.

7. تحليل هلام باستخدام معالجة الصور وتحليل البرمجيات32

  1. بعد التشغيل ، صور الجل (باستخدام نظام اكتساب التصوير الهلامي) وتجنب أي تشبع النطاق وتحديد النطاقات باستخدام برنامج معالجة الصور.
  2. للقياس الكمي النظر في العصابات في ~ 631 نقطة أساس ، ~ 493 نقطة أساس ، و ~ 156 نقطة أساس لتتوافق مع 13S ، 12S و 9S isoforms ، على التوالي.
  3. من قائمة ملف البرنامج، افتح ملف الصورة الذي تم الحصول عليه من نظام الحصول على التصوير. قم بالتحويل إلى تدرج رمادي، وضبط السطوع والتباين، وإزالة الضوضاء المتطرفة إذا لزم الأمر.
  4. رسم مستطيل حول الممر الأول باستخدام أداة تحديد المستطيل وحدده من خلال تحليل | | الهلام حدد الأمر "المسار الأول"، أو بالضغط على اختصار لوحة المفاتيح له.
  5. استخدام الماوس للنقر وعقد في منتصف المستطيل على حارة الأولى وسحبه إلى حارة المقبل. انتقل إلى تحليل | | الهلام حدد التالي حارة، أو اضغط على الاختصار المتوفر. كرر هذه الخطوة إلى جميع الممرات المتبقية.
  6. بعد تمييز جميع الممرات ورقمها، انتقل إلى تحليل | | الهلام مؤامرة الممرات لرسم مؤامرة الملف الشخصي لكل حارة.
  7. باستخدام أداة التحديد على الخط المستقيم، ارسم خطا عبر قاعدة كل قمة مقابلة لكل نطاق، مع استبعاد ضوضاء الخلفية. بعد أن تم إغلاق جميع القمم ، من كل حارة ، حدد أداة Wand وانقر داخل كل قمة. لكل الذروة التي تم تمييزها، يجب أن تظهر القياسات في إطار النتائج الذي يظهر.
  8. جمع كثافة من جميع العصابات 3 لكل عينة وحساب النسبة المئوية لكل isoform بالنسبة إلى المجموع.
  9. رسم النسب المئوية لكل isoform أو الاختلافات في النسبة المئوية بالنسبة للعينات غير المعالجة.
    ملاحظة: تأكد من أن مجموع المتغيرات E1A الثلاثة يجب أن يساوي 100٪.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

تم إجراء فحص مواقع الربط 5 'باستخدام E1A minigene لتقييم التغيرات في ملف تعريف الربط في الخلايا بعد معرض العلاج الكيميائي. تم تقييم دور Nek4 - isoform 1 في تنظيم AS في خلايا HEK293 المستقرة بعد علاج باكليتاكسيل أو سيسبلاتين.

11- تعتبر منطقة أدينوفيرالي E1A مسؤولة عن إنتاج ثلاثة من الرناس الرئيسي من سلفة واحدة من السلائف الرناية بسبب استخدام مختلف الجهات المانحة للربط. أنها تشترك المشتركة 5 'و 3' termini ولكن تختلف في حجم introns المقتطعة. يتم تسمية الرناس الأدينوفيرالي E1A وفقا لمعاملات الترسيب الخاصة بهم، 13S و 12S و 9S. خلال المرحلة المبكرة من عدوى الفيروس الغدي (حوالي 7 ساعة) ، يتم إنتاج البروتينات الهامة لإعداد الخلية المصابة لتكرار الحمض النووي الفيروسي (13S - 723 aa و 12S - 586 aa) ، وفي المرحلة المتأخرة (حوالي 18 ساعة) إلى جانب تلك ، يتم إنتاج بروتين صغير (9S -249 aa)20. باستخدام البلازميد الذي يحتوي على مينيجين من E1A ، يمكن ملاحظة التأثير على الربط البديل في الخلايا بعد العدوى تقييم نسبة مرنا من كل isoform المنتجة : 13S : 631 نقطة أساس ، 12S : 493 bp و 9S 156 bp (الشكل 1A و B).

