Summary
Denne protokollen presenterer et raskt og nyttig verktøy for å evaluere rollen til et protein med ukarakterisert funksjon i alternativ skjøteregulering etter kjemoterapeutisk behandling.
Abstract
mRNA-behandling innebærer flere samtidige trinn for å forberede mRNA for oversettelse, for eksempel 5'capping, poly-A addisjon og skjøting. Foruten konstituerende skjøting, tillater alternativ mRNA-skjøting uttrykket av multifunksjonelle proteiner fra ett gen. Siden interaktivitetsstudier generelt er den første analysen for nye eller ukjente proteiner, er foreningen av agnproteinet med skjøtefaktorer en indikasjon på at det kan delta i mRNA-skjøteprosessen, men å bestemme i hvilken sammenheng eller hvilke gener som er regulert er en empirisk prosess. Et godt utgangspunkt for å evaluere denne funksjonen er å bruke det klassiske minigene verktøyet. Her presenterer vi den adenovirale E1A minigene-bruken for evaluering av de alternative skjøteendringene etter forskjellige cellulære stressstimuli. Vi evaluerte skjøtingen av E1A minigene i HEK293 stabilt overekspresserende Nek4-protein etter ulike stressende behandlinger. Protokollen inkluderer E1A minigene transfeksjon, cellebehandling, RNA-ekstraksjon og cDNA-syntese, etterfulgt av PCR- og gelanalyse og kvantifisering av de skjøtede variantene av E1A. Bruken av denne enkle og veletablerte metoden kombinert med spesifikke behandlinger er et pålitelig utgangspunkt for å belyse cellulære prosesser eller hvilke gener som kan reguleres av mRNA-skjøting.
Introduction
Skjøting er blant de viktigste trinnene i eukaryotisk mRNA-behandling som skjer samtidig til 5'mRNA capping og 3'mRNA polyadenylering, bestående av intronfjerning etterfulgt av exon junction. Anerkjennelsen av skjøteplassene (SS) av skjøteosomet, et ribonucleoproteinkompleks som inneholder små ribonukleoproteiner (snRNP U1, U2, U4 og U6), små RNAer (snRNAer) og flere regulatoriske proteiner1 er nødvendig for skjøting.
Foruten intronfjerning (konstituerende skjøting), i eukaryoter, kan introner beholdes og eksoner kan utelukkes, og konfigurerer prosessen som kalles mRNA alternativ skjøting (AS). Den alternative pre-mRNA skjøtingen utvider kodingskapasiteten til eukaryote genomer slik at produksjonen av et stort og mangfoldig antall proteiner fra et relativt lite antall gener. Det er anslått at 95-100% av menneskelige mRNAer som inneholder mer enn en exon kan gjennomgå alternativ skjøting2,3. Dette er grunnleggende for biologiske prosesser som nevronutvikling, apoptoseaktivering og cellulær stressrespons4, og gir organismealternativene for å regulere cellefunksjon ved hjelp av samme repertoar av gener.
Maskinene som er nødvendige for alternativ skjøting er det samme som brukes til konstituerende skjøting, og bruken av SS er hoveddeterminanten for alternativ skjøteforekomst. Konstituerende skjøting er relatert til bruk av sterke skjøteplasser, som vanligvis ligner mer på konsensusmotiver for skjøtemosomgjenkjenning5.
Alternative eksoner er vanligvis anerkjent mindre effektivt enn konstitutive eksoner når dens cis-regulatoriskeelementer, sekvensene i 5'SS og 3'SS flanking disse exons, viser en dårligere bindende kapasitet til skjøteosomet. mRNA inneholder også regioner som kalles forsterkere eller lyddempere plassert i eksoner (eksoniske skjøteforsterkere (ESE) og eksoniske skjøte lyddempere (ESSs)) og introner (introniske skjøteforsterkere (ISE) og introniske skjøte lyddempere (ISSs)) som forbedrer eller undertrykker eksonbruk, henholdsvis5. Disse sekvensene gjenkjennes av transregulatoriske elementer, eller skjøtefaktorer (SF). SFs er representert hovedsakelig av to familier av proteiner, serin / arginin rike skjøtefaktorer (SRSFer) som binder seg til ESE og familien av heterogene kjernefysiske ribonukleoproteiner (hnRNPer) som binder seg til ESSs-sekvenser5.
Alternativ skjøting kan moduleres ved fosforylering/ defosforylering av transfaktorer som endrer interaksjonspartnerne og cellulær lokalisering av skjøtefaktorer6,7,8. Identifisering av nye regulatorer av skjøtefaktorer kan gi nye verktøy for å regulere skjøting og følgelig noen kreftbehandlinger.
