Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

איסוף נתונים טוריים של יעד קבוע במקור אור יהלום

Published: February 26, 2021 doi: 10.3791/62200
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 2, 1,3, 1,4, 5, 2, 1
1Diamond Light Source, Harwell Science and Innovation Campus, 2School of Life Sciences, University of Essex, 3X-ray Science Division, Argonne National Laboratory, 4European Molecular Biology Laboratory, Hamburg Outstation c/o DESY, 5Biological Sciences, Institute for Life Sciences, University of Southampton

Summary

אנו מציגים מדריך מקיף להכנת מדגם יעד קבוע, איסוף נתונים ועיבוד נתונים עבור קריסטלוגרפיה סינכרוטרון סדרתית בקו קרן יהלום I24.

Abstract

איסוף נתונים טוריים הוא טכניקה חדשה יחסית עבור משתמשי סינכרוטרון. מדריך למשתמש לאיסוף נתוני יעד קבוע ב- I24, מקור אור יהלום מוצג עם הוראות מפורטות שלב אחר שלב, איורים וסרטוני וידאו לאיסוף נתונים חלק.

Introduction

קריסטלוגרפיה סינכרוטרון סדרתי (SSX) היא שיטה מתפתחת לאיסוף נתונים אשר בהשראת לייזרים אלקטרונים ללא קרנירנטגן(XFEL) 1,2,3. ב XFEL, דפוס עקיפה יחיד נרשם מגביש חלבון קטן מאוד בדרך כלל, לפני הגביש נהרס על ידי פעימת רנטגן בהירה מאוד. משמעות הדבר היא, בדרך כלל, כי גביש חדש חייב להיות הציג לתוך קרן הרנטגן כדי להשיג דפוס עקיפה אחר4. צורך זה לחדש את הגבישים ללא הרף הניע את הפיתוח של טכניקות משלוח מדגם סדרתיות רבות5.

בסינכרוטרונים, שיטות קריסטלוגרפיה סיבוב קלאסיות (לא סדרתיות) מיושמות באופן נרחב, תוך ניצול גביש גדול יחיד המסתובב בקרן רנטגן באמצעות גוניומטר כדי לאסוף ערכת נתונים מלאה לפתרון מבנה6. על מנת להגדיל את משך החיים של גבישים, כך ערכת נתונים מלאה ניתן לאסוף7,8, וגם כדי להקל על משלוח והעברת מדגם אוטומטי, גבישים הם cryocooled ~ 100 K לאיסוף נתונים. ב- beamlines מיקרופוקוס אינטנסיבי, אסטרטגיות מרובות קריסטלים משמשות לעתים קרובות כמו נזק קרינה יכול לאסור על איסוף של ערכת נתונים מלאה מקריסטל אחד9,10,11. למרות המגבלות שהוטלו על ידי נזקי קרינה, מספר הגבישים המשמשים נותר צנוע יחסית והגישה המשמשת זהה במהותה לניסוי הקריסטל היחיד.

SSX, לעומת זאת, משתמשת במשלוח מדגם סדרתי כדי להשיג דפוסי עקיפה בודדים מאלפי גבישים מכוונים באופן אקראי כדי ליצור ערכת נתונים מלאה. יצוין כי טכניקות סדרתיות המשלבות סיבוב גביש נמצאות בפיתוח12,13 למרות שאנו מתמקדים עדיין, אפס סיבוב, גישות. ישנם מגוון רחב של מערכות משלוח מדגם עם יתרונות וחסרונות שונים14, החל אספקת זרם של גבישים בזרימה ממוקדת / צמיג סילון15,16,17, שבב microfluidic18,19, או גבישים על מטרה קבועה כגון שבב סיליקון חרוט20,21 . בדרך כלל, גבישים מוחזקים בטמפרטורת החדר, המאפשר מגוון קונפורמציה גדול יותר להיות נצפה ומספק סביבה רלוונטית יותר מבחינה פיזיולוגית22. SSX מאפשר איסוף של ערכות נתונים במינון נמוך מאוד23, כמו המינון הכולל של ערכת הנתונים שווה לחשיפה אחת קצרה רנטגן של גביש אחד. יתרון מרכזי נוסף ש-SSX מספק הוא חקר דינמיקת החלבון באמצעות שיטות שנפתרו בזמן, עם תגובות המופעלות על ידי חשיפה לאור לייזר24,25,26,27או על ידי ערבוב של גבישים וליגנד /מצע 28,29. באמצעות גבישים קטנים יותר פירושו אור לייזר יכול לחדור את מכלול הגביש, באופן אחיד ייזום התגובה ללא ספיגת מולטיפוטונים כדי לספק מתווכים תגובה מוגדרים היטב עבור נתוני עקיפה נלקחו בנקודות זמן שונות27. השימוש בגבישים גדולים יותר ובשיטות איסוף נתונים מבוססות סיבוב סובל מעומק חדירת לייזר מוגבל, הפעלה לא-יונית או מולטיפוטנית, נזק לקרינה וזמן תקורה מכני בתוך סריקות נתונים, וכתוצאה מכך שילוב של מתווכים תגובה שיכולים להתברר כקשים או בלתי אפשריים לפענוח במהירויות תגובה מהירות יותר. גבישים קטנים יותר מספקים יתרון דומה בערבוב ניסויים, שכן ליגנדים יכולים לפזר במהירות ובאופן אחיד יותר בכל הגביש, ושוב מאפשרים לתעד מתווכים מוגדרים בעיכובים בזמן שונה30,31,32.

בקו הקרן של המיקרופוקוס I24 של דיאמונד ניתן לבצע הן סיבוב קונבנציונלי והן ניסויי SSX. כאן מוצג פרוטוקול מקיף להכנת מדגם SSX ואיסוף נתונים באמצעות יעדים קבועים ב- I24 ופרוטוקולים לניתוח נתונים של נתונים סידוריים ב- Diamond. בעוד שכתב היד והסרטונים הנלווים אמורים לאפשר למשתמשים לבצע ניסוי SSX מוצלח ב- I24, יש לציין כי זהו תחום המתפתח במהירות וגישות מתפתחות ללא הרף. כמו כן, יש לציין כי שיטות טוריות זמינות במקורות סינכרוטרון אחרים, כולל אך לא מוגבל לפטרה השלישי (P14-TREXX), MAX IV (BioMAX)33, SLS (PXI ו- PXII)34ו- NSLS (FMX)35. בעוד שהפרטים של איסוף ועיבוד נתונים טוריים יהיו שונים בין מקורות, עקרונות הליבה יישארו זהים. הפרוטוקולים שלהלן צריכים להיראות כמייצגים נקודת התחלה ומסלול למחנה הבסיס ולא את פסגת מה שניתן להשיג.

