Summary
Dit protocol biedt een snel en nuttig hulpmiddel voor het evalueren van de rol van een eiwit met een niet-gekarakteriseerde functie in alternatieve splicing-regulatie na chemotherapeutische behandeling.
Abstract
mRNA-verwerking omvat meerdere gelijktijdige stappen om mRNA voor te bereiden op vertaling, zoals 5'capping, poly-A-toevoeging en splicing. Naast constitutief splicing maakt alternatieve mRNA-splicing de expressie van multifunctionele eiwitten uit één gen mogelijk. Aangezien interactoomstudies over het algemeen de eerste analyse zijn voor nieuwe of onbekende eiwitten, is de associatie van het aaseiwit met splicingfactoren een indicatie dat het kan deelnemen aan het mRNA-splicingproces, maar om te bepalen in welke context of welke genen worden gereguleerd, is een empirisch proces. Een goed uitgangspunt om deze functie te evalueren is het gebruik van de klassieke minigene tool. Hier presenteren we het adenovirale E1A minigene gebruik voor het evalueren van de alternatieve splicing veranderingen na verschillende cellulaire stress stimuli. We evalueerden de splicing van E1A minigene in HEK293 stabiel overexpressie Nek4 eiwit na verschillende stress behandelingen. Het protocol omvat E1A minigene transfectie, celbehandeling, RNA extractie en cDNA synthese, gevolgd door PCR en gel analyse en kwantificering van de E1A gesplitste varianten. Het gebruik van deze eenvoudige en gevestigde methode in combinatie met specifieke behandelingen is een betrouwbaar uitgangspunt om licht te werpen op cellulaire processen of welke genen kunnen worden gereguleerd door mRNA-splicing.
Introduction
Splicing is een van de belangrijkste stappen in eukaryotische mRNA-verwerking die gelijktijdig plaatsvindt met 5'mRNA-aftopping en 3'mRNA-polyadenylation, bestaande uit intronverwijdering gevolgd door exon-verbinding. De herkenning van de splicingplaatsen (SS) door het spliceosoom, een ribonucleoproteïnecomplex dat kleine ribonucleoproteïnen (snRNP U1, U2, U4 en U6), kleine RNA's (snRNAs) en verschillende regulerende eiwitten1 bevat, is noodzakelijk voor het splicen.
Naast intronverwijdering (constitutieve splicing), kunnen in eukaryoten introns worden behouden en exonen worden uitgesloten, waardoor het proces genaamd mRNA alternative splicing (AS) wordt geconfigureerd. De alternatieve pre-mRNA-prothese breidt de codeercapaciteit van eukaryotische genomen uit, waardoor een groot en divers aantal eiwitten uit een relatief klein aantal genen kan worden voortgekregen. Geschat wordt dat 95-100% van de menselijke mRNAs die meer dan één exon bevatten , alternatieve spen kunnen ondergaan2,3. Dit is fundamenteel voor biologische processen zoals neuronale ontwikkeling, apoptoseactivatie en cellulaire stressrespons4, waardoor het organisme alternatieven biedt om het functioneren van cellen te reguleren met behulp van hetzelfde repertoire van genen.
De machines die nodig zijn voor alternatieve splicing worden dezelfde gebruikt voor constitutieve splicing en het gebruik van de SS is de belangrijkste determinant voor het optreden van alternatieve splicing. Constitutief splicing houdt verband met het gebruik van sterke splicingsites, die meestal meer lijken op consensusmotieven voor spliceosome-herkenning5.
Alternatieve exonen worden meestal minder efficiënt herkend dan constitutieve exonen zodra de cis-regulerendeelementen, de sequenties in 5'SS en 3'SS die deze exons flankeren, een inferieur bindingsvermogen vertonen voor het spliceosome. mRNA bevat ook gebieden met de naam versterkers of geluiddempers in exonen (exonische splicing enhancers (ESE's) en exonische splicing silencers (ESSs)) en introns (intronic splicing enhancers (ISE's) en intronic splicing silencers (ISSs)) die het exongebruik verbeteren of onderdrukken, respectievelijk5. Deze sequenties worden herkend door transregulerende elementen of splicingfactoren (SF). SF's worden voornamelijk vertegenwoordigd door twee families van eiwitten, de serine/argininerijke splicingfactoren (SRSF's) die zich binden aan ESE's en de familie van heterogene nucleaire ribonucleoproteïnen (hnRNPs) die zich binden aan ESSs-sequenties5.
Alternatieve splicing kan worden gemoduleerd door fosforylering/defosforylatie van transfactoren die de interactiespartners en cellulaire lokalisatie van splicingfactorenwijzigen 6,7,8. Het identificeren van nieuwe regulatoren van splicingfactoren kan nieuwe instrumenten bieden om splicing en bijgevolg sommige kankerbehandelingen te reguleren.
Anufrieva et al.9, in een mRNA microarray genexpressieprofiel, waargenomen consistente veranderingen in de niveaus van spliceosomal componenten in 101 cellijnen en na verschillende stressomstandigheden (platina-gebaseerde geneesmiddelen, gammastraling, topoisomeraseremmers, tyrosinekinaseremmers en taxanen). De relatie tussen splicing patroon en chemotherapie werkzaamheid is al aangetoond in longkanker cellen, die chemotherapie resistent zijn, met veranderingen in caspase-9 varianten tarief10. HEK293 cellen behandeld met chemotherapeutica panel vertonen veranderingen in splicing met een toename van pro-apoptotische varianten. Gabriel et al.11 waargenomen veranderingen in ten minste 700 gebeurtenissen van splicing na cisplatine behandeling in verschillende cellijnen, erop wijzend dat splicing paden zijn cisplatine-beïnvloed. Splicing modulatoren hebben al aangetoond anti-tumor activiteit, waaruit blijkt dat splicing is belangrijk voor de ontwikkeling van de tumor en, voornamelijk, chemotherapie respons12. Daarom is het karakteriseren van nieuwe eiwitten die splicing reguleren na cellulaire stressoren, zoals chemotherapeutica, erg belangrijk om nieuwe behandelingsstrategieën te ontdekken.
De aanwijzingen van alternatieve splicing-regulatie uit interactoomstudies, met name belangrijk om functies van nieuwe of niet-gekarakteriseerde eiwitten te karakteriseren, kunnen een meer algemene en eenvoudige benadering vereisen om de echte rol van het eiwit in AS te verifiëren. Minigenen zijn belangrijke instrumenten voor de analyse van de algemene rol van een eiwit dat de splicing-regulatie beïnvloedt. Zij bevatten segmenten van een interessant gen dat alternatief gesplitleerde en flankerende genomische gebieden bevat13. Het gebruik van een minigene-tool maakt de analyse van het splitsen in vivo mogelijk met verschillende voordelen, zoals de lengte van het minigeen dat klein is en daarom geen beperking is voor de versterkingsreactie; hetzelfde minigeen kan in verschillende cellijnen worden geëvalueerd; alle cellulaire componenten, voornamelijk hun regulerende post-translationele modificatie (fosforylering en veranderingen in celcompartimenten) zijn aanwezig en kunnen worden aangepakt13,14. Bovendien kunnen veranderingen in het alternatieve splicingpatroon worden waargenomen na cellulaire stress en, het gebruik van een minigeensysteem, maken het mogelijk om de route te identificeren die wordt gemoduleerd door verschillende stimuli.
Er zijn al verschillende minigene-systemen beschreven die specifiek zijn voor verschillende soorten splicing-gebeurtenissen13,14, maar als voorlopige test is de minigene E1A15 een zeer goed ingeburgerd alternatief splicing reporter-systeem voor de studie van 5'SS-selectie in vivo. Uit slechts één gen, E1A, worden vijf mRNAs geproduceerd door alternatieve splicing op basis van selectie van drie verschillende 5′ splice-sites en van één belangrijke of een kleine 3′ splice-site16,17,18. De expressie van E1A-varianten verandert afhankelijk van de periode van Adenovirale infectie19,20.
We hebben eerder aangetoond dat beide Nek4-isovormen interageren met splicingfactoren zoals SRSF1 en hnRNPA1 en terwijl isoform 2 minigene E1A alternatieve splicing verandert, heeft isoform 1 geen effect in dat21. Omdat isovorm 1 de meest voorkomende isovorm is en de chemotherapieresistentie en DNA-schaderespons verandert, evalueren we of het minigene E1A alternatieve splicing in een stresstoestand kan veranderen.
Minigene-assay is een eenvoudige, goedkope en snelle methode, omdat het alleen RNA-extractie, cDNA-synthese, versterking en agarosegelanalyses nodig heeft en een nuttig hulpmiddel kan zijn om te evalueren, omdat een mogelijk effect op alternatieve splicing door een eiwit van belang tot het effect van verschillende behandelingen op cellulair alternatief splicingpatroon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Plating cellen
OPMERKING: In dit beschreven protocol werden HEK293 stabiele cellijnen, eerder gegenereerd voor stabiele inductieve expressie van Nek4, gebruikt21, maar hetzelfde protocol is geschikt voor veel andere cellijnen, zoals HEK29322, HeLa23,24,25,26, U-2 OS27, COS728, SH-SY5Y29. Het expressiepatroon van minigeen E1A-isovormen onder basale omstandigheden varieert tussen deze cellen en moet voor elke aandoening worden gekarakteriseerd. Dit protocol is niet beperkt tot stabiele cellijnen. De meest voorkomende benadering bij de evaluatie van kandidaat-eiwit is door voorbijgaande co-transfectie van het verhogen van de hoeveelheid met een vaste hoeveelheid van het minigeen. Hetzelfde protocol is geschikt voor knock-out cellen.
- Plaatcellen rekening houdend met voertuig-, niet-getransfecteerde en GFP-controles.
- Cultuur HEK293 cellen met stabiele expressie van het gen van belang in Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) aangevuld met 10% foetale runderserum (FBS), 4,5 g/L glucose, 4 mM L-Glutamine en handhaven met 100 μg/ml hygromycine B, op met weefselkweek behandelde platen bij 37 °C in 5% CO2 en een bevochtigde atmosfeer.
- Splits cellen met 0,25% trypsine-EDTA. Plaat 3 x 105 cellen in 6-putplaten en incubeer ze gedurende 24 uur bij 37 °C in 5% CO2.
OPMERKING: Voor transfectie moeten cellen 70-80% samenvloeien om de celdood na de transfectie te verminderen.
2. Celtransfectie
OPMERKING: Hier werd 1-2 μg pMTE1A minigeen plasmide gebruikt, maar de DNA-hoeveelheid en het tijdstip van expressie moeten minimaal worden gehouden om toxiciteit te voorkomen. Zo werd hoge toxiciteit waargenomen in HeLa-cellen na 30 uur transfectie met 1 μg pMTE1A DNA. Voor de hier beschreven transfectie werd een lipidengebaseerd transfectiereagens gebruikt
- Controleer celconfluentie 24 uur na plating en transfect hek293 stabiele cellen alleen wanneer 70-80% samenvloeien.
- Verwijder het celkweekmedium voorzichtig met een pipet, in plaats van een vacuümpompsysteem te gebruiken. Voeg vervolgens voorzichtig 2 ml compleet DMEM-medium zonder antibiotica toe en plaats de plaat terug in de incubator.
- Bereid een buis voor met de transfectiebuffer (200 μL/put), voeg 2 μg pMTE1A DNA, vortex toe en voeg vervolgens 2 μL transfectiereagens toe. Vortex opnieuw en incubeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.
- Verwijder de platen uit de incubator en voeg het transfectiemengsel voorzichtig druppelgewijs toe.
- Voeg aan HEK293 stabiele cellen tetracycline (0,5 μg/ml) toe voor Nek4 expressie inductie 6 uur na de transfectie. Medium verandering is niet nodig.
OPMERKING: Volumes/bedragen die in deze sectie worden beschreven, zijn voor één put. Bereid het mengsel voor alle putten die in het experiment in dezelfde buis worden gebruikt. - Bereid een put voor om te transfecteren met EGFP, of een andere fluorofoor die plasmide uitdrukt om de transfectie-efficiëntie te schatten. Betere resultaten kunnen worden waargenomen met transfectie-efficiëntie van ten minste 40%, maar goede prestaties met een lagere transfectie-efficiëntie werden eerder waargenomen.
- Houd bij het gebruik van co-transfectie (interesse-eiwit en minigeen) een put met niet-getransfecteerde cellen om te voorkomen dat resultaten van endogene mRNA worden verkregen. In het geval van E1A drukken HEK293-cellen al het E1A-gen30 uit.
3. Het bereiden van de drugs
OPMERKING: De tijd en concentratie van de behandeling werden gekozen op basis van literatuurresultaten, die wijzen op veranderingen in alternatieve splicing voor sommige genen.
- Voer een dosis-responscurve uit voordat u met de test begint om de minimale concentratie op alternatieve splicing-inductie te bepalen zonder effect op de levensvatbaarheid van de cel.
- Bereid een Paclitaxel stamoplossing bij 5 mM concentratie in ethanol. De uiteindelijke concentratie is 1 μM. Bewaren bij -20 °C. Gebruik 0,02% ethanol als voertuigcontrole.
- Bereid een cisplatineoplossing door 0,9% NaCl te verdunnen bij ongeveer 0,5 mg/ml (1,66 ml). Beschermen tegen licht, vortex en incuberen in een thermaal bad, 37 °C gedurende 30 min. De uiteindelijke concentratie is 30 μM. Vers bereiden of bewaren bij 2-10 °C gedurende een maand.
OPMERKING: Alle geneesmiddelen moeten tegen het licht worden beschermd.
4. Celbehandeling en -inzameling
OPMERKING: HEK293 stabiele cellen werden 48 uur na de transfectie verzameld en hiervoor 24 uur na de transfectie behandeld omdat het hoogste Nek4-expressieniveau binnen 48 uur wordt bereikt. Echter, hoge niveaus van 13S isoform expressie (tot 90%) werden waargenomen op dit moment. Om het aandeel van 13S isoform te verminderen, probeer cellen 30 uur na transfectiemaximum te behandelen en te verzamelen.
- Gebruik RNA/DNase gratis tips en tubes. Voer de totale RNA-extractie uit met fenol-chloroform reagens volgens de aanbeveling van de fabrikant.
- 24 uur na de transfectie, controleer de celmorfologie en transfectie-efficiëntie met behulp van een fluorescerende microscoop.
- Verwijder het celkweekmedium bij voorkeur met behulp van een pipet in plaats van een vacuümpompsysteem. Voeg vervolgens celkweekmedium toe met de chemotherapeutica in de eerder beschreven eindconcentratie.
- Incubeer bij 37 °C, 5% CO2 gedurende 18 - 24 uur.
- Verzamel RNA door het celkweekmedium in een container te gooien en 0,5 - 1 ml RNA-extractiereagens rechtstreeks aan de put toe te voegen. Als putten zeer samenvloeiend zijn, gebruik dan 1 ml RNA-extractiereagens om de RNA-kwaliteit te verbeteren.
- Homogeniseer met de pipet en breng over op een centrifugebuis van 1,5 ml. Op dit punt kan het protocol worden onderbroken door monsters op te slaan bij -80 °C of onmiddellijk door te gaan naar de RNA-extractie.
WAARSCHUWING: Het RNA-extractiereagens op basis van fenol is giftig en alle procedures moeten worden uitgevoerd in een chemische zuurkast en de residuen moeten op de juiste manier worden verwijderd.
5. RNA-extractie en cDNA-synthese
- Ontdooi in een zuurkast de monsters en incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Voeg 0,1 -0,2 ml chloroform toe en roer krachtig.
- Incubeer gedurende 3 minuten bij kamertemperatuur.
- Centrifugeer gedurende 15 min bij 12.000 x g en 4 °C.
- Verzamel de bovenste waterfase en breng over naar een nieuwe centrifugebuis van 1,5 ml. Verzamel ongeveer 60% van het totale volume; verzamel echter niet het DNA of de organische (onderste) fase.
- Voeg 0,25 - 0,5 ml isopropanol toe en roer 4 keer door inversie. Incubeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.
- Centrifugeer gedurende 10 minuten op 12.000 x g, bij 4 °C en gooi het supernatant weg.
- Was de RNA-pellet tweemaal met ethanol (75% in met diethylpyrocarbonaat (DEPC) behandeld water). Centrifugeer gedurende 5 minuten op 7.500 x g en gooi de ethanol weg.
- Verwijder overtollige ethanol door de buis om te keren op een handdoekpapier en laat de buis vervolgens open in een zuurkast om de pellet 5 - 10 minuten gedeeltelijk te drogen.
- Resuspend de RNA pellet in 15 μL DEPC-behandeld water.
- Kwantificeer het totale RNA met behulp van absorptie bij 230 nm, 260 nm en 280 nm om de RNA-kwaliteit te controleren.
- Om de totale RNA-kwaliteit te controleren, voert u een 1% agarosegel uit die is voorbehandeld met 1,2% (v/v) van een 2,5% natriumhypochlorietoplossing gedurende 30 min31.
- Voer cDNA-synthese uit met 1-2 μg totaal RNA.
- Pipet RNA, 1 μL oligo-dT (50 μM), 1 μL dNTP (10 mM) en vormen het volume tot 12 μL met nucleasevrij water. Incubeer in de thermocycler gedurende 5 min bij 65 °C.
- Verwijder monsters uit de thermocycler om af te koelen en bereid het reactiemengsel voor: 4 μL reverse transcriptasebuffer, 2 μL dithiothreitol (DTT) en 1 μL ribonucleaseremmer. Incubeer bij 37 °C gedurende 2 min.
- Voeg 1 μL thermostallend reverse transcriptase toe. Incubeer gedurende 50 minuten bij 37 °C en inactiveer het enzym gedurende 15 minuten bij 70 °C.
OPMERKING: De cDNA kan enkele weken bij -20 °C worden bewaard. Voer een niet-reverse transcriptase (NRT) controle uit voor genomische besmetting door putatieve intron-retentie gebeurtenissen discriminatie.
6. pMTE1A minigeen PCR
- Voer PCR uit met de reactiesamenstelling (1,5 mM MgCl2, 0,3 mM dNTP-mix, 0,5 μM van elke primer, 2,5 U van een hot-start Taq Polymerase en 150 ng cDNA) met de volgende voorwaarden:
94 °C gedurende 2 min, 29 cycli van: 94 °C gedurende 1 min, 50 °C gedurende 2 min, 72 °C gedurende 2 min, 72 °C gedurende 10 min. - Laad 20-25 μL van het PCR-product in een 3% agarosegel die nucleïnezuurvlek bevat en voer ongeveer 1 uur op 100 V.
7. Analyse van de gel met behulp van een beeldverwerkings- en analysesoftware32
- Fotografeer na de uitvoering de gel (met behulp van een gel imaging acquisition system) om bandverzadiging te voorkomen en kwantificeer de banden met behulp van een beeldverwerkingssoftware.
- Voor kwantificering overweeg de banden bij ~ 631 bp, ~ 493 bp en ~ 156 bp om overeen te komen met de 13S, 12S en 9S isoforms, respectievelijk.
- Open in het menu Bestand van de software het afbeeldingsbestand dat is verkregen van het imaging-acquisitiesysteem. Converteer naar grijswaarden, pas de helderheid en het contrast aan en verwijder indien nodig uitschietergeluiden.
- Teken een rechthoek rond de eerste rijstrook met het gereedschap Rechthoekselectie en selecteer deze via de | Gels | Selecteer de opdracht First Lane of druk daarvoor op de sneltoets.
- Gebruik de muis om te klikken en houd in het midden van de rechthoek op de eerste rijstrook en sleep deze naar de volgende rijstrook. Ga naar | analyseren Gels | Selecteer Volgende rijstrookof druk op de beschikbare snelkoppeling. Herhaal deze stap naar alle resterende rijstroken.
- Nadat alle rijstroken zijn gemarkeerd en genummerd, gaat u naar | analyseren Gels | Plot Lanes om een profielplot van elke baan te tekenen.
- Teken met het gereedschap Rechte lijnselectie een lijn over de basis van elke piek die overeenkomt met elke band, waarbij het achtergrondgeluid wordt weggelaten. Nadat alle pieken, van elke rijstrook, zijn afgesloten, selecteert u het gereedschap Toverstaf en klikt u binnen elke piek. Voor elke piek die is gemarkeerd, moeten metingen verschijnen in het venster Resultaten dat wordt weergegeven.
- Som de intensiteit van alle 3 banden voor elk monster op en bereken het percentage voor elke isovorm ten opzichte van het totaal.
- Plot de percentages van elke isovorm of de verschillen in het percentage ten opzichte van onbehandelde monsters.
OPMERKING: Zorg ervoor dat de som van drie E1A-varianten gelijk moet zijn aan 100%.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Een 5' splice sites test met behulp van E1A minigene werd uitgevoerd om veranderingen in het splicing profiel in cellen te evalueren na chemotherapie expositie. De rol van Nek4 - isoform 1 in AS-regulatie in HEK293 stabiele cellen na paclitaxel- of cisplatinebehandeling werd geëvalueerd.
De regio Adenoviral E1A is verantwoordelijk voor de productie van drie belangrijke mRNAs van één RNA-precursor vanwege het gebruik van verschillende splice-donoren. Ze delen gemeenschappelijke 5' en 3' termini, maar verschillen in de grootte van hun accijnsintrons. Adenovirale E1A mRNAs worden genoemd op basis van hun sedimentatiecoëfficiënten, 13S, 12S en 9S. Tijdens de vroege fase van adenovirusinfectie (rond 7 uur) worden eiwitten geproduceerd die belangrijk zijn om de geïnfecteerde cel voor te bereiden op virale DNA-replicatie (13S - 723 aa en 12S - 586 aa) en in de late fase (ongeveer 18 uur) daarnaast wordt een klein eiwit (9S -249 aa) geproduceerd20. Met behulp van een plasmide die het minigeen van E1A bevat, kan het effect op alternatieve splicing worden waargenomen in cellen na de transfectie die het aandeel mRNA van elke geproduceerde isovorm evalueert: 13S: 631 bp, 12S: 493 bp en 9S 156 bp (Figuur 1A en B).
Basale expressie van E1A-isovormenvarianten is afhankelijk van de cellijn en de tijd van de E1A-expressie. Er werd opgemerkt dat HEK293-stabiele cellijn (HEK293-Flag) of HEK293 recombinase bevattende site (HEK293-FRT - de oorspronkelijke cellijn) een hogere expressie van 13S vertoont in vergelijking met HeLa-cellen (HeLa-PLKO) die vergelijkbare niveaus van 13S en 12S isovormen toont na 48 uur E1A-expressie (figuur 1C en D).
Het hoge niveau van 13S-expressie waargenomen in HEK293 stabiele cellen is aanzienlijk verminderd onder kortere tijden van E1A-expressie (ongeveer 30 uur). Het aandeel (%) van 13S:12S:9S om 30 uur en 48 uur is respectievelijk 60:33:7 en 80:15:5 (niet-weergegeven gegevens). Om deze reden is het belangrijk om het basale cellulaire minigene E1A-splicingprofiel te karakteriseren voordat u met de experimenten begint.
Cellen blootgesteld aan cisplatine vertoonden een verschuiving in 5'SS splicing selectie ten gunste van 12S expressie (een toename van ongeveer 15% in vergelijking met onbehandelde cellen). Dit effect werd waargenomen in HEK293 stabiel uitdrukken vlag lege vector evenals isoform 1 van Nek4. Wanneer grote veranderingen in het expressiepercentage worden waargenomen, geeft een plot met percentages duidelijk de resultaten weer (figuur 2).
Bij het vergelijken van twee aandoeningen (Flag en Nek4 overexpressie) die reageren op een behandeling, is meestal de beste manier om de gegevens weer te geven het plotten van de verschillen in een grafiek, omdat het basale expressieniveau anders kan zijn en de percentages niet het werkelijke effect van de behandeling weerspiegelen. Dit is te zien in figuur 3. Veranderingen in AS na paclitaxelbehandeling waren zeer discreet, maar de richtingen van de veranderingen waren het tegenovergestelde in Flag en Nek4 die cellen uitdrukken.
Ondanks kleine veranderingen na de behandeling waren de resultaten consistent, wat aangeeft dat de paclitaxelbehandeling leidt tot een afname van 13S isoform, met een toename van 12S en 9S in Flag expressing cellen, terwijl aan de andere kant in Nek4 expresserende cellen het tegenovergestelde effect wordt waargenomen.
Figuur 1: Minigene E1A splicing patroon hangt af van cellijn. A) Schematische weergave van minigene E1A-splicingsites. De pijlen geven het primergloeigebied aan voor minigene E1A isoforms versterking. B) Isovormen gegenereerd door alternatieve splicing van minigene E1A. C) HEK293 die de lege vector van de Vlag (HEK293 -Vlag), HeLa transfected met PLKO vector (HeLa - PLKO) of, HEK293 recombinase-bevattende plaatsen uitdrukt (van wat HEK293 stabiel uitdrukkende Vlag of Nek4.1 werden geproduceerd - HEK293-FRT) werden getransfecteerd met pMTE1A plasmide. 48 uur nadat het transfectietotaal RNA was geïsoleerd en E1A-isovormen waren gescheiden in agarosegel (D). Grafiek die het percentage 13S, 12S en 9S isoform in HEK293-Flag en HeLa-PLKO cellen onder basale omstandigheden vergelijkt. Gegevens van drie onafhankelijke experimenten. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 2: Effect van cisplatinebehandeling in minigeen E1A splicing patroon. HEK293 stabiel uitdrukken Vlag lege vector (Vlag) of Nek4.1 Vlag tag gesmolten, werden getransfecteerd met pMTE1A plasmide. Zes uur nadat de transfectie tetracycline werd toegevoegd aan eiwitexpressie inductie. 24 uur tot 48 uur werd het celkweekmedium vervangen voor medium dat 30 μM Cisplatine bevat. Na 24 uur incubatie werd totaal RNA geëxtraheerd en werden de producten van PCR gescheiden met 3% agarosegel. A) Overheersende minigene E1A isovormen zijn afgebeeld. Grafieken B-D geven het % van elke isovorm weer ten opzichte van de som van drie varianten (13S, 12S en 9S). In Ewordt het verschil in expressiepercentage ten opzichte van elke isovorm weergegeven ten opzichte van de voertuigregeling (medium). Grafieken worden gepresenteerd als het gemiddelde en SEM van drie onafhankelijke experimenten. * p< 0,05, ** p<0,01 in onbezoldigde t-test. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 3: Effect van Paclitaxel behandeling in minigene E1A splicing patroon. HEK293 stabiel uitdrukkend Vlag lege vector (Vlag) of Nek4.1 Vlag gesmolten, werden getransfecteerd met pMTE1A plasmide. Zes uur nadat de transfectie tetracycline werd toegevoegd aan eiwitexpressie inductie. 24 uur tot 48 uur werd het celkweekmedium vervangen door een medium dat 1 μM Paclitaxel of ethanol (0,02%) bevatte dat als voertuigcontrole werd gebruikt. Na 24 uur incubatie werd totaal RNA geëxtraheerd en werden de producten van PCR gescheiden met 3% agarosegel. A) Overheersende isovormen worden afgebeeld. Grafieken B-D geven het % van elke isovorm weer ten opzichte van de som van drie varianten (13S, 12S en 9S). In Ewordt het verschil in expressiepercentage ten opzichte van elke isovorm weergegeven ten opzichte van de controle van het voertuig (ethanol). Grafieken worden gepresenteerd als het gemiddelde en SEM van drie onafhankelijke experimenten. * p< 0,05 in onbezoldigde t-toets. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Minigenes zijn belangrijke instrumenten om de effecten in wereldwijde alternatieve splicing in vivo te bepalen. De adenovirale minigene E1A wordt al tientallen jaren met succes gebruikt om de rol van eiwitten te evalueren door de hoeveelheid hiervan in cel13,14te verhogen . Hier stellen we het minigene E1A-gebruik voor voor het evalueren van alternatieve splicing na chemotherapeutische blootstelling. Een stabiele cellijn die Nek4 isoform 1 uitdrukte, werd gebruikt, vermijdend de artefacten van overexpressie die door voorbijgaande transfectie worden veroorzaakt. De isoform 1 van Nek4 vertoonde geen effect in de minigene E1A alternatieve splicing in basale aandoeningen21, maar heeft veel splicing gerelateerde interactoren, waardoor we het specifieke effect van de chemotherapeutische behandeling in E1A alternatieve splicing in deze cellen kunnen evalueren.
Ondanks de lage gevoeligheid, voornamelijk in vergelijking met radioactieve benaderingen, is de hier beschreven methode eenvoudig en vereist geen speciale reagentia of laboratoriumomstandigheden. Het is echter belangrijk op te merken dat de minigene E1A een wereldwijde verslaggever is van 5'SS-selecties, hoewel 3'SS-selectie met dit protocol kan worden geëvalueerd, moet de specifieke minigene-verslaggever worden gebruikt14,33,34. Bovendien kunnen de resultaten worden beïnvloed door de cellijn en moeten ze zorgvuldig worden geëvalueerd om verkeerde interpretatie vanwege het basale alternatieve splicingprofiel te voorkomen.
Meestal worden grote verschillen in minigene E1A-splicingpatroon alleen waargenomen bij het veranderen van de expressie van splicingfactoren. Andere veranderingen zijn minder duidelijk vanwege het grote aantal eiwitten dat de activiteit van deze factoren moduleert. Om deze reden moet bij het starten van studies voor een indirecte kandidaat de klassieke benadering, gebaseerd op toenemende hoeveelheden van dit kandidaat-eiwit, de voorkeur krijgen. Wanneer een bepaald effect wordt waargenomen, kunnen de behandelingen worden uitgevoerd om te onderzoeken of de regulatie specifiek kan zijn voor een bepaalde cellulaire stimulus.
Na een voorlopig positief resultaat kan de standaardisatie van tijd en medicijnconcentratie worden uitgevoerd om het experiment te optimaliseren.
Dit eenvoudige protocol is een voorlopige test, een startpunt dat kan beantwoorden of het eiwit van belang een effect vertoont in alternatieve splicing en ook, wanneer enig effect in alternatieve splicing-regulatie al bekend is, de studies kan leiden naar de meer consistente route waar het eiwit een rol speelt bij het reguleren van alternatieve splicing in chemotherapierespons.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen hebben.
Acknowledgments
We danken Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP, via Grant Temático 2017/03489-1 aan JK en fellowship aan FLB 2018/05350-3) en de Conselho Nacional de Desenvolvimento Cientifico e Tecnológico (CNPq) voor de financiering van dit onderzoek. We willen dr. Adrian Krainer bedanken voor het leveren van de pMTE1A plasmide en Zerler en collega's voor hun werk in het klonen van E1A. We danken ook Prof. Dr. Patrícia Moriel, Prof. Dr. Wanda Pereira Almeida, Prof. Dr. Marcelo Lancellotti en Prof. Dr. Karina Kogo Cogo Müller om ons in staat te stellen hun laboratoriumruimte en apparatuur te gebruiken.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 pb DNA Ladder | Invitrogen | 15628-050 | |
| 6 wells plate | Sarstedt | 833920 | |
| Agarose | Sigma | A9539-250G | |
| Cisplatin | Sigma | P4394 | |
| DEPC water | ThermoFisher | AM9920 | |
| DMEM | ThermoFisher | 11965118 | |
| dNTP mix | ThermoFisher | 10297-018 | |
| Fetal Bovine Serum - FBS | ThermoFisher | 12657029 | |
| Fluorescent Microscope | Leica | DMIL LED FLUO | |
| Gel imaging acquisition system - ChemiDoc Gel Imagin System | Bio-Rad | ||
| GFP - pEGFPC3 | Clontech | ||
| HEK293 stable cells - HEK293 Flp-In | Generated from Flp-In™ T-REx™ 293 - Invitrogen and described in ref 21 | ||
| Hygromycin B | ThermoFisher | 10687010 | Used for Flp-In cells maintenemant |
| Image processing and analysis software - FIJI software | ref. 32 | ||
| Lipid- based transfection reagent - jetOPTIMUS Polyplus Reagent | Polyplus | 117-07 | |
| Oligo DT | ThermoFisher | 18418020 | |
| Paclitxel | Invitrogen | P3456 | |
| Plate Reader/ UV absorbance | Biotech | Epoch Biotek/ Take3 adapter | |
| pMTE1A plasmid | Provided by Dr. Adrian Krainer | ||
| pMTE1A F | Invitrogen | 5’ -ATTATCTGCCACGGAGGTGT-3 | |
| pMTE1A R | Invitrogen | 5’ -GGATAGCAGGCGCCATTTTA-3’ | |
| Refrigerated centrifuge | Eppendorf | F5810R | |
| Reverse Transcriptase - M-MLV | ThermoFisher | 28025013 | |
| Reverse transcriptase - Superscript IV | ThermoFisher | 18090050 | |
| Ribunuclease inhibitor RNAse OUT | ThermoFisher | 10777-019 | |
| RNA extraction phenol-chloroform based reagent - Trizol | ThermoFisher | 15596018 | |
| SybrSafe DNA gel stain | ThermoFisher | S33102 | |
| Taq Platinum | Thermo | 10966026 | |
| Tetracyclin | Sigma | T3383 | Used for Flag empty or Nek4- Flag expression induction |
| Thermocycler Bio-Rad | Bio-Rad | T100 | |
| Trypsin | Sigma | T4799 |
References
- Ule, J., Blencowe, B. J. Alternative Splicing Regulatory Networks: Functions, Mechanisms, and Evolution. Molecular Cell. 76 (2), 329-345 (2019).
- Pan, Q., Shai, O., Lee, L. J., Frey, B. J., Blencowe, B. J. Deep surveying of alternative splicing complexity in the human transcriptome by high-throughput sequencing. Nature Genetics. 40 (12), 1413-1415 (2008).
- Nilsen, T. W., Graveley, B. R. Expansion of the eukaryotic proteome by alternative splicing. Nature. 463 (7280), 457-463 (2010).
- Stamm, S. Signals and their transduction pathways regulating alternative splicing: a new dimension of the human genome. Human Molecular Genetics. 11 (20), 2409-2416 (2002).
- Kornblihtt, A. R., et al. Alternative splicing: a pivotal step between eukaryotic transcription and translation. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (3), 153-165 (2013).
- Zhong, X. -Y., Ding, J. -H., Adams, J. A., Ghosh, G., Fu, X. -D. Regulation of SR protein phosphorylation and alternative splicing by modulating kinetic interactions of SRPK1 with molecular chaperones. Genes & Development. 23 (4), 482-495 (2009).
- Misteli, T., Cáceres, J. F., Clement, J. Q., Krainer, A. R., Wilkinson, M. F., Spector, D. L. Serine Phosphorylation of SR Proteins Is Required for Their Recruitment to Sites of Transcription In Vivo. Journal of Cell Biology. 143 (2), 297-307 (1998).
- Kanopka, A., et al. Regulation of adenovirus alternative RNA splicing by dephosphorylation of SR proteins. Nature. 393 (6681), 185-187 (1998).
- Anufrieva, K. S., et al. Therapy-induced stress response is associated with downregulation of pre-mRNA splicing in cancer cells. Genome Medicine. 10 (1), 49 (2018).
- Shultz, J. C., et al. SRSF1 Regulates the Alternative Splicing of Caspase 9 Via A Novel Intronic Splicing Enhancer Affecting the Chemotherapeutic Sensitivity of Non-Small Cell Lung Cancer Cells. Molecular Cancer Research. 9 (7), 889-900 (2011).
- Gabriel, M., et al. Role of the splicing factor SRSF4 in cisplatin-induced modifications of pre-mRNA splicing and apoptosis. BMC Cancer. 15, (2015).
- Lee, S. C. -W., Abdel-Wahab, O.
- Cooper, T. A. Use of minigene systems to dissect alternative splicing elements. Methods. 37 (4), 331-340 (2005).
- Stoss, O., Stoilov, P., Hartmann, A. M., Nayler, O., Stamm, S. The in vivo minigene approach to analyze tissue-specific splicing. Brain Research Protocols. 4 (3), 383-394 (1999).
- Zerler, B., et al. Adenovirus E1A coding sequences that enable ras and pmt oncogenes to transform cultured primary cells. Molecular and Cellular Biology. 6 (3), 887-899 (1986).
- Gattoni, R., Schmitt, P., Stevenin, J. In vitro splicing of adenovirus E1A transcripts: characterization of novel reactions and of multiple branch points abnormally far from the 3' splice site. Nucleic Acids Research. 16 (6), 2389-2409 (1988).
- Stephens, C., Harlow, E. Differential splicing yields novel adenovirus 5 E1A mRNAs that encode 30 kd and 35 kd proteins. The EMBO journal. 6 (7), 2027-2035 (1987).
- Ulfendahl, P. J., et al. A novel adenovirus-2 E1A mRNA encoding a protein with transcription activation properties. The EMBO journal. 6 (7), 2037-2044 (1987).
- Berk, A. J., Sharp, P. A. Structure of the adenovirus 2 early mRNAs. Cell. 14 (3), 695-711 (1978).
- Svensson, C., Pettersson, U., Akusjärvi, G. Splicing of adenovirus 2 early region 1A mRNAs is non-sequential. Journal of Molecular Biology. 165 (3), 475-495 (1983).
- Basei, F. L., Meirelles, G. V., Righetto, G. L., dos Santos Migueleti, D. L., Smetana, J. H. C., Kobarg, J. New interaction partners for Nek4.1 and Nek4.2 isoforms: from the DNA damage response to RNA splicing. Proteome Science. 13 (1), 11 (2015).
- Zhou, Z., et al. The Akt-SRPK-SR Axis Constitutes a Major Pathway in Transducing EGF Signaling to Regulate Alternative Splicing in the Nucleus. Molecular Cell. 47 (3), 422-433 (2012).
- Caceres, J., Stamm, S., Helfman, D., Krainer, A. Regulation of alternative splicing in vivo by overexpression of antagonistic splicing factors. Science. 265 (5179), 1706-1709 (1994).
- Zhong, X. -Y., Ding, J. -H., Adams, J. A., Ghosh, G., Fu, X. -D. Regulation of SR protein phosphorylation and alternative splicing by modulating kinetic interactions of SRPK1 with molecular chaperones. Genes & Development. 23 (4), 482-495 (2009).
- Naro, C., et al. The centrosomal kinase NEK2 is a novel splicing factor kinase involved in cell survival. Nucleic Acids Research. 42 (5), 3218-3227 (2014).
- Lu, C. -C., Chen, T. -H., Wu, J. -R., Chen, H. -H., Yu, H. -Y., Tarn, W. -Y. Phylogenetic and Molecular Characterization of the Splicing Factor RBM4. PLoS ONE. 8 (3), 59092 (2013).
- Jarnæss, E., et al. Splicing Factor Arginine/Serine-rich 17A (SFRS17A) Is an A-kinase Anchoring Protein That Targets Protein Kinase A to Splicing Factor Compartments. Journal of Biological Chemistry. 284 (50), 35154-35164 (2009).
- Bressan, G. C., et al. Functional association of human Ki-1/57 with pre-mRNA splicing events. FEBS Journal. 276 (14), 3770-3783 (2009).
- Vivarelli, S., et al. Paraquat Modulates Alternative Pre-mRNA Splicing by Modifying the Intracellular Distribution of SRPK2. PLoS ONE. 8 (4), 61980 (2013).
- Russell, W. C., Graham, F. L., Smiley, J., Nairn, R. Characteristics of a Human Cell Line Transformed by DNA from Human Adenovirus Type 5. Journal of General Virology. 36 (1), 59-72 (1977).
- Aranda, P. S., LaJoie, D. M., Jorcyk, C. L. Bleach gel: A simple agarose gel for analyzing RNA quality. Electrophoresis. 33 (2), 366-369 (2012).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Bai, Y. Control of 3' splice site choice in vivo by ASF/SF2 and hnRNP A1. Nucleic Acids Research. 27 (4), 1126-1134 (1999).
- Cote, G. J., Nguyen, N., Lips, C. J. M., Berget, S. M., Gagel, R. F. Validation of an in vitro RNA processing system for CT/CGRP precursor mRNA. Nucleic Acids Research. 19 (13), 3601-3606 (1991).