Anufrieva et al.9, i en mRNA mikroarray genuttrykksprofil, observerte konsistente endringer i nivåer av spleiseosomale komponenter i 101 cellelinjer og etter forskjellige stressforhold (platinabaserte legemidler, gammabestråling, topoisomerasehemmere, tyrosinkinasehemmere og taxanes). Forholdet mellom skjøtemønster og kjemoterapi effekt er allerede vist i lungekreftceller, som er kjemoterapi resistente, viser endringer i caspase-9 varianter rate10. HEK293 celler behandlet med kjemoterapeutisk panel viser endringer i skjøting med en økning i pro-apoptotiske varianter. Gabriel et al.11 observerte endringer i minst 700 tilfeller av skjøting etter cisplatinbehandling i forskjellige cellelinjer, og påpekte at skjøtebaner er cisplatin-påvirket. Skjøtemodulatorer har allerede vist anti-tumoral aktivitet, som viser at skjøting er viktig for tumorutvikling og hovedsakelig kjemoterapirespons12. Derfor er karakterisering av nye proteiner som regulerer skjøting etter cellulære stressorer, som kjemoterapeutiske midler, svært viktig for å oppdage nye behandlingsstrategier.
Ledetrådene om alternativ skjøteregulering fra interaktivitetsstudier, spesielt viktig for å karakterisere funksjoner av nye eller ukarakteriserte proteiner, kan kreve en mer generell og enkel tilnærming for å verifisere proteinets reelle rolle i AS. Minigenes er viktige verktøy for analyse av den generelle rollen til et protein som påvirker skjøtereguleringen. De inneholder segmenter fra et gen av interesse som inneholder alternativt spleisede og flankende genomiske regioner13. Ved hjelp av et minigene verktøy tillater analysen av skjøting in vivo med flere fordeler som lengden på minigene som er mindre og derfor ikke er en begrensning i forsterkningsreaksjonen; den samme minigene kan evalueres i forskjellige cellelinjer; alle cellulære komponenter, hovedsakelig deres regulerende post-translasjonsmodifikasjon (fosforylering og endringer i cellerom) er til stede og kan adresseres13,14. Videre kan endringer i alternativt skjøtemønster observeres etter cellulært stress og, bruken av et minigensystem, tillate å identifisere banen som moduleres av forskjellige stimuli.
Det er flere minigene systemer som allerede er beskrevet som er spesifikke for ulike typer skjøtehendelser13,14, men som en foreløpig analyse er minigeneE1A 15 et meget godt etablert alternativt skjøtereportersystem for studiet av 5'SS utvalg in vivo. Fra bare ett gen, E1A, produseres fem mRNAer ved alternativ skjøting basert på utvalg av tre forskjellige 5′ skjøteplasser og av en stor eller en mindre 3′ skjøte sted16,17,18. Uttrykket av E1A-varianter endres i henhold til perioden for Adenoviral infeksjon19,20.
Vi har tidligere vist at både Nek4 isoformer samhandler med skjøtefaktorer som SRSF1 og hnRNPA1, og mens isoform 2 endrer minigene E1A alternativ skjøting, isoform 1 har ingen effekt i at21. Fordi isoform 1 er den mest tallrike isoformen og endrer kjemoterapimotstand og DNA-skaderespons, vurderer vi om det kan endre minigene E1A alternativ skjøting i en stresstilstand.
Minigene analyser er en enkel, rimelig og rask metode, siden den bare trenger RNA-ekstraksjon, cDNA-syntese, forsterkning og agarosegelanalyser, og kan være et nyttig verktøy for å evaluere siden en mulig effekt på alternativ skjøting av et protein av interesser til effekten av forskjellige behandlinger på cellulært alternativt skjøtemønster.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Plating celler
MERK: I denne beskrevne protokollen ble HEK293 stabile cellelinjer, tidligere generert for stabilt inducible uttrykk for Nek4, brukt21, men den samme protokollen passer for mange andre cellelinjer, for eksempel HEK29322, HeLa23,24,25,26, U-2 OS27, COS728, SH-SY5Y29. Uttrykksmønsteret til minigene E1A-isoformer under basale forhold varierer mellom disse cellene og bør karakteriseres for hver tilstand. Denne protokollen er ikke begrenset til stabile cellelinjer. Den vanligste tilnærmingen i evaluering av kandidatprotein er ved forbigående samtransfeksjon av å øke mengden med fast mengde av minigene. Den samme protokollen er egnet for knockout-celler.
- Plateceller vurderer kjøretøy, utransfected og GFP kontroller.
- Kultur HEK293 celler med stabilt uttrykk for genet av interesse i Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) supplert med 10% av Fetal Bovine Serum (FBS), 4.5 g/L Glukose, 4 mM L-Glutamin og opprettholde med 100 μg/ml hygromycin B, på vevskulturbehandlede plater ved 37 °C i 5 % CO2 og en fuktig atmosfære.
- Del celler ved hjelp av 0,25 % trypsin-EDTA. Plate 3 x 105 celler i 6-brønns plater og inkuber dem i 24 timer ved 37 °C i 5 % CO2.
MERK: For transfeksjon må cellene være 70-80% sammenfallende for å redusere celledød etter transfeksjonen.
2. Celletransfeksjon
MERK: 1-2 μg pMTE1A minigene plasmid ble brukt her, men DNA-mengden, så vel som uttrykkstidspunktet, må holdes på minimalt for å unngå toksisitet. For eksempel ble det observert høy toksisitet i HeLa-celler etter 30 timers transfeksjon med 1 μg pMTE1A DNA. For transfeksjonen som er beskrevet her, ble et lipidbasert transfeksjonsreagens brukt
- Kontroller cellesammenløpet 24 timer etter plating og transfekt HEK293 stabile celler bare når 70-80% sammenfallende.
- Fjern cellekulturmediet forsiktig med en pipette, i stedet for å bruke et vakuumpumpesystem. Tilsett deretter forsiktig 2 ml komplett DMEM-medium uten antibiotika og legg platen tilbake i inkubatoren.
- Forbered et rør med transfeksjonsbufferen (200 μL /brønn), tilsett 2 μg pMTE1A DNA, virvel og tilsett deretter 2 μL transfeksjonsreagens. Virvel igjen og inkuber i 10 min ved romtemperatur.
- Fjern plater fra inkubatoren og legg forsiktig til transfeksjonsblandingen dråpevis.
- Til HEK293 stabile celler, tilsett tetracyklin (0,5 μg/ml) for Nek4-uttrykksinduksjon 6 timer etter transfeksjonen. Middels endring er ikke nødvendig.
MERK: Volumer/beløp som er beskrevet i denne delen, er for én brønn. Forbered blandingen for alle brønner som brukes i eksperimentet i samme rør. - Forbered en brønn for å transfektere med EGFP, eller en annen fluorofor som uttrykker plasmid for å estimere transfeksjonseffektiviteten. Bedre resultater kan observeres med transfeksjonseffektivitet på minst 40%, men gode ytelser med lavere transfeksjonseffektivitet ble tidligere observert.
- Ved bruk av co-transfection (renteprotein og minigene) hold en brønn med ikke-transfected celler for å unngå å oppnå resultater fra endogen mRNA. Når det gjelder E1A, uttrykker HEK293-celler allerede E1A-genet30.
3. Klargjøring av stoffene
MERK: Tiden og konsentrasjonen av behandling ble valgt basert på litteraturresultater, som påpeker endringer i alternativ skjøting for noen gener.
- Utfør en doseresponskurve før du starter analysen for å bestemme den minimale konsentrasjonen til alternativ skjøteinduksjon uten effekt i celle levedyktighet.
- Forbered en Paclitaxel lagerløsning ved 5 mM konsentrasjon i etanol. Den endelige konsentrasjonen er 1 μM. Hold ved -20 °C. Bruk 0,02% etanol som kjøretøykontroll.
- Forbered en cisplatinløsning ved å fortynne i 0,9% NaCl ved rundt 0,5 mg / ml (1,66 mM). Beskytt mot lys, virvel og inkuber i et termisk bad, 37 °C i 30 minutter. Den endelige konsentrasjonen er 30 μM. Forbered fersk eller oppbevar ved 2-10 °C i inntil en måned.
MERK: Alle legemidler må beskyttes mot lyset.
4. Cellebehandling og innsamling
MERK: HEK293 stabile celler ble samlet inn 48 timer etter transfeksjonen og for dette ble behandlet 24 timer etter transfeksjonen fordi det høyeste Nek4-uttrykksnivået oppnås innen 48 timer. Imidlertid ble høye nivåer av 13S isoformuttrykk (til 90%) observert på dette tidspunktet. For å redusere andelen 13S isoform, prøv å behandle og samle celler 30 timer etter transfeksjon maksimum.
- Bruk RNA/DNase gratis tips og rør. Utfør total RNA-ekstraksjon med fenol-kloroform reagens etter produsentens anbefaling.
- 24 timer etter transfeksjonen, bekreft cellemorfologi og transfeksjonseffektivitet ved hjelp av et fluorescerende mikroskop.
- Fjern cellekulturmediet, fortrinnsvis ved hjelp av en pipette i stedet for et vakuumpumpesystem. Legg deretter til cellekulturmedium med kjemoterapeutikken i den tidligere beskrevne endelige konsentrasjonen.
- Inkuber ved 37 °C, 5 % CO2 i 18 –24 timer.
- Samle RNA ved å kaste cellekulturmediet i en beholder og tilsett 0,5 - 1 ml RNA ekstraksjonsreagens direkte til brønnen. Hvis brønnene er svært sammenfallende, bruk 1 ml RNA ekstraksjonsreagens for å forbedre RNA-kvaliteten.
- Homogeniser med pipetten og overfør til et 1,5 ml sentrifugerør. På dette tidspunktet kan protokollen settes på pause ved å lagre prøver ved -80 °C eller fortsette umiddelbart til RNA-ekstraksjonen.
ADVARSEL: Det fenolbaserte RNA-ekstraksjonsreagenset er giftig, og alle prosedyrer skal utføres i en kjemisk avtrekkshette og rester avhendes på riktig måte.
