Summary
Ce protocole présente un outil rapide et utile pour évaluer le rôle d’une protéine avec la fonction uncaracterized dans le règlement d’épissage alternatif après traitement chimiothérapeutique.
Abstract
Le traitement de l’ARNm implique plusieurs étapes simultanées pour préparer l’ARNm à la traduction, telles que le capsulage 5', l’addition de poly-A et l’épissage. Outre l’épissage constitutif, l’épissage alternatif de l’ARNm permet l’expression de protéines multifonctionnelles à partir d’un gène. Comme les études d’interactome sont généralement la première analyse pour des protéines nouvelles ou inconnues, l’association de la protéine appât avec des facteurs d’épissage est une indication qu’elle peut participer au processus d’épissage de l’ARNm, mais déterminer dans quel contexte ou quels gènes sont régulés est un processus empirique. Un bon point de départ pour évaluer cette fonction est l’utilisation de l’outil minigène classique. Ici nous présentons l’utilisation adenoviral de minigene d’E1A pour évaluer les changements alternatifs d’épissage après différents stimulus cellulaires d’effort. Nous avons évalué l’épissage du minigène E1A dans HEK293 surexprimant de manière stable la protéine Nek4 après différents traitements de stress. Le protocole comprend la transfection de minigène e1A, le traitement cellulaire, l’extraction d’ARN et la synthèse d’ADNc, suivis de l’analyse de PCR et de gel et de la quantification des variantes épissées d’E1A. L’utilisation de cette méthode simple et bien établie combinée à des traitements spécifiques est un point de départ fiable pour faire la lumière sur les processus cellulaires ou sur les gènes qui peuvent être régulés par l’épissage de l’ARNm.
Introduction
L’épissage est parmi les étapes les plus importantes dans le traitement eucaryote de l’ARNm qui se produit simultanément au capsulage de l’ARNm 5 et à la polyadénylation de l’ARNm 3', comprenant l’élimination de l’intron suivie d’une jonction d’exon. La reconnaissance des sites d’épissage (SS) par l’spliceosome, un complexe ribonucléoprotéine contenant de petites ribonucléoprotéines (snRNP U1, U2, U4 et U6), de petits ARN (snRNAs) et plusieurs protéines régulatrices1 est nécessaire pour l’épissage.
Outre l’élimination des introns (épissage constitutif), chez les eucaryotes, les introns peuvent être conservés et les exons peuvent être exclus, en configurant le processus appelé épissage alternatif de l’ARNm (AS). L’épissage alternatif pré-ARNm élargit la capacité de codage des génomes eucaryotes permettant la production d’un grand nombre et diversifié de protéines à partir d’un nombre relativement faible de gènes. On estime que 95 à 100 % des ARNm humains qui contiennent plus d’un exon peuvent subir un épissage alternatif2,3. Ceci est fondamental pour les processus biologiques tels que le développement neuronal, l’activation de l’apoptose et la réponse au stress cellulaire4, fournissant à l’organisme des alternatives pour réguler le fonctionnement cellulaire en utilisant le même répertoire de gènes.
La machinerie nécessaire à l’épissage alternatif est la même que celle utilisée pour l’épissage constitutif et l’utilisation de la SS est le principal déterminant pour l’épissage alternatif. L’épissage constitutif est lié à l’utilisation de sites d’épissage forts, qui sont généralement plus similaires aux motifs de consensus pour la reconnaissance des spliceosomes5.
Les exons alternatifs sont typiquement reconnus moins efficacement que les exons constitutifs une fois que ses éléments cis-régulateurs, les séquences dans 5'SS et 3'SS flanquant ces exons, montrent une capacité de liaison inférieure au spliceosome. L’ARNm contient également des régions nommées activateurs ou silencieux situés dans les exons (activateurs d’épissage exonique (EES) et silencieux d’épissage exonique (ESS)) et les introns (exhausteurs d’épissage introniques (ISE) et silencieux d’épissage intronique (ISS)) qui améliorent ou répriment l’utilisation de l’exon, respectivement5. Ces séquences sont reconnues par des éléments trans-régulateurs, ou facteurs d’épissage (SF). Les SFs sont représentés principalement par deux familles de protéines, les facteurs d’épissage riches en sérine/arginine (SRSF) qui se lient aux ES et la famille des ribonucléoprotéines nucléaires hétérogènes (hnRNPs) qui se lient aux séquences ESSs5.