التعبير القاعدي للمتغيرات ISOFORMS E1A يعتمد على خط الخلية والوقت للتعبير E1A. ولوحظ أن خط الخلية المستقر HEK293 (HEK293-Flag) أو HEK293 recombinase الذي يحتوي على موقع (HEK293-FRT - خط الخلية الأصلي) يظهر تعبيرا أعلى من 13S بالمقارنة مع خلايا HeLa (HeLa-PLKO) التي تظهر مستويات مماثلة من 13S و 12S isoforms بعد 48 ساعة من التعبير E1A (الشكل 1C و D).

انخفاض كبير في مستوى التعبير 13S لوحظ في خلايا مستقرة HEK293 تحت أقصر الأوقات من التعبير E1A (حوالي 30 ساعة). نسبة (٪) من 13S:12S:9S في 30 ساعة و 48 ساعة هي 60:33:7 و 80:15:5، على التوالي (البيانات غير الممثلة). لهذا السبب، من المهم توصيف التشكيل الجانبي للربط الخلوي القاعدي E1A قبل بدء التجارب.

وأظهرت الخلايا المعرضة ل سيسبلاتين تحولا في اختيار الربط 5 SS لصالح التعبير 12S (زيادة حوالي 15٪ مقارنة مع الخلايا غير المعالجة). وقد لوحظ هذا التأثير في HEK293 التعبير عن ستابلي العلم ناقلات فارغة وكذلك isoform 1 من Nek4. عندما يتم ملاحظة تغييرات رئيسية في النسبة المئوية للتعبير، تمثل المؤامرة ذات النسب المئوية النتائج بوضوح(الشكل 2).

عند مقارنة شرطين (العلم وNek4 التعبير المفرط) الاستجابة للعلاج، وعادة ما تكون أفضل طريقة لتمثيل البيانات هو رسم الاختلافات على الرسم البياني، لأن المستوى القاعدي للتعبير يمكن أن تكون مختلفة، والنسب المئوية لن تعكس التأثير الحقيقي للعلاج. ويمكن ملاحظة ذلك في الشكل 3. كانت التغييرات في AS بعد علاج باكليتاكسيل منفصلة للغاية ، ولكن اتجاهات التغييرات كانت عكس ذلك في Flag و Nek4 التي تعبر عن الخلايا.

على الرغم من التغيرات الطفيفة بعد العلاج ، كانت النتائج متسقة ، مما يشير إلى أن علاج باكليتاكسيل يؤدي إلى انخفاض في 13S isoform ، مع زيادة في 12S و 9S في الخلايا المعبرة عن العلم ، في حين أنه من ناحية أخرى ، في Nek4 التعبير عن الخلايا ، لوحظ التأثير المعاكس.