5. RNA-ekstraksjon og cDNA-syntese
- I en avtrekkshette tin prøvene og inkuber i 5 min ved romtemperatur. Tilsett 0,1 -0,2 ml kloroform og rør kraftig.
- Inkuber i 3 min ved romtemperatur.
- Sentrifuge i 15 min ved 12 000 x g og 4 °C.
- Samle den øvre vandige fasen og overfør til et nytt 1,5 ml sentrifugerør. Samle rundt 60% av det totale volumet; Men ikke samle DNA eller organisk (lavere) fase.
- Tilsett 0,25 - 0,5 ml isopropanol og agiter ved inversjon 4 ganger. Inkuber i 10 min ved romtemperatur.
- Sentrifuge ved 12.000 x g i 10 min, ved 4 °C og kast supernatanten.
- Vask RNA-pellet to ganger med etanol (75% i dietylpyrokarbonat (DEPC)-behandlet vann). Sentrifuge ved 7500 x g i 5 min og kast etanol.
- Fjern overflødig etanol ved å invertere røret på et håndklepapir og la deretter røret stå åpent inne i en avtrekkshette for delvis å tørke pelletsen i 5 - 10 min.
- Resuspend RNA-pelletsen i 15 μL DEPC-behandlet vann.
- Kvantifisere total RNA ved bruk av absorbans ved 230 nm, 260 nm og 280 nm for å verifisere RNA-kvalitet.
- For å verifisere total RNA-kvalitet, kjør en 1% agarose gel forhåndsbehandlet med 1,2% (v / v) av en 2,5% natriumhypoklorittoppløsning i 30 min31.
- Utfør cDNA-syntese ved hjelp av 1-2 μg totalt RNA.
- Pipette RNA, 1 μL oligo-dT (50 μM), 1 μL dNTP (10 mM) og utgjør volumet til 12 μL med nukleasefritt vann. Inkuber i termosykleren i 5 min ved 65 °C.
- Fjern prøver fra termosykleren for å kjøle ned og forberede reaksjonsblandingen: 4 μL omvendt transkripsjonsbuffer, 2 μL dithiothreitol (DTT) og 1 μL ribonukleasehemmer. Inkuber ved 37 °C i 2 minutter.
- Tilsett 1 μL termostabil omvendt transkripsjon. Inkuber ved 37 °C i 50 minutter og inaktiver enzymet ved 70 °C i 15 minutter.
MERK: CDNA kan oppbevares ved -20 °C i flere uker. Utfør en ikke-omvendt transkripsjonskontroll (NRT) for genomisk kontaminering fra diskriminering av putative intronbevaringshendelser.
6. pMTE1A minigene PCR
- Utfør PCR med reaksjonssammensetningen (1,5 mM MgCl2, 0,3 mM dNTP-blanding, 0,5 μM av hver primer, 2,5 U av en hot-start Taq Polymerase og 150 ng cDNA) med følgende forhold:
94 °C i 2 min, 29 sykluser på: 94 °C i 1 min, 50 °C i 2 minutter, 72 °C i 2 minutter, 72 °C i 10 minutter. - Last 20-25 μL av PCR-produktet i en 3% agarose gel som inneholder nukleinsyreflekk og kjør ved 100 V i ca. 1 time.
7. Analyse av gelen ved hjelp av en bildebehandlings- og analyseprogramvare32
- Etter løpet, fotografi gelen (ved hjelp av en gel bildebehandling oppkjøp system) unngå band metning og kvantifisere båndene ved hjelp av en bildebehandling programvare.
- For kvantifisering bør du vurdere båndene på ~ 631 bp, ~ 493 bp og ~ 156 bp for å tilsvare henholdsvis 13S, 12S og 9S isoforms.
- Åpne bildefilen som er hentet fra bildeinnsamlingssystemet, fra Fil -menyen i programvaren. Konverter til gråtoner, juster lysstyrke og kontrast og fjern om nødvendig ytterstøy.
- Tegn et rektangel rundt den første banen med rektangelmerkingsverktøyet, og det gjennom Analyser | Geler | Velg First Lane-kommandoen, eller ved å trykke hurtigtasten for den.
- Bruk musen til å klikke og holde midt i rektanglet på første kjørefelt og dra den over til neste kjørefelt. Gå til Analysere | Geler | Velg Neste kjørefelt, eller trykk den tilgjengelige snarveien. Gjenta dette trinnet til alle gjenværende baner.
- Når alle banene er uthevet og nummerert, går du til Analyser | Geler | Plot Lanes for å tegne en profilplott av hvert kjørefelt.
- Med markeringsverktøyet Rett linje tegner du en linje over bunnen av hver topp som tilsvarer hvert felt, og utelater bakgrunnsstøyen. Etter at alle toppene, fra hvert kjørefelt, har blitt stengt av, velger du Tryllestavverktøyet og klikker inne i hver topp. For hver topp som er uthevet, skal målinger dukke opp i resultatvinduet som vises.
- Summer intensiteten fra alle de tre feltene for hvert utvalg, og beregn prosenten for hver isoform i forhold til totalen.
- Tegn inn prosentandelene av hver isoform eller forskjellene i prosentandelen i forhold til ubehandlede prøver.
MERK: Kontroller at summen av tre E1A-varianter må være lik 100 %.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En 5' skjøte steder analyse ved hjelp av E1A minigene ble utført for å evaluere endringer i skjøteprofil i celler etter kjemoterapi utstilling. Nek4 - isoform 1s rolle i AS-regulering i HEK293 stabile celler etter at paclitaksel- eller cisplatinbehandling ble evaluert.
Adenoviral E1A-regionen er ansvarlig for produksjon av tre hoved-mRNAer fra en RNA-forløper på grunn av bruk av forskjellige skjøtedonorer. De deler felles 5' og 3' termini, men varierer i størrelsen på deres utskilte introner. Adenoviral E1A mRNAer er navngitt i henhold til deres sedimenteringskoeffisienter, 13S, 12S og 9S. I den tidlige fasen av adenovirusinfeksjon (rundt 7 timer) produseres proteiner som er viktige for å forberede den infiserte cellen for viral DNA-replikasjon (13S - 723 aa og 12S - 586 aa), og i senfasen (rundt 18 timer) i tillegg til de, produseres et lite protein (9S -249 aa)20. Ved hjelp av en plasmid som inneholder minigene fra E1A, kan effekten på alternativ skjøting observeres i celler etter transfeksjonen som evaluerer andelen mRNA fra hver isoform produsert: 13S: 631 bp, 12S: 493 bp og 9S 156 bp (Figur 1A og B).
Basaluttrykket til E1A-isoformvarianter avhenger av cellelinjen og klokkeslettet for E1A-uttrykket. Det ble observert at HEK293-stabil cellelinje (HEK293-Flagg) eller HEK293 rekombininaseholdig sted (HEK293-FRT - den opprinnelige cellelinjen) viser et høyere uttrykk for 13S i forhold til HeLa-celler (HeLa-PLKO) som viser lignende nivåer av 13S og 12S isoformer etter 48 h E1A-uttrykk ( Figur 1C og 12S isoforms etter 48 h E1A-uttrykk (Figur 1C og DC) .
Det høye nivået av 13S-uttrykk observert i HEK293 stabile celler er betydelig redusert under kortere tider av E1A-uttrykk (rundt 30 timer). Andelen (%) av 13S:12S:9S ved 30 t og 48 t er henholdsvis 60:33:7 og 80:15:5 (uforberedte data). Av denne grunn er det viktig å karakterisere den basale cellulære minigene E1A skjøteprofilen før du starter forsøkene.
Celler eksponert for cisplatin viste et skifte i 5'SS skjøtevalg favoriserer 12S uttrykk (en økning på rundt 15% sammenlignet med ubehandlede celler). Denne effekten ble observert i HEK293 stabilt uttrykke Flagg tom vektor samt isoform 1 av Nek4. Når store endringer observeres i prosent av uttrykket, representerer et plott med prosenter tydelig resultatene (Figur 2).
Når du sammenligner to forhold (Flagg og Nek4 overekspression) som reagerer på en behandling, er det vanligvis den beste måten å representere dataene på å plotte forskjellene på en graf, fordi det basale uttrykksnivået kan være forskjellig, og prosentandelene vil ikke gjenspeile den virkelige effekten av behandlingen. Dette kan observeres i figur 3. Endringer i AS etter paclitaxel-behandling var svært diskrete, men retningene for endringene var de motsatte i Flag og Nek4 som uttrykte celler.
Til tross for små endringer etter behandlingen var resultatene konsistente, noe som indikerer at paclitakselbehandlingen fører til en nedgang i 13S isoform, med en økning i 12S og 9S i Flagg som uttrykker celler, mens det derimot i Nek4 uttrykker celler, observeres motsatt effekt.
Figur 1: Minigene E1A skjøtemønster avhenger av cellelinjen. A) Skjematisk representasjon av minigene E1A skjøteområder. Pilene indikerer primer annealing området for minigene E1A isoforms forsterkning. B) Isoformer generert fra alternativ skjøting av minigene E1A. C) HEK293 stabilt uttrykker Flagg tom vektor (HEK293 -Flagg), HeLa transfektert med PLKO vektor (HeLa - PLKO) eller, HEK293 rekombinusholdige steder (fra hva HEK293 stabilt uttrykker Flagg eller Nek4.1 ble generert - HEK293-FRT) ble transfektert med pMTE1A plasmid. 48 timer etter at transfeksjonstotalen RNA ble isolert og E1A-isoformene ble separert i agarosegel (D). Graf som sammenligner prosentandelen av 13S-, 12S- og 9S-isoform i HEK293-Flagg- og HeLa-PLKO-celler under basale forhold. Data fra tre uavhengige eksperimenter. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Effekt av Cisplatinbehandling i minigene E1A skjøtemønster. HEK293 stabilt uttrykker Flagg tom vektor (Flagg) eller Nek4.1 Flagg tag smeltet, ble transfektert med pMTE1A plasmid. Seks timer etter transfeksjon tetracyklin ble lagt til proteiner uttrykk induksjon. 24 timer til 48 timer, cellekulturmediet ble erstattet for medium som inneholder 30 μM Cisplatin. Etter 24 timers inkubasjon ble total RNA ekstrahert og produktene av PCR ble separert ved 3% agarose gel. A) Dominerende minigene E1A-isoformer er avbildet. Grafer B-D representerer % av hver isoform i forhold til summen av tre varianter (13S, 12S og 9S). I Epresenteres forskjellen i uttrykksprosenten til hver isoform i forhold til kjøretøykontroll (middels). Grafer presenteres som gjennomsnitt og SEM for tre uavhengige eksperimenter. * p< 0,05, ** p<0,01 i ubetalt t-test. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Effekt av Paclitaxel-behandling i minigene E1A skjøtemønster. HEK293 stabilt uttrykker Flagg tom vektor (Flagg) eller Nek4.1 Flagg smeltet, ble transfektert med pMTE1A plasmid. Seks timer etter transfeksjon tetracyklin ble lagt til proteiner uttrykk induksjon. 24 timer til 48 timer, cellekulturmediet ble erstattet av medium som inneholder 1 μM Paclitaxel eller etanol (0,02%) brukt som kjøretøykontroll. Etter 24 timers inkubasjon ble total RNA ekstrahert og produktene av PCR ble separert ved 3% agarose gel. A) Dominerende isoformer er avbildet. Grafer B-D representerer % av hver isoform i forhold til summen av tre varianter (13S, 12S og 9S). I Epresenteres forskjellen i prosentandelen av uttrykk til hver isoform i forhold til kjøretøykontroll (etanol). Grafer presenteres som gjennomsnitt og SEM for tre uavhengige eksperimenter. * p< 0,05 i ubetalt t-test. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Minigenes er viktige verktøy for å bestemme effektene i global alternativ skjøting in vivo. Den adenovirale minigene E1A har blitt brukt med hell i flere tiår for å evaluere proteinenes rolle ved å øke mengden av disse i celle13,14. Her foreslår vi minigene E1A-bruk for å evaluere alternativ skjøting etter kjemoterapeutisk eksponering. En stabil cellelinje som uttrykker Nek4 isoform 1 ble brukt, og unngår artefakter av overekspression forårsaket av forbigående transfeksjon. Isoform 1 av Nek4 viste ikke effekt i minigene E1A alternativ skjøting i basale forhold21, men har mange skjøterelaterte interagere, derfor, slik at vi kan evaluere den spesifikke effekten av kjemoterapeutisk behandling i E1A alternativ skjøting i disse cellene.
Til tross for sin lave følsomhet, hovedsakelig sammenlignet med radioaktive tilnærminger, er metoden beskrevet her enkel og krever ikke spesielle reagenser eller laboratorieforhold. Det er imidlertid viktig å merke seg at minigene E1A er en global reporter for 5'SS-valg, selv om 3'SS-valg kan evalueres med denne protokollen, må den spesifikke minigene reporteren brukes14,33,34. Videre kan resultatene påvirkes av cellelinjen og bør vurderes nøye for å unngå feiltolkning på grunn av den basale alternative skjøteprofilen.
Vanligvis observeres store forskjeller i minigene E1A skjøtemønster bare når du endrer uttrykket for skjøtefaktorer. Andre endringer er mindre åpenbare på grunn av det store antallet proteiner som modulerer aktiviteten til disse faktorene. Av denne grunn, når du starter studier for en indirekte kandidat, bør den klassiske tilnærmingen, basert på økende mengder av dette kandidatproteinet, foretrekkes. Når en viss effekt observeres, kan behandlingene utføres for å undersøke om reguleringen kan være spesifikk for en bestemt cellulær stimulans.
Etter et foreløpig positivt resultat kan standardisering av tid og legemiddelkonsentrasjon utføres for å optimalisere eksperimentet.
Denne enkle protokollen er en foreløpig analyse, et utgangspunkt som kan svare på om proteinet av interesse viser en effekt i alternativ skjøting, og også når en viss effekt i alternativ skjøteregulering allerede er kjent, kan lede studiene til den mer konsistente banen der proteinet spiller en rolle som regulerer alternativ skjøting i kjemoterapirespons.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer at de ikke har konkurrerende økonomiske interesser.
Acknowledgments
Vi takker Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP, gjennom Grant Temático 2017/03489-1 til JK og stipendiatstilling til FLB 2018/05350-3) og Conselho Nacional de Desenvolvimento Cientifico e Tecnológico (CNPq) for finansiering av denne forskningen. Vi vil gjerne takke Dr Adrian Krainer for å gi pMTE1A plasmid og Zerler og kolleger for deres arbeid i E1A kloning. Vi takker også professor Dr. Patrícia Moriel, prof. Dr. Wanda Pereira Almeida, prof. Dr. Marcelo Lancellotti og prof. Dr. Karina Kogo Cogo Müller for å tillate oss å bruke laboratorieplassen og utstyret deres.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 pb DNA Ladder | Invitrogen | 15628-050 | |
| 6 wells plate | Sarstedt | 833920 | |
| Agarose | Sigma | A9539-250G | |
| Cisplatin | Sigma | P4394 | |
| DEPC water | ThermoFisher | AM9920 | |
| DMEM | ThermoFisher | 11965118 | |
| dNTP mix | ThermoFisher | 10297-018 | |
| Fetal Bovine Serum - FBS | ThermoFisher | 12657029 | |
| Fluorescent Microscope | Leica | DMIL LED FLUO | |
| Gel imaging acquisition system - ChemiDoc Gel Imagin System | Bio-Rad | ||
| GFP - pEGFPC3 | Clontech | ||
| HEK293 stable cells - HEK293 Flp-In | Generated from Flp-In™ T-REx™ 293 - Invitrogen and described in ref 21 | ||
| Hygromycin B | ThermoFisher | 10687010 | Used for Flp-In cells maintenemant |
| Image processing and analysis software - FIJI software | ref. 32 | ||
| Lipid- based transfection reagent - jetOPTIMUS Polyplus Reagent | Polyplus | 117-07 | |
| Oligo DT | ThermoFisher | 18418020 | |
| Paclitxel | Invitrogen | P3456 | |
| Plate Reader/ UV absorbance | Biotech | Epoch Biotek/ Take3 adapter | |
| pMTE1A plasmid | Provided by Dr. Adrian Krainer | ||
| pMTE1A F | Invitrogen | 5’ -ATTATCTGCCACGGAGGTGT-3 | |
| pMTE1A R | Invitrogen | 5’ -GGATAGCAGGCGCCATTTTA-3’ | |
| Refrigerated centrifuge | Eppendorf | F5810R | |
| Reverse Transcriptase - M-MLV | ThermoFisher | 28025013 | |
| Reverse transcriptase - Superscript IV | ThermoFisher | 18090050 | |
| Ribunuclease inhibitor RNAse OUT | ThermoFisher | 10777-019 | |
| RNA extraction phenol-chloroform based reagent - Trizol | ThermoFisher | 15596018 | |
| SybrSafe DNA gel stain | ThermoFisher | S33102 | |
| Taq Platinum | Thermo | 10966026 | |
| Tetracyclin | Sigma | T3383 | Used for Flag empty or Nek4- Flag expression induction |
| Thermocycler Bio-Rad | Bio-Rad | T100 | |
| Trypsin | Sigma | T4799 |
References
- Ule, J., Blencowe, B. J. Alternative Splicing Regulatory Networks: Functions, Mechanisms, and Evolution. Molecular Cell. 76 (2), 329-345 (2019).
- Pan, Q., Shai, O., Lee, L. J., Frey, B. J., Blencowe, B. J. Deep surveying of alternative splicing complexity in the human transcriptome by high-throughput sequencing. Nature Genetics. 40 (12), 1413-1415 (2008).
- Nilsen, T. W., Graveley, B. R. Expansion of the eukaryotic proteome by alternative splicing. Nature. 463 (7280), 457-463 (2010).
- Stamm, S. Signals and their transduction pathways regulating alternative splicing: a new dimension of the human genome. Human Molecular Genetics. 11 (20), 2409-2416 (2002).
- Kornblihtt, A. R., et al. Alternative splicing: a pivotal step between eukaryotic transcription and translation. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (3), 153-165 (2013).
- Zhong, X. -Y., Ding, J. -H., Adams, J. A., Ghosh, G., Fu, X. -D. Regulation of SR protein phosphorylation and alternative splicing by modulating kinetic interactions of SRPK1 with molecular chaperones. Genes & Development. 23 (4), 482-495 (2009).
- Misteli, T., Cáceres, J. F., Clement, J. Q., Krainer, A. R., Wilkinson, M. F., Spector, D. L. Serine Phosphorylation of SR Proteins Is Required for Their Recruitment to Sites of Transcription In Vivo. Journal of Cell Biology. 143 (2), 297-307 (1998).
- Kanopka, A., et al. Regulation of adenovirus alternative RNA splicing by dephosphorylation of SR proteins. Nature. 393 (6681), 185-187 (1998).
- Anufrieva, K. S., et al. Therapy-induced stress response is associated with downregulation of pre-mRNA splicing in cancer cells. Genome Medicine. 10 (1), 49 (2018).
- Shultz, J. C., et al. SRSF1 Regulates the Alternative Splicing of Caspase 9 Via A Novel Intronic Splicing Enhancer Affecting the Chemotherapeutic Sensitivity of Non-Small Cell Lung Cancer Cells. Molecular Cancer Research. 9 (7), 889-900 (2011).
- Gabriel, M., et al. Role of the splicing factor SRSF4 in cisplatin-induced modifications of pre-mRNA splicing and apoptosis. BMC Cancer. 15, (2015).
- Lee, S. C. -W., Abdel-Wahab, O.
- Cooper, T. A. Use of minigene systems to dissect alternative splicing elements. Methods. 37 (4), 331-340 (2005).
- Stoss, O., Stoilov, P., Hartmann, A. M., Nayler, O., Stamm, S. The in vivo minigene approach to analyze tissue-specific splicing. Brain Research Protocols. 4 (3), 383-394 (1999).
- Zerler, B., et al. Adenovirus E1A coding sequences that enable ras and pmt oncogenes to transform cultured primary cells. Molecular and Cellular Biology. 6 (3), 887-899 (1986).
- Gattoni, R., Schmitt, P., Stevenin, J. In vitro splicing of adenovirus E1A transcripts: characterization of novel reactions and of multiple branch points abnormally far from the 3' splice site. Nucleic Acids Research. 16 (6), 2389-2409 (1988).
- Stephens, C., Harlow, E. Differential splicing yields novel adenovirus 5 E1A mRNAs that encode 30 kd and 35 kd proteins. The EMBO journal. 6 (7), 2027-2035 (1987).
- Ulfendahl, P. J., et al. A novel adenovirus-2 E1A mRNA encoding a protein with transcription activation properties. The EMBO journal. 6 (7), 2037-2044 (1987).
- Berk, A. J., Sharp, P. A. Structure of the adenovirus 2 early mRNAs. Cell. 14 (3), 695-711 (1978).
- Svensson, C., Pettersson, U., Akusjärvi, G. Splicing of adenovirus 2 early region 1A mRNAs is non-sequential. Journal of Molecular Biology. 165 (3), 475-495 (1983).
- Basei, F. L., Meirelles, G. V., Righetto, G. L., dos Santos Migueleti, D. L., Smetana, J. H. C., Kobarg, J. New interaction partners for Nek4.1 and Nek4.2 isoforms: from the DNA damage response to RNA splicing. Proteome Science. 13 (1), 11 (2015).
- Zhou, Z., et al. The Akt-SRPK-SR Axis Constitutes a Major Pathway in Transducing EGF Signaling to Regulate Alternative Splicing in the Nucleus. Molecular Cell. 47 (3), 422-433 (2012).
- Caceres, J., Stamm, S., Helfman, D., Krainer, A. Regulation of alternative splicing in vivo by overexpression of antagonistic splicing factors. Science. 265 (5179), 1706-1709 (1994).
- Zhong, X. -Y., Ding, J. -H., Adams, J. A., Ghosh, G., Fu, X. -D. Regulation of SR protein phosphorylation and alternative splicing by modulating kinetic interactions of SRPK1 with molecular chaperones. Genes & Development. 23 (4), 482-495 (2009).
- Naro, C., et al. The centrosomal kinase NEK2 is a novel splicing factor kinase involved in cell survival. Nucleic Acids Research. 42 (5), 3218-3227 (2014).
- Lu, C. -C., Chen, T. -H., Wu, J. -R., Chen, H. -H., Yu, H. -Y., Tarn, W. -Y. Phylogenetic and Molecular Characterization of the Splicing Factor RBM4. PLoS ONE. 8 (3), 59092 (2013).
- Jarnæss, E., et al. Splicing Factor Arginine/Serine-rich 17A (SFRS17A) Is an A-kinase Anchoring Protein That Targets Protein Kinase A to Splicing Factor Compartments. Journal of Biological Chemistry. 284 (50), 35154-35164 (2009).
- Bressan, G. C., et al. Functional association of human Ki-1/57 with pre-mRNA splicing events. FEBS Journal. 276 (14), 3770-3783 (2009).
- Vivarelli, S., et al. Paraquat Modulates Alternative Pre-mRNA Splicing by Modifying the Intracellular Distribution of SRPK2. PLoS ONE. 8 (4), 61980 (2013).
- Russell, W. C., Graham, F. L., Smiley, J., Nairn, R. Characteristics of a Human Cell Line Transformed by DNA from Human Adenovirus Type 5. Journal of General Virology. 36 (1), 59-72 (1977).
- Aranda, P. S., LaJoie, D. M., Jorcyk, C. L. Bleach gel: A simple agarose gel for analyzing RNA quality. Electrophoresis. 33 (2), 366-369 (2012).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Bai, Y. Control of 3' splice site choice in vivo by ASF/SF2 and hnRNP A1. Nucleic Acids Research. 27 (4), 1126-1134 (1999).
- Cote, G. J., Nguyen, N., Lips, C. J. M., Berget, S. M., Gagel, R. F. Validation of an in vitro RNA processing system for CT/CGRP precursor mRNA. Nucleic Acids Research. 19 (13), 3601-3606 (1991).