L’épissage alternatif peut être modulé par phosphorylation/déphosphorylation de trans- facteurs modifiant les interactions partenaires et la localisation cellulaire des facteurs d’épissage6,7,8. L’identification de nouveaux régulateurs des facteurs d’épissage peut fournir de nouveaux outils pour réguler l’épissage et, par conséquent, certains traitements du cancer.
Anufrieva et coll.9,dans un profil d’expression génique de puces à ADN messagère, ont observé des changements constants dans les niveaux de composants splicosomal dans 101 lignées cellulaires et après différentes conditions de stress (médicaments à base de platine, irradiation gamma, inhibiteurs de la topoisomérase, inhibiteurs de tyrosine kinase et taxanes). La relation entre le modèle d’épissage et l’efficacité de la chimiothérapie a déjà été démontrée dans les cellules cancéreuses du poumon, qui sont résistantes à la chimiothérapie, montrant des changements dans le taux de variantes de la caspase-910. Les cellules HEK293 traitées avec le panneau de chimiothérapie montrent des changements dans l’épissage avec une augmentation des variantes pro-apoptotic. Gabriel et coll.11 ont observé des changements dans au moins 700 événements d’épissage après un traitement au cisplatine dans différentes lignées cellulaires, soulignant que les voies d’épissage sont affectées par le cisplatine. Les modulateurs d’épissage ont déjà démontré une activité antitumorale, montrant que l’épissage est important pour le développement tumoral et, principalement, la réponse chimiothérapeutique12. Par conséquent, caractériser de nouvelles protéines qui régulent l’épissage après les agents de stress cellulaires, comme les agents chimiothérapeutiques, est très important pour découvrir de nouvelles stratégies de traitement.
Les indices de régulation alternative d’épissage des études d’interactome, particulièrement importants pour caractériser des fonctions des protéines nouvelles ou non caractérisées, peuvent exiger une approche plus générale et simple pour vérifier le rôle réel de la protéine dans l’AS. Les minigènes sont des outils importants pour l’analyse du rôle général d’une protéine affectant la régulation de l’épissage. Ils contiennent des segments d’un gène d’intérêt contenant alternativement des régions génomiques épissées et flanquantes13. L’utilisation d’un outil de minigène permet l’analyse de l’épissage in vivo avec plusieurs avantages tels que la longueur du minigène qui est mineure et n’est donc pas une limitation à la réaction d’amplification; le même minigène peut être évalué dans différentes lignées cellulaires; tous les composants cellulaires, principalement leur modification post-traductionnelle régulatrice (phosphorylation et changements dans les compartiments cellulaires) sont présents et peuvent être traités13,14. De plus, des changements dans le modèle d’épissage alternatif peuvent être observés après le stress cellulaire et, l’utilisation d’un système minigène, permettent d’identifier la voie modulée par différents stimuli.
Il existe plusieurs systèmes de minigènes déjà décrits qui sont spécifiques à différents types d’événements d’épissage13,14,cependant, en tant qu’essai préliminaire, le minigène E1A15 est un système de rapporteur d’épissage alternatif très bien établi pour l’étude de la sélection 5'SS in vivo. À partir d’un seul gène, E1A, cinq ARNm sont produits par épissage alternatif basé sur la sélection de trois sites d’épissure 5′ différents et d’un site d’épissure majeur ou mineur de 3′16,17,18. L’expression des variantes E1A change en fonction de la période d’infection adénovirale19,20.
Nous avons montré précédemment que les deux isoformes Nek4 interagissent avec des facteurs d’épissage tels que SRSF1 et hnRNPA1 et tandis que l’isoforme 2 change l’épissage alternatif minigène E1A, l’isoforme 1 n’a aucun effet en ce que21. Puisque l’isoforme 1 est l’isoforme la plus abondante et change la résistance de chimiothérapie et la réponse aux dommages d’ADN, nous évaluons si elle pourrait changer l’épissage alternatif du minigène E1A dans un état de stress.
Le dosage minigène est une méthode simple, peu coûteuse et rapide, car il ne nécessite que l’extraction de l’ARN, la synthèse de l’ADNc, l’amplification et les analyses de gel d’agarose, et peut être un outil utile pour évaluer depuis un effet possible sur l’épissage alternatif par une protéine d’intérêt jusqu’à l’effet de différents traitements sur le modèle d’épissage alternatif cellulaire.
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Protocol
1. Placage des cellules
REMARQUE: Dans ce protocole décrit, les lignées cellulaires stables HEK293, précédemment générées pour une expression inductible stable de Nek4 ont été utilisées21,cependant, le même protocole convient à de nombreuses autres lignées cellulaires, telles que HEK29322,HeLa23, 24,25, 26,U-2 OS27,COS728,SH-SY5Y29. Le modèle d’expression des isoformes du minigène E1A dans des conditions basiques varie entre ces cellules et devrait être caractérisé pour chaque condition. Ce protocole n’est pas limité aux lignées cellulaires stables. L’approche la plus courante dans l’évaluation de la protéine candidate est par co-transfection transitoire d’augmenter sa quantité avec la quantité fixe du minigène. Le même protocole convient aux cellules knockout.
- Cellules de plaque tenant compte des contrôles de véhicule, non transfectés et GFP.
- Culture de cellules HEK293 avec expression stable du gène d’intérêt dans le milieu Eagle modifié (DMEM) de Dulbecco complétées par 10 % de sérum fœtal bovin (FBS), 4,5 g/L de glucose, 4 mM de L-glutamine et conservent avec 100 μg/mL d’hygromycine B, sur des plaques traitées par culture tissulaire à 37 °C dans 5 % deCO2 et une atmosphère humidifiée.
- Cellules fractionnées à l’aide de 0,25% de trypsine-EDTA. Plaque 3 x 105 cellules dans des plaques à 6 puits et incuber pendant 24 h à 37 °C dans 5 % deCO2.
REMARQUE: Pour la transfection, les cellules doivent être 70-80% confluent pour diminuer la mort cellulaire après la transfection.
2. Transfection cellulaire
REMARQUE: 1-2 μg de plasmide minigène pMTE1A a été utilisé ici, mais la quantité d’ADN, ainsi que le temps d’expression, doivent être maintenus au minimum pour éviter la toxicité. Par exemple, une toxicité élevée a été observée dans les cellules HeLa après 30 h de transfection avec 1 μg d’ADN pMTE1A. Pour la transfection décrite ici, un réactif de transfection à base de lipides a été utilisé
- Vérifiez la confluence des cellules 24 h après le placage et transfectez les cellules stables HEK293 uniquement lorsque 70-80% confluent.
- Retirez soigneusement le milieu de culture cellulaire avec une pipette, au lieu d’utiliser un système de pompe à vide. Ajoutez ensuite soigneusement 2 mL de milieu DMEM complet sans antibiotiques et remettez la plaque dans l’incubateur.
- Préparer un tube avec le tampon de transfection (200 μL/puits), ajouter 2 μg d’ADN pMTE1A, vortex, puis ajouter 2 μL de réactif de transfection. Vortex à nouveau et incuber pendant 10 min à température ambiante.
- Retirez les plaques de l’incubateur et ajoutez soigneusement le mélange de transfection goutte à goutte.
- Aux cellules stables HEK293, ajouter la tétracycline (0,5 μg/mL) pour l’induction de l’expression nek4 6 h après la transfection. Un changement moyen n’est pas nécessaire.
REMARQUE : Les volumes/montants décrits dans cette section sont pour un puits. Préparer le mélange pour tous les puits utilisés dans l’expérience dans le même tube. - Préparer un puits à transfecter avec EGFP, ou un autre fluorophore exprimant le plasmide pour estimer l’efficacité de la transfection. De meilleurs résultats peuvent être observés avec une efficacité de transfection d’au moins 40%, mais de bonnes performances avec une efficacité de transfection inférieure ont été observées précédemment.
- Lors de l’utilisation de la co-transfection (protéine d’intérêt et minigène), gardez un puits avec des cellules non transfectées pour éviter d’obtenir des résultats à partir d’ARNm endogène. Dans le cas d’E1A, les cellules HEK293 expriment déjà le gène E1A30.
3. Préparation des médicaments
REMARQUE: Le moment et la concentration du traitement ont été choisis en fonction des résultats de la littérature, qui soulignent des changements dans l’épissage alternatif pour certains gènes.
- Effectuer une courbe dose-réponse avant de commencer l’essai pour déterminer la concentration minimale à l’induction d’épissage alternative sans effet sur la viabilité cellulaire.
- Préparer une solution mère de Paclitaxel à une concentration de 5 mM dans de l’éthanol. La concentration finale est de 1 μM. Maintenir à -20 °C. Utilisez de l’éthanol à 0,02 % comme véhicule de contrôle.
- Préparer une solution de cisplatine en diluant dans du NaCl à 0,9 % à environ 0,5 mg/mL (1,66 mM). Protéger de la lumière, du vortex et incuber dans un bain thermal, 37 °C pendant 30 min. La concentration finale est de 30 μM. Préparer frais ou conserver à 2-10 °C jusqu’à un mois.
REMARQUE: Tous les médicaments doivent être protégés de la lumière.
4. Traitement cellulaire et prélèvement
REMARQUE: Les cellules stables HEK293 ont été collectées 48 h après la transfection et pour cela ont été traitées 24 h après la transfection car le niveau d’expression Nek4 le plus élevé est atteint dans les 48 h. Cependant, on a observé des niveaux élevés de l’expression isoforme 13S (jusqu’à 90%) à ce moment-là. Pour diminuer la proportion d’isoforme 13S, essayez de traiter et de recueillir les cellules 30 h après transfection maximum.
- Utilisez des embouts et des tubes sans ARN/DNase. Effectuer l’extraction de l’ARN total avec un réactif phénol-chloroforme en suivant la recommandation du fabricant.
- 24 h après la transfection, vérifier la morphologie cellulaire et l’efficacité de la transfection à l’aide d’un microscope fluorescent.
- Retirez le milieu de culture cellulaire, de préférence à l’aide d’une pipette au lieu d’un système de pompe à vide. Ajoutez ensuite le milieu de culture cellulaire avec les agents chimiothérapeutiques dans la concentration finale décrite précédemment.
- Incuber à 37 °C, 5 % deCO2 pendant 18 à 24 h.
- Recueillir l’ARN en jetant le milieu de culture cellulaire dans un récipient et en ajoutant 0,5 à 1 mL de réactif d’extraction d’ARN directement au puits. Si les puits sont très confluents, utilisez 1 mL de réactif d’extraction d’ARN pour améliorer la qualité de l’ARN.
- Homogénéiser avec la pipette et transférer dans un tube centrifuge de 1,5 mL. À ce stade, le protocole peut être mis en pause en stockant des échantillons à -80 °C ou procéder immédiatement à l’extraction de l’ARN.
AVERTISSEMENT: Le réactif d’extraction d’ARN à base de phénol est toxique et toutes les procédures doivent être effectuées dans une hotte chimique et les résidus éliminés correctement.
5. Extraction de l’ARN et synthèse de l’ADNc
- Dans une hotte, décongeler les échantillons et incuber pendant 5 min à température ambiante. Ajouter 0,1 à 0,2 mL de chloroforme et agiter vigoureusement.
- Incuber pendant 3 min à température ambiante.
- Centrifuger pendant 15 min à 12 000 x g et 4 °C.
- Recueillir la phase aqueuse supérieure et le transférer dans un nouveau tube centrifuge de 1,5 mL. Collecter environ 60% du volume total; cependant, ne collectez pas l’ADN ou la phase organique (inférieure).
- Ajouter 0,25 à 0,5 mL d’isopropanol et agiter par inversion 4 fois. Incuber pendant 10 min à température ambiante.
- Centrifuger à 12 000 x g pendant 10 min, à 4 °C et jeter le surnageant.
- Laver la pastille d’ARN deux fois avec de l’éthanol (75 % dans de l’eau traitée au diéthylpyrocarbonate (DEPC)). Centrifuger à 7 500 x g pendant 5 min et jeter l’éthanol.
- Retirez l’excès d’éthanol en inversant le tube sur un papier essuie-tout, puis laissez le tube ouvert à l’intérieur d’une hotte pour sécher partiellement le culot pendant 5 à 10 min.
- Ressusciter la pastille d’ARN dans 15 μL d’eau traitée au DEPC.
- Quantifier l’ARN total en utilisant l’absorbance à 230 nm, 260 nm et 280 nm pour vérifier la qualité de l’ARN.
- Pour vérifier la qualité totale de l’ARN, faire fonctionner un gel d’agarose à 1% pré-traité avec 1,2% (v/v) d’une solution d’hypochlorite de sodium à 2,5% pendant 30 min31.
- Effectuer la synthèse de l’ADNc en utilisant 1-2 μg d’ARN total.
- Arn pipélette, 1 μL d’oligo-dT (50 μM), 1 μL de dNTP (10 mM) et composent le volume à 12 μL avec de l’eau sans nucléase. Incuber dans le thermocycleur pendant 5 min à 65 °C.
- Prélever des échantillons du thermocycleur pour refroidir et préparer le mélange réactionnel : 4 μL de tampon de transcriptase inverse, 2 μL de dithiothreitol (TNT) et 1 μL d’inhibiteur de la ribonucléase. Incuber à 37 °C pendant 2 min.
- Ajouter 1 μL de transcriptase inverse thermo-stable. Incuber à 37 °C pendant 50 min et inactiver l’enzyme à 70 °C pendant 15 min.
REMARQUE: L’ADNc peut être conservé à -20 °C pendant plusieurs semaines. Effectuer un contrôle de la transcriptase non inverse (TRN) pour la contamination génomique résultant d’événements putatifs de rétention d’intron.
6. PCR minigène pMTE1A
- Effectuer une PCR avec la composition réactionnelle (1,5 mM deMgCl2,0,3 mM de mélange de dNTP, 0,5 μM de chaque amorce, 2,5 U d’une polymérase Taq à chaud et 150 ng d’ADNc) dans les conditions suivantes :
94 °C pendant 2 min, 29 cycles de : 94 °C pendant 1 min, 50 °C pendant 2 min, 72 °C pendant 2 min, 72 °C pendant 10 min. - Chargez 20 à 25 μL du produit PCR dans un gel d’agarose à 3 % contenant une coloration d’acide nucléique et courez à 100 V pendant environ 1 h.
7. Analyse du gel à l’aide d’un logiciel de traitement et d’analyse d’images32
- Après la course, photographiez le gel (à l’aide d’un système d’acquisition d’imagerie de gel) en évitant toute saturation de bande et quantifiez les bandes à l’aide d’un logiciel de traitement d’image.
- Pour la quantification, considérez les bandes à ~631 bp, ~493 bp et ~156 bp pour correspondre aux isoformes 13S, 12S et 9S, respectivement.
- Dans le menu Fichier du logiciel, ouvrez le fichier image obtenu à partir du système d’acquisition d’imagerie. Convertissez en niveaux de gris, ajustez la luminosité et le contraste et supprimez le bruit aberrant si nécessaire.
- Dessinez un rectangle autour de la première voie à l’aide de l’outil Sélection de rectangle et sélectionnez-le via l’outil Analyser (Analyze | Gels | Sélectionnez la commande First Lane ou appuyez sur le raccourci clavier qui s’y trouve.
- Utilisez la souris pour cliquer et maintenir au milieu du rectangle sur la première voie et faites-la glisser vers la voie suivante. Aller à Analyser les | Gels | Sélectionnez Next Lane (Voie suivante)ou appuyez sur le raccourci disponible. Répétez cette étape sur toutes les voies restantes.
- Une fois que toutes les voies sont mises en évidence et numérotées, accédez à Analyser les | Gels | Tracez les voies pour dessiner un tracé de profil de chaque voie.
- Avec l’outil sélection en ligne droite, tracez une ligne sur la base de chaque pic correspondant à chaque bande, en omettant le bruit de fond. Une fois que tous les pics, de chaque voie, ont été fermés, sélectionnez l’outil Baguette et cliquez à l’intérieur de chaque pic. Pour chaque pic mis en surbrillance, les mesures doivent apparaître dans la fenêtre Résultats qui s’affiche.
- Additionnez l’intensité des 3 bandes pour chaque échantillon et calculez le pourcentage pour chaque isoforme par rapport au total.
- Tracer les pourcentages de chaque isoforme ou les différences dans le pourcentage par rapport aux échantillons non traités.
Remarque : Assurez-vous que la somme de trois variantes E1A doit être égale à 100 %.
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Representative Results
Un 5' l’analyse d’emplacements d’épissure utilisant le minigene d’E1A a été exécutée pour évaluer des changements de l’épissage du profil en cellules après exposition de chimiothérapie. Le rôle de Nek4 - isoform 1 dans la régulation AS dans les cellules stables HEK293 après que le traitement de paclitaxel ou de cisplatin ait été évalué.
La région adénovirale E1A est responsable de la production de trois ARNm principaux à partir d’un précurseur d’ARN en raison de l’utilisation de différents donneurs d’épissure. Ils partagent des termini communs de 5' et de 3' mais diffèrent par la taille de leurs introns excisés. Les ARNm adénoviraux E1A sont nommés en fonction de leurs coefficients de sédimentation, 13S, 12S et 9S. Au cours de la phase précoce de l’infection à adénovirus (environ 7 h), des protéines importantes pour préparer la cellule infectée à la réplication de l’ADN viral sont produites (13S - 723 aa et 12S - 586 aa) et, dans la phase tardive (environ 18 h) en plus de celles-ci, une petite protéine (9S -249 aa) est produite20. En utilisant un plasmide contenant le minigène d’E1A, l’effet sur l’épissage alternatif peut être observé dans les cellules après la transfection évaluant la proportion d’ARNm de chaque isoforme produite : 13S : 631 pb, 12S : 493 pb et 9S 156 bp (Figure 1A et B).
L’expression basale des variantes d’isoformes E1A dépend de la lignée cellulaire et du temps d’expression d’E1A. Il a été observé que la lignée cellulaire stable HEK293 (HEK293-Flag) ou le site contenant de la recombinase HEK293 (HEK293-FRT - la lignée cellulaire d’origine) montre une expression plus élevée de 13S par rapport aux cellules HeLa (HeLa-PLKO) qui montre des niveaux similaires d’isoformes 13S et 12S après 48 h d’expression E1A (figure 1C et D).
Le niveau élevé d’expression 13S observé dans les cellules stables HEK293 est considérablement diminué sous des temps plus courts d’expression d’E1A (environ 30 h). La proportion (%) de 13S:12S:9S à 30 h et 48 h est de 60:33:7 et 80:15:5, respectivement (données non présentées). Pour cette raison, il est important de caractériser le profil d’épissage du minigène cellulaire basal E1A avant de commencer les expériences.
Les cellules exposées au cisplatine ont montré un changement dans la sélection d’épissage de SS 5 favorisant l’expression 12S (une augmentation d’environ 15% par rapport aux cellules non traitées). Cet effet a été observé dans HEK293 exprimant de manière stable le vecteur vide Flag ainsi que l’isoforme 1 de Nek4. Lorsque des changements majeurs sont observés dans le pourcentage d’expression, un graphique avec des pourcentages représente clairement les résultats (Figure 2).
Lorsque l’on compare deux conditions (flag et surexpression Nek4) répondant à un traitement, la meilleure façon de représenter les données est généralement de tracer les différences sur un graphique, car le niveau basal d’expression peut être différent et les pourcentages ne refléteront pas l’effet réel du traitement. Cela peut être observé à la figure 3. Les changements de COMME après traitement de paclitaxel étaient très discrets, mais les directions des changements étaient le contraire dans le drapeau et les cellules exprimant Nek4.
Malgré de petits changements après le traitement, les résultats étaient cohérents, indiquant que le traitement au paclitaxel entraîne une diminution de l’isoforme 13S, avec une augmentation de 12S et 9S des cellules exprimant Flag, tandis que, d’autre part, dans les cellules exprimant Nek4, on observe l’effet inverse.
Figure 1: Le motif d’épissage minigène E1A dépend de la lignée cellulaire. A) Représentation schématique des sites d’épissage du minigène E1A. Les flèches indiquent la région de recuit de l’amorce pour l’amplification des isoformes minigène e1A. B) Isoformes générées par épissage alternatif du minigène E1A. C)HEK293 exprimant de manière stable Flag vecteur vide (HEK293 -Flag), HeLa transfecté avec le vecteur PLKO (HeLa - PLKO) ou, HEK293 recombinase-sites contenant (à partir de ce que HEK293 exprimant stably Flag ou Nek4.1 ont été générés - HEK293-FRT) ont été transfectés avec le plasmide pMTE1A. 48h après l’isolement de l’ARN total de transfection et des isoformes E1A ont été séparées en gel d’agarose(D). Graphique comparant le pourcentage d’isoformes 13S, 12S et 9S dans les cellules HEK293-Flag et HeLa-PLKO dans des conditions basales. Données de trois expériences indépendantes. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2: Effet du traitement au cisplatine dans le modèle d’épissage du minigène E1A. HEK293 exprimant de manière stable le vecteur vide flag (Flag) ou l’étiquette Flag Nek4.1 fusionnée, ont été transfectés avec le plasmide pMTE1A. Pendant six heures après que la tétracycline de transfection ait été ajoutée à l’induction d’expression de protéines. De 24 h à 48 h, le milieu de culture cellulaire a été remplacé par un milieu contenant 30 μM de Cisplatine. Après 24 h d’incubation, l’ARN total a été extrait et les produits de l’ACP ont été séparés au gel d’agarose de 3%. A)Les isoformes prédominantes du minigène E1A sont représentées. Les graphiques B-D représentent le % de chaque isoforme par rapport à la somme de trois variantes (13S, 12S et 9S). Dans E, la différence dans le pourcentage d’expression de chaque isoforme est présentée par rapport au contrôle du véhicule (moyen). Les graphiques sont présentés comme la moyenne et le MEB de trois expériences indépendantes. * p< 0,05, ** p<0,01 dans le test t non apparié. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3: Effet du traitement au paclitaxel dans le modèle d’épissage du minigène E1A. HEK293 exprimant de manière stable flag vecteur vide (Flag) ou Nek4.1 Flag fusionné, ont été transfectés avec pMTE1A plasmide. Pendant six heures après que la tétracycline de transfection ait été ajoutée à l’induction d’expression de protéines. De 24 h à 48 h, le milieu de culture cellulaire a été remplacé par un milieu contenant 1 μM de Paclitaxel ou d’éthanol (0,02 %) utilisé comme témoin du véhicule. Après 24 h d’incubation, l’ARN total a été extrait et les produits de l’ACP ont été séparés au gel d’agarose de 3%. A)Les isoformes prédominantes sont représentées. Les graphiques B-D représentent le % de chaque isoforme par rapport à la somme de trois variantes (13S, 12S et 9S). Dans E, la différence dans le pourcentage d’expression de chaque isoforme est présentée par rapport au véhicule (éthanol) témoin. Les graphiques sont présentés comme la moyenne et le MEB de trois expériences indépendantes. * p< 0,05 dans le test t non apparié. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Discussion
Les minigènes sont des outils importants pour déterminer les effets de l’épissage alternatif global in vivo. Le minigène adénoviral E1A est utilisé avec succès depuis des décennies pour évaluer le rôle des protéines en augmentant la quantité de celles-ci dans la cellule13,14. Ici, nous proposons l’utilisation du minigene E1A pour évaluer l’épissage alternatif après exposition chimiothérapeutique. Une variété de cellule stable exprimant l’isoforme 1 de Nek4 a été employée, évitant les objets façonné de l’overexpression provoqués par transfection passagère. L’isoforme 1 de Nek4 n’a pas montré d’effet dans le minigène E1A épissage alternatif dans les conditions basales21,mais a de nombreux interacteurs liés à l’épissage, nous permettant donc d’évaluer l’effet spécifique du traitement chimiothérapeutique dans l’épissage alternatif E1A dans ces cellules.
Malgré sa faible sensibilité, principalement par rapport aux approches radioactives, la méthode décrite ici est simple et ne nécessite pas de réactifs spéciaux ou de conditions de laboratoire. Cependant, il est important de noter que le minigène E1A est un rapporteur global des sélections 5'SS, bien que la sélection 3'SS puisse être évaluée avec ce protocole le journaliste minigene spécifique doit être utilisé14,33,34. D’ailleurs, les résultats peuvent être influencés par la variété de cellule et devraient être soigneusement évalués pour éviter l’interprétation erronée en raison du profil basique alternatif d’épissage.
Habituellement, de grandes différences dans le modèle d’épissage minigène E1A ne sont observées que lors de la modification de l’expression des facteurs d’épissage. D’autres changements sont moins évidents en raison du grand nombre de protéines modulant l’activité de ces facteurs. Pour cette raison, lors du démarrage d’études pour un candidat indirect, l’approche classique, basée sur des quantités croissantes de cette protéine candidate, doit être préférée. Lorsqu’un effet est observé, les traitements peuvent être effectués pour explorer si la régulation peut être spécifique à un stimulus cellulaire particulier.
Après un résultat positif préliminaire, la normalisation du temps et de la concentration du médicament peut être effectuée pour optimiser l’expérience.
Ce protocole simple est un essai préliminaire, un point de départ qui peut répondre si la protéine d’intérêt montre un effet dans l’épissage alternatif et aussi, quand un certain effet dans la régulation alternative d’épissage est déjà connu, peut diriger les études vers la voie plus cohérente où la protéine joue un rôle régulant l’épissage alternatif dans la réponse de chimiothérapie.
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Disclosures
Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.
Acknowledgments
Nous remercions la Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP, par le biais de Grant Temático 2017/03489-1 à JK et de la bourse à FLB 2018/05350-3) et le Conselho Nacional de Desenvolvimento Cientifico e Tecnológico (CNPq) pour le financement de cette recherche. Nous tenons à remercier le Dr Adrian Krainer d’avoir fourni le plasmide pMTE1A et Zerler et ses collègues pour leur travail sur le clonage E1A. Nous remercions également le Prof. Dr. Patrícia Moriel, prof. Dr. Wanda Pereira Almeida, prof. Dr. Marcelo Lancellotti et prof. Dr. Karina Kogo Cogo Müller pour nous permettre d’utiliser leur espace de laboratoire et leur équipement.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 pb DNA Ladder | Invitrogen | 15628-050 | |
| 6 wells plate | Sarstedt | 833920 | |
| Agarose | Sigma | A9539-250G | |
| Cisplatin | Sigma | P4394 | |
| DEPC water | ThermoFisher | AM9920 | |
| DMEM | ThermoFisher | 11965118 | |
| dNTP mix | ThermoFisher | 10297-018 | |
| Fetal Bovine Serum - FBS | ThermoFisher | 12657029 | |
| Fluorescent Microscope | Leica | DMIL LED FLUO | |
| Gel imaging acquisition system - ChemiDoc Gel Imagin System | Bio-Rad | ||
| GFP - pEGFPC3 | Clontech | ||
| HEK293 stable cells - HEK293 Flp-In | Generated from Flp-In™ T-REx™ 293 - Invitrogen and described in ref 21 | ||
| Hygromycin B | ThermoFisher | 10687010 | Used for Flp-In cells maintenemant |
| Image processing and analysis software - FIJI software | ref. 32 | ||
| Lipid- based transfection reagent - jetOPTIMUS Polyplus Reagent | Polyplus | 117-07 | |
| Oligo DT | ThermoFisher | 18418020 | |
| Paclitxel | Invitrogen | P3456 | |
| Plate Reader/ UV absorbance | Biotech | Epoch Biotek/ Take3 adapter | |
| pMTE1A plasmid | Provided by Dr. Adrian Krainer | ||
| pMTE1A F | Invitrogen | 5’ -ATTATCTGCCACGGAGGTGT-3 | |
| pMTE1A R | Invitrogen | 5’ -GGATAGCAGGCGCCATTTTA-3’ | |
| Refrigerated centrifuge | Eppendorf | F5810R | |
| Reverse Transcriptase - M-MLV | ThermoFisher | 28025013 | |
| Reverse transcriptase - Superscript IV | ThermoFisher | 18090050 | |
| Ribunuclease inhibitor RNAse OUT | ThermoFisher | 10777-019 | |
| RNA extraction phenol-chloroform based reagent - Trizol | ThermoFisher | 15596018 | |
| SybrSafe DNA gel stain | ThermoFisher | S33102 | |
| Taq Platinum | Thermo | 10966026 | |
| Tetracyclin | Sigma | T3383 | Used for Flag empty or Nek4- Flag expression induction |
| Thermocycler Bio-Rad | Bio-Rad | T100 | |
| Trypsin | Sigma | T4799 |
References
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