Summary
Denne protokol præsenterer et hurtigt og nyttigt værktøj til evaluering af et proteins rolle med ukarakteriseret funktion i alternativ splejsningsregulering efter kemoterapeutisk behandling.
Abstract
mRNA-behandling involverer flere samtidige trin til at forberede mRNA til oversættelse, såsom 5'udjævning, poly-A-tilsætning og splejsning. Udover konstituerende splejsning giver alternativ mRNA-splejsning mulighed for at udtrykke multifunktionelle proteiner fra et gen. Da interactome-undersøgelser generelt er den første analyse af nye eller ukendte proteiner, er foreningen af agnproteinet med splejsningsfaktorer et tegn på, at det kan deltage i mRNA-splejsningsproces, men at bestemme, i hvilken sammenhæng eller hvilke gener der reguleres, er en empirisk proces. Et godt udgangspunkt for at evaluere denne funktion er at bruge det klassiske minigene værktøj. Her præsenterer vi adenoviral E1A minigene brug for evaluering af alternative splejsning ændringer efter forskellige cellulære stress stimuli. Vi vurderede splejsning af E1A minigene i HEK293 stably overexpressing Nek4 protein efter forskellige stressende behandlinger. Protokollen omfatter E1A minigentransfekt, cellebehandling, RNA-ekstraktion og cDNA-syntese efterfulgt af PCR- og gelanalyse og kvantificering af E1A-splejsede varianter. Brugen af denne enkle og veletablerede metode kombineret med specifikke behandlinger er et pålideligt udgangspunkt for at kaste lys over cellulære processer, eller hvilke gener der kan reguleres af mRNA-splejsning.
Introduction
Splejsning er blandt de vigtigste trin i eukaryote mRNA-behandling, der sker samtidigt til 5'mRNA-udjævning og 3'mRNA polyadenylering, bestående af intronfjernelse efterfulgt af exon-krydset. Det splejsningssteders (SS) anerkendelse af splejsningsstederne, et ribonukleoproteinkompleks, der indeholder små ribonukleoproteiner (snRNP U1, U2, U4 og U6), små RNA'er (snRNA'er) og flere regulerende proteiner1 er nødvendige for splejsning.
Ud over intronfjernelse (konstituerende splejsning) kan introner i eukaryoter bevares, og exoner kan udelukkes, hvilket konfigurerer processen kaldet mRNA-alternativ splejsning (AS). Den alternative præ-mRNA splejsning udvider kodning kapacitet eukaryote genomer gør det muligt at producere et stort og forskelligartet antal proteiner fra et relativt lille antal gener. Det anslås , at 95-100% af humane mRNA'er , der indeholder mere end én exon , kan gennemgå alternativ splejsning2,3. Dette er grundlæggende for biologiske processer som neuronal udvikling, apoptoseaktivering og cellulær stressrespons4, der giver organismens alternativer til at regulere cellefunktion ved hjælp af det samme repertoire af gener.
De maskiner, der er nødvendige for alternativ splejsning, er de samme, der anvendes til konstituerende splejsning, og brugen af SS er den vigtigste afgørende faktor for alternativ splejsning. Konstituerende splejsning er relateret til brugen af stærke splejsningssteder, som normalt mere ligner konsensusmotiver til splejsning afanerkendelse 5.
Alternative exons er typisk anerkendt mindre effektivt end konstituerende exons når dens cis-regulerendeelementer, sekvenserne i 5'SS og 3'SS flankerende disse exons, viser en ringere bindende kapacitet til splejsning. mRNA indeholder også regioner med navnet forstærkere eller lyddæmpere beliggende i exons (exonic splejsning forstærkere (ESEs) og exonic splejsning lyddæmpere (ESSs)) og introner (intronic splejsning forstærkere (ISEs) og intronic splejsning lyddæmpere (ISSs)), der forbedrer eller undertrykke exon brug, henholdsvis5. Disse sekvenser genkendes af transregulerende elementer eller splejsningsfaktorer (SF). SF'er repræsenteres hovedsageligt af to proteinfamilier, de serin-/argininrige splejsningsfaktorer (SRSF'er), der binder sig til EES og familien af heterogene nukleare ribonukleoproteiner (hnRNP'er), som binder sig til ESS-sekvenser5.
Alternativ splejsning kan moduleres ved fosforylering/ dephosphorylering af transfaktorer , der ændrer interaktionspartnerne , og cellulær lokalisering af splejsningsfaktorer6,7,8. Identifikation af nye regulatorer af splejsningsfaktorer kan give nye værktøjer til at regulere splejsning og dermed nogle kræftbehandlinger.