Figure 1
الشكل 1: Minigene E1A نمط الربط يعتمد على خط الخلية. أ) تمثيل تخطيطي لمواقع الربط E1A مصغرة. تشير الأسهم إلى منطقة تمييع التمهيدي لتضخيم الأشكال المتساوية E1A minigene. ب) Isoforms المتولدة من الربط البديل من E1A minigene. ج)HEK293 التعبير بثبات العلم ناقلات فارغة (HEK293 -العلم)، هيلا المصابة مع ناقلات PLKO (هيلا - PLKO) أو، HEK293 المواقع التي تحتوي على إعادة دمج (من ما HEK293 التعبير طعن العلم أو Nek4.1 تم إنشاؤها - HEK293-FRT) تم تحويلها مع pMTE1A plasmid. 48h بعد عزل مجموع RNA transfection وفصل ISOFORMS E1A في هلام الآغاروز(D). رسم بياني يقارن النسبة المئوية لخلايا 13S و 12S و 9S في خلايا HEK293-Flag و HeLa-PLKO في ظل ظروف أساسية. بيانات من ثلاث تجارب مستقلة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: تأثير العلاج سيسبلاتين في نمط الربط E1A minigene. HEK293 التعبير عن ستابل العلم ناقلات فارغة (العلم) أو Nek4.1 علامة العلم تنصهر، تم نقل المصابة مع pMTE1A البلازميد. بعد ست ساعات من إضافة التتراسيكلين عبر العدوى إلى تحريض تعبير البروتينات. 24 ساعة إلى 48 ساعة، تم استبدال وسيطة ثقافة الخلية لوسط يحتوي على 30 ميكرومتر من سيسبلاتين. بعد 24 ساعة من الحضانة، تم استخراج الحمض النووي الريبي الكلي وتم فصل منتجات PCR في هلام الآغاروز 3٪. أ)يصور النظائر المصغرة السائدة E1A. تمثل الرسوم البيانية B-D ٪ لكل متساوي الشكل بالنسبة إلى مجموع ثلاثة متغيرات (13S و 12S و 9S). في E، يتم عرض الفرق في النسبة المئوية للتعبير لكل isoform بالنسبة للتحكم في السيارة (المتوسط). يتم تقديم الرسوم البيانية على أنها متوسط و SEM لثلاث تجارب مستقلة. * ع < 0.05 ، ** ع <0.01 في اختبار ر غير مدفوعة الأجر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: تأثير العلاج باكليتاكسيل في نمط الربط E1A minigene. HEK293 التعبير بثبات العلم ناقلات فارغة (العلم) أو Nek4.1 العلم تنصهر، تم تحويلها مع pMTE1A البلازميد. بعد ست ساعات من إضافة التتراسيكلين عبر العدوى إلى تحريض تعبير البروتينات. 24 ساعة إلى 48 ساعة، تم استبدال وسيطة ثقافة الخلية بوسط يحتوي على 1 ميكرومتر من باكليتاكسيل أو الإيثانول (0.02٪) المستخدمة كتحكم في السيارة. بعد 24 ساعة من الحضانة، تم استخراج الحمض النووي الريبي الكلي وتم فصل منتجات PCR في هلام الآغاروز 3٪. أ)يتم تصوير الأشكال isoforms السائدة. تمثل الرسوم البيانية B-D ٪ لكل متساوي الشكل بالنسبة إلى مجموع ثلاثة متغيرات (13S و 12S و 9S). في E، يتم تقديم الفرق في النسبة المئوية للتعبير لكل isoform بالنسبة للتحكم في المركبة (الإيثانول). يتم تقديم الرسوم البيانية على أنها متوسط و SEM لثلاث تجارب مستقلة. * ع < 0.05 في اختبار ر غير مدفوعة الأجر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Minigenes هي أدوات هامة لتحديد الآثار في الربط البديل العالمي في الجسم الحي. وقد استخدمت adenoviral minigene E1A بنجاح لعقود لتقييم دور البروتينات عن طريقزيادة كميةهذه في الخلية 13,14. هنا، نقترح استخدام E1A minigene لتقييم الربط البديل بعد التعرض للعلاج الكيميائي. تم استخدام خط خلية مستقر يعبر عن Nek4 isoform 1 ، وتجنب القطع الأثرية من التعبير المفرط الناجم عن العدوى العابرة. لم يظهر isoform 1 من Nek4 تأثيرا في الربط البديل E1A minigene في الحالات القاعدية21، ولكن لديه العديد من المتفاعلات ذات الصلة بالربط ، لذلك ، مما يسمح لنا بتقييم التأثير المحدد للعلاج الكيميائي في الربط البديل E1A في هذه الخلايا.

على الرغم من الحساسية المنخفضة ، مقارنة بشكل رئيسي بالنهج المشعة ، فإن الطريقة الموصوفة هنا بسيطة ولا تتطلب كاشفات خاصة أو ظروف مختبرية. ومع ذلك، من المهم أن نلاحظ أن E1A minigene هو مراسل عالمي من التحديدات SS 5، على الرغم من أن اختيار 3 SS يمكن تقييمها مع هذا البروتوكول يجب استخدام مراسل minigeneمحددة 14،33،34. وعلاوة على ذلك، يمكن أن تتأثر النتائج بخط الخلية وينبغي تقييمها بعناية لتجنب سوء التفسير بسبب ملف الربط البديل القاعدي.