פרוטוקול זה מניח שלמשתמשים יש חלבון או מערכת גביש מולקולה קטנה, שממנה נוצרה רפש מיקרוקריסטלי בסדר גודל של 0.5-2.0 מ"ל עם צפיפות טובה של מיקרוקריסטלים לכל מ"ל. פרוטוקולים להשגת השמצה קריסטל תוארו בעבר 36. סוגים רבים ושונים של יעד קבוע זמינים, הנפוץ ביותר ב- I24 משתמש בשבב סיליקון מוגדר במדויק. על מנת להבדיל מפריסות שבב אחרות, מתחת ובממשק קו הקרן זה נקרא 'שבב אוקספורד'. כפי שתואר בעבר פריסת שבב אוקספורד כוללת 8×8 'בלוקים עירוניים', כל אחד מכיל 20×20 פתחים עבור סך של 25,600פתחים 20,21.

Protocol

1. הכנה וטעינה של שבב

הערה: התהליך מתרחש בסביבה מבוקרת לחות (איור 1),בדרך כלל בין 80% ל-90% או יותר לחות יחסית, כדי למנוע ייבוש של גבישי חלבון. לאחר טעינה ואיטום, גבישים יכולים לשרוד במשך למעלה מ 24 שעות. עם זאת, זה יכול להשתנות מאוד בין מערכות קריסטל. בתוך התא משאבת ואקום בעלת עוצמה נמוכה המחוברת לשלב טעינה כדי להחזיק שבב סיליקון (איור 1),שבב סיליקון, מחזיק שבב עם רדיד פוליאסטר(איור 2),פיפטה p200, 200 טיפים פיפטה μL, פינצטה, נייר מסנן ורפש גביש חלבון נדרשים.

  1. הכן מחזיק שבב.
    1. חותכים שני גיליונות של רדיד פוליאסטר לריבועים כ 6 ס"מ x 6 ס"מ.
    2. מניחים את יריעות הפוליאסטר על שתי צלחות הבסיס (גדולות וקטנות).
    3. תקן את יריעות הפוליאסטר במקום באמצעות טבעות איטום מתכת.
    4. בזהירות למשוך על רדיד פוליאסטר עודף כדי להסיר את כל קמטים כדי להפוך הדמיה ורכול דגימות קל יותר מאוחר יותר.
  2. בחר שבב סיליקון עם צמצם בגודל מתאים (7-30 מיקרומטר) ביחס לגודל הגבישים.
  3. זוהר לפרוק את השבב במשך 25 שניות ב 0.39 mBar ושימוש בזרם של 15 mA כדי לאפשר התפשטות קלה של גבישי מיקרו על השבב.
  4. הנח את שבב הסיליקון על שלב טעינת השבב באמצעות פינצטה עם הסורגים המוגבהים הפונים כלפי מטה.
  5. יש למרוח 200 מיקרו-לן של תרחיף מיקרו-קריסטל על הצד השטוח של השבב באמצעות פיפטה.
  6. תפרוש את תרחיף הקריסטל כדי לכסות את כל "בלוקי העיר" של השבב.
  7. אם השבב פגום, לכסות את כל החורים עם חתיכה קטנה של רדיד פוליאסטר או מסנן קצה pipette כדי להבטיח ואקום אחיד ניתן ליישם.
  8. יש למרוח ואקום עדין עד שכל הנוזל העודף נשאב דרך השבב.
  9. הסר את השבב משלב טעינת השבב עם פינצטה.
  10. בזהירות כתם את החלק התחתון של השבב עם נייר מסנן כדי להסיר נוזל עודף.
  11. מניחים את השבב הטעון על החצי הגדול יותר של מחזיק השבב בין המדריך מסמן צד שטוח כלפי מטה.
  12. אוטמים את השבב על ידי הנחת החצי הקטן של מחזיק השבב למעלה.
    1. שני החצאים של מחזיק השבבים יתמקם. אם המחצית השנייה לא יושבת סומק, לסובב את המחזיק 180 ° כדי ליישר כראוי את המגנטים.
  13. בורג מחזיק השבב סגור עם ברגים משורשים כדי לתקן את השבב בבטחה במקום.
    הערה: לחלופין, שבב "ללא שבב" ניתן לטעון באופן דומה, עם נפח קטן יותר של תרחיף קריסטל (~ 15 μL) סנדוויץ בין שתי שכבות של רדיד פוליאסטר במחזיק השבב 37, או נפח קטן יותר ניתן לטעון באמצעות spacer דבק דו צדדי 50 מיקרומטר להחיל ישירות על רדיד פוליאסטר כפי שתואר קודם לכן 38 . השימוש במרווחי דבק מאפשר גם לטעון דגימות מרובות (או גרסאות של דגימות כגון ספוגי ליגנד) על כל שבב ללא שבב. גישת טעינה משלימה המנצלת פליטת טיפה אקוסטית (ADE) לטעינת שבבי סיליקון יכולה לשמש גם ב- Diamond39. ADE מאפשרת לטעון שבבים באמצעות כמויות קטנות יותר של ריר קריסטל מאשר טעינת פיפטה. זוהי טכניקה שימושית במיוחד כאשר דגימות הם נדירים, אם כי ההרכב הכימי ואת הצמיגות של רפש חייב להילקח בחשבון.

2. GUI והגדרה בקו הקורה

  1. בצע את כל יישור השבבים והגדרתו לאיסוף נתונים באמצעות ממשק משתמש גרפי (EDM) פשוט של מנהל התצוגה של EPICS (GUI) (איור 3a). פעולה זו מספקת ממשק הצבעה ולחיצה למכשור קו קרן ומספקת פרמטרי קלט עבור איסוף נתונים מבוסס פייתון. חלונות משנה מספקים בקרה נוספת לאיסוף מאזורי משנה של מחזיק מדגם(איור 3b)או ניסויי לייזר/LED(איור 3c).