Anufrieva et al.9observerede i en mRNA-mikroarray-genekspressionsprofil konsekvente ændringer i niveauer af splejseosomale komponenter i 101 cellelinjer og efter forskellige stressforhold (platinbaserede lægemidler, gammabestråling, topoisomerase-hæmmere, tyrosinkinasehæmmere og taxanes). Forholdet mellem splejsning mønster og kemoterapi effekt er allerede blevet påvist i lungekræft celler, som er kemoterapi resistente, viser ændringer i caspase-9 varianter sats10. HEK293 celler behandlet med kemoterapeutiske panel viser ændringer i splejsning med en stigning i pro-apptotiske varianter. Gabriel et al.11 observerede ændringer i mindst 700 tilfælde af splejsning efter cisplatinbehandling i forskellige cellelinjer og påpegede, at splejsningsveje er cisplatin-påvirket. Splejsning modulatorer har allerede vist anti-tumoral aktivitet, viser, at splejsning er vigtigt at tumoral udvikling og, hovedsagelig, kemoterapi respons12. Derfor er det meget vigtigt at karakterisere nye proteiner, der regulerer splejsning efter cellulære stressfaktorer, som kemoterapeutik, for at opdage nye behandlingsstrategier.
Ledetrådene i alternativ splejsning regulering fra interactome undersøgelser, især vigtigt at karakterisere funktioner af nye eller ukarakteriserede proteiner, kan kræve en mere generel og enkel tilgang til at kontrollere den reelle rolle protein i AS. Minigener er vigtige værktøjer til analyse af den generelle rolle af et protein, der påvirker splejsning regulering. De indeholder segmenter af interessegen, der indeholder alternativt splejsede og flankerende genomiske regioner13. Ved hjælp af et minigenværktøj kan analysen af splejsning in vivo med flere fordele såsom længden af minigenet, som er mindre og derfor ikke er en begrænsning af forstærkningsreaktionen; den samme minigen kan evalueres i forskellige cellelinjer; alle cellulære komponenter, hovedsagelig deres regulerende post-translationelle modifikation (fosforylering og ændringer i cellerum) er til stede og kan behandles13,14. Desuden kan ændringer i alternativt splejsningsmønster observeres efter cellulær stress, og brugen af et minigensystem gør det muligt at identificere den vej, der moduleres af forskellige stimuli.
Der er flere minigene systemer, der allerede er beskrevet, som er specifikke for forskellige former for splejsning begivenheder13,14, men som en foreløbig analyse, minigene E1A15 er en meget veletableret alternativ splejsning reporter system til undersøgelse af 5's SS udvælgelse in vivo. Fra kun ét gen, E1A, fem mRNA'er er produceret af alternative splejsning baseret på udvælgelse af tre forskellige 5 'splejsning steder og en større eller en mindre 3 'splejsning site16,17,18. Udtrykket af E1A varianter ændres i henhold til perioden for Adenoviral infektion19,20.
Vi har tidligere vist, at både Nek4 isoformer interagerer med splejsningsfaktorer som SRSF1 og hnRNPA1, og mens isoform 2 ændrer minigen E1A alternativ splejsning, har isoform 1 ingen effekt i den21. Fordi isoform 1 er den mest rigelige isoform og ændrer kemoterapiresistens og DNA-skaderespons, vurderer vi, om det kan ændre minigen E1A alternativ splejsning i en stresstilstand.
Minigene assay er en enkel, billig og hurtig metode, da den kun har brug for RNA-ekstraktion, cDNA-syntese, forstærkning og agarosegelanalyser og kan være et nyttigt værktøj til at evaluere, da en mulig effekt på alternativ splejsning af et protein af interesser indtil virkningen af forskellige behandlinger på cellulært alternativt splejsningsmønster.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Plating celler
BEMÆRK: I denne beskrevne protokol blev HEK293 stabile cellelinjer, der tidligere blev genereret til stabilt indukbelt udtryk for Nek4, brugt21, men den samme protokol er egnet til mange andre cellelinjer, såsom HEK29322, HeLa23,24,25,26, U-2 OS27, COS728, SH-SY5Y29. Mønsteret af ekspression af minigene E1A isoformer under basale forhold varierer mellem disse celler og bør karakteriseres for hver tilstand. Denne protokol er ikke begrænset til stabile cellelinjer. Den mest almindelige tilgang til evaluering af kandidatprotein er ved forbigående medtransfekt at øge sin mængde med fast mængde af minigenet. Den samme protokol er velegnet til knockout celler.
- Pladeceller overvejer køretøj, utransfekt og GFP kontrol.
- Kultur HEK293 celler med stabilt udtryk for genet af interesse i Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) suppleret med 10% af FBS (Fetal Bovine Serum), 4,5 g/L Glukose, 4 mM L-glutamin og med 100 μg/ml hygromycin B opretholdes på vævskulturbehandlede plader ved 37 °C i 5% CO2 og en befugtet atmosfære.
- Opdel celler ved hjælp af 0,25% trypsin-EDTA. Plade 3 x 105 celler i 6-brønds plader og inkuber dem i 24 timer ved 37 °C i 5% CO2.
BEMÆRK: Ved transfekt skal cellerne være 70-80 % sammenflydende for at mindske celledøden efter overfekten.
2. Celletransfekt
BEMÆRK: Der blev her anvendt 1-2 μg pMTE1A minigene plasmid, men DNA-mængden samt udtrykstidspunktet skal holdes på et minimum for at undgå toksicitet. For eksempel blev der observeret høj toksicitet i HeLa-celler efter 30 timers transfekt med 1 μg pMTE1A DNA. Til den transfekt, der er beskrevet her, blev der brugt et lipidbaseret transfektreagens
- Kontroller kun cellekonfluens 24 timer efter plating og transfect HEK293 stabile celler, når 70-80% sammenflydende.
- Fjern cellekulturmediet forsigtigt med en pipette i stedet for at bruge et vakuumpumpesystem. Derefter tilsættes forsigtigt 2 mL komplet DMEM-medium uden antibiotika og læg pladen tilbage i inkubatoren.
- Der fremstilles et rør med transfektbufferen (200 μL/brønd), der tilsættes 2 μg pMTE1A DNA, vortex, og derefter tilsættes 2 μL transfektreagens. Vortex igen og inkuberes i 10 minutter ved stuetemperatur.
- Fjern plader fra inkubatoren og tilsæt forsigtigt transfektblandingen dråbevis.
- Til HEK293 stabile celler tilsættes tetracyklin (0,5 μg/mL) for Nek4-ekspressionsinduktion 6 timer efter transinfektionen. Medium ændring er ikke nødvendig.
BEMÆRK: Mængder/beløb, der er beskrevet i dette afsnit, er for en brønd. Forbered blandingen til alle brønde, der anvendes i forsøget i samme rør. - Forbered en brønd til at transfektere med EGFP, eller en anden fluorophore udtrykke plasmid at vurdere transfekturet effektivitet. Bedre resultater kan observeres med transfekteffektivitet på mindst 40%, men gode præstationer med lavere transfekteffektivitet blev tidligere observeret.
- Når du bruger co-transfection (interesse protein og minigene) holde en brønd med ikke-transfected celler for at undgå at opnå resultater fra endogene mRNA. For E1A udtrykker HEK293-cellerne allerede E1A-genet30.
3. Forberedelse af narkotika
BEMÆRK: Behandlingstiden og koncentrationen blev valgt på baggrund af litteraturresultater, som peger på ændringer i alternativ splejsning for nogle gener.
- Udfør en dosis-respons kurve, før du starter analysen for at bestemme den minimale koncentration til alternativ splejsning induktion uden effekt i celle levedygtighed.
- Forbered en Paclitaxel stamopløsning ved 5 mM koncentration i ethanol. Den endelige koncentration er 1 μM. Ved -20 °C opbevares. Brug 0,02% ethanol som køretøjskontrol.
- Der fremstilles en cisplatinopløsning ved fortynding i 0,9% NaCl ved ca. 0,5 mg/mL (1,66 mM). Beskyt mod lys, hvirvelstrøm og inkuber i et termisk bad, 37 °C i 30 min. Den endelige koncentration er 30 μM. Forbered frisk eller opbevar ved 2-10 °C indtil en måned.
BEMÆRK: Alle lægemidler skal beskyttes mod lyset.
4. Cellebehandling og indsamling
BEMÆRK: HEK293 stabile celler blev indsamlet 48 timer efter transfekten, og for dette blev behandlet 24 timer efter transfekten, fordi det højeste Nek4-udtryksniveau opnås inden for 48 timer. Der blev dog observeret høje niveauer af 13S isoformudtryk (indtil 90%) på dette tidspunkt. For at reducere andelen af 13S isoform, så prøv at behandle og indsamle celler 30 timer efter transfekt maksimum.
- Brug RNA/DNase gratis tips og rør. Udfør total RNA-ekstraktion med phenol-chloroform reagens efter fabrikantens anbefaling.
- 24 timer efter transfekten kontrolleres cellemorfologi og transfektureeffektivitet ved hjælp af et fluorescerende mikroskop.
- Fjern cellekulturmediet, fortrinsvis ved hjælp af en pipette i stedet for et vakuumpumpesystem. Derefter tilsættes cellekultur medium med kemoterapeutik i den tidligere beskrevne endelige koncentration.
- Inkuber ved 37 °C, 5% CO2 i 18 - 24 timer.
- RNA opsamles ved at kassere cellekulturmediet i en beholder og tilsætte 0,5 - 1 mL RNA-ekstraktionsreagens direkte til brønden. Hvis brøndene er meget sammenflydende, skal du bruge 1 mL RNA-ekstraktionsreagens for at forbedre RNA-kvaliteten.
- Homogeniseres med pipetten og overføres til et 1,5 mL centrifugerør. På dette tidspunkt kan protokollen standses midlertidigt ved at opbevare prøver ved -80 °C eller straks gå videre til RNA-ekstraktionen.
ADVARSEL: Det phenolbaserede RNA-ekstraktionsreagens er giftigt, og alle procedurer skal udføres i en kemisk røghætte, og restkoncentrationerne bortskaffes korrekt.
5. RNA-ekstraktion og cDNA-syntese
- I en røghætte optøs prøverne og inkuberes i 5 minutter ved stuetemperatur. Der tilsættes 0,1 -0,2 ml kloroform og omrøres kraftigt.
- Inkuber i 3 minutter ved stuetemperatur.
- Centrifuge i 15 minutter ved 12.000 x g og 4 °C.
- Den øverste vandige fase opsamles og overføres til et nyt centrifugerør på 1,5 mL. Indsamle omkring 60% af det samlede volumen; dna'et eller den organiske (nedre) fase må dog ikke indsamles.
- Tilsæt 0,25 - 0,5 mL isopropanol og omrør ved inversion 4 gange. Inkuber i 10 minutter ved stuetemperatur.
- Centrifuge ved 12.000 x g i 10 min. ved 4 °C og kassér supernatanten.
- RNA-pellet to gange med ethanol (75% i diethylpyrocarbonat (DEPC)-behandlet vand). Centrifuge ved 7.500 x g i 5 min og kassér ethanolen.
- Fjern overskydende ethanol ved at vende røret på et håndklædepapir og lad derefter røret stå åbent inde i en røghætte for delvist at tørre pelleten i 5 - 10 minutter.
- RNA-pelletpen blev genbrugt i 15 μL DEPC-behandlet vand.
- Quantify total RNA ved hjælp af absorbans ved 230 nm, 260 nm og 280 nm for at verificere RNA-kvaliteten.
- For at kontrollere den samlede RNA-kvalitet skal du køre en 1% agarosegel forbehandlet med 1,2% (v/v) af en 2,5% natriumhypochloritopløsning i 30min. 31.
- CDNA-syntesen udføres ved hjælp af 1-2 μg totalt RNA.
- Pipette RNA, 1 μL oligo-dT (50 μM), 1 μL dNTP (10 mM) og udgør volumenet til 12 μL med kernefrit vand. Inkuber i termocyklen i 5 min ved 65 °C.
- Prøverne fjernes fra termocyklen for at køle ned og forberede reaktionsblandingen: 4 μL omvendt transskriptionsbuffer, 2 μL dithiothreitol (DTT) og 1 μL ribonukleasehæmmer. Inkuber ved 37 °C i 2 min.
- Der tilsættes 1 μL termostalsk omvendt transskription. Inkuber ved 37 °C i 50 min. og inaktiver enzymet ved 70 °C i 15 min.
BEMÆRK: CDNA kan opbevares ved -20 °C i flere uger. Udfør en ikke-omvendt transskriptionskontrol (NRT) for genomisk kontaminering fra formodede intronfastholdelseshændelser.
6. pMTE1A minigen PCR
- Udfør PCR med reaktionssammensætningen (1,5 mM MgCl2, 0,3 mM dNTP-blanding, 0,5 μM af hver primer, 2,5 U af en varmstart Taq Polymerase og 150 ng cDNA) med følgende betingelser:
94 °C i 2 min., 29 cyklusser på: 94 °C i 1 min., 50 °C i 2 min., 72 °C i 2 min., 72 °C i 10 min. - 20-25 μL af PCR-produktet indlæses i en 3% agarosegel, der indeholder nukleinsyreplet, og kør ved 100 V i ca. 1 time.
7. Analyse af gelen ved hjælp af en billedbehandlings- og analysesoftware32
- Efter løbeturen skal du fotografere gelen (ved hjælp af et gel imaging acquisition system) og undgå bandmætning og kvantificere båndene ved hjælp af en billedbehandlingssoftware.
- For kvantificering overveje båndene på ~ 631 bp, ~ 493 bp, og ~ 156 bp til at svare til 13S, 12S og 9S isoformer, henholdsvis.
- Åbn den billedfil, der er hentet fra billedopsamlingssystemet, i menuen Filer. Konverter til gråtoner, juster lysstyrke og kontrast, og fjern om nødvendigt mere støj.
- Tegn et rektangel rundt om den første vognbane med værktøjet Rektangelmarkering, og marker det ved hjælp af | Analyser Geler | Vælg kommandoen First Lane, eller tryk på tastaturgenvejen for den.
- Brug musen til at klikke og holde i midten af rektanglet på den første vognbane og trække den over til næste vognbane. Gå til Analyser | Geler | Vælg Næste vognbane, eller tryk på den tilgængelige genvej. Gentag dette trin til alle resterende baner.
- Når alle banerne er fremhævet og nummereret, skal du gå til Analyser | Geler | Plot Lanes at tegne en profil plot af hver vognbane.
- Med markeringsværktøjet Lige streg kan du tegne en streg hen over bunden af hver top, der svarer til hvert bånd, og udelade baggrundsstøjen. Når alle toppe fra hver vognbane er blevet lukket, skal du vælge wandværktøjet og klikke inde i hver top. For hvert højdepunkt, der fremhæves, skal målinger dukke op i det resultatvindue, der vises.
- Summen af intensiteten fra alle de 3 bånd for hver prøve og beregn procentdelen for hver isoform i forhold til totalen.
- Procentdelen af hver isoform eller forskellene i procent i forhold til ubehandlede prøver afbildes.
BEMÆRK: Sørg for, at summen af tre E1A-varianter skal være lig med 100 %.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En 5 'splejsning steder assay ved hjælp af E1A minigene blev udført for at evaluere ændringer i splejsning profil i celler efter kemoterapi redegørelse. Nek4 - isoform 1's rolle i AS-regulering i HEK293 stabile celler efter paclitaxel eller cisplatinbehandling blev evalueret.
Adenoviral E1A-regionen er ansvarlig for produktionen af tre hovedmRNA'er fra en RNA-prækursor på grund af brugen af forskellige splejsedonorer. De deler fælles 5' og 3' termini, men adskiller sig i størrelsen af deres punkterede introner. Adenoviral E1A mRNA'er navngives efter deres sedimenteringskoefficienter, 13S, 12S og 9S. I den tidlige fase af adenovirusinfektion (ca. 7 timer) produceres proteiner, der er vigtige for at forberede den inficerede celle til viral DNA-replikation (13S - 723 aa og 12S - 586 aa), og i den sene fase (ca. 18 timer) ud over dem produceres et lille protein (9S -249 aa)20. Ved hjælp af et plasmid, der indeholder minigenet fra E1A, kan virkningen på alternativ splejsning observeres i celler efter transfekten, der vurderer andelen af mRNA fra hver produceret isoform: 13S: 631 bp, 12S: 493 bp og 9S 156 bp (Figur 1A og B).
Basalt udtryk for E1A isoforme varianter afhænger af cellelinje og tidspunkt for E1A-udtryk. Det blev bemærket, at HEK293-stabil cellelinje (HEK293-Flag) eller HEK293 rekombinisse indeholdende sted (HEK293-FRT - den oprindelige cellelinje) viser et højere udtryk på 13S i forhold til HeLa-celler (HeLa-PLKO), der viser lignende niveauer af 13S og 12S isoformer efter 48 timer med E1A-udtryk (Figur 1C og D).
Det høje niveau på 13S-ekspression observeret i HEK293 stabile celler reduceres betydeligt under kortere tider med E1A-udtryk (ca. 30 timer). Andelen (%) af 13S:12S:9S ved henholdsvis 30 timer og 48 timer er henholdsvis 60:33:7 og 80:15:5 (ikke-repræsenterede data). Af denne grund er det vigtigt at karakterisere den basale cellulære minigene E1A splejsningsprofil, før eksperimenterne startes.
Celler udsat for cisplatin viste et skift i 5's SS splejsning udvælgelse favoriserer 12S udtryk (en stigning på omkring 15% i forhold til ubehandlede celler). Denne effekt blev observeret i HEK293 stably udtrykke Flag tom vektor samt isoform 1 af Nek4. Når der observeres større ændringer i udtryksprocenten, repræsenterer et område med procenter klart resultaterne (Figur 2).
Når man sammenligner to tilstande (Flag og Nek4 overekspression) reagerer på en behandling, normalt den bedste måde at repræsentere data er plotte forskellene på en graf, fordi det basale niveau af udtryk kan være forskellige, og procenterne vil ikke afspejle den reelle effekt af behandlingen. Dette kan iagttages i figur 3. Ændringer i AS efter paclitaxel behandling var meget diskret, men anvisningerne for ændringerne var det modsatte i Flag og Nek4 udtrykke celler.
På trods af små ændringer efter behandlingen var resultaterne konsistente, hvilket indikerer, at paclitaxelbehandlingen fører til et fald i 13S isoform, med en stigning i 12S og 9S i Flag, der udtrykker celler, mens den modsatte effekt observeres i Nek4, der udtrykker celler.