عادة، لوحظ اختلافات كبيرة في نمط الربط E1A minigene فقط عند تغيير التعبير عن عوامل الربط. تغييرات أخرى أقل وضوحا بسبب العدد الكبير من البروتينات تحوير نشاط هذه العوامل. لهذا السبب، عند بدء الدراسات لمرشح غير مباشر، ينبغي تفضيل النهج الكلاسيكي، على أساس كميات متزايدة من هذا البروتين المرشح. عندما يلاحظ بعض التأثير ، يمكن إجراء العلاجات لاستكشاف ما إذا كان التنظيم يمكن أن يكون محددا لتحفيز خلوي معين.

بعد نتيجة إيجابية أولية ، يمكن إجراء توحيد الوقت وتركيز الدواء لتحسين التجربة.

هذا البروتوكول البسيط هو الفحص الأولي ، وهي نقطة بداية يمكن أن تجيب على ما إذا كان البروتين المثير للاهتمام يظهر تأثيرا في الربط البديل ، وكذلك ، عندما يكون هناك بعض التأثير في تنظيم الربط البديل معروف بالفعل ، يمكن توجيه الدراسات إلى المسار الأكثر اتساقا حيث يلعب البروتين دورا في تنظيم الربط البديل في الاستجابة للعلاج الكيميائي.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ويعلن أصحاب البلاغ أنه ليس لديهم مصالح مالية متنافسة.

Acknowledgments

نشكر فونداساو دي أمبارو بيسكيسا دو استادو دي ساو باولو (FAPESP، من خلال غرانت تيماتيكو 2017/03489-1 إلى JK وزمالة إلى FLB 2018/05350-3) وConselho Nacional de Desenvolvimento Cientifico e Tecnológico (CNPq) لتمويل هذا البحث. نود أن نشكر الدكتور أدريان كراينر على توفير البلازميد pMTE1A وZerler وزملاؤه لعملهم في الاستنساخ E1A. كما نشكر البروفيسورة باتريسيا موريل، والأستاذة الدكتورة واندا بيريرا ألميدا، والبروفيسور الدكتور مارسيلو لانسيلوتي، والبروفيسورة الدكتورة كارينا كوغو كوغو مولر للسماح لنا باستخدام مساحة ومعدات مختبرهم.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
100 pb DNA Ladder Invitrogen 15628-050
6 wells plate Sarstedt 833920
Agarose Sigma A9539-250G
Cisplatin Sigma P4394
DEPC water ThermoFisher AM9920
DMEM ThermoFisher 11965118
dNTP mix ThermoFisher 10297-018
Fetal Bovine Serum - FBS ThermoFisher 12657029
Fluorescent Microscope Leica DMIL LED FLUO
Gel imaging acquisition system - ChemiDoc Gel Imagin System Bio-Rad
GFP - pEGFPC3 Clontech
HEK293 stable cells - HEK293 Flp-In Generated from Flp-In™ T-REx™ 293 - Invitrogen and described in ref 21
Hygromycin B ThermoFisher 10687010 Used for Flp-In cells maintenemant
Image processing and analysis software - FIJI software ref. 32
Lipid- based transfection reagent - jetOPTIMUS Polyplus Reagent Polyplus 117-07
Oligo DT ThermoFisher 18418020
Paclitxel Invitrogen P3456
Plate Reader/ UV absorbance Biotech Epoch Biotek/ Take3 adapter
pMTE1A plasmid Provided by Dr. Adrian Krainer
pMTE1A F Invitrogen  5’ -ATTATCTGCCACGGAGGTGT-3
pMTE1A R Invitrogen 5’ -GGATAGCAGGCGCCATTTTA-3’
Refrigerated centrifuge Eppendorf F5810R
Reverse Transcriptase - M-MLV ThermoFisher 28025013
Reverse transcriptase - Superscript IV ThermoFisher 18090050
Ribunuclease inhibitor RNAse OUT ThermoFisher 10777-019
RNA extraction phenol-chloroform based reagent - Trizol ThermoFisher 15596018
SybrSafe DNA gel stain ThermoFisher S33102
Taq Platinum Thermo 10966026
Tetracyclin Sigma T3383 Used for Flag empty or Nek4- Flag expression induction
Thermocycler Bio-Rad Bio-Rad T100
Trypsin Sigma T4799

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ule, J., Blencowe, B. J. Alternative Splicing Regulatory Networks: Functions, Mechanisms, and Evolution. Molecular Cell. 76 (2), 329-345 (2019).
  2. Pan, Q., Shai, O., Lee, L. J., Frey, B. J., Blencowe, B. J. Deep surveying of alternative splicing complexity in the human transcriptome by high-throughput sequencing. Nature Genetics. 40 (12), 1413-1415 (2008).
  3. Nilsen, T. W., Graveley, B. R. Expansion of the eukaryotic proteome by alternative splicing. Nature. 463 (7280), 457-463 (2010).
  4. Stamm, S. Signals and their transduction pathways regulating alternative splicing: a new dimension of the human genome. Human Molecular Genetics. 11 (20), 2409-2416 (2002).
  5. Kornblihtt, A. R., et al. Alternative splicing: a pivotal step between eukaryotic transcription and translation. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (3), 153-165 (2013).
  6. Zhong, X. -Y., Ding, J. -H., Adams, J. A., Ghosh, G., Fu, X. -D. Regulation of SR protein phosphorylation and alternative splicing by modulating kinetic interactions of SRPK1 with molecular chaperones. Genes & Development. 23 (4), 482-495 (2009).
  7. Misteli, T., Cáceres, J. F., Clement, J. Q., Krainer, A. R., Wilkinson, M. F., Spector, D. L. Serine Phosphorylation of SR Proteins Is Required for Their Recruitment to Sites of Transcription In Vivo. Journal of Cell Biology. 143 (2), 297-307 (1998).
  8. Kanopka, A., et al. Regulation of adenovirus alternative RNA splicing by dephosphorylation of SR proteins. Nature. 393 (6681), 185-187 (1998).
  9. Anufrieva, K. S., et al. Therapy-induced stress response is associated with downregulation of pre-mRNA splicing in cancer cells. Genome Medicine. 10 (1), 49 (2018).
  10. Shultz, J. C., et al. SRSF1 Regulates the Alternative Splicing of Caspase 9 Via A Novel Intronic Splicing Enhancer Affecting the Chemotherapeutic Sensitivity of Non-Small Cell Lung Cancer Cells. Molecular Cancer Research. 9 (7), 889-900 (2011).
  11. Gabriel, M., et al. Role of the splicing factor SRSF4 in cisplatin-induced modifications of pre-mRNA splicing and apoptosis. BMC Cancer. 15, (2015).
  12. Lee, S. C. -W., Abdel-Wahab, O. Therapeutic targeting of splicing in cancer. Nature Medicine. 22 (9), 976-986 (2016).
  13. Cooper, T. A. Use of minigene systems to dissect alternative splicing elements. Methods. 37 (4), 331-340 (2005).
  14. Stoss, O., Stoilov, P., Hartmann, A. M., Nayler, O., Stamm, S. The in vivo minigene approach to analyze tissue-specific splicing. Brain Research Protocols. 4 (3), 383-394 (1999).
  15. Zerler, B., et al. Adenovirus E1A coding sequences that enable ras and pmt oncogenes to transform cultured primary cells. Molecular and Cellular Biology. 6 (3), 887-899 (1986).
  16. Gattoni, R., Schmitt, P., Stevenin, J. In vitro splicing of adenovirus E1A transcripts: characterization of novel reactions and of multiple branch points abnormally far from the 3' splice site. Nucleic Acids Research. 16 (6), 2389-2409 (1988).
  17. Stephens, C., Harlow, E. Differential splicing yields novel adenovirus 5 E1A mRNAs that encode 30 kd and 35 kd proteins. The EMBO journal. 6 (7), 2027-2035 (1987).
  18. Ulfendahl, P. J., et al. A novel adenovirus-2 E1A mRNA encoding a protein with transcription activation properties. The EMBO journal. 6 (7), 2037-2044 (1987).
  19. Berk, A. J., Sharp, P. A. Structure of the adenovirus 2 early mRNAs. Cell. 14 (3), 695-711 (1978).
  20. Svensson, C., Pettersson, U., Akusjärvi, G. Splicing of adenovirus 2 early region 1A mRNAs is non-sequential. Journal of Molecular Biology. 165 (3), 475-495 (1983).
  21. Basei, F. L., Meirelles, G. V., Righetto, G. L., dos Santos Migueleti, D. L., Smetana, J. H. C., Kobarg, J. New interaction partners for Nek4.1 and Nek4.2 isoforms: from the DNA damage response to RNA splicing. Proteome Science. 13 (1), 11 (2015).
  22. Zhou, Z., et al. The Akt-SRPK-SR Axis Constitutes a Major Pathway in Transducing EGF Signaling to Regulate Alternative Splicing in the Nucleus. Molecular Cell. 47 (3), 422-433 (2012).
  23. Caceres, J., Stamm, S., Helfman, D., Krainer, A. Regulation of alternative splicing in vivo by overexpression of antagonistic splicing factors. Science. 265 (5179), 1706-1709 (1994).
  24. Zhong, X. -Y., Ding, J. -H., Adams, J. A., Ghosh, G., Fu, X. -D. Regulation of SR protein phosphorylation and alternative splicing by modulating kinetic interactions of SRPK1 with molecular chaperones. Genes & Development. 23 (4), 482-495 (2009).
  25. Naro, C., et al. The centrosomal kinase NEK2 is a novel splicing factor kinase involved in cell survival. Nucleic Acids Research. 42 (5), 3218-3227 (2014).
  26. Lu, C. -C., Chen, T. -H., Wu, J. -R., Chen, H. -H., Yu, H. -Y., Tarn, W. -Y. Phylogenetic and Molecular Characterization of the Splicing Factor RBM4. PLoS ONE. 8 (3), 59092 (2013).
  27. Jarnæss, E., et al. Splicing Factor Arginine/Serine-rich 17A (SFRS17A) Is an A-kinase Anchoring Protein That Targets Protein Kinase A to Splicing Factor Compartments. Journal of Biological Chemistry. 284 (50), 35154-35164 (2009).
  28. Bressan, G. C., et al. Functional association of human Ki-1/57 with pre-mRNA splicing events. FEBS Journal. 276 (14), 3770-3783 (2009).
  29. Vivarelli, S., et al. Paraquat Modulates Alternative Pre-mRNA Splicing by Modifying the Intracellular Distribution of SRPK2. PLoS ONE. 8 (4), 61980 (2013).
  30. Russell, W. C., Graham, F. L., Smiley, J., Nairn, R. Characteristics of a Human Cell Line Transformed by DNA from Human Adenovirus Type 5. Journal of General Virology. 36 (1), 59-72 (1977).
  31. Aranda, P. S., LaJoie, D. M., Jorcyk, C. L. Bleach gel: A simple agarose gel for analyzing RNA quality. Electrophoresis. 33 (2), 366-369 (2012).
  32. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  33. Bai, Y. Control of 3' splice site choice in vivo by ASF/SF2 and hnRNP A1. Nucleic Acids Research. 27 (4), 1126-1134 (1999).
  34. Cote, G. J., Nguyen, N., Lips, C. J. M., Berget, S. M., Gagel, R. F. Validation of an in vitro RNA processing system for CT/CGRP precursor mRNA. Nucleic Acids Research. 19 (13), 3601-3606 (1991).

Tags

أبحاث السرطان، العدد 170، التشبيك البديل مرنا، مينيجين E1A، Nek4، استجابة العلاج الكيميائي، التعبير isoforms، خلايا مستقرة HEK293.
استخدام أداة E1A Minigene لدراسة تغييرات الربط مرنا
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Basei, F. L., Moura, L. A. R.,… More

Basei, F. L., Moura, L. A. R., Kobarg, J. Using the E1A Minigene Tool to Study mRNA Splicing Changes. J. Vis. Exp. (170), e62181, doi:10.3791/62181 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter