Summary
이 프로토콜은 화학 요법 치료 후 대체 접합 조절에서 특징이 없는 기능을 가진 단백질의 역할을 평가하기 위한 신속하고 유용한 도구를 제공합니다.
Abstract
mRNA 처리에는 5'capping, 폴리-A 첨가 및 접합과 같은 번역을 위한 mRNA를 준비하는 다중 동시 단계가 포함됩니다. 구성 접합 외에도 대체 mRNA 접합은 한 유전자에서 다기능 단백질의 발현을 허용합니다. 상호 작용 연구는 일반적으로 새로운 또는 알려지지 않은 단백질에 대한 첫 번째 분석이기 때문에, 접합 인자를 가진 미끼 단백질의 협회는 mRNA 접합 과정에 참여할 수 있다는 표시이지만, 어떤 맥락이나 어떤 유전자가 규제되는지 결정하는 것은 경험적 과정입니다. 이 기능을 평가하는 좋은 출발점은 고전적인 미니진 도구를 사용하는 것입니다. 여기서 우리는 다른 세포 스트레스 자극 후 대체 접합 변화를 평가하기위한 adenoviral E1A 미니 유전자 사용을 제시한다. 다양한 스트레스 치료 후 Nek4 단백질을 안정적으로 과발현하는 HEK293에서 E1A 미니진의 접합을 평가했습니다. 프로토콜은 E1A 미니유전자 이식, 세포 처리, RNA 추출 및 cDNA 합성을 포함하고, E1A 접합변의 PCR 및 겔 분석 및 정량화에 선행됩니다. 특정 치료와 결합된 이 간단하고 잘 확립된 방법의 사용은 세포 프로세스 또는 mRNA 접합에 의해 통제될 수 있는 어떤 유전자에 빛을 비추기 위하여 믿을 수 있는 출발점입니다.
Introduction
접합은 5mRNA 캡핑 및 3'mRNA 폴리아데닐레이션에 동시에 발생하는 진핵 mRNA 처리에서 가장 중요한 단계 중 하나이며, 엑손 접합에 이어 인트론 제거로 구성된다. 접합 부위(SS)의 인식은 작은 리보뉴클레오단백질(snRNP U1, U2, U4 및 U6), 소형 RNA(snRNAs) 및 여러 조절 단백질1을 포함하는 리보뉴클레오단백질 복합체에 의해 접합 부위(SS)를 분리하는 데 필요하다.
인트론 제거(구성)외에도 진핵생물에서 인트론을 유지할 수 있으며 엑손을 배제하여 mRNA 대체 접합(AS)이라는 과정을 구성할 수 있다. 대체 사전 mRNA 접합유전자는 상대적으로 적은 수의 유전자로부터 크고 다양한 수의 단백질을 생산할 수 있도록 진핵 게놈의 코딩 능력을 확장합니다. 하나 이상의 기전을 포함하는 인간 mRNA의 95-100%가 대체 접합2,3을겪을 수 있다고 추정됩니다. 이것은 신경 발달, 세포 운동 활성화 및 세포 스트레스 반응4와같은 생물학적 과정에 대한 기본이며, 유전자의 동일한 레퍼토리를 사용하여 세포 기능을 조절하는 유기체 대안을 제공합니다.
대체 접합에 필요한 기계는 구성 접합에 사용되는 것과 동일하며 SS의 사용은 대체 접합 발생을 위한 주요 결정요인입니다. 구성 접합은 일반적으로 화려한 인식5에대한 합의 모티브와 더 유사한 강한 접합 사이트의 사용과 관련이 있습니다.
대체 엑소는 일반적으로 일단 cis-규제요소, 5'SS의 시퀀스 및 3'SS의 시퀀스가 이러한 exons를 측면에 두면 구성 적인 엑소보다 덜 효율적으로 인식되며, 스플렉스에 대한 열등한 결합 능력을 보여줍니다. mRNA는 또한 엑손 (엑소닉 접합 강화제 (ESEs) 및 외장 접합 소음기 (ESS)와 인트론 (내성 접합 강화제 (ISEs) 및 내향성 스플리싱 소음기 (ISS)에 위치한 강화 또는 소음기라는 영역을 포함, 각각5. 이러한 시퀀스는 트랜스 규제 요소 또는 접합 계수(SF)에 의해 인식됩니다. SF는 ESS 서열5에결합하는 ESEs 및 이질핵단백질(hnRNPs)의 가족과 ESEs에 결합하는 세린/아르기닌 풍부한 접합 인자(SRSF)의 두 제품군에 의해 주로 대표된다.
대체 접합은 접합 인자의 상호 작용 파트너 및 세포 국소화를 수정하는 트랜스 인자의 인산화/탈포식에 의해 변조될 수 있다6,7,8. 접합 요인의 새로운 레귤레이터를 식별하는 것은 접합을 통제하는 새로운 공구를 제공할 수 있고, 결과적으로, 몇몇 암 처리.
Anufrieva외. 9,mRNA 마이크로어레이 유전자 발현 프로파일에서, 101 세포주에서 및 다른 스트레스 조건(백금 계 약물, 감마 조사, 토포이솜라제 억제제, 티로신 키나아제 억제제 및 taxanes)에서 스플리케소말 성분의 수준에서 일관된 변화를 관찰하였다. 접합 패턴과 화학요법 효능 간의 관계는 이미 화학요법내성 폐암 세포에서 입증되어 caspase-9 변이체 비율10의변화를 보이고 있다. 화학요법 패널로 치료된 HEK293 세포는 세포 세포가 증가하는 것을 보여준다. 가브리엘외. 11 다른 세포주에서 시스플라틴 치료 후 접합의 적어도 700 이벤트에서 변화를 관찰, 접합 경로는 시스플라틴 영향을 지적. 접합 변조기는 이미 항 종양 활성을 입증하여 접합이 종양 발달에 중요하다는 것을 보여주고, 주로 화학요법반응(12). 따라서 화학 요법과 같은 세포 스트레스 에이전트 후 접합을 조절하는 새로운 단백질을 특성화하는 것은 새로운 치료 전략을 발견하는 것이 매우 중요합니다.
상호 작용 연구에서 대체 접합 조절의 단서, 특히 새로운 또는 특징화 되지 않은 단백질의 기능을 특성화 하는 데 중요 한, AS에서 단백질의 실제 역할을 확인 하기 위해 보다 일반적 이고 간단한 접근을 요구할 수 있습니다. Minigenes는 접합 조절에 영향을 미치는 단백질의 일반적인 역할을 분석하기 위한 중요한 도구입니다. 그(것)들은 대안적으로 접합되고 편측면 게놈 영역(13)을포함하는 관심의 유전자에서 세그먼트를 포함합니다. 미니진 도구를 사용하면 소소하여 증폭 반응에 제한이 없는 미니진의 길이와 같은 몇 가지 장점을 갖는 생체 내 접합을 분석할 수 있습니다. 동일한 미니진은 상이한 세포주에서 평가될 수 있다; 모든 세포 성분, 주로 그들의 조절 포스트 번역 수정 (인산화 및 세포 구획의 변화)가 존재하며13,14를해결할 수 있습니다. 더욱이, 대체 접합 패턴의 변화는 세포 스트레스 후 관찰될 수 있고, 미니진 시스템의 사용은, 상이한 자극에 의해 변조되는 통로를 식별할 수 있게 한다.
이미 설명된 여러 미니진 시스템은 다른 종류의 접합이벤트(13,14)에특이적이지만, 예비 분석으로서, 미니진 E1A15는 생체 내에서 5의 SS 선택 연구를 위한 매우 잘 확립된 대체 접합 기자 시스템이다. 단 하나의 유전자에서, E1A, 5 mRNA는 3개의 다른 5′ 스플라이스 사이트 및 1개의 주요 또는 1개의 사소한 3′ 스플라이스 사이트16의선택에 근거를 둔 대안 접합에 의해 생성됩니다16,17,18. E1A 변이체의 발현은 아데노바이러스감염(19)및20의기간에 따라 변경된다.
우리는 이전에 Nek4 등형이 모두 SRSF1 및 hnRNPA1과 같은 접합 요인과 상호 작용하고 isoform 2변경 미니 진 E1A 대체 접합, 동위 원소 형 1은 그21에영향을 미치지 않는다는 것을 이전에 보여주었습니다. 동위 원소 형 1은 가장 풍부한 동소형태이고 화학 요법 저항및 DNA 손상 반응을 변화하기 때문에, 우리는 스트레스 상태에서 미니진 E1A 대체 접합을 변경할 수 있는지 평가합니다.
미니진 분석은 RNA 추출, cDNA 합성, 증폭 및 아가로즈 겔 분석만 필요하기 때문에 간단하고 저렴한 비용과 신속한 방법이며, 세포 대체 접합 패턴에 대한 상이한 치료법의 효과까지 관심사의 단백질에 의한 대체 접합에 가능한 효과이기 때문에 평가하는 유용한 도구가 될 수 있다.
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Protocol
1. 도금 세포
참고: 본 설명된 프로토콜에서, HEK293 안정세포주, 이전에 는 Nek4의 안정적인 유도발현을 위해 생성된21개가사용되었지만, 동일한 프로토콜은 HEK29322,HeLa23,24,25,26,U-2 OS27,COS728,SH-SY5YYY YY 29Y와같은 많은 다른 세포주에 적합합니다. 기저 조건 하에서 미니진 E1A 동소형의 발현 패턴은 이 세포 마다 변화하고 각 조건에 대해 특징지어져야 합니다. 이 프로토콜은 안정적인 세포주에 국한되지 않습니다. 후보 단백질의 평가에서 가장 일반적인 접근은 미니진의 고정된 양으로 양을 증가의 일시적인 공동 변환에 의해. 동일한 프로토콜은 녹아웃 셀에 적합합니다.
- 차량, 비감염 및 GFP 제어를 고려 중인 플레이트 셀.
- 배양 HEK293 세포는 덜벡코의 변형독수리 매체(DMEM)에 대한 관심 유전자의 안정적인 발현을 가진 태아 소세럼(FBS), 4.5g/L 글루타민, 4m L-글루타민, 100μg/mL의 혈중음과 37°C의 분양처리 플레이트에서 27°C의 분양처리 플레이트에서 유지관리한다.
- 0.25%의 트립신-EDTA를 사용하여 셀을 분할합니다. 플레이트 3 x 105 세포를 6웰 플레이트에 넣은 후 5% CO2에서37°C에서 24시간 동안 배양한다.
참고: 트랜스포션의 경우, 세포는 70-80% 컨실수 있어야 감염 후 세포 사멸을 감소시켜야 합니다.
2. 세포 질주
참고: pMTE1A 미니유전자 플라스미드의 1-2 μg가 여기에 사용되었지만, DNA 양뿐만 아니라 발현 시간은 독성을 피하기 위해 최소한의 유지되어야 한다. 예를 들어, 높은 독성은 pMTE1A DNA의 1 μg와 함께 30 h의 형질 전환 후 HeLa 세포에서 관찰되었다. 여기에 설명된 트랜스페트에 대해 지질계 형질 전환 시약이 사용되었습니다.
- 70-80%의 컨할수 있는 경우에만 도금 및 경질 HEK293 안정셀 후 24시간 세포 결합을 확인한다.
- 진공 펌프 시스템을 사용하는 대신 파이펫으로 세포 배양 배지를 조심스럽게 제거합니다. 그런 다음 항생제없이 완전한 DMEM 배지 의 2 mL을 조심스럽게 추가하고 접시를 인큐베이터에 다시 넣습니다.
- 형질 완충제(200 μL/well)로 튜브를 준비하고, pMTE1A DNA, 소용돌이 의 2 μg를 추가한 다음 2 μL의 트랜스펙트 시약을 추가합니다. 소용돌이를 다시 하고 실온에서 10분 동안 배양합니다.
- 인큐베이터에서 플레이트를 제거하고 조심스럽게 경질 혼합물을 드롭 와이즈로 추가합니다.
- HEK293 안정셀에, 형질 전환 후 넥4 발현 유도 6h에 테트라사이클린(0.5 μg/mL)을 추가한다. 중간 변경은 필요하지 않습니다.
참고: 이 섹션에 설명된 볼륨/금액은 하나 만입니다. 동일한 튜브의 실험에 사용되는 모든 우물에 대한 혼합물을 준비합니다. - EGFP또는 플라스미드를 발현하는 다른 플루오로포어를 사용하여 경질 효율을 추정할 수 있는 우물 하나를 준비한다. 더 나은 결과는 적어도 40%의 경질 효율로 관찰될 수 있습니다, 그러나 더 낮은 경질 효율을 가진 좋은 성과는 이전에 관찰되었습니다.
- co-transfection (이자 단백질 및 미니 진)을 사용하는 경우 내인성 mRNA에서 결과를 얻는 것을 피하기 위해 비 트랜스 감염 된 세포와 잘 유지합니다. E1A의 경우, HEK293 세포는 이미 E1A유전자(30)를발현한다.
3. 약물 준비
참고: 치료의 시간과 농도는 일부 유전자에 대 한 대체 접합에 변화를 지적 하는 문학 결과에 따라 선택 되었다.
- 세포 생존가능성에 영향을 미치지 않고 대체 접합 유도에 대한 최소한의 농도를 결정하기 위해 분석서를 시작하기 전에 용량 반응 곡선을 수행한다.
- 에탄올농도 5m농도에서 파클리탁셀 스톡 솔루션을 준비한다. 최종 농도는 1 μM입니다. -20 °C에서 보관하십시오. 0.02%의 에탄올을 차량 제어로 사용하십시오.
- 약 0.5 mg/mL(1.66mMMM)에서 0.9% NaCl에서 희석하여 시스플라틴 용액을 준비한다. 30분 동안 37°C의 온천탕에서 빛, 소용돌이로부터 보호하고 인큐베이션을 즐기실 수 있습니다. 최종 농도는 30 μM입니다. 한 달까지 2-10 °C에서 신선하거나 저장하십시오.
참고: 모든 약물은 빛으로부터 보호되어야 합니다.
4. 세포 치료 및 수집
참고: HEK293 안정세포는 48시간 후 경질 후 48h를 수집하였고, 이를 위해 가장 높은 Nek4 발현 수준이 48h 이내에 달성되었기 때문에 형질 전환 후 24시간 처리되었다. 그러나, 13S 등포형 표현식(90%까지)의 높은 수준을 이 때 관찰하였다. 13S 이소폼의 비율을 줄이려면, 최대 감속 후 세포를 30시간 치료하고 수집해 보십시오.
- RNA/DNase 무료 팁과 튜브를 사용하십시오. 제조 업체의 권고에 따라 페놀 클로로폼 시약으로 총 RNA 추출을 수행합니다.
- 24 h의 형광 후 형광 현미경을 사용하여 세포 형태및 형질 성체 효율을 확인합니다.
- 진공 펌프 시스템 대신 파이펫을 사용하여 셀 배양 배지를 제거합니다. 그런 다음 이전에 설명된 최종 농도에서 화학요법을 가진 세포 배양 배지를 추가한다.
- 37 °C에서 인큐베이션, 18 - 24 h에 대한 5 % CO2.
- 용기에 세포 배양 배지를 버리고 0.5-1 mL의 RNA 추출 시약을 우물에 직접 첨가하여 RNA를 수집한다. 우물이 매우 혼잡한 경우 RNA 추출 시약 1mL을 사용하여 RNA 품질을 개선하십시오.
- 파이펫으로 균질화하고 1.5 mL 원심분리기 튜브로 이송합니다. 이 시점에서, 프로토콜은 -80°C에서 샘플을 저장하여 일시 중지하거나 RNA 추출로 즉시 진행할 수 있다.
경고: 페놀 계 RNA 추출 시약은 독성이 있으며 모든 절차는 화학 연기 후드에서 수행되어야하며 잔류물이 제대로 폐기되어야합니다.
5. RNA 추출 및 cDNA 합성
- 연기 후드에서 샘플을 해동하고 실온에서 5 분 동안 배양합니다. 0.1 -0.2mL의 클로로폼을 넣고 적극적으로 교반합니다.
- 실온에서 3분 동안 배양하십시오.
- 원심분리기는 12,000 x g 및 4°C에서 15분 동안 가능합니다.
- 상부 수성 단계를 수집하고 새로운 1.5 mL 원심분리기 튜브로 이송하십시오. 총 볼륨의 약 60%를 수집합니다. 그러나 DNA 또는 유기(lower) 위상을 수집하지 마십시오.
- 0.25 - 0.5mL의 이소프로판올을 넣고 반전으로 4회 동요합니다. 실온에서 10분 동안 배양하십시오.
- 원심분리기는 12,000 x g에서 10분 동안 4°C에서 슈퍼네티드를 폐기합니다.
- RNA 펠릿을 에탄올로 두 번 세척하십시오(디틸피로카보네이트(DEPC)의 75%는 처리된 물). 원심분리기는 7,500 x g에서 5분 동안 에탄올을 폐기합니다.
- 수건 종이에 튜브를 반전시켜 과도한 에탄올을 제거한 다음 튜브를 연기 후드 내부에 열어 놓고 5-10분 동안 펠릿을 부분적으로 건조시하십시오.
- DEPC 처리된 물의 15 μL에서 RNA 펠릿을 다시 중단합니다.
- RNA 품질을 확인하기 위해 230nm, 260nm 및 280 nm에서 흡수도를 사용하여 총 RNA를 정량화합니다.
- 총 RNA 품질을 확인하려면 30분31분동안 2.5%의 하이포염염 염화나트륨 용액의 1.2%(v/v)로 미리 처리된 1% 아가로즈 젤을 실행한다.
- 총 RNA의 1-2 μg를 사용하여 cDNA 합성을 수행합니다.
- 파이펫 RNA, 올리고 dT(50 μM)의 1μL, dNTP(10mMM)의 1μL및 뉴클레아제 프리 워터로 12 μL까지 부피를 구성한다. 65°C에서 5분 동안 열순환기에서 배양합니다.
- 열순환기에서 샘플을 제거하여 분해하고 반응 혼합물을 준비하십시오: 역전사 버퍼 4μL, 디티오스리톨 2μL(DTT), 리보누벨리스 억제제 1μL. 37°C에서 2분 동안 배양합니다.
- 열 안정성 역전사 1μL을 추가합니다. 37°C에서 50분 동안 배양하고 효소를 70°C에서 15분 동안 비활성화합니다.
참고: cDNA는 몇 주 동안 -20°C로 저장할 수 있습니다. 퍼티트 인트론 보존 이벤트 차별으로부터 유전체 오염에 대한 비역 전사(NRT) 제어를 수행한다.
6. pMTE1A 미니진 PCR
- 반응 구성(MgCl2의1.5mM, dNTP 믹스의 0.3mM, 각 프라이머의 0.5 μM, 핫스타트 타크 폴리머라제2.5U, cDNA 150ng)로 PCR을 수행한다.
94°C 2분, 29사이클: 1분 동안 94°C, 2분 동안 50°C, 2분 동안 72°C, 10분 동안 72°C. - 핵산 얼룩을 함유한 3% 아가로즈 젤에 PCR 제품의 20-25 μL을 적재하고 약 1시간 동안 100V에서 실행한다.
7. 이미지 처리 및 분석 소프트웨어를 사용하여 젤분석(32)
- 실행 후, 모든 대역 채도를 피하고 이미지 처리 소프트웨어를 사용하여 밴드를 정량화하는 젤 (젤 이미징 수집 시스템을 사용하여)을 촬영합니다.
- 정량화를 위해 각각 13S, 12S 및 9S 등산에 대응하는 ~631 bp, ~493 bp 및 ~156 bp에서 밴드를 고려한다.
- 소프트웨어의 파일 메뉴에서 이미징 수집 시스템에서 얻은 이미지 파일을 엽니다. 그레이스케일로 변환하고 밝기와 대비를 조정하고 필요한 경우 이상치 노이즈를 제거합니다.
- 사각형 선택 도구를 사용하여 첫 번째 차선 주위에 사각형을 그리고 분석 | 통해 선택합니다. 젤 | 첫 번째 차선 명령을 선택하거나 키보드 바로 가기를 눌러 선택합니다.
- 마우스를 사용하여 첫 번째 차선의 사각형 가운데를 클릭하고 길게 잡고 다음 차선으로 드래그합니다. | 분석으로 이동 젤 | 다음 차선을 선택하거나사용 가능한 바로 가기를 누릅니다. 이 단계를 남은 모든 차선으로 반복합니다.
- 모든 차선이 강조 표시되고 번호가 매겨진 후 | 분석으로 이동합니다. 젤 | 각 차선의 프로파일 플롯을 그리도록 차선을 플롯합니다.
- 직선 선택 도구를 사용하면 각 대역에 해당하는 각 피크의 베이스를 가로질러 배경을 잡음이 남깁니다. 모든 차선에서 모든 피크가 닫힌 후 지팡이 도구를 선택하고 각 피크 내부를 클릭합니다. 강조 표시된 각 피크에 대해 나타나는 결과 창에 측정값이 나타납니다.
- 각 샘플의 모든 3 대역에서 강도를 합산하고 합계에 비해 각 등색에 대한 백분율을 계산합니다.
- 각 등도형의 백분율 또는 처리되지 않은 샘플에 비해 백분율의 차이를 플롯합니다.
참고: 세 개의 E1A 변형합계가 100%와 같아야 합니다.
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Representative Results
E1A 미니진을 이용한 5' 스플라이스 부위 분석이 화학요법 박람회 후 세포에서 접합 프로필의 변화를 평가하기 위해 수행되었다. Nek4-isoform 1의 HEK293 안정세포에서 의 한층 형성1이 파클리탁셀 또는 시스플라틴 처리 후 평가되었다.
Adenoviral E1A 지역은 다른 스플라이스 기증자의 사용 때문에 1개의 RNA 전구체에서 3개의 주요 mRNAs의 생산을 책임집니다. 그들은 공통 5'와 3 '테르미니를 공유하지만, 그들의 절제 된 인트론의 크기는 다릅니다. Adenoviral E1A mRNAs는 퇴적계 계수, 13S, 12S 및 9S에 따라 명명됩니다. 아데노바이러스 감염(약 7시간)의 초기 단계에서 바이러스 DNA 복제를 위해 감염된 세포를 준비하는 데 중요한 단백질이 생성되고(13S-723 aa 및 12S-586 aa) 및 후반기(약 18h)에서 작은단백질(9S-249 aa)이 생성된다. E1A로부터 미니진을 함유하는 플라스미드를 사용하여, 대체 접합에 미치는 영향은 생성된 각 등동포로부터 mRNA의 비율을 평가하는 트랜스페션 후 세포에서 관찰될 수 있다: 13S: 631bp, 12S: 493bp 및 9S 156bp(그림1A 및 B).
E1A 이체의 기저식 발현은 E1A 발현의 세포주 및 시간에 따라 달라집니다. HEK293-안정형 세포주(HEK293-플래그) 또는 HEK293 재조합 부위(HEK293-FRT-원래 세포주)가 13S 및 12S 의 유사한 수준을 보이는 HeLa 세포(HeLa-PLKO)와 비교하여 13S의 더 높은 발현을 나타낸다는 것을 관찰하였다.11.41.11 의이후에도 유사한 수준을 나타낸다.
HEK293 안정세포에서 관찰된 13S 발현의 높은 수준은 E1A 발현(약 30시간)의 짧은 시간 하에서 상당히 감소된다. 30시간 48시에 13S:12S:9S의 비율(%) 각각 60:33:7 및 80:15:5입니다(제시되지 않은 데이터). 이러한 이유로, 실험을 시작하기 전에 기저 세포 미니진 E1A 접합 프로파일을 특성화하는 것이 중요하다.
시스플라틴에 노출된 세포는 12S 발현(치료되지 않은 세포에 비해 약 15% 증가)을 선호하는 5'SS 접합 선택에 변화를 보였다. 이러한 효과는 HEK293에서 안정적으로 플래그 빈 벡터뿐만 아니라 Nek4의 등색도 1을 발현하는 것으로 관찰되었다. 표현식 백분율에서 주요 변경 사항이 관찰되면 백분율이 있는 플롯이 결과를 명확하게나타냅니다(그림 2).
치료에 반응하는 두 가지 조건(Flag 및 Nek4 과발현)을 비교할 때, 일반적으로 데이터를 나타내는 가장 좋은 방법은 기저 식이 서로 다를 수 있고 백분율이 치료의 실제 효과를 반영하지 않기 때문에 그래프에 차이를 플로팅하는 것입니다. 이는 도 3에서관찰할 수 있다. 파클리탁셀 처리 후 AS의 변화는 매우 이산적이었지만, 변화의 방향은 플래그와 Nek4발성 세포에서 반대였다.
치료 후 작은 변화에도 불구하고, 결과는 일관되었으며, 파클리탁셀 치료가 13S 이소형태의 감소로 이어지고, 플래그 발현 세포에서 12S 및 9S의 증가와 함께, 반면, Nek4에서 세포를 발현하는 동안, 반대의 효과가 관찰된다.
도 1: 미니진 E1A 접합 패턴은 세포주에 따라 다릅니다. A)미니진 E1A 접합 사이트의 회로도 표현. 화살표는 미니진 E1A 상류체 증폭에 대한 프라이머 어닐링 영역을 나타낸다. B)미니진 E1A의 대체 접합으로부터 생성된 동위원. C)HEK293 안정적으로 발현플래그 빈 벡터(HEK293-플래그), PLKO 벡터(HeLa-PLKO) 또는 HEK293 재조합 함유 부위(HEK293안정적으로 플래그 또는 Nek4.1을 발현하는 것로부터 - HEK293-FRT)가 pMAmid1로 감염되었다. 48h 경질 후 총 RNA가 분리되었고 E1A 동소형태는 아가로즈겔(D)으로분리되었다. HEK293-플래그 및 HeLa-PLKO 세포에서 13S, 12S 및 9S 이소폼의 백분율을 기초 조건 하에서 비교하는 그래프. 세 가지 독립적인 실험의 데이터입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 미니진 E1A 접합 패턴으로 시스플라틴 치료의 효과. HEK293 안정적으로 플래그 빈 벡터(Flag) 또는 Nek4.1 플래그 태그가 융합된 pMTE1A 플라스미드로 변형하였다. 트랜스펙트 테트라사이클린 이6시간 후 단백질 발현 유도에 첨가되었다. 24시간 48시간, 세포 배양 배지는 시스플라틴의 30μM를 함유하는 배지로 대체되었다. 24h의 인큐베이션 후, 총 RNA를 추출하고 PCR의 제품이 3% 아가로즈 젤로 분리되었다. A)우세한 미니진 E1A 동소형태가 묘사된다. 그래프 B-D는 세 가지 변형(13S, 12S 및 9S)의 합에 비해 각 등쪽의 %를 나타냅니다. E에서,각 등도포에 대한 발현의 백분율의 차이는 차량(medium) 제어에 따라 제시된다. 그래프는 세 가지 독립적 인 실험의 평균 및 SEM으로 제공됩니다. * p< 0.05, ** p<0.01 페어링되지 않은 t 테스트. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 미니진 E1A 접합 패턴에서 파클리탁셀 치료의 효과. HEK293 안정적으로 플래그 빈 벡터(Flag) 또는 Nek4.1 플래그 융합, pMTE1A 플라스미드로 변형하였다. 트랜스펙트 테트라사이클린 이6시간 후 단백질 발현 유도에 첨가되었다. 24h ~48h, 세포 배양 배지는 차량 제어로 사용되는 파클리탁셀 또는 에탄올(0.02%)의 1μM을 함유한 배지로 대체되었다. 24h의 인큐베이션 후, 총 RNA를 추출하고 PCR의 제품이 3% 아가로즈 젤로 분리되었다. A)우세한 등소형태가 묘사됩니다. 그래프 B-D는 세 가지 변형(13S, 12S 및 9S)의 합에 비해 각 등쪽의 %를 나타냅니다. E에서,각 등도포에 대한 발현의 백분율의 차이는 차량(ethanol) 제어에 따라 제시된다. 그래프는 세 가지 독립적 인 실험의 평균 및 SEM으로 제공됩니다. * p< 0.05 페어링되지 않은 t 테스트. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
Minigenes는 생체 내에서 접합되는 글로벌 대체 품에 있는 효력을 결정하는 중요한 공구입니다. 아데노바이러스 미니진 E1A는 세포13,14에서이들의 양을 증가시킴으로써 단백질의 역할을 평가하기 위해 수십 년 동안 성공적으로 사용되어 왔다. 여기서는 화학요법 노출 후 대체 접합을 평가하기 위한 미니진 E1A 사용을 제안합니다. Nek4 isoform 1을 발현하는 안정적인 세포주가 사용되어 일시적인 과발성 으로 인한 과발현의 아티팩트를 피했습니다. Nek4의 동위 체형 1은 기저조건(21)에서접합하는 미니진 E1A 대안에 효과를 나타내지 않았지만, 많은 접합 관련 인터랙터가 있어 이러한 세포에서 E1A 대안접합에 있어서 화학요법 치료의 특정 효과를 평가할 수 있게 되었다.
낮은 감도에도 불구하고, 주로 방사성 접근법에 비해, 여기에 설명 된 방법은 간단하고 특별한 시약이나 실험실 조건을 필요로하지 않습니다. 그러나 미니진 E1A는 5가지 SS 선택의 글로벌 리포터이지만, 3의 SS 선택은 이 프로토콜로 평가될 수 있지만 특정 미니진 리포터는14,33,34를사용해야 한다. 더욱이, 결과는 세포주에 의해 영향을 받을 수 있고 기저대체 접합 프로파일 때문에 오해를 피하기 위하여 주의 깊게 평가되어야 한다.
일반적으로, 미니진 E1A 접합 패턴의 큰 차이는 접합 인자의 표현을 변경할 때만 관찰된다. 그밖 변경은 이 요인의 활동을 변조하는 단백질의 다수 때문에 보다 적게 명백합니다. 이러한 이유로, 간접 후보에 대 한 연구를 시작할 때, 고전적인 접근, 이 후보 단백질의 증가 금액에 따라 선호 되어야 한다. 일부 효과가 관찰될 때, 조절이 특정 세포 자극에 특이적일 수 있는지 탐구하기 위하여 처리를 수행할 수 있습니다.
예비 양성 결과 후, 시간 및 약물 농도의 표준화는 실험을 최적화하기 위해 수행될 수 있다.
이 간단한 프로토콜은 예비 분석, 관심의 단백질이 대체 접합에 있는 효력을 보여줍니다 또한, 또한, 대체 접합 규칙에 있는 몇몇 효력이 이미 알려지면, 단백질이 화학요법 반응에 있는 대체 접합을 통제하는 역할을 하는 더 일관된 통로에 연구를 지시할 수 있는 출발점입니다.
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Disclosures
저자는 경쟁적인 재정적 이익이 없다고 선언합니다.
Acknowledgments
우리는 Fundação 드 Amparo 페스타도 데 상파울루 (FAPESP, 그랜트 Temático 를 통해 2017/03489-1 JK와 FLB 2018/05350-3) 및 Conselho Nacional desenvolvimento Cientifico e.tientifico e.에 대한 연구(CNPgico) 우리는 E1A 복제에서 자신의 작품에 대한 pMTE1A 플라스미드와 제러와 동료를 제공 박사 애드리안 Krainer에게 감사드립니다. 우리는 또한 Patrícia Moriel 교수, 완다 페레이라 알메이다 박사, 마르셀로 란셀로티 교수, 카리나 코고 코고 뮐러 교수에게 감사드리며 실험실 공간과 장비를 사용할 수 있게 해 주었습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 pb DNA Ladder | Invitrogen | 15628-050 | |
| 6 wells plate | Sarstedt | 833920 | |
| Agarose | Sigma | A9539-250G | |
| Cisplatin | Sigma | P4394 | |
| DEPC water | ThermoFisher | AM9920 | |
| DMEM | ThermoFisher | 11965118 | |
| dNTP mix | ThermoFisher | 10297-018 | |
| Fetal Bovine Serum - FBS | ThermoFisher | 12657029 | |
| Fluorescent Microscope | Leica | DMIL LED FLUO | |
| Gel imaging acquisition system - ChemiDoc Gel Imagin System | Bio-Rad | ||
| GFP - pEGFPC3 | Clontech | ||
| HEK293 stable cells - HEK293 Flp-In | Generated from Flp-In™ T-REx™ 293 - Invitrogen and described in ref 21 | ||
| Hygromycin B | ThermoFisher | 10687010 | Used for Flp-In cells maintenemant |
| Image processing and analysis software - FIJI software | ref. 32 | ||
| Lipid- based transfection reagent - jetOPTIMUS Polyplus Reagent | Polyplus | 117-07 | |
| Oligo DT | ThermoFisher | 18418020 | |
| Paclitxel | Invitrogen | P3456 | |
| Plate Reader/ UV absorbance | Biotech | Epoch Biotek/ Take3 adapter | |
| pMTE1A plasmid | Provided by Dr. Adrian Krainer | ||
| pMTE1A F | Invitrogen | 5’ -ATTATCTGCCACGGAGGTGT-3 | |
| pMTE1A R | Invitrogen | 5’ -GGATAGCAGGCGCCATTTTA-3’ | |
| Refrigerated centrifuge | Eppendorf | F5810R | |
| Reverse Transcriptase - M-MLV | ThermoFisher | 28025013 | |
| Reverse transcriptase - Superscript IV | ThermoFisher | 18090050 | |
| Ribunuclease inhibitor RNAse OUT | ThermoFisher | 10777-019 | |
| RNA extraction phenol-chloroform based reagent - Trizol | ThermoFisher | 15596018 | |
| SybrSafe DNA gel stain | ThermoFisher | S33102 | |
| Taq Platinum | Thermo | 10966026 | |
| Tetracyclin | Sigma | T3383 | Used for Flag empty or Nek4- Flag expression induction |
| Thermocycler Bio-Rad | Bio-Rad | T100 | |
| Trypsin | Sigma | T4799 |
References
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