Figur 1:Minigene E1A-splejsningsmønsteret afhænger af cellelinjen. A) Skematisk repræsentation af minigene E1A-splejsningssteder. Pilene angiver primer annealing regionen for minigene E1A isoformer forstærkning. B)Isoformer fra alternativ splejsning af minigene E1A. C)HEK293 knivstændigt udtrykke Flag tom vektor (HEK293 -Flag), HeLa transfected med PLKO vektor (HeLa - PLKO) eller, HEK293 rekombininase-holdige steder (fra hvad HEK293 stably udtrykke Flag eller Nek4.1 blev genereret - HEK293-FRT) blev transfected med pMTE1A plasmid. 48h efter transfekten samlede RNA blev isoleret og E1A isoformer blev adskilt i agarose gel (D). Graf, der sammenligner procentdelen af 13S-, 12S- og 9S-isoform i HEK293-Flag- og HeLa-PLKO-celler under basale forhold. Data fra tre uafhængige eksperimenter. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Virkningen af Cisplatin-behandling i minigene E1A-splejsningsmønster. HEK293 stably udtrykke Flag tom vektor (Flag) eller Nek4.1 Flag tag smeltet, blev transfected med pMTE1A plasmid. Seks timer efter transfekt tetracyklin blev tilsat proteiner udtryk induktion. 24 timer til 48 timer blev cellekulturmediet udskiftet for medium indeholdende 30 μM Cisplatin. Efter 24 timers inkubation blev det samlede RNA udvundet, og produkterne fra PCR blev adskilt ved 3% agarosegel. A)Fremherskende minigen E1A isoformer er afbildet. Figur B-D repræsenterer % af hver isoform i forhold til summen af tre varianter (13S, 12S og 9S). I Epræsenteres forskellen i ekspressionsprocenten for hver isoform i forhold til køretøjets (medium) kontrol. Grafer præsenteres som middelværdi og SEM for tre uafhængige eksperimenter. * p< 0,05, ** p<0,01 i uparret t test. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Virkningen af Paclitaxel-behandling i minigene E1A splejsningsmønster. HEK293 stably udtrykke Flag tom vektor (Flag) eller Nek4.1 Flag smeltet, blev transfected med pMTE1A plasmid. Seks timer efter transfekt tetracyklin blev tilsat proteiner udtryk induktion. 24 timer til 48 timer blev cellekulturmediet erstattet af et medium, der indeholdt 1 μM Paclitaxel eller ethanol (0,02%), der blev anvendt som køretøjskontrol. Efter 24 timers inkubation blev det samlede RNA udvundet, og produkterne fra PCR blev adskilt ved 3% agarosegel. A)Fremherskende isoformer er afbildet. Figur B-D repræsenterer % af hver isoform i forhold til summen af tre varianter (13S, 12S og 9S). I Epræsenteres forskellen i procent af ekspressionen for hver isoform i forhold til køretøjets (ethanol) kontrol. Grafer præsenteres som middelværdi og SEM for tre uafhængige eksperimenter. * p< 0,05 i uparret t test. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Minigener er vigtige værktøjer til at bestemme virkningerne i den globale alternative splejsning in vivo. Den adenoviral minigene E1A er blevet brugt med succes i årtier til at evaluere proteiners rolle ved at øge mængden af disse i celle13,14. Her foreslår vi minigene E1A brug til evaluering af alternativ splejsning efter kemoterapieksponering. En stabil cellelinje, der udtrykker Nek4 isoform 1, blev brugt, så man undgik artefakter af overekspression forårsaget af forbigående transfekt. Isoform 1 af Nek4 viste ikke effekt i minigenet E1A alternativ splejsning under basale forhold21, men har mange splejsningsrelaterede interactorer, hvilket giver os mulighed for at evaluere den specifikke effekt af kemoterapeutisk behandling i E1A alternativ splejsning i disse celler.
På trods af sin lave følsomhed, hovedsagelig sammenlignet med radioaktive tilgange, er den her beskrevne metode enkel og kræver ikke specielle reagenser eller laboratorieforhold. Det er dog vigtigt at bemærke, at minigene E1A er en global reporter af 5's SS-valg, selvom 3's SS-valg kan evalueres med denne protokol, skal den specifikke minigene reporter bruges14,33,34. Desuden kan resultaterne påvirkes af cellelinjen og bør evalueres omhyggeligt for at undgå fejlfortolkning på grund af den basale alternative splejsningsprofil.
Normalt observeres store forskelle i minigen E1A splejsningsmønster kun, når udtrykket af splejsningsfaktorer ændres. Andre ændringer er mindre indlysende på grund af det store antal proteiner, der modulerer aktiviteten af disse faktorer. Derfor bør man foretrække den klassiske tilgang, der er baseret på stigende mængder af dette kandidatprotein, når man starter undersøgelser for en indirekte kandidat. Når en vis effekt observeres, kan behandlingerne udføres for at undersøge, om reguleringen kan være specifik for en bestemt cellulær stimulus.
Efter et foreløbigt positivt resultat kan standardiseringen af tid og lægemiddelkoncentration udføres for at optimere eksperimentet.
Denne enkle protokol er en foreløbig analyse, et udgangspunkt, der kan besvare, om det protein af interesse viser en effekt i alternativ splejsning og også, når en vis effekt i alternativ splejsning regulering er allerede kendt, kan direkte undersøgelserne til de mere konsekvente vej, hvor proteinet spiller en rolle regulere alternative splejsning i kemoterapi respons.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Vi takker Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP, gennem Grant Temático 2017/03489-1 til JK og stipendium til FLB 2018/05350-3) og Conselho Nacional de Desenvolvimento Cientifico e Tecnológico (CNPq) til finansiering af denne forskning. Vi vil gerne takke Dr. Adrian Krainer for at give pMTE1A plasmid og Zerler og kolleger for deres arbejde i E1A kloning. Vi takker også prof. Dr. Patrícia Moriel, prof. Dr. Wanda Pereira Almeida, prof. Dr. Marcelo Lancellotti og prof. Dr. Karina Kogo Cogo Müller for at give os mulighed for at bruge deres laboratorieplads og udstyr.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 pb DNA Ladder | Invitrogen | 15628-050 | |
| 6 wells plate | Sarstedt | 833920 | |
| Agarose | Sigma | A9539-250G | |
| Cisplatin | Sigma | P4394 | |
| DEPC water | ThermoFisher | AM9920 | |
| DMEM | ThermoFisher | 11965118 | |
| dNTP mix | ThermoFisher | 10297-018 | |
| Fetal Bovine Serum - FBS | ThermoFisher | 12657029 | |
| Fluorescent Microscope | Leica | DMIL LED FLUO | |
| Gel imaging acquisition system - ChemiDoc Gel Imagin System | Bio-Rad | ||
| GFP - pEGFPC3 | Clontech | ||
| HEK293 stable cells - HEK293 Flp-In | Generated from Flp-In™ T-REx™ 293 - Invitrogen and described in ref 21 | ||
| Hygromycin B | ThermoFisher | 10687010 | Used for Flp-In cells maintenemant |
| Image processing and analysis software - FIJI software | ref. 32 | ||
| Lipid- based transfection reagent - jetOPTIMUS Polyplus Reagent | Polyplus | 117-07 | |
| Oligo DT | ThermoFisher | 18418020 | |
| Paclitxel | Invitrogen | P3456 | |
| Plate Reader/ UV absorbance | Biotech | Epoch Biotek/ Take3 adapter | |
| pMTE1A plasmid | Provided by Dr. Adrian Krainer | ||
| pMTE1A F | Invitrogen | 5’ -ATTATCTGCCACGGAGGTGT-3 | |
| pMTE1A R | Invitrogen | 5’ -GGATAGCAGGCGCCATTTTA-3’ | |
| Refrigerated centrifuge | Eppendorf | F5810R | |
| Reverse Transcriptase - M-MLV | ThermoFisher | 28025013 | |
| Reverse transcriptase - Superscript IV | ThermoFisher | 18090050 | |
| Ribunuclease inhibitor RNAse OUT | ThermoFisher | 10777-019 | |
| RNA extraction phenol-chloroform based reagent - Trizol | ThermoFisher | 15596018 | |
| SybrSafe DNA gel stain | ThermoFisher | S33102 | |
| Taq Platinum | Thermo | 10966026 | |
| Tetracyclin | Sigma | T3383 | Used for Flag empty or Nek4- Flag expression induction |
| Thermocycler Bio-Rad | Bio-Rad | T100 | |
| Trypsin | Sigma | T4799 |
References
- Ule, J., Blencowe, B. J. Alternative Splicing Regulatory Networks: Functions, Mechanisms, and Evolution. Molecular Cell. 76 (2), 329-345 (2019).
- Pan, Q., Shai, O., Lee, L. J., Frey, B. J., Blencowe, B. J. Deep surveying of alternative splicing complexity in the human transcriptome by high-throughput sequencing. Nature Genetics. 40 (12), 1413-1415 (2008).
- Nilsen, T. W., Graveley, B. R. Expansion of the eukaryotic proteome by alternative splicing. Nature. 463 (7280), 457-463 (2010).
- Stamm, S. Signals and their transduction pathways regulating alternative splicing: a new dimension of the human genome. Human Molecular Genetics. 11 (20), 2409-2416 (2002).
- Kornblihtt, A. R., et al. Alternative splicing: a pivotal step between eukaryotic transcription and translation. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (3), 153-165 (2013).
- Zhong, X. -Y., Ding, J. -H., Adams, J. A., Ghosh, G., Fu, X. -D. Regulation of SR protein phosphorylation and alternative splicing by modulating kinetic interactions of SRPK1 with molecular chaperones. Genes & Development. 23 (4), 482-495 (2009).
- Misteli, T., Cáceres, J. F., Clement, J. Q., Krainer, A. R., Wilkinson, M. F., Spector, D. L. Serine Phosphorylation of SR Proteins Is Required for Their Recruitment to Sites of Transcription In Vivo. Journal of Cell Biology. 143 (2), 297-307 (1998).
- Kanopka, A., et al. Regulation of adenovirus alternative RNA splicing by dephosphorylation of SR proteins. Nature. 393 (6681), 185-187 (1998).
- Anufrieva, K. S., et al. Therapy-induced stress response is associated with downregulation of pre-mRNA splicing in cancer cells. Genome Medicine. 10 (1), 49 (2018).
- Shultz, J. C., et al. SRSF1 Regulates the Alternative Splicing of Caspase 9 Via A Novel Intronic Splicing Enhancer Affecting the Chemotherapeutic Sensitivity of Non-Small Cell Lung Cancer Cells. Molecular Cancer Research. 9 (7), 889-900 (2011).
- Gabriel, M., et al. Role of the splicing factor SRSF4 in cisplatin-induced modifications of pre-mRNA splicing and apoptosis. BMC Cancer. 15, (2015).
- Lee, S. C. -W., Abdel-Wahab, O.
- Cooper, T. A. Use of minigene systems to dissect alternative splicing elements. Methods. 37 (4), 331-340 (2005).
- Stoss, O., Stoilov, P., Hartmann, A. M., Nayler, O., Stamm, S. The in vivo minigene approach to analyze tissue-specific splicing. Brain Research Protocols. 4 (3), 383-394 (1999).
- Zerler, B., et al. Adenovirus E1A coding sequences that enable ras and pmt oncogenes to transform cultured primary cells. Molecular and Cellular Biology. 6 (3), 887-899 (1986).
- Gattoni, R., Schmitt, P., Stevenin, J. In vitro splicing of adenovirus E1A transcripts: characterization of novel reactions and of multiple branch points abnormally far from the 3' splice site. Nucleic Acids Research. 16 (6), 2389-2409 (1988).
- Stephens, C., Harlow, E. Differential splicing yields novel adenovirus 5 E1A mRNAs that encode 30 kd and 35 kd proteins. The EMBO journal. 6 (7), 2027-2035 (1987).
- Ulfendahl, P. J., et al. A novel adenovirus-2 E1A mRNA encoding a protein with transcription activation properties. The EMBO journal. 6 (7), 2037-2044 (1987).
- Berk, A. J., Sharp, P. A. Structure of the adenovirus 2 early mRNAs. Cell. 14 (3), 695-711 (1978).
- Svensson, C., Pettersson, U., Akusjärvi, G. Splicing of adenovirus 2 early region 1A mRNAs is non-sequential. Journal of Molecular Biology. 165 (3), 475-495 (1983).
- Basei, F. L., Meirelles, G. V., Righetto, G. L., dos Santos Migueleti, D. L., Smetana, J. H. C., Kobarg, J. New interaction partners for Nek4.1 and Nek4.2 isoforms: from the DNA damage response to RNA splicing. Proteome Science. 13 (1), 11 (2015).
- Zhou, Z., et al. The Akt-SRPK-SR Axis Constitutes a Major Pathway in Transducing EGF Signaling to Regulate Alternative Splicing in the Nucleus. Molecular Cell. 47 (3), 422-433 (2012).
- Caceres, J., Stamm, S., Helfman, D., Krainer, A. Regulation of alternative splicing in vivo by overexpression of antagonistic splicing factors. Science. 265 (5179), 1706-1709 (1994).
- Zhong, X. -Y., Ding, J. -H., Adams, J. A., Ghosh, G., Fu, X. -D. Regulation of SR protein phosphorylation and alternative splicing by modulating kinetic interactions of SRPK1 with molecular chaperones. Genes & Development. 23 (4), 482-495 (2009).
- Naro, C., et al. The centrosomal kinase NEK2 is a novel splicing factor kinase involved in cell survival. Nucleic Acids Research. 42 (5), 3218-3227 (2014).
- Lu, C. -C., Chen, T. -H., Wu, J. -R., Chen, H. -H., Yu, H. -Y., Tarn, W. -Y. Phylogenetic and Molecular Characterization of the Splicing Factor RBM4. PLoS ONE. 8 (3), 59092 (2013).
- Jarnæss, E., et al. Splicing Factor Arginine/Serine-rich 17A (SFRS17A) Is an A-kinase Anchoring Protein That Targets Protein Kinase A to Splicing Factor Compartments. Journal of Biological Chemistry. 284 (50), 35154-35164 (2009).
- Bressan, G. C., et al. Functional association of human Ki-1/57 with pre-mRNA splicing events. FEBS Journal. 276 (14), 3770-3783 (2009).
- Vivarelli, S., et al. Paraquat Modulates Alternative Pre-mRNA Splicing by Modifying the Intracellular Distribution of SRPK2. PLoS ONE. 8 (4), 61980 (2013).
- Russell, W. C., Graham, F. L., Smiley, J., Nairn, R. Characteristics of a Human Cell Line Transformed by DNA from Human Adenovirus Type 5. Journal of General Virology. 36 (1), 59-72 (1977).
- Aranda, P. S., LaJoie, D. M., Jorcyk, C. L. Bleach gel: A simple agarose gel for analyzing RNA quality. Electrophoresis. 33 (2), 366-369 (2012).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Bai, Y. Control of 3' splice site choice in vivo by ASF/SF2 and hnRNP A1. Nucleic Acids Research. 27 (4), 1126-1134 (1999).
- Cote, G. J., Nguyen, N., Lips, C. J. M., Berget, S. M., Gagel, R. F. Validation of an in vitro RNA processing system for CT/CGRP precursor mRNA. Nucleic Acids Research. 19 (13), 3601-3606 (1991).