3. יישור השבב

  1. הנח את השבב הטעון על במת XYZ בקו הקרן (מוצג באיור 4a) באמצעות הרכבות הקימנטיות.
    1. הדאג להימנע ממושך את השלבים לאורך כיוון הנסיעה שלהם. המגנטים בהרים הקימתיים חזקים למדי כך שניתן לעשות זאת די בקלות במקרה.
    2. כאשר מתקרבים להר, מחזיק השבב צריך להיות מוחזק בזווית קלה (±30°). כאשר המגנטים יוצרים מגע מאפשרים למחזיק השבב להסתובב במקביל לרצפה (0°) ומחזיק השבב ילחץ למקומו(איור 4b).
    3. בעת פריקת שבב, בצע נתיב הפוך. סובבו את השבב והרחיקו את השבב מהשלבים לפני שתרחיקו את מחזיק השבב.
  2. באמצעות מערכת הצפייה על הציר של קו הקרן ו- GUI יישור השבב, אתר את ה- fiducial השמאלי העליון של השבב. הפידויאלים הם שלושה ריבועים, שניים קטנים ואחד גדול, בזוויות ישרות זה לזה(איור 5a). השבב מואר בחזרה כך שהשבב ייראה כהה עם פתחים כמו ריבועים לבנים.
  3. מרכז על אפס פי דו-שנתי ב- X, Y ו- Z (איור 5b). ישר X ו- Y על-ידי מעבר שמאלה/ימינה ולמעלה/למטה, בהתאמה. ישר Z על-ידי הזזת השבב פנימה והחוצה של המוקד.
  4. לחץ על הגדרת אפס פיודוזי.
  5. חזור על שלב 3.2 עבור פידו-1 (ימין עליון, איור 5c)ושני פי דו-כיווני (משמאל למטה, איור 5d)כדי ליישר את כל ההסתה עם קרן הרנטגן.
  6. צור מטריצה מתואמת על ידי לחיצה על הפוך את המערכת המתואמת, זה מחשב את היסט, המגרש, רול, ו yaw של השבב ביחס לשלבים המאפשרים את כל התנועות הבאות להתבצע במסגרת מתאם השבב.
  7. לחץ על בדיקת בלוקים כדי להעביר את שלב XYZ לבאר הראשונה של כל בלוק עיר לקבלת אישור חזותי שהשבב מיושר היטב.
  8. אם כוונת הרנטגן תואמת את פתחי הצמצם, השבב מיושר. אם לא, חזור על שלבים 3.2-3.3.
    הערות: במקרה של קושי ביישור (fiducials שבור), פתחים שונים על השבב יכול לשמש ליישור באמצעות תפריט הנפתח "סוג יישור". סוגים רבים ושונים של שבב זמינים לאיסוף נתוני יעד קבועים. סוגי שבבים שונים מתאכסנים באמצעות תפריט הנפתח 'סוג השבב'. סוגי השבבים הנפוצים ביותר המשמשים ב- I24 הם שבבי 'אוקספורד' ו'מותאמים אישית'. המספר והמרווח של פתחים ופידים בשבב נקראים ממילון שבבים המוגדר באמצעות התפריט הנפתח. שבב מותאם אישית מאפשר להגדיר את המרווח בצמצם תוך כדי תנועה, וזה שימושי במיוחד עבור גיליון על גיליון סרט דק או שבבים מסוג 'chipless' אחרים שבהם גבישים ממוקמים באופן אקראי על פני המחזיק37. GUI חדש של Python, המציע פונקציונליות של מעבר-על-לחץ ויישור שבב אוטומטי נמצא כעת בפיתוח, אך עדיין אינו מוכן לשימוש שגרתי בעת כתיבת כתב יד זה.

4. הגדרת איסוף נתונים

הערה: הגדרת איסוף הנתונים תהיה תלויה במערכת הנחקרת, והניסוי יבוצע. זה יכול לנוע בין ניסוי SSX הפשוט ביותר, איסוף מבנה במינון נמוך, לניסוי שנפתר בזמן באמצעות לייזרים או ערבוב מהיר כדי ליזום תגובה אשר תדרוש ערכות נתונים מלאות מרובות בעיכובי זמן שונים. כדי להגדיר אוסף נתונים, יש להגדיר את הפרמטרים הבאים.

  1. משתנים ניסיוניים: מלא את התיקייה, שם הקובץ, זמן החשיפה, השידור, מרחק הגלאי ומספר היריות לכל צמצם בהתאם לצורך.
  2. סוג השבב: כפי שתואר לעיל, התאם את סוג השבב לשבב שבשימוש.
    1. אם נעשה שימוש בסרט דק או בשבב 'ללא שבב', הגדר את סוג השבב כ-None.
    2. הגדר את מספר השלבים ואת גודל השלב הן ב- x והן ב- y ב- GUI.
  3. הגדר את סוג המפה: פעולה זו מאפשרת לבחור סעיפים משנה של שבב לאיסוף נתונים (איור 3b). 'אף אחד' פירושו שנתונים נאספים מכל צמצם על שבב. 'Lite' פירושו שנתונים נאספים מבלוקים נבחרים של העיר על השבב(איור 3b). אפשרות זו יכולה להיות שימושית אם, לדוגמה, אזור של שבב ידוע להיות טעון או ריק בצורה גרועה. 'מלא' מאפשר לבחור צמצמים בודדים לאיסוף נתונים. במקרה זה יש לספק קובץ טקסט בתבנית נכונה. ניתן לקבל פרטים ותבנית מצוות קו הקרן.
  4. משאבה-בדיקה: בחר את סוג הניסוי בגשושית המשאבה ואת השהיית הזמן הרצויה. הפעלת המשאבה (בדרך כלל LED או לייזר) היא לעתים קרובות ספציפית לניסוי מסוים, ולכן לא יתואר בפירוט כאן.
    1. עיכובים 'קצרים' מתייחסים לניסויים כאשר יש מגורים בכל צמצם בין המשאבה לבין הגשושית (כלומר, משאבה, בדיקה, 'עבור לדגימה הבאה.) עיכובים הם בדרך כלל בסדר גודל של שנייה אחת או עשרות אלפיות השנייה.
    2. עיכובים ארוכים מתייחסים לאסטרטגיית התרגשות וביקור שוב (EAVA), שבה מבקרים פעמיים פתחים, עם עיכוב זמן מוגדר בין ביקורים (כלומר, משאבה, תנועה, משאבה, תנועה, בדיקה, מהלך, בדיקה וכו '). השהיית הזמן מחושבת וזמני החשיפה לרנטגן (איור 3c)והם בדרך כלל ~ 1 שנייה או יותר.

5. שיטות נפוצות לאיסוף נתונים

הערה: להלן הפרמטרים העיקריים המגדירים את סוג הניסוי המתבצע. סעיף זה מניח שהוגדרו ההגדרות האחרות מפרוטוקול 3 "הגדרת איסוף נתונים".

  1. תרחיש 1: איסוף נתונים במינון נמוך. אוסף של תמונת עקיפה אחת מכל צמצם שנבחר במחזיק המדגם.
    1. הגדר את מספר הזריקות לכל צמצם ל- 1.
    2. הגדר את גשושית המשאבה ל-None.
  2. תרחיש 2: סדרת מינון, איסוף n תמונות ברצף מכל צמצם שנבחר על מחזיק המדגם. השבב נייח בכל צמצם בזמן שכל קבוצה של n תמונות נאספה.
    1. הגדר את מספר היריות לכל צמצםל-' n ' . שים לב שעיבוד הוא פשוט יותר אם n=5, 10, 20 או כפולה אחרת של 10. קשה לקבוע מגמות אם < 5. כדאי לשקול את הזמן הכולל הנדרש כדי לכסות שבב ואת מספר קבצי תמונה המיוצרים כאשר n גדל.
    2. הגדר את גשושית המשאבה ל-None.
  3. תרחיש 3: שיטות בדיקה של משאבה
    1. בחרו שיטה מתפריט הנפתח Pump Probe כדי לפתוח את מרכז הבקרה של עירור לייזר.
    2. לניסוי גשושי משאבה מלאו את הלייזר התעכבו בכל אפשרות של צמצם.
    3. עבור EAVA מלאו את הלייזר השתהו בכל חשיפה לצמצם ולרנטגן ולחצו על חשב.
    4. בחר באפשרות חזרה המתאימה בתפריט הנפתח הנפתח של משאבת משאבת GUI עבור זמן ההשהיה הרצוי.
    5. אם הניסוי דורש שלב טרום תאורה מלא בסעיף לייזר 2 Dwell.
    6. לאחר כל המשתנים הניסיוניים מוגדרים הקש הגדר פרמטרים וצור רשימה קצרה. זה טוען משתנים ניסיוניים לבקר הגיאובריק. לאחר פעולה זו הקשה על התחל תעביר את הגלאי פנימה, התאורה האחורית ותתחיל באיסוף נתונים. בכל הנקודות בהגדרת איסוף נתונים כדאי לפתוח חלון מסוף שבו מודפס משוב על המצב והתוצאה של כל אחד מהצעדים.

6. עיבוד נתונים

הערה: ניתן לחלק עיבוד נתונים באופן כללי לשלוש קבוצות בהתבסס על הדחיפות שבה נדרש משוב. משוב מהיר נדרש כדי להראות אם גבישים קיימים ומתפזרים, ואם כן, באילו מספרים. זה אמור לעמוד בקצב של איסוף הנתונים. ביצוע יצירת אינדקס נתונים ואינטגרציה שיכולים להיות איטיים יותר אך עדיין יש לבצע בסולם זמן דומה עם איסוף נתונים. מיזוג ושינוי קנה מידה של עוצמות השתקפות לתוך קובץ mtz לפתרון מבנה ויצירת מפות צפיפות אלקטרונים מייצג את השלב הסופי והוא יכול להיות איטי יותר עדיין. כאן יתחיל צינורות ב- I24 עבור שני השלבים הראשונים בלבד יידונו, כפי שהם נדרשים למשוב בזמן אמת כדי להנחות את הניסוי שלך, אם כי שים לב כי מדדים כגון קצבי פגע וסטטיסטיקות קנה מידה אינם תחליף לבדיקת צפיפות אלקטרונים, אשר עשוי לספק את האישור היחיד כי ליגנד כבול, או תגובה התרחשה, ב crystallo.

  1. משוב מהיר
    1. כדי לטעון את מודולי עיבוד הנתונים סוג מודול לטעון i24-ssx לתוך המסוף בכל תחנת עבודה קו קרן.
    2. כדי להפעיל את סוג ניתוח הלהיטים i24-ssx /path/to/visit/directory/ לתוך המסוף: i24-ssx /dls/i24/data/2020/mx12345-6/
      הערה: פעולה זו פותחת שלושה חלונות מסוף, ולאחר שנכתבו נתונים לדיסק, ייצוג גרפי של תוצאות חיפוש נקודתי משילוב עקיפה למקורות אור מתקדמים (DIALS) 40,41(איור 6a).
      1. הגדרות ברירת המחדל מקבלות ציונים כל תמונהעשירית ומתרעננות כל כמה שניות כדי למזער את העומס החישובי.
      2. שנה את ברירת המחדל על-ידי הוספת ארגומנט לסוף הפקודה לעיל. לדוגמה, 'i24-ssx /dls/i24/data/2020/mx12345-6 2' i24-ssx יריץ ממצאי התנקשות בכל תמונה אחרת. עם זאת, הדבר עלול להפעיל לחץ מופרז על האשכול (משאב משותף!) ולהאט את זמני העיבוד. הגרף מקודד בצבע בהתבסס על הסבירות של יצירת אינדקס מוצלחת, אדום מראה לפחות 15 כתמי בראג נמצאו (סיכוי טוב של אינדקס), כחול מראה מעט מאוד עקיפה שימושית.
      3. הצג תמונות עקיפה מעניינות במציג התמונות של DIALS על-ידי לחיצה על הכתמים בממשק מאתר הספוט.
  2. משוב על יצירת אינדקס ואינטגרציה
    הערה: יצירת אינדקס ושילוב של נתוני עקיפה מבוצעים באמצעות DIALS באמצעות הפונקציה dials.still_process 40,41. ככזה, יש להכניס קובץ טקסט מסוג .phil) ספציפי הקשור לקריסטל שלך (קבוצת מרחב קריסטל צפויה, תא יחידה וגיאומטריית ניסוי).
    1. טען מודולי חיוג על-ידי הקלדת לוחות חיוג של מודול במסוף.
    2. כדי להתחיל לעבד סוג ערכת נתונים dials.still_process /path/to/images/ /pathto/phil- file.phil. ניתן לפקח על ההתקדמות של כל ערכות הנתונים שעדיין מעבדות על-ידי הפעלת קובץ ה- Script stills_monitor על-ידי הקלדת monitor_stills_process.py (לאחר ביצוע טעינת מודול i24-ssx ושינוי ספריה לביקור הנוכחי) (איור 6b).
    3. ניתן לפקח על התפלגות תאי היחידה של נתוני עקיפה באינדקס (איור 7a) באמצעות הפקודה ctbx.xfel.plot_uc_cloud_from_experiments/path/to/dials/output/*refined.expt combine_all_input=true זה שימושי במיוחד לזיהוי ופתרון של פולימורפים של תאי יחידה כפי שנדון קודם לכן 42.
    4. 'Visualzie' אם וכיצד, הפצה זו משתנה על-פני יעד קבוע על-ידי הפקת התוויה דו-פעמית (איור 7b) באמצעות הפיתון הפקודה pacman.py /visit/processing/_hit_finding/chip.out.
    5. הפק תחזיות סטריאגוגרפיות של כל נתוני העקיפה הכלולים באינדקס (איור 7c) באמצעות הפקודה DIALS dials.stereographic_projection hkl = 0,0,1 expand_to_P 1 =True /path/to/dials/output/*refined.expt.
      הערה: זוהי פתולוגיה נפוצה בעת עיבוד נתוני סטילס מגבישים שבהם הסימטריה של סריג Bravais גבוהה יותר מאשר סימטריית קבוצת החלל כי נתונים ממוזגים מופיעים כתאום מושלם. אלגוריתמים לעיבוד נתונים התפתחו כדי לפתור אתהפתולוגיה 43,44,45,46 אבל המשתמשים צריכים להיות מודעים לכך בעת עיבוד הנתונים שלהם.

Representative Results

איסוף נתונים וסדרות במינון נמוך
במינון נמוך (שלב 5.1: תרחיש 1) וסדרות מינון (שלב 5.2: תרחיש 2) נתונים נאספו על גבישי מיקרו ניטריט נחושת ב- I24 ופורסמו בעבר 42. כל הדגימות הוכנו כמתואר בשלב 1, נתונים שנאספו לפי שלבים 3, 4 ו- 5, ועובדו בשיטות בשלב 6. בעבודה זו נאספה סדרת מינון מהירה עם 20 תמונות עקיפה שצולמו בכל צמצם (כלומר, n=20 באוסף הנתונים המוצג לעיל) לפני המעבר לדגימה טרייה. מנתונים אלה זוהתה התפלגות דו-מודולית של תאי יחידה בקבוצת החלל P213 (a = b = c = 97.25 Å, ו- a = b = c = 96.38 Å). זיהוי והפרדה של פולימורפים אלה של תאי יחידה לעיבוד הראו שיפור ניכר באינדיקטורים לאיכות הנתונים וחשפו שני מבנים שונים בלולאה גמישה בין שאריות 189-193 במקום המצב המעורב שנצפו בעת עיבוד כל הנתונים יחד. זיהוי של פולימורפים כאלה יכול לעשות את כל ההבדל במחקר מבני עדין שנפתר בזמן שבו רק שינויים מבניים קטנים צפויים. יתר על כן, סדרת המינון שנאספו חשפה שינוי תא יחידה תלוי מינון בגביש, עם מינון מוגבר הסטת האוכלוסייה לטובת תא יחידה גדול יותר.

עבודה דומה בוצעה על ידי אברהים ואח ' (2019)47, שבו סדרת מינון (שלב 5.2: תרחיש 2) נאספה מתוך heme peroxidase מסוג צבע מ- Streptomyces lividans (DtpAa) כדי להשוות מבנים במינון נמוך מ- SSX (שלב 5.1: תרחיש 1) עם אלה שנמדדו באותה מערכת יעד קבועה באמצעות SFX. נתוני SFX נאספו ב- SACLA Beamline BL2 EH3 עם אורך דופק של 10 פמטו-שניות וקצב חזרה של 30 הרץ. משך הדופק של 10 femtosecond מבטיח כי אפקטים תלויי מינון אינם קיימים בנתוני SFX. נתוני SFX הושוו לנתוני SSX שנאספו בקו הקרן I24, שם נמדדו 10 חשיפות רציפות של 10 אלפיות השנייה בכל מיקום מדגם (כלומר, n=10). נצפתה נדידה תלוית מינון של מולקולת מים מתואמת מברזל, כמו גם שינוי קונפורמציה באחת מקבוצות ההמיונט בסדרת המינון של SSX. למרות שלא נגרם נזק כמו מבנה SFX, סדרת המינון אפשרה את אורך הקשר Fe-O של ערכת נתונים במינון אפס (חמה ferric) להיות אקסטרפולוס, עם זה מסכים בתוך שגיאה ניסיונית עם הערך שהתקבל מ- SFX.

שיטות איסוף נתוני הקריסטלוגרפיה הסדרתיות המתוארות כאן יכולות גם להיות מותאמות בקלות כדי לספק סביבות מדגם חדשות, למשל, לחקור מבני חלבון אנאירובי בטמפרטורת החדר. כפי שמתואר ב- Rabe et al 2020 48, טעינת מדגם 'גיליון על גיליון', או 'שבב ללא שבב', עם סרטי איטום שונים בתא אירובי מאפשר איסוף טמפרטורת החדר של נתונים מבניים מדגימות רגישות לדיאוקסיגן.

משאבת בדיקה
למרות שהתוצאות הייצוגיות הבאות לא נאספו ב- Diamond Beamline I24, שיטות אלה פותחו בשיתוף פעולה הדוק בין מתקנים בתוכנית iNEXT כדי לפעול לשיטות סטנדרטיות בפיתוח שיטת קריסטלוגרפיה סדרתית. Beamline I24 מציע, או יציע בקרוב, שיטות איסוף שוות ערך לאלה המתוארות להלן כדי לבצע ניסויים כאלה באמצעות השיטות המתוארות בפרוטוקולים לעיל.

משאבה בדיקה: ערבוב מהיר
ערבוב מהיר SSX בוצע ב- T-REXX בקרן ב- PETRA III על ידי Mehrabi et al (2019) 28 באמצעות מזרק טיפה מונחה פיזו כדי ליזום תגובות על מטרות קבועות. עבודה זו מציגה הוכחה של עיקרון על ניסוי ערבוב שבב מחייב GlcNac3כדי lysozyme microcrystals, עם כריכה המתרחשת בתוך 50 אלפיות שני של טיפה 75 pL מוחל על המדגם. מחקר זה היה במעקב עם סדרה 7-מבנה נפתר זמן של פעילות איזומראז קסילוז, הדגמת כריכת גלוקוז בתוך 15 ms ואת היווצרות של קונפורמציה טבעת פתוחה במולקולת הגלוקוז לאחר עיכוב של 60 שניות. התקנה שווה ערך עבור הזרקת טיפה נמצאת כעת בפיתוח לשימוש על I24.

משאבה-בדיקה: הפעלת אור
ניסוי סדרתי משאבה-בדיקה מופעל אור מוצג שולץ ואח '(2018) 49. פלואורואצטט דהידרוגנאז היה ספוג בפלואורואצטט עם פוטוקאאוט ושאב עם אור לייזר 320-360 ננומטר כדי לייצר מבנים ב -4 נקודות זמן (t = 0, 30, 752 ו - 2,052 ms). מבנה מצב המנוחה (0 אלפיות שני) מציג אתר פעיל ריק, למעט כמה מולקולות מים, וצפיפות שווה ערך בין תחומי המכסה של שני תתי-קבוצות החלבון. 30 אלפיות השנייה ו-752 אלפיות השנייה לאחר הפעלת האור ניתן לראות ירידה משמעותית בצפיפות האלקטרונים בתחום המכסה של subunit B ביחס ל- subunit A. הירידה בצפיפות האלקטרונים בתחום הכובע של subunit B עולה בקנה אחד עם המראה של פלואורואצטט באתר הפעיל של subunit A ב 752 ms. ערכת הנתונים הסופית ב 2,052 ms מראה סידור מבני נוסף של ligand, חשוד כדי להקל על הגיאומטריה הנכונה עבור התקפת SN2, ויצירת פוטנציאל של מצב ביניים בתגובה. על I24, מערכת לייזר Pharos נייד אשר טונה מ 210-2500 ננומטר מתן פולסים femtosecond יכול לשמש להפעלת אור. ניסויים ראשוניים הראו הפעלה מוצלחת של צילומי צילום באמצעות עירור של 308 ננומטר עם כריכה של הליבנד המשוחרר לחלבון היעד שנצפה. בעת כתיבת שורות אלה ההשתלבות במערכת הבטיחות של כוח האדם בקו הקורה נמשכת וצפויים ניסויי משתמש שגרתיים בתחילת 2021. לניסויים כאשר נדרשים פולסים פחות אינטנסיביים של אור, הפעלת אור עם נורות LED הנשלטות על ידי TTL בוצעה בהצלחה.

Figure 1
איור 1: ציוד טעינה לדוגמה במקום במקור אור היהלום. התפאורה מורכבת ממשאבת ואקום (א),תא כפפות (b)ו- humidifier (c). בתוך תיבת הכפפות לחץ ואקום משמש לפעול על שבב טעון עם תרחיף קריסטל מוחזק בלוק מדגם (ד)מחובר בקבוקון Büchner(e,חץ ירוק), באמצעות וסת לחץ(f,חץ צהוב) מחובר stopcock (g,חץ כחול). אוויר לח נשאב לאוהל באמצעות צינורות פלסטיק המחוברים לספינת הלחות(h),ונמדד באמצעות הייגרומטר (i). הרכיבים מוחזקים במקום באמצעות דוכנימלחציים( j ). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: מחזיקי מדגם. הם משתמשים בטבעת O ממתכת (א)כדי להדק סרט פוליאסטר על חלק עליון (b) ותחתון (c) חצי, עם החצי התחתון ספורטיבי הרכבות מגנטיות (ד) המשמשים להצמדת מחזיק המדגם לשלבי המדגם. סרט הפוליאסטר (6 מיקרומטר (e) או 3 מיקרומטר(f))כמו גם גומי O-טבעות (חצים לבנים) למנוע שבב טעון קריסטל להתייבש במהירות במחזיק מדגם אשר סגור הדוק עם ברגים משושה (גרם). צ'יפס מנוקים באמצעות אמבטיות רציפים של 15 דקות ב- dH2O, 1 M HCl, ו- dH2O(h). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: ממשק משתמש גרפי לאיסוף נתונים עבור איסוף נתוני יעד קבוע ב- I24. (א)מציג את הממשק העיקרי המשמש ליישור שבבים ולהגדרת פרמטרי איסוף נתונים(b) הוא ממשק המיפוי lite המשמש להגדרת אזורי משנה של שבב לאיסוף נתונים ו -( c) הוא ממשק להגדרת פרמטרים להארת לייזר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4: תהליך הרכבת מחזיק שבב על הבמות כמתואר בשלב 3, נקודה 1. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 5
איור 5: יישור שבבים. שבב מיושר על ידי לחיצה על שלושה סמנים פיודואליים על השבב המוצג ב(a). תצוגות של fiducials 0, 1 ו- 2 דרך מערכת הצפייה בקו הקרן על ציר מוצגים ב -( b), (c) ו -( ד). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 6
איור 6: תוצאות עיבוד אוטומטי מוצגות כמתואר בשלב 6.1. התוויית קצב פגיעה מתעדכנתמוצגת( , inset). אם לוחצים על 'hit' בתמונת ההסתעפות המתאימה מוצגת במציג התמונות של המחוגים. שיעור הפגיעה באוסף הנתונים הנוכחי מוצג (29.6% בדוגמה זו). החלונית (ב)מציגה דוגמה לחלון המציג את שיעורי יצירת האינדקס והאינטגרציה הנוכחיים עבור נתונים שנאספו עד כה במהלך הביקור המתעדכנים בזמן אמת. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 7
איור 7: ניתוח נתונים מעמיק יותר. הדמיה של פרמטרי תא יחידה יכולה לחשוף פולימורפים (א). פרמטרי תא יחידה ממוצעים מחושבים; עם זאת, זה עדיין לא חל על ממוצעים בודדים עבור פולימורפים. הדמיה של תת-קבוצה קטנה של נתונים (הנתונים המוצגים הם תת-קבוצה של 793 גבישי ניטריט נחושת מנתונים המתוארים ב- Ebrahim et al 2019) מספיקה לעתים קרובות כדי לחשוף מגמות. ניתן לייצר גם חלקות דו-ממדיות של פרמטרים שימושיים כדי לחשוף וריאציות המתעוררות עקב השפעות טעינה או התייבשות שניתן לטפל בהן עבור אוספי נתונים קרובים (b). תחזיות סטריוגרפיות יכולות לחשוף את הנוכחות, או היעדר, כיוונים מועדפים הניזונים בחזרה לפרוטוקול הטעינה (c). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Discussion

איסוף נתוני סינכרוטרון סדרתי הוא טכניקה חדשה יחסית בקווי קרן MX, המגשרת על הפער בין אוספי הנתונים המהירים במיוחד המבוצעים כעת ב- XFELs לבין MX מבוסס סינכרוטרון מסורתי. כתב יד זה נועד לתת סקירה כללית של כיצד לאסוף בהצלחה נתונים סידוריים יעד קבוע ב beamline I24, מקור אור יהלום עבור מינון נמוך, סדרת מינון, וניסויים זמן נפתר. כמו בקריסטלוגרפיה סטנדרטית, הכנת מדגם היא צוואר בקבוק מרכזי בתמיסת המבנה. SSX אינו שונה, והכנת תיעוב גביש הומוגני בכמויות מספיקות עדיין לא נהנתה מכמה עשורים של מחקר ועידון כמו הצמיחה של גבישי חלבון גדולים יחידים. עם זאת, הכנת השמצה זו היא מחוץ לתחום של נייר זה סוכם במקום אחר36. השלב הקריטי בגישה המתוארת כאן כרוך בשימוש זהיר במדגם הזמין באמצעות ממשקי GUI קלים לשימוש (שלב 3) וצינורות עיבוד נתונים אוטומטיים (שלב 6) כדי ליידע את טעינת השבב (שלב 1) וכיצד ניסוי צריך להמשיך.

צינור המשוב המהיר הוא כלי רב עוצמה המאפשר למשתמשים להעריך את קצבי הלהיטים הראשוניים במהלך איסוף נתונים כדי ליידע את פרוטוקולי טעינת השבבים הבאים לאיסוף נתונים מוצלח. כאשר הם מתמודדים עם שיעור פגיעה נמוך (<5%), משתמשים מסתכנים באיסוף נתונים לא שלמים ו/או בבזבוז זמן קרן עם אוספים נוספים. במקרה זה, ניתן לאגד את הדגימה, מרוכזת על ידי צנטריפוגה עדינה, ו/או ניתן לטעון נפחים גדולים יותר בשלב 1.5. שיעור פגיעה גבוה יותר הוא בדרך כלל חיובי, עם זאת, יש נקודה של תשואה פוחתת שבה עומס יתר מוביל גבישים מרובים באותה באר. DIALS מסוגל להתמודד עם נתוני עקיפה מרוביסריגים 50, אבל דאגה גדולה יותר מאשר אינדקס ואינטגרציה היא ההשפעה המזיקה קיבוץ גביש יכול להיות על ההפעלה הזוגית של גבישים על ידי אור לייזר או ערבוב מהיר לניסויים מדויקים נפתר זמן. לכן יש לנקוט בזהירות מסוימת כדי למנוע עומס יתר על מטרות קבועות לניסויים שנפתרו בזמן.

שלב עיבוד האינדקס והאינטגרציה מייצר התוויה כאשר הצלב המרכזי מייצג את כיוון הקרן, כל נקודה המייצגת את כיוון השתקפות hkl 001 של סדקים בודדים, ואת הטבעת החיצונית של המעגל המייצג סיבוב של 90° הרחק מציר הקרן. פעולה זו תציג אם לגבישים שלך יש כיוון מועדף, שעשוי להשפיע על שלמות הנתונים ולציין את הצורך באיסוף נתונים נוספים או לשנות את פרוטוקול הטעינה. בחלונית השמאלית של איור 7cמוצגת ההשפעה של עומס יתר על שבב עם גבישי HEWL. כאשר הצמצמים מתמלאים בגבישים נוספים, הם נצמדים לקירות הזוויתיים של הצמצמים במקום להיתקע בבסיס באוריינטציה אקראית. שתי אליפסות אורתוגונל הן תוצאה של גבישים השוכבים על הקירות הפנימיים של השבב אשר נמצאים ~ 35 ° לכיוון הקורה. פעולה זו מפחיתה את נפח הגבישים הטעונים, מפחיתה את קצב הפגיעה ומפחיתה באופן דרמטי את שבר הגבישים השוכבים במישורים המועדפים הללו.

יש לציין כי גישות סדרתיות אחרות זמינות ב- I24, כגון מחבטי LCP ושבבים מיקרופלואידיים. אלה משתמשים ב- GUIs דומים ובאותם צינורות עיבוד כל כך הרבה מהנ"ל יישארו ישימים גם אם נעשה שימוש בטכניקה אחרת. קיימות מספר גישות טוריות הן עבור SSX והן עבור SFX מעבר לגישת היעד הקבועה המתוארת כאן, לכל אחת מהן יתרונות מסוימים על פני השני בהתאם לניסוי שיש לבצע וקו הקרן המשמש לניסוי. ככל שגישות סדרתיות מתפתחות במהירות, מומלץ לבדוק את דפי האינטרנט של קו הקורה (https://www.diamond.ac.uk/Instruments/Mx/I24.html) לקבלת עדכונים אחרונים ולדבר עם צוות Beamline בשלב מוקדם ככל האפשר בעת תכנון זמן קרן. הגישה ל- I24 לניסויים סטנדרטיים וסדרתיים היא ללא תשלום בנקודת השימוש. עבור משתמשי בריטניה והאיחוד האירופי עלויות הנסיעה והלינה מכוסות בחלקן באמצעות iNEXT דיסקברי.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכה על ידי iNEXT-Discovery (מענק 871037) במימון תוכנית Horizon 2020 של הנציבות האירופית.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Chip Holders Custom Built N/A In-house custom built metallic chip holders consisting of 2 magnetic base plates, 2 metal rings, and a kinematic mount.
Chipless Chip Spacers SWISCII N/A LCP adhesive sheets available as part of the LCP modular range
Geobrick LV-IMS-II Delta Tau N/A A multi-axis controller/amplifier with a custom Diamond Light Source hardware configuration
Kinematic Mounts ThorLabs KB25/M Square bases with 3 magnets arranged in a triangle affixed to chip holders.
KNF Laboport Vacuum Pump Merck Z262285-1EA Solid PTFE vauum pump, 10 l/min pumping speed.
Mylar Sheets 6 µm Fisher Scientific 15360562 300 ft roll of 6 µm thick mylar XRF film by SPEX SamplePrep
Mylar Sheets 3 µm Fisher Scientific 04-675-4 300 ft roll of 3 µm thick mylar XRF film by SPEX SamplePrep
Pelco easiGlow Glow Discharge System Ted Pella, INC. 91000 A compact stand alone glow discharge system used to produce hydrophillic surfaces
Silicon Chips University of Southampton N/A Custom etched silicon chips with 25,6000 apertures available in a variety of sizes.
Translation Stages Smaract N/A XYZ sample stages are a collaborative design by Diamond Light Source and SmarAct, custom-built by SmarAct using three linear translation 50mm travel stages, precise crossed roller guideways, and an integrated sensor with up to 1 nm resolution
1byOne Humidifier (701UK-0003 ) 1byOne B01DENO0EQ Commercially available 1.3 Litre ultrasonic humidifier

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Schlichting, I. Serial femtosecond crystallography: the first five years. IUCrJ. 2 (2), 246-255 (2015).
  2. Diederichs, K., Wang, M. Serial Synchrotron X-Ray Crystallography (SSX). Protein Crystallography: Methods and Protocols. Wlodawer, A., Dauter, Z., Jaskolski, M. , Springer. New York, NY. 239-272 (2017).
  3. Pearson, A. R., Mehrabi, P. Serial synchrotron crystallography for time-resolved structural biology. Current Opinion in Structural Biology. 65, 168-174 (2020).
  4. Chapman, H. N. Structure Determination Using X-Ray Free-Electron Laser Pulses. Protein Crystallography: Methods and Protocols. Wlodawer, A., Dauter, Z., Jaskolski, M. , Springer New York. New York, NY. 295-324 (2017).
  5. Chavas, L. M., Gumprecht, L., Chapman, H. N. Possibilities for serial femtosecond crystallography sample delivery at future light sources. Structural Dynamics. 2 (4), 041709 (2015).
  6. Dauter, Z., Wlodawer, A. Progress in protein crystallography. Protein & Peptide Letters. 23 (3), 201-210 (2016).
  7. Owen, R. L., Rudiño-Piñera, E., Garman, E. F. Experimental determination of the radiation dose limit for cryocooled protein crystals. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (13), 4912-4917 (2006).
  8. Garman, E. F., Weik, M. X-ray radiation damage to biological samples: recent progress. Journal of Synchrotron Radiation. 26, Pt 4 907-911 (2019).
  9. Axford, D., et al. In situ macromolecular crystallography using microbeams. Acta crystallographica. Section D, Biological crystallography. 68, Pt 5 592-600 (2012).
  10. Warren, A. J., Axford, D., Paterson, N. G., Owen, R. L. Exploiting Microbeams for Membrane Protein Structure Determination. Advances in Experimental Medicine and Biology. 922, 105-117 (2016).
  11. Sanishvili, R., Fischetti, R. F. Applications of X-Ray Micro-Beam for Data Collection. Protein Crystallography: Methods and Protocols. Wlodawer, A., Dauter, Z., Jaskolski, M. , Springer New York. New York, NY. 219-238 (2017).
  12. Wierman, J. L., et al. Fixed-target serial oscillation crystallography at room temperature. IUCrJ. 6 (2), 305-316 (2019).
  13. Maeki, M., et al. Room-temperature crystallography using a microfluidic protein crystal array device and its application to protein-ligand complex structure analysis. Chemical Science. 11 (34), 9072-9087 (2020).
  14. Grunbein, M. L., Nass Kovacs, G. Sample delivery for serial crystallography at free-electron lasers and synchrotrons. Acta Crystallographica Section D. 75 (2), 178-191 (2019).
  15. Weierstall, U. Liquid sample delivery techniques for serial femtosecond crystallography. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 369 (1647), 20130337 (2014).
  16. Botha, S., et al. Room-temperature serial crystallography at synchrotron X-ray sources using slowly flowing free-standing high-viscosity microstreams. Acta crystallographica. Section D, Biological crystallography. 71, Pt 2 387-397 (2015).
  17. Kovácsová, G., et al. Viscous hydrophilic injection matrices for serial crystallography. IUCrJ. 4, Pt 4 400-410 (2017).
  18. Monteiro, D. C. F., et al. A microfluidic flow-focusing device for low sample consumption serial synchrotron crystallography experiments in liquid flow. Journal of Synchrotron Radiation. 26 (2), 406-412 (2019).
  19. Monteiro, D. C. F., et al. 3D-MiXD: 3D-printed X-ray-compatible microfluidic devices for rapid, low-consumption serial synchrotron crystallography data collection in flow. IUCrJ. 7, Pt 2 207-219 (2020).
  20. Mueller, C., et al. Fixed target matrix for femtosecond time-resolved and in situ serial micro-crystallography. Structural Dynamics. 2 (5), 054302 (2015).
  21. Owen, R. L., et al. Low-dose fixed-target serial synchrotron crystallography. Acta Crystallographica Section D: Structural Biology. 73, Pt 4 373-378 (2017).
  22. Keedy, D. A., et al. Mapping the conformational landscape of a dynamic enzyme by multitemperature and XFEL crystallography. eLife. 4, (2015).
  23. de la Mora, E., et al. Radiation damage and dose limits in serial synchrotron crystallography at cryo- and room temperatures. Proceedings of the National Academy of Sciences. 117 (8), 4142-4151 (2020).
  24. Barends, T. R., et al. Direct observation of ultrafast collective motions in CO myoglobin upon ligand dissociation. Science. 350 (6259), 445-450 (2015).
  25. Pande, K., et al. Femtosecond structural dynamics drives the trans/cis isomerization in photoactive yellow protein. Science. 352 (6286), 725-729 (2016).
  26. Standfuss, J., Spence, J. Serial crystallography at synchrotrons and X-ray lasers. IUCrJ. 4 (2), 100-101 (2017).
  27. Grünbein, M. L., et al. Illumination guidelines for ultrafast pump-probe experiments by serial femtosecond crystallography. Nature Methods. 17 (7), 681-684 (2020).
  28. Mehrabi, P., et al. Liquid application method for time-resolved analyses by serial synchrotron crystallography. Nature Methods. 16 (10), 979-982 (2019).
  29. Beyerlein, K. R., et al. Mix-and-diffuse serial synchrotron crystallography. IUCrJ. 4, Pt 6 769-777 (2017).
  30. Schmidt, M. Mix and Inject: Reaction Initiation by Diffusion for Time-Resolved Macromolecular Crystallography. Advances in Condensed Matter Physics. , 167276 (2013).
  31. Kupitz, C., et al. Structural enzymology using X-ray free electron lasers. Structural Dynamics. 4 (4), 044003 (2017).
  32. Stagno, J. R., et al. Structures of riboswitch RNA reaction states by mix-and-inject XFEL serial crystallography. Nature. 541 (7636), 242-246 (2017).
  33. Shilova, A., et al. Current status and future opportunities for serial crystallography at MAX IV Laboratory. Journal of Synchrotron Radiation. 27 (5), 1095-1102 (2020).
  34. Huang, C. -Y., et al. In meso in situ serial X-ray crystallography of soluble and membrane proteins. Acta Crystallographica Section D. 71 (6), 1238-1256 (2015).
  35. Gao, Y., et al. High-speed raster-scanning synchrotron serial microcrystallography with a high-precision piezo-scanner. Journal of Synchrotron Radiation. 25 (5), 1362-1370 (2018).
  36. Beale, J. H., et al. Successful sample preparation for serial crystallography experiments. Journal of Applied Crystallography. 52, Pt 6 1385-1396 (2019).
  37. Doak, R. B., et al. Crystallography on a chip - without the chip: sheet-on-sheet sandwich. Acta Crystallographica Section D: Structural Biology. 74, Pt 10 1000-1007 (2018).
  38. Axford, D., Aller, P., Sanchez-Weatherby, J., Sandy, J. Applications of thin-film sandwich crystallization platforms. Acta Crystallographica Section F: Structural Biology Communications. 72, Pt 4 313-319 (2016).
  39. Davy, B., et al. Reducing sample consumption for serial crystallography using acoustic drop ejection. Journal of Synchrotron Radiation. 26 (5), 1820-1825 (2019).
  40. Brewster, A. S., et al. Improving signal strength in serial crystallography with DIALS geometry refinement. Acta Crystallographica Section D. 74 (9), 877-894 (2018).
  41. Winter, G., et al. DIALS: implementation and evaluation of a new integration package. Acta Crystallographica Section D. 74 (2), 85-97 (2018).
  42. Ebrahim, A., et al. Resolving polymorphs and radiation-driven effects in microcrystals using fixed-target serial synchrotron crystallography. Acta Crystallographica Section D. 75 (2), 151-159 (2019).
  43. Brehm, W., Diederichs, K. Breaking the indexing ambiguity in serial crystallography. Acta Crystallographica Section D. 70 (1), 101-109 (2014).
  44. White, T. Processing serial crystallography data with CrystFEL: a step-by-step guide. Acta Crystallographica Section D. 75 (2), 219-233 (2019).
  45. Shi, Y., Liu, H. EM-detwin: A Program for Resolving Indexing Ambiguity in Serial Crystallography Using the Expectation-Maximization Algorithm. Crystals. 10 (7), 588 (2020).
  46. Gildea, R. J., Winter, G. Determination of Patterson group symmetry from sparse multi-crystal data sets in the presence of an indexing ambiguity. Acta Crystallographica Section D. 74 (5), 405-410 (2018).
  47. Ebrahim, A., et al. Dose-resolved serial synchrotron and XFEL structures of radiation-sensitive metalloproteins. IUCrJ. 6 (4), 543-551 (2019).
  48. Rabe, P., et al. Anaerobic fixed-target serial crystallography. IUCrJ. 7 (5), 901-912 (2020).
  49. Schulz, E. C., et al. The hit-and-return system enables efficient time-resolved serial synchrotron crystallography. Nature Methods. 15 (11), 901-904 (2018).
  50. Gildea, R. J., et al. New methods for indexing multi-lattice diffraction data. Acta Crystallographica Section D. 70 (10), 2652-2666 (2014).

Tags

ביוכימיה גיליון 168 קריסטלוגרפיה סדרתית ביולוגיה מבנית קריסטלוגרפיה מקרמולאקולרית
איסוף נתונים טוריים של יעד קבוע במקור אור יהלום
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Horrell, S., Axford, D., Devenish,… More

Horrell, S., Axford, D., Devenish, N. E., Ebrahim, A., Hough, M. A., Sherrell, D. A., Storm, S. L. S., Tews, I., Worrall, J. A. R., Owen, R. L. Fixed Target Serial Data Collection at Diamond Light Source. J. Vis. Exp. (168), e62200, doi:10.3791/62200 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